PL240585B1 - Chimeryczny receptor antygenowy (CAR), komórki immunologiczne zawierające CAR oraz kompozycja farmaceutyczna je zawierająca do leczenia nowotworów - Google Patents

Chimeryczny receptor antygenowy (CAR), komórki immunologiczne zawierające CAR oraz kompozycja farmaceutyczna je zawierająca do leczenia nowotworów Download PDF

Info

Publication number
PL240585B1
PL240585B1 PL422231A PL42223117A PL240585B1 PL 240585 B1 PL240585 B1 PL 240585B1 PL 422231 A PL422231 A PL 422231A PL 42223117 A PL42223117 A PL 42223117A PL 240585 B1 PL240585 B1 PL 240585B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
car
cells
cell
cancer
immune cell
Prior art date
Application number
PL422231A
Other languages
English (en)
Other versions
PL422231A1 (pl
Inventor
Heman Lap Man CHAO
Heman Lap Man Chao
Wah Yau Wong
Baomin Tian
Lakshmi Krishnan
Jamshid Tanha
Marni Diane UGER
Marni Diane Uger
Original Assignee
Helix Biopharma Corp
Nat Res Council Canada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Biopharma Corp, Nat Res Council Canada filed Critical Helix Biopharma Corp
Publication of PL422231A1 publication Critical patent/PL422231A1/pl
Publication of PL240585B1 publication Critical patent/PL240585B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46448—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/464482—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

PL 240 585 B1
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy immunoterapii nowotworu, bardziej specyficznie chimerycznych receptorów antygenowych (CAR), komórek immunologicznych zawierających CAR oraz kompozycji farmaceutycznych je zawierających do leczenia nowotworów u ludzi. Wynalazek obejmuje poddane inżynierii CAR (chimeryczne receptory antygenowe; ang. chimeric antigen receptors) i genetycznie modyfikowane komórki immunologiczne, które wyrażają takie CAR o wysokim powinowactwie dla antygenu związanego z nowotworem. Bardziej szczegółowo, komórki są komórkami CAR-T rozpoznającymi antygeny guza litego, wskazane są ich zastosowania i sposoby ich wytwarzania. Opisane zostały sposoby terapeutyczne i ich zastosowanie do leczenia nowotworów zależnych od CEACAM6.
Stan techniki
Adoptywny transfer komórek (ACT) jest transferem komórek do pacjenta. W szczególnych przypadkach obejmuje on poddanie inżynierii własnych komórek immunologicznych pacjentów do rozpoznawania i atakowania ich komórek nowotworowych. W niektórych podejściach komórki T pobiera się od osobnika, podaje się inżynierii genetycznej do wytwarzania specjalnych receptorów na ich powierzchni nazywanych chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR), które umożliwiają komórkom T na rozpoznawanie specyficznego białka (antygenu) na komórkach nowotworowych. Te poddane inżynierii komórki CAR-T następnie namnażano w laboratorium i ponownie wprowadzono do pacjenta, gdzie wykrywają one antygen nowotworowy i natychmiast aktywują się, wyzwalając swoją aktywność cytotoksyczną, uwalniając cytokiny w obrębie mikrośrodowiska nowotworu i dalej proliferując. Prowadzi to do zabijania komórek nowotworowych, które niosą antygen na swoich powierzchniach.
Dotychczas badania skupiały się na identyfikacji i zastosowaniu antygenów nowotworów innych niż lite do opracowania terapii ACT. Antygen CD19 jest obecny na powier zchni niemal wszystkich komórek B, zarówno prawidłowych jak i nowotworowych, czyniąc go dobrym celem dla leczenia chłoniaków. Jednak dla większości nowotworów litych antygeny specyficzne względem nowotworu nie są jeszcze dobrze zdefiniowane, czyniąc selekcję docelowego antygenu trudną.
Komórkowa cząsteczka adhezyjna 6 związana z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6) jest białkiem powierzchniowym połączonym z glikozylofosfoinozytolem (GPI) i członkiem rodziny białek CEACAM, którzy to członkowie są glikoproteinami zakotwiczonymi w komórce poprzez glikozylofosfatydyloinozytol (GPI). Ekspresja CEACAM6 jest podwyższona w wielu guzach litych, takich jak rak piersi, trzustki, jajników, wątrobowokomórkowy i okrężnicy (Blumenthal et al, 2007, BMC Cancer 2007; 7:2.7). Dodatkowo nadekspresja CEACAM6 w tkankach nowotworu trzustki promuje inwazję komórek nowotworu trzustki, przerzutowanie i angiogenezę, czyniąc CEACAM6 celem dla terapii nowotworu trzustki.
Podczas gdy adoptywny transfer komórek wykorzystujący terapię komórkową CAR wydaje się być atrakcyjną alternatywą dla operacji, chemioterapii i terapii radiacyjnej, leczenie zostało ograniczone do małych badań klinicznych i istnieją kwestie w odniesieniu do jej zastosowań klinicznych. Na przykład może następować ograniczona ekspansja in vivo komórek CAR-T, zanikanie komórek CAR-T po wlewie i działania niepożądane, takie jak zespół uwalniania cytokin. Szczególnie może być znacznie zróżnicowane powinowactwo do docelowego antygenu nowotworowego, a zatem zróżnicowana aktywność kliniczna. Ponadto komórki CAR-T mogą w sposób niedyskryminujący atakować zarówno komórki zdrowe jak i nowotworowe, skutkując „toksycznością związaną z celem, niezwiązaną z nowotworem”. Jeśli reaktywność związana z celem niezwiązana z nowotworem niszczy lub uszkadza istotne tkanki lub skutkuje zbyt silnym wydzielaniem cytokin, działania niepożądane terapii komórkowej CAR-T mogą nie być tolerowane. Byłoby korzystne opracowanie CAR i komórek CAR o wysokim powinowactwie dla docelowego antygenu nowotworowego, a zatem skutecznego leczenia specyficznego nowotworu wyrażającego taki antygen, gdzie wykazano skuteczność kliniczną, a możliwe działania niepożądane są tolerowalne.
Istnieje pilna potrzeba w dziedzinie kompozycji, sposobów wykonywania takich kompozycji i sposobów leczenia guzów litych z zastosowaniem CAR, które rozpoznają antygeny nowotworo we CEACAM6 ze specyficzną i pożądaną skuteczną aktywnością kliniczną. Niniejszy wynala zek spełnia to zapotrzebowanie.
Istotą wynalazku jest chimeryczny receptor antygenowy (CAR) zawierający lub składający się z sekwencji:
PL 240 585 Β1
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWF RQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFP GPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR (SEQ ID NO:5) lub sekwencji w co najmniej 95% z nią identyczną na całej długości, specyficzne wiążący się z komórkową cząsteczką adhezyjną 6 związaną z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6).
W korzystnym wykonaniu CAR zawiera cząsteczkę elementu dystansowego, region transbłonowy i jedną albo większą liczbę domen przekazywania sygnału w komórce wybranych z grupy składającej się z ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27, białka 0X40, ludzkiego białka 4-IBB, modyfikowanych wersji dowolnych z powyższych i dowolnych połączeń powyższych.
W innym korzystnym wykonaniu CAR jest humanizowany.
Wynalazek dotyczy komórki immunologicznej, która jest komórką T lub komórką zabójcą indukowaną cytokiną (CIK) zawierającą CAR według wynalazku.
Korzystna komórka immunologiczna ponadto zawiera co najmniej drugi CAR.
Korzystnie komórka immunologiczna ponadto zawiera system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
Korzystniej system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
Korzystniej system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X. Korzystnie komórka immunologiczna ponadto zawiera gen samobójczy.
Korzystnie komórka immunologiczna jest formułowana do kompozycji zawierającej farmaceutyczny nośnik, rozcieńczalnik i/lub rozczynnik.
Wynalazek dotyczy również cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje chimeryczny receptor antygenowy (CAR) według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydową kodującą CAR według wynalazku, przy czym CAR zawiera w kolejności od N-końca do C-końca:
i) przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment specyficzny dla wiązania z komórkową cząsteczką adhezyjną 6 związaną z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6);
ii) domenę transbłonową;
iii) polipeptyd kostymulatorowy, przy czym polipeptyd kostymulatorowyjest polipeptydem 4-1BB i/lub polipeptydem ΟΧ-40; i iv) wewnątrzkomórkową domenę przekazywania sygnału.
Korzystna cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera region zawiasowy umieszczony między przeciwciałem jednodomenowym i domeną transbłonową.
Korzystnie w cząsteczce kwasu nukleinowego region zawiasowy jest regionem zawiasowym immunoglobuliny IgG lub zawiasem pochodzącym z CD8.
Korzystnie w cząsteczce kwasu nukleinowego wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawiera aktywujący motyw immunoreceptora na bazie tyrozyny (ITAM).
Korzystnie w cząsteczce kwasu nukleinowego wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawierająca ITAM jest wybrana z CD3-zeta i ZAP70.
Korzystnie w cząsteczce kwasu nukleinowego sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki T.
Korzystnie w cząsteczce kwasu nukleinowego sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki NK.
Wynalazek dotyczy chimerycznego receptora antygenowego (CAR) kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego zawierającą SEQ ID NO: 9 lub SEQ ID NO: 10.
Wynalazek dotyczy wektora zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
PL 240 585 B1
Wynalazek dotyczy komórki immunologicznej gospodarza zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
W korzystnym wykonaniu komórka immunologiczna gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki T i komórki zabójcy indukowanej cytokiną CIK.
Korzystna komórka immunologiczna gospodarza ponadto zawiera co najmniej drugi CAR.
Komórka immunologiczna gospodarza ponadto zawiera system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
W korzystnej komórce immunologicznej gospodarza system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
W korzystnej komórce immunologicznej gospodarza system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
Korzystna komórka immunologiczna gospodarza ponadto zawiera gen samobójczy.
Wynalazek dotyczy populacji komórek zawierającej co najmniej jedną komórkę gospodarza według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej, która zawiera komórkę immunologiczną według wynalazku lub komórkę gospodarza według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również komórki immunologicznej według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym komórka immunologiczna podawana jest ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka.
W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej nowotworem jest nowotwór wyrażający CEACAM6.W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej ponadto obejmuje ono podawanie środka chemoterapeutycznego.
Wynalazek dotyczy również komórki immunologicznej gospodarza według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym komórka immunologiczna gospodarza podawana jest ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka.
W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej gospodarza nowotworem jest nowotwór wyrażający komórkową cząsteczkę adhezyjną 6 związaną z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6). ‘
W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej gospodarza nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
W korzystnym zastosowaniu komórki immunologicznej gospodarza ponadto obejmuje ono podawanie środka chemoterapeutycznego.
Wynalazek również dotyczy kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym kompozycja farmaceutyczna podawana jest ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka.
W korzystnym zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej nowotworem jest nowotwór wyrażający CEACAM6.
W korzystnym zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
W korzystnym zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej ponadto obejmuje ono podawanie środka chemoterapeutycznego.
Niniejszy wynalazek dostarcza CAR poddanych inżynierii do ukierunkowania na antygeny guza litego. Opisane w niniejszym opisie CAR mają wysokie powinowactwo do antygenów guzów litych. W aspektach opisane w niniejszym opisie CAR mają wysokie powinowactwo do nowotworów zależnych od CEACAM6. Unikalna specyficzność CAR opisanych w niniejszym opisie pochodzi z zastosowania sdAb (przeciwciał jednodomenowych; ang. sigle domain antibodies) w miejsce scFv poddanych inżynierii CAR. Dostarcza to wyższego powinowactwa ze względu na ich mały rozmiar. Takie przeciwciała również mają skłonność do łatwego ponownego fałdowania i stabilności biofizycznej. Dodatkowo mogą one rozpoznawać epitopy, które nie są dostępne dla konwencjonalnych przeciwciał i można je poddać inżynierii.
PL 240 585 B1
W aspektach opisanych w niniejszym opisie sdAb są jednodomenowymi przeciwciałami wielbłądowatych specyficznymi dla antygenu guza litego. W aspektach sdAb są specyficzne dla antygenu nowotworowego CEACAM6, jak również jego fragmentów lub wariantów.
W aspektach dostarczono komórki immunologiczne, które wyrażają CAR opisane w niniejszym opisie. Komórki immunologiczne typowo są komórkami T lub komórkami CIK.
W aspektach opisanych w niniejszym opisie dostarczono sposoby wytwarzania CAR-T specyficznych dla CEACAM6. W aspektach sposoby mogą być wirusowe lub inne niż wirusowe. Bardziej specyficznie sposoby w aspektach są sposobami innymi niż wirusowe obejmującymi transpozony.
Ujawniono izolowaną sekwencję kwasu nukleinowego kodującą chimeryczny receptor antygenowy (CAR), przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygeny, która wiąże się z CEACAM6, jego wariantami, fragmentami i specyficznymi epitopami, domenę transbłonową, jeden lub większą liczbę kostymulatorowych regionów przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta. W jednym aspekcie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca CAR zawiera sekwencję kwasu nukleinowego o SEQ ID NO: 5.
W jednym aspekcie domeną wiążącą antygeny w CAR jest przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen. Typowo fragment wiążący antygen jest przeciwciałem jednodomenowym lub jego fragmentem.
W jednym aspekcie domena wiążąca antygen w CAR wiąże się z antygenem nowotworowym. W jednym aspekcie antygen nowotworowy jest związany z guzem litym. W jeszcze innym aspekcie antygen nowotworowy wybrano z grupy składającej się z CEACAM6, jego fragmentów, jego wariantów i jego epitopów.
W jednym aspekcie kostymulatorowy region przekazywania sygnału w CAR zawiera domenę wewnątrzkomórkową cząsteczki kostymulatorowej wybranej z grupy składającej się z CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antygenu 1 związanego z funkcją limfocytów (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda, który specyficznie wiąże się z CD83 i ich dowolnych kombinacji.
Opisano również izolowany CAR zawierający domenę wiążącą antygen, domenę transbłonową, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta.
Opisano również komórkę zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen, domenę transbłonową, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta.
W jednym aspekcie komórka immunologiczna zawierająca CAR jest wybrana z grupy składającej się z komórki T, komórki NK (naturalni zabójcy), komórki CIK, cytotoksycznego limfocytu T (CTL) i regulatorowej komórki T.
Opisano również wektor zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta.
Opisano również sposób do stymulowania odpowiedzi immunologicznej, w której pośredniczą komórki T do tkanki docelowej u ssaka. W jednym aspekcie sposób obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości komórek modyfikowanych genetycznie do ekspresji CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta, przy czym domenę wiążącą antygen wybrano, aby specyficznie rozpoznawała populację komórek docelowych lub tkankę.
Ujawniono również sposób leczenia zwierzęcia mającego chorobę, zaburzenie lub stan związany z podwyższoną ekspresją antygenu CEACAM6. Ujawniono również zastosowanie w sposobie leczenia zwierzęcia mającego chorobę, zaburzenie lub stan związany z podwyższoną ekspresją antygenu CEACAM6. W jednym aspekcie sposób obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości komórek modyfikowanych genetycznie do ekspresji CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen specyficzną dla CEACAM6, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta, lecząc w ten sposób ssaka.
W jednym aspekcie komórka jest autologiczną komórką T.
W innym aspekcie komórka jest allogeniczną komórką T.
W jednym aspekcie antygenem nowotworowym jest CEACAM6, jego wariant, jego fragmenty i dowolne jego połączenia.
PL 240 585 B1
Ujawniono również sposób generowania utrzymującej się populacji genetycznie modyfikowanych komórek T u człowieka ze zdiagnozowanym nowotworem. W jednym aspekcie sposób obejmuje podawanie człowiekowi komórek T modyfikowanych genetycznie do ekspresji CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta, przy czym utrzymująca się populacja poddanych inżynierii genetycznej komórek T utrzymuje się u człowieka przez co najmniej jeden miesiąc po podaniu.
W jednym aspekcie utrzymująca się populacja poddanych inżynierii genetycznej komórek T zawiera co najmniej jedną komórkę wybraną z grupy składającej się z komórki T, którą podawano człowiekowi, potomstwa komórki T, którą podawano człowiekowi i ich kombinacji.
W jednym aspekcie utrzymująca się populacja poddanych inżynierii genetycznej komórek T zawiera komórkę T pamięci (limfocyty pamięci).
W jednym aspekcie utrzymująca się populacja poddanych inżynierii genetycznej komórek T utrzymuje się u człowieka przez co najmniej trzy miesiące po podaniu. W innym aspekcie utrzymująca się populacja poddanych inżynierii genetycznej komórek T utrzymuje się u człowieka przez co najmniej cztery miesiące, pięć miesięcy, sześć miesięcy, siedem miesięcy, osiem miesięcy, dziewięć miesięcy, dziesięć miesięcy, jedenaście miesięcy, dwanaście miesięcy, dwa lata lub trzy lata po podaniu.
Ujawniono również sposób namnażania (rozszerzania) populacji poddanych inżynierii genetycznej komórek T u człowieka ze zdiagnozowanym nowotworem. W jednym aspekcie sposób obejmuje podawanie człowiekowi komórek T poddanych inżynierii genetycznej do ekspresji CAR, przy czym CAR zawiera domenę wiążącą antygen specyficzną dla CEACAM6, kostymulatorowy region przekazywania sygnału i domenę przekazywania sygnału CD3 zeta, przy czym podawanie poddanych inżynierii genetycznej komórek T wytwarza populację potomną komórek T u człowieka.
W jednym aspekcie potomstwo komórek T u człowieka zawiera komórki T pamięci.
W jednym aspekcie komórka T jest autologiczną komórką T lub allogeniczną komórką T.
W jednym aspekcie komórką immunologiczną jest komórka CIK, która może być autologiczną lub allogeniczną.
W innym aspekcie człowiek jest oporny na co najmniej jeden środek chemoterapeutyczny.
W jednym aspekcie nowotworem jest dowolny nowotwór, który wyraża CEACAM6, jak również jego warianty lub epitopy. Takie nowotwory obejmują, w sposób nieograniczający, nowotwór trzustki, piersi, okrężnicy i odbytnicy, płuc, żołądka, jajników i pęcherza moczowego.
W jednym aspekcie populacja potomnych komórek T utrzymuje się u człowieka przez co najmniej trzy miesiące po podaniu. W innym aspekcie utrzymująca się populacja potomnych komórek T utrzymuje się u człowieka przez co najmniej cztery miesiące, pięć miesięcy, sześć miesięcy, siedem miesięcy, osiem miesięcy, dziewięć miesięcy, dziesięć miesięcy, jedenaście miesięcy, dwanaście miesięcy, dwa lata lub trzy lata po podaniu.
W aspektach jest nim chimeryczny receptor antygenowy (CAR), który wiąże się z CEACAM6, jego epitopem lub fragmentem lub jego wariantem.
W aspektach CAR zawiera przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment do wiązania CEACAM6.
W aspektach przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment jest z gatunku Camelidae.
W aspektach CAR wiąże się z epitopem CEACAM6 zawierającym lub składającym się z sekwencji NRIGYSWYKG (SEQ ID NO: 6).
W aspektach CAR zawiera region determinujący komplementarność (CDR) 1 zawierający sekwencję GRTNSVYTMG (SEQ ID NO: 1), CDR2 zawierający sekwencję IMWGAGTNTHYADSVKG (SEQ ID NO: 2) i/lub CDR3 zawierający sekwencję AANRGIPIAGRQYDY (SEQ ID NO: 3) do wiązania CEACAM6.
W aspektach CAR zawiera sekwencję:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQ
IMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAN
RGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 4) lub sekwencję do niej w co najmniej 90% identyczną.
W aspektach CAR zawiera cząsteczkę elementu dystansowego, region transbłonowy i jedną lub większą liczbę domen przekazywania sygnału w komórce wybranych z grupy składającej się z ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27,
PL 240 585 Β1 białka 0X40, ludzkiego białka 4-IBB, modyfikowanych wersji dowolnych z powyższych i dowolnych kombinacji powyższych.
W aspektach CAR zawiera lub składa się z sekwencji:
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWF RQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFP GPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR (SEQ ID NO:5).
Opisana jest również komórka immunologiczna zawierająca CAR, jak opisano w niniejszym opisie. Komórką może być komórka T lub komórka zabójca indukowana cytokiną (CIK). W aspektach komórka immunologiczna może ponadto zawierać co najmniej drugi CAR.
W aspektach komórka immunologiczna zawiera system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny. W aspektach system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny (ang. Sleeping Beauty). W kolejnych aspektach system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB 100Χ.
W kolejnych aspektach komórka immunologiczna CAR może ponadto zawierać gen samobójczy.
W kolejnych aspektach komórka immunologiczna CAR jest dostarczona jako kompozycja zawierająca farmaceutyczny nośnik, rozcieńczalnik i/lub rozczynnik. Kompozycja może być schłodzona, zamrożona lub rozmrożona.
Ujawniona jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny receptor antygenowy (CAR), przy czym CAR zawiera ugrupowanie wiążące CEACAM6 i ugrupowanie aktywacji komórki immunologicznej, przy czym ugrupowanie wiążące CEACAM6 wiąże się z CEACAM6 lub jego wariantem, lub fragmentem.
W aspektach ugrupowanie wiążące CEACAM6 zawiera przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążącą antygen skierowaną przeciwko CEACAM6, lub jego wariantowi, lub fragmentowi.
W aspektach ugrupowanie wiążące CEACAM6 zawiera region zmienny przeciwciała monoklonalnego.
W aspektach ugrupowanie aktywacji komórki immunologicznej zawiera domenę przekazywania sygnału komórki T któregokolwiek jednego lub większej liczby z następujących białek: ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27, białka 0X40, ludzkiego białka 4-IBB i ich wariantów lub fragmentów.
W aspektach cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego co najmniej jednej z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO:5 i/lub która wiąże się z sekwencją o SEQ ID NO: 6.
W aspektach jest cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydowa kodującą jeden lub oba łańcuchu polipeptydowe chimerycznego receptora antygenowego (CAR), przy czym CAR zawiera, w kolejności od N-końca do C-końca:
i) przeciwciało jednodomenowe wiążące antygen specyficzny dla CEACAM6;
ii) domenę transbłonową;
iii) polipeptyd kostymulatorowy, przy czym polipeptyd kostymulatorowyjest polipeptydem 4-1BB i/lub polipeptydem ΟΧ-40; i iv) wewnątrzkomórkową domenę przekazywania sygnału.
W aspektach pierwszy polipeptyd zawiera region zawiasowy umieszczony między przeciwciałem jednodomenowym i domeną transbłonową.
W aspektach region zawiasowy jest regionem zawiasowym immunoglobuliny IgG lub zawiasem pochodzącym z CD8.
W aspektach wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawiera aktywujący motyw immunoreceptora na bazie tyrozyny (ITAM).
PL 240 585 B1
W aspektach wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawierająca ITAM jest wybrana z CD3-zeta i ZAP70?
W aspektach sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki T.
W aspektach sekwencja nukleotydowa jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki NK.
W ujawnionych aspektach chimeryczny receptor antygenowy (CAR) kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego, jak ujawniono w niniejszym opisie, w aspektach CAR jest specyficzny dla CEACAM6.
W ujawnionych aspektach CAR zawiera sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 5.
W aspektach jest wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego, jak opisano w niniejszym opisie.
W aspektach jest komórka gospodarza wyrażająca cząsteczkę kwasu nukleinowego lub CAR, jak opisano w niniejszym opisie, w aspektach komórką gospodarza jest komórka immunologiczna.
W aspektach komórkę gospodarza wybrano z grupy składającej się z komórki T i komórki zabójcy indukowanej cytokiną CIK i w aspektach może ponadto zawierać co najmniej drugi CAR.
W aspektach komórka gospodarza ponadto zawierająca system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny (ang. Sleeping Beauty), w aspektach system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny. W kolejnych aspektach system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
W aspektach komórka gospodarza może ponadto zawierać gen samobójczy.
W aspektach ujawniona jest populacja komórek zawierająca co najmniej jedną komórkę gospodarza, jak opisano w niniejszym opisie.
W aspektach jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca komórkę immunologiczną lub komórkę gospodarza, jak opisano w niniejszym opisie.
W aspektach jest sposób leczenia lub zapobiegania nowotworowi wyrażającemu CEACAM6 u ssaka a zastosowaniem jest sposób leczenia lub zapobiegania nowotworowi wyrażającemu CEACAM6 u ssaka, przy czym sposób obejmuje podawanie komórki immunologicznej lub komórki gospodarza, jak opisano w niniejszym opisie, ssakowi w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania nowotworowi u ssaka. W aspektach nowotworem jest guz lity. W aspektach nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
Opisany jest sposób zmniejszania wzrostu lub zmniejszania wielkości nowotworu wyrażającego CEACAM6 u osobnika, gdzie sposób obejmuje podawanie kompozycji zawierającej CAR-T specyficzną dla antygenu CEACAM6.
Aspekty dostarczone w ujawnieniu podsumowano w poniżej wyliczonych punktach:
1. Chimeryczny receptor antygenowy (CAR), który wiąże się z CEACAM6, jego epitopem lub fragmentem lub jego wariantem.
2. CAR według punktu 1, przy czym wspomniany CAR zawiera przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment do wiązania CEACAM6.
3. CAR według punktu 2, przy czym wspomniane przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment jest z gatunku Camelidae.
4. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 3, przy czym wspomniany CAR wiąże się z epitopem CEACAM6 zawierającym lub składającym się z sekwencji NRIGYSWYKG (SEQ ID NO: 6
5. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 4, przy czym wspomniany CAR zawiera co najmniej jeden region determinujący komplementarność (CDR) do wiązania CEACAM6 wybrany z CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym CDR1 zawiera sekwencję GRTNSVYTMG (SEQ ID NO: 1), CDR2 zawiera sekwencję IMWGAGTNTHYADSVKG (SEQ ID NO:2), CDR3 zawiera sekwencję AANRGIPIAGRQYDY (SEQ ID NO:3).
6. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 5, zawierający sekwencję:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQ IMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAN RGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 4) lub sekwencję do niej w co najmniej 90% identyczną.
PL 240 585 Β1
7. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 6, przy czym CAR zawiera cząsteczkę elementu dystansowego, region transbłonowy i jedną lub większą liczbę domen przekazywania sygnału w komórce wybranych z grupy składającej się z ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27, białka 0X40, ludzkiego białka 4-IBB, modyfikowanych wersji dowolnych z powyższych i dowolnych połączeń powyższych.
8. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 7, zawierający lub składający się z sekwencji: MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWF RQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYC AANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTI1HVKGKHLCPSPLFP GPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR (SEQ EJ NO:5).
9. CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 8, przy czym CAR jest humanizowany.
10. Komórka immunologiczna zawierająca CAR według któregokolwiek z punktów od 1 do 9.
11. Komórka immunologiczna według punktu 10, przy czym wspomnianą komórką jest komórka T lub komórka zabójca indukowana cytokiną (CIK).
12. Komórka immunologiczna według punktu 10 lub 11, ponadto zawierająca drugi CAR.
13. Komórka immunologiczna według któregokolwiek z punktów od 10 do 12, ponadto zawierająca system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
14. Komórka immunologiczna według punktu 13, przy czym system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
15. Komórka immunologiczna według punktu 13 lub 14, przy czym system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
16. Komórka immunologiczna według któregokolwiek z punktów od 10 do 15, ponadto zawierająca gen samobójczy.
17. Komórka immunologiczna według któregokolwiek z punktów od 10 do 16, formułowana do kompozycji zawierającej farmaceutyczny nośnik, rozcieńczalniki/lub rozczynnik.
18. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny receptor antygenowy (CAR), przy czym CAR zawiera ugrupowanie wiążące CEACAM6 i ugrupowanie aktywacji komórki immunologicznej, przy czym ugrupowanie wiążące CEACAM6 wiąże się z CEACAM6 lub jego wariantem lub fragmentem.
19. Cząsteczka kwasu nukleinowego według punktu 18, przy czym ugrupowanie wiążące CEACAM6 zawiera przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążącą antygen skierowaną przeciwko CEACAM6 lub jego wariantowi lub fragmentowi.
20. Cząsteczka kwasu nukleinowego według punktu 19, przy czym ugrupowanie wiążące CEACAM6 zawiera region zmienny przeciwciała monoklonalnego.
21. Cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 18 do 20, przy czym ugrupowanie aktywacji komórki immunologicznej zawiera domenę przekazywania sygnału komórki T któregokolwiek jednego lub większej liczby z następujących białek: ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27, białka ΟΧ40, ludzkiego białka 4-IBB i ich wariantów lub fragmentów.
22. Cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 18 do 21, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego co najmniej jedną z SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5 i/lub która wiąże się z sekwencją o SEQ ID NO: 6.
23. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub oba łańcuchy polipeptydowe chimerycznego receptora antygenowego (CAR), przy czym CAR zawiera, w kolejności od N-końca do C-końca:
i) przeciwciało jednodomenowe wiążące antygen specyficzny dla CEACAM6;
ii) domenę transbłonową;
PL 240 585 B1 iii) polipeptyd kostymulatorowy, przy czym polipeptyd kostymulatorowy jest polipeptydem 4-1BB i/lub polipeptydem OX-40; i iv) wewnątrzkomórkową domenę przekazywania sygnału.
v) 24.
24. Cząsteczka kwasu nukleinowego według punktu 23, przy czym pierwszy polipeptyd zawiera region zawiasowy umieszczony między przeciwciałem jednodomenowym i domeną transbłonową.
25. Cząsteczka kwasu nukleinowego według punktu 24, przy czym region zawiasowy jest regionem zawiasowym immunoglobuliny IgG lub zawiasem pochodzącym z CD8.
26. Kwas nukleinowy według któregokolwiek z punktów od 23 do 26, przy czym wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawiera aktywujący motyw immunoreceptora na bazie tyrozyny (ITAM).
27. Cząsteczka kwasu nukleinowego według punktu 26, przy czym wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawierająca ITAM jest wybrana z CD3-zeta i ZAP70.
28. Cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 23 do 27, przy czym sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki T.
29. Cząsteczka kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 23 do 28, przy czym sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki NK.
30. Chimeryczny receptor antygenowy (CAR) kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 20 do 29.
31. CAR według punktu 30 zawierający sekwencję aminokwasową o SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 5.
32. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 20 do 29.
33. Komórka gospodarza wyrażająca cząsteczkę kwasu nukleinowego według któregokolwiek z punktów od 20 do 29 lub CAR według punktu 30 lub 31.
34. Komórka gospodarza według punktu 33, przy czym komórką gospodarza jest komórka immunologiczna.
35. Komórka gospodarza według punktu 34, gdzie komórkę gospodarza wybrano z grupy składającej się z komórki T i komórki zabójcy indukowanej cytokiną CIK.
36. Komórka gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 35, ponadto zawierająca co najmniej drugi CAR.
37. Komórka gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 36, ponadto zawierająca system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
38. Komórka gospodarza według punktu 37, przy czym system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
39. Komórka gospodarza według punktu 37 lub 38, przy czym system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
40. Komórka gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 39, ponadto zawierająca gen samobójczy.
41. Populacja komórek zawierająca co najmniej jedną komórkę gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 40.
42. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca komórkę immunologiczną według któregokolwiek z punktów od 10 do 17 lub komórkę gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 38.
44. Zastosowanie komórki immunologicznej, jak zdefiniowano w jednym z punktów od 10 do 17, lub komórki gospodarza, jak zdefiniowano w którymkolwiek z punktów od 33 do 40, w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym zastosowanie obejmuje podawanie komórki immunologicznej, jak zdefiniowano w którymkolwiek z punktów od 10 do 17, lub komórki gospodarza, jak zdefiniowano w którymkolwiek z punktów od 33 do 40, ssakowi w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania nowotworowi u ssaka.
45. Zastosowanie według punktu 44, przy czym nowotworem jest rak wyrażający CEACAM6.
PL 240 585 B1
46. Zastosowanie według punktu 44 lub 45, przy czym nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
47. Zastosowanie według któregokolwiek z punktów od 44 do 46, ponadto obejmujące podawanie środka chemoterapeutycznego.
48. Sposób leczenia lub zapobiegania nowotworowi u ssaka, przy czym sposób obejmuje podawanie komórki immunologicznej według któregokolwiek z punktów od 10 do 17 lub komórki gospodarza według któregokolwiek z punktów od 33 do 40 ssakowi w ilości skutecznej do leczenia lub zapobiegania nowotworowi u ssaka.
49. Sposób według punktu 48, przy czym nowotworem jest rak wyrażający CEACAM6.
50. Sposób według punktu 48 lub 49, przy czym nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
51. Sposób według któregokolwiek z punktów od 48 do 49, ponadto obejmujący podawanie środka chemoterapeutycznego.
Krótki opis figur rysunku
Poniższy szczegółowy opis typowych aspektów opisanych w niniejszym opisie będzie lepiej zrozumiały, gdy będzie się go czytało w połączeniu z załączonymi rysunkami. Dla celów ilustracji wynalazku na rysunkach przedstawiono aspekty, które są obecnie typowe. Należy jednak zrozumieć, że wynalazek nie ogranicza się do dokładnych układów i narzędzi aspektów przedstawionych na figurach rysunku.
Figura 1 jest wykresem przedstawiającym zwiększone zabijanie komórek docelowych w obecności komórek CAR-T. RTCA z zastosowaniem komórek docelowych BXPC3 (pozytywnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po wprowadzeniu komórek efektorowych, zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 56 godzin.
Figura 2 jest wykresem przedstawiającym, że komórki ujemne pod względem CEACAM6 nie są zabijane w obecności komórek CAR-T. RTCA z zastosowaniem komórek docelowych Pan02a (ujemnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po wprowadzeniu komórek efektorowych, zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 36 godzin.
Figura 3A jest wykresem przedstawiającym, że poziomy wydzielania interferonu gamma są zwiększone w sposób istotny i specyficzny względem CAR-T. 3B przedstawia krzywą standardową generowaną dla testu wydzielania IFN-gamma.
Figura 4A jest wykresem przedstawiającym, że poziomy wydzielania IL-2 są zwiększone w sposób istotny i specyficzny względem CAR-T. 4B przedstawia krzywą standardową generowaną dla testu wydzielania IL-2.
Figura 5 przedstawia przeciwciało anty-Fab wiążące się do komórek CAR-T wskazujące na wydajność transdukcji wynoszącą > 26%.
Figura 6 przedstawia RTCA wskazujące wzmocniony efekt cytotoksyczny komórek CAR-T CEACAM-6 względem docelowych komórek BxPC-3. Stosunek efektor: komórki docelowe = 10:1. A. Komórki CAR-T do wstrzykiwania #1, dzień 1; B. Komórki CAR-T zastosowane do wstrzykiwania #2, dzień 8. C. Komórki CAR-T zastosowane do wstrzykiwania #3, dzień 15.
Figura 7 jest wykresem przedstawiającym, że komórki CAR-T CEACAM-6 istotnie zmniejszały wzrost ksenoprzeszczepu nowotworu BxPC3 in vivo. N=5 myszy na grupę. Strzałka wskazuje dzień wstrzyknięcia (dni 1, 8, 15). Przedstawiono średnią +/- błędy standardowe. Obliczono wartości p i dnia 29 różnica była istotna przy p < 0,001 w grupie CAR-T względem grupy PBS i kontrolnej pozorowanej dla komórek T.
Figura 8 przedstawia masę ciała myszy po wstrzykiwaniu komórek CEACAM-6-CAR-T i komórek T.
Figura 9 przedstawia nowotwory pobrane dnia 30. po wstrzyknięciu komórek BxPC3. Myszy traktowane CEACAM-6 mają istotnie zmniejszone wielkości nowotworów, a jeden nowotwór był całkowicie wyeliminowany.
Figura 10 przedstawia analizę cytometrii przepływowej wskazującą wydajną transdukcję komórek T lentiwirusowym CAR i ekspresję scFv CEACAM-6. Barwienie CD3-APC wykryło wysoki procent komórek T.
Figura 11 przedstawia wyniki RTCA z zastosowaniem komórek docelowych raka trzustki BXPC3 (pozytywnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po
PL 240 585 B1 wprowadzeniu komórek efektorowych, zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 26 godzin. Dane przedstawiają zwiększone zabijanie komórek docelowych w obecności komórek CAR-T CEACAM-6.
Figura 12 przedstawia wyniki RTCA z zastosowaniem komórek docelowych raka okrężnicy S174-T (pozytywnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po wprowadzeniu komórek efektorowych zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 26 godzin. Dane przedstawiają zwiększone zabijanie komórek docelowych w obecności komórek CART CEACAM-6.
Figura 13 przedstawia wyniki RTCA z zastosowaniem komórek docelowych raka przewodowego gruczołu sutkowego HCC-1954 (pozytywnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po wprowadzeniu komórek efektorowych, zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 26 godzin. Dane przedstawiają zwiększone zabijanie komórek docelowych w obecności komórek CAR-T CEACAM-6.
Figura 14 przedstawia wyniki RTCA z zastosowaniem komórek docelowych raka płuc A549 (pozytywnych pod względem CEACAM6). Stosunek efektora do komórki docelowej wynosi 10:1. Po wprowadzeniu komórek efektorowych, zbieranie danych RTCA postępowało przez dodatkowe 26 godzin. Dane przedstawiają zwiększone zabijanie komórek docelowych w obecności komórek CAR-T CEACAM-6.
Figura 15 przedstawia wyniki RTCA wskazujące wzmocniony efekt cytotoksyczny komórek CAR-T CEACAM-6 względem docelowych komórek BxPC-3. Stosunek efektor: komórki docelowe = 10:1. Komórki T i komórki CAR-T dodano dnia 13. A. Komórki CAR-T zastosowane do wstrzyknięcia #1. B. Komórki CAR-T zastosowane do wstrzyknięcia #2. C. Komórki CAR-T zastosowane do wstrzyknięcia #3.
Figura 16 przedstawia, że komórki CAR-T CEACAM-6 istotnie zmniejszały wzrost ustanowionego ksenoprzeszczepu nowotworu BxPC3 in vivo. N=5 myszy na grupę. Strzałki wskazują dzień wstrzyknięcia. Przedstawiono średnią +/- błędy standardowe.
Figura 17 przedstawia masę ciała myszy po wstrzyknięciu PBS, komórek CEACAM-6-CAR-T i komórek T.
Figura 18 przedstawia zdjęcia nowotworów pobranych dnia 34 po wstrzyknięciu komórek BxPC3. Myszy traktowane CEACAM-6 mają istotnie zmniejszone wielkości nowotworów, a dwa nowotwory były całkowicie wyeliminowane.
OPIS SZCZEGÓŁOWY
Definicje
O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie określenia techniczne i naukowe stosowane w niniejszym opisie mają to samo znaczenie, co w powszechnym rozumieniu znawców w dziedzinie, której dotyczy wynalazek. Mimo że dowolne sposoby i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych w niniejszym opisie mogą być stosowane w praktykowaniu lub badaniu niniejszego wynalazku, w niniejszym opisie opisano typowe materiały i sposoby. W opisie i zastrzeżeniach niniejszego wynalazku zastosowano następującą terminologię.
Należy również zrozumieć, ze stosowana tutaj terminologia ma na celu opisanie wyłącznie szczególnych aspektów i nie jest ograniczająca.
Liczba pojedyncza została zastosowana w niniejszym opisie jako dotycząca jednego lub więcej niż jednego (tj. co najmniej jednego) gramatycznego dopełnienia. Tytułem przykładu „element” oznacza jeden element lub więcej niż jeden element.
„Około”, jak zastosowano w niniejszym opisie, gdy dotyczy wartości mierzalnej, takiej jak ilość, czas trwania i tym podobnych, ma obejmować odchylenia wynoszące ± 20% lub ± 10%, bardziej typowo ± 5%, jeszcze bardziej typowo ± 1% i nadal jeszcze bardziej typowo ± 0,1% od określonej wartości, ponieważ takie odchylenia są odpowiednie do przeprowadzenia ujawnionych sposobów.
„Aktywacja”, jak zastosowano w niniejszym opisie, dotyczy stanu komórki immunologicznej, takiej jak komórka CIK lub komórka T, którą skutecznie stymulowano do indukowania wykrywalnej proliferacji komórkowej. Aktywacja może również wiązać się z indukowanym wytwarzaniem cytokin i wykrywalnymi funkcjami efektorowymi. Określenie „aktywowane komórki T” dotyczy, między innymi, komórek T, które przechodzą podział komórki.
PL 240 585 B1
Określenie „przeciwciało” również nazywane w dziedzinie jako „immunoglobulina” (Ig), zastosowane w niniejszym opisie dotyczy białka konstruowanego z parowanych łańcuchów polipeptydów ciężkiego i lekkiego, różnych istniejących izotypów Ig, w tym IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Gdy przeciwciało jest prawidłowo sfałdowane, każdy łańcuch fałduje do licznych różnych domen globularnych połączonych przez większą liczbę liniowych sekwencji polipeptydowych. Na przykład łańcuch lekki immunoglobuliny fałduje do domeny zmiennej (Vl) i stałej (Cl), podczas gdy łańcuch ciężki fałduje do domeny zmiennej (Vh) i trzech stałych (CH, CH2, CH3). Oddziaływanie domen zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego (Vh i Vl) skutkuje utworzeniem regionu wiążącego antygen (Fv). Każda domena jest dobrze poznaną strukturą znaną znawcom w dziedzinie.
Regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego są odpowiedzialne za wiązanie docelowego antygenu i mogą zatem wykazywać istotną różnorodność sekwencji między przeciwciałami.
Regiony stałe przedstawiają mniejszą różnorodność sekwencji i są odpowiedzialne za wiązanie licznych naturalnych białek do wywołania ważnych zdarzeń immunologicznych. Region zmienny przeciwciała zawiera determinanty wiązania antygenu w cząsteczce i zatem określa specyficzność przeciwciała dla jego antygenu docelowego. Większość zmienności sekwencji występuje w sześciu regionach hiperzmiennych, trzy na zmienny łańcuch ciężki i lekki; regiony hiperzmienne łączą się do utworzenia miejsca wiążącego antygen i przyczyniają się do wiązania i rozpoznawania determinanty antygenowej. Specyficzność i powinowactwo przeciwciała dla jego antygenu określa się poprzez strukturę regionów hiperzmiennych, jak również ich wielkość, kształt i chemię powierzchni, którą prezentują antygenowi. Istnieją różne schematy do identyfikacji regionów hiperzmienności, przy czym dwoma najpowszechniejszymi są te Kabata oraz Chothia’ego i Leska. Kabat et al (1991a; 1991 b) definiuje „regiony determinujące komplementarność” (CDR) w oparciu o zmienność sekwencji w regionach wiążących antygen domen VH i VL. Chothia i Lesk (1987) definiują „pętle hiperzmienne” (H lub L) w oparciu o lokalizację strukturalnych regionów pętli w domenach VH i VL. Ponieważ te pojedyncze schematy definiują CDR i hiperzmienne regiony pętli, które są przylegające lub nakładające się na siebie, znawcy w dziedzinie przeciwciał często wykorzystują określenia „CDR” i „pętla hiperzmienna” zamiennie i mogą być one tak zastosowane w niniejszym opisie. Z tej przyczyny regiony tworzące miejsce wiązania antygenu określa się jako CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, CDR H3 w przypadku przeciwciał zawierających domenę VH i VL lub jako CDR1, CDR2, CDR3 w przypadku regionów wiążących antygen albo łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego. CDR/pętle określa się w niniejszym opisie według systemu numerowania IMGT (Lefranc et al., 2003), który opracowano do ułatwienia porównania domen zmiennych. W tym systemie aminokwasy zachowane (takie jak Cys23, Trp41 Cys104, Phe/Trp118 i reszta hydrofobowa w pozycji 89) zawsze mają tę samą pozycję. Dodatkowo zapewniono standaryzowane rozgraniczenie regionów zrębu (FR1: pozycje od 1 do 26, FR2: od 39 do 55; FR3: od 66 do 104; i FR4: od 118 do 128) i CDR (CDR1: od 27 do 38, CDR2: od 56 do 65; i CDR3: Od 105 do 117).
„Fragment przeciwciała”, jak nazwano w niniejszym opisie, może obejmować dowolny znany w dziedzinie odpowiedni fragment przeciwciała wiążący antygen. Fragmentem przeciwciała może być naturalnie występujący fragment przeciwciała lub może być uzyskany przez manipulację naturalnie występującego przeciwciała lub poprzez zastosowanie sposobów rekombinacyjnych. Na przykład fragment przeciwciała może obejmować, w sposób nieograniczający, Fv, Fv jednołańcuchowe (scFv; cząsteczka składająca się z Vl i Vh połączonych łącznikiem peptydowym), Fab, F(ab')2, przeciwciało jednodomenowe (sdAb; fragment złożony z pojedynczej Vl lub Vh) i wielowalentne postaci dowolnego z nich.
Przez określenie „przeciwciało syntetyczne”, jak zastosowano w niniejszym opisie, rozumie się przeciwciało, które jest generowane z zastosowaniem technologii rekombinowanego DNA, takie jak na przykład przeciwciało wyrażane przez bakteriofaga, jak opisano w niniejszym opisie. Określenie powinno również interpretować się jako oznaczające przeciwciało, które generowano przez syntezę cząsteczki DNA kodującej przeciwciało, i która to cząsteczka DNA wyraża białko przeciwciała lub sekwencję aminokwasową określającą przeciwciało, przy czym DNA lub sekwencję aminokwasową uzyskano z zastosowaniem technologii syntetycznego DNA lub sekwencji aminokwasowej, która jest dostępna i dobrze znana w dziedzinie.
W nieograniczającym przykładzie fragmentem przeciwciała może być sdAb pochodzące z naturalnie występujących źródeł. Przeciwciała łańcucha ciężkiego pochodzące z wielbłądowatych (Hamers-Casterman et al, 1993) nie mają łańcuchów lekkich, a zatem ich miejsca wiązania antygenu składają się z jednej domeny, nazywanej Vhh. sdAb zaobserwowano również u rekinów i nazwano Vnar (Nuttall et al, 2003). Inne sdAb można poddać inżynierii w oparciu o ludzkie sekwencje łańcucha ciężkiego
PL 240 585 B1 i lekkiego (Jespers et al, 2004; To et al, 2005). Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenie „sdAb” obejmuje te sdAb bezpośrednio izolowane z rezerwuaru Vh, Vhh, Vl lub Vnar dowolnego pochodzenia poprzez prezentację fagową lub inne technologie, sdAb pochodzące z wcześniej wspomnianych sdAB, sdAb wytwarzane w sposób rekombinacyjny, jak również te sdAb generowane poprzez dalszą modyfikację takich sdAb przez humanizowanie, dojrzewanie powinowactwa, stabilizowanie, solubilizację, np. upodobnianie do przeciwciał wielbłądowatych (ang. camelization) lub inne sposoby inżynierii przeciwciał. Niniejsze ujawnienie obejmuje również homologi, pochodne lub fragmenty, które utrzymują funkcję wiązania antygenu i specyficzność sdAb.
sdAb są doskonałymi cegiełkami dla nowych cząsteczek przeciwciała ze względu na ich wysoką termostabilność, wysoką odporność na detergent, względnie wysoką odporność na proteazy (Dumoulin et al, 2002) i wysoką wydajność wytwarzania (Arbabi-Ghahroudi et al, 1997); można poddać je również inżynierii do objęcia bardzo wysokiego powinowactwa poprzez izolowanie z biblioteki immunologicznej (Li et al, 2009) lub poprzez dojrzewanie powinowactwa in vitro (Davies & Riechmann, 1996).
Znawca w dziedzinie dobrze zna strukturę przeciwciała jednodomenowego (patrz, na przykład 3DWT, 2P42 w białkowej bazie danych). sdAb zawiera pojedynczą domenę immunoglobuliny, która utrzymuje fałdowanie immunoglobuliny; szczególnie, tylko trzy CDR tworzą miejsce wiązania antygenu. Jednak, i jak rozumieją znawcy w dziedzinie, nie wszystkie CDR mogą być wymagane do wiązania antygenu. Na przykład i w sposób nieograniczający, jeden, dwa lub trzy z CDR mogą przyczyniać się do wiązania i rozpoznawania antygenu przez sdAb. CDR sdAb lub domeny zmiennej określa się w niniejszym opisie jako CDR1, CDR2 i CDR3 i numeruje się jak zdefiniowali Kabat et al. (1991b).
Określenie „antygen” lub „Ag”, jak zastosowano w niniejszym opisie, zdefiniowano jako cząsteczkę, która prowokuje odpowiedź immunologiczną. Ta odpowiedź immunologiczna może obejmować wytwarzanie przeciwciała lub aktywację specyficznych komórek kompetentnych immunologicznie lub oba. Znawcy w dziedzinie rozumieją, że dowolna makrocząsteczka, w tym praktycznie wszystkie białka lub peptydy, może służyć jako antygen. Ponadto antygeny mogą pochodzić z rekombinowanego lub genomowego DNA. Znawca w dziedzinie rozumie, że dowolny DNA, który zawiera sekwencje nukleotydowe lub częściową sekwencję nukleotydową kodującą białko, które wywołuje odpowiedź immunologiczną koduje w ten sposób „antygen” - jak zastosowano to określenie w niniejszym opisie. Ponadto znawca w dziedzinie rozumie, że antygen nie musi być kodowany wyłącznie przez sekwencję nukleotydową genu pełnej długości. Oczywiste jest, że niniejsze ujawnienie obejmuje, w sposób nieograniczający, zastosowanie częściowych sekwencji nukleotydowych więcej niż jednego genu, i że te sekwencje nukleotydowe są ułożone w różnych połączeniach do wywołania pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Ponadto znawca w dziedzinie zrozumie, że antygen w ogóle nie musi być kodowany przez „gen”. Oczywiste jest, że antygen można syntetyzować lub może pochodzić z próbki biologicznej. Taka próbka biologiczna może obejmować, w sposób nieograni czający, próbkę tkanki, próbkę nowotworu, komórkę lub płyn biologiczny.
Określenie „efekt przeciwnowotworowy” lub „leczenie nowotworu” (leczenie raka), jak zastosowano w niniejszym opisie, dotyczy efektu biologicznego, który może manifestować się przez zmniejszenie objętości nowotworu, zmniejszenie liczby komórek nowotworowych, zmniejszenie tempa wzrostu nowotworu, zmniejszenie liczby przerzutów, ustabilizowaną chorobę, zwiększenie oczekiwanej długości życia lub poprawę różnych objawów fizjologicznych związanych ze stanem nowotworowym. „Efekt przeciwnowotworowy” może również manifestować się zdolnością peptydów, polinukleotydów, komórek i przeciwciał opisanych w niniejszym opisie do zapobiegania przede wszystkim występowaniu nowotworu.
Określenie „auto-antygen” oznacza, według niniejszego wynalazku, dowolny własny antygen, który jest przez pomyłkę rozpoznawany przez układ immunologiczny jako obcy. Auto-antygeny obejmują, w sposób nieograniczający, białka komórkowe, fosfoproteiny, białka powierzchni komórkowej, lipidy komórkowe, kwasy nukleinowe, glikoproteiny, w tym wszystkie receptory powierzchni komórki.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenie „autologiczny” ma oznaczać dowolny materiał pochodzący z tego samego osobnika, który później ponownie wprowadza się do osobnika.
„Allogeniczny” dotyczy przeszczepu pochodzącego z innego zwierzęcia tego samego gatunku.
„Ksenogeniczny” dotyczy przeszczepu pochodzącego z innego gatunku.
„Syngeniczny” dotyczy przeszczepu pochodzącego z identycznego osobnika.
Określenie „nowotwór”, jak zastosowano w niniejszym opisie, zdefiniowano jako chorobę charakteryzującą się szybkim i niekontrolowanym wzrostem nieprawidłowych komórek. Komórki nowotworowe mogą rozprzestrzeniać się lokalnie lub przez krwiobieg i układ limfatyczny do innych części organizmu.
PL 240 585 B1
Przykłady różnych nowotworów obejmują, w sposób nieograniczający, raka piersi, raka prostaty, raka jajników, raka szyjki macicy, raka skóry, raka trzustki, raka okrężnicy i odbytnicy, raka nerek, raka wątroby, raka mózgu, chłoniaka, białaczkę, raka płuc i tym podobne.
„Ligand kostymulatorowy”, w określeniu stosowanym w niniejszym opisie, obejmuje cząsteczkę lub komórkę prezentującą antygen (np. aAPC, komórkę dendrytyczną, komórkę B i tym podobne), która specyficznie wiąże się z pokrewną cząsteczką kostymulatorową na komórce T, dostarczając w ten sposób sygnał przez na przykład wiązanie kompleksu TCR/CD3 z cząsteczką MHC załadowaną peptydem, pośredniczy w odpowiedzi komórki T, w tym, w sposób nieograniczający, proliferacji, aktywacji, różnicowania i tym podobnych. Ligand kostymulatorowy może obejmować, w sposób nieograniczający, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, indukowalny ligand kostymulatorowy (ICOS-L), wewnątrzkomórkową cząsteczkę adhezyjną (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor limfotoksyny beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, agonistę lub przeciwciało, które wiąże się z receptorem liganda Toll i ligand, który specyficznie wiąże się z B7-H3. Ligand kostymulatorowy obejmuje również, między innymi, przeciwciało, które specyficznie wiąże się z cząsteczką kostymulatorową obecną na komórce T, taką jak, w sposób nieograniczający, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD--1, ICOS, antygen 1 związany z funkcję limfocytu (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i ligand, który specyficznie wiąże się z CD83.
„Cząsteczka kostymulatorowa” dotyczy pokrewnego partnera wiążącego na komórce T, który specyficznie wiąże się z ligandem kostymulatorowym, pośrednicząc w ten sposób w odpowiedzi kostymulatorowej przez komórkę T, takiej jak, lecz w sposób nieograniczający, proliferacja. Cząsteczki kostymulatorowe obejmują, w sposób nieograni czający, cząsteczkę MHC klasy I, BTLA i receptor liganda Toll.
„Sygnał kostymulatorowy”, jak zastosowano w niniejszym opisie, odnosi się do sygnału, który w połączeniu z pierwotnym sygnałem, takim jak ligacja TCR/CD3, prowadzi do proliferacji komórek T i/lub stymulacji lub hamowania kluczowych cząsteczek.
„Skuteczna ilość”, jak zastosowano w niniejszym opisie, oznacza ilość, która zapewnia korzyść terapeutyczną lub profilaktyczną.
„Kodujący” dotyczy nieodłącznej własności specyficznych sekwencji nukleotydów w polinukleotydzie, takim jak gen, cDNA lub mRNA do stanowienia matryc dla syntezy innych polimerów i makrocząsteczek w procesach biologicznych mających albo zdefiniowaną sekwencję nukleotydów (np. rRNA, tRNA i mRNA) lub zdefiniowaną sekwencję aminokwasów i wynikające z tego własności biologiczne. Zatem gen koduje białko, jeśli transkrypcja i translacja mRNA odpowiadającego temu genowi wytwarza białko w komórce lub innym układzie biologicznym. Zarówno nić kodująca, której sekwencja nukleotydowa jest identyczna do sekwencji mRNA i jest zwykle dostarczana w wykazach sekwencji, jak i nić niekodująca stosowana jako matryca do transkrypcji genu lub cDNA, może być określana jako kodująca białko lub inny produkt tego genu, lub cDNA.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, „endogenny” dotyczy dowolnego materiału z lub wytwarzanego wewnątrz organizmu, komórki, tkanki lub układu.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, „egzogenny” dotyczy dowolnego materiału wprowadzonego z lub wytwarzanego na zewnątrz organizmu, komórki, tkanki lub układu.
Określenie „ekspresja”, jak zastosowano w niniejszym opisie, zdefiniowano jako transkrypcję i/lub translację poszczególnej sekwencji nukleotydowej kierowaną przez jej promotor.
„Wektor ekspresyjny” dotyczy wektora zawierającego rekombinowany polinukleotyd zawierający sekwencje kontrolne ekspresji operacyjnie połączone z sekwencją nukleotydową do ekspresji. Wektor ekspresyjny zawiera wystarczające elementy działające in cis do ekspresji; inne elementy do ekspresji mogą być dostarczane przez komórkę gospodarza lub system ekspresji in vitro. Wektory ekspresyjne obejmują wszystkie te znane w dziedzinie, takie jak kosmidy, plazmidy (np. nagie lub zawarte w liposomach) i wirusy (np. lentiwirusy, retrowirusy, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami), które wbudowują rekombinowany polinukleotyd.
„Homologiczny” dotyczy podobieństwa sekwencji lub identyczności sekwencji między dwoma polipeptydami lub między dwiema cząsteczkami kwasu nukleinowego. Gdy pozycja w obu spośród dwóch porównywanych sekwencji jest zajęta przez tę samą zasadę lub monomeryczną podjednostkę aminokwasu, np. gdy pozycja w każdej spośród dwóch cząsteczek DNA jest zajmowana przez adeninę, wtedy cząsteczki te są homologiczne względem tej pozycji. Procent homologii między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby dopasowanych lub homologicznych pozycji wspólnych dla dwóch sekwencji dzielonej przez liczbę porównywanych pozycji razy 100. Na przykład, jeśli 6 z 10 pozycji w dwóch sekwencjach
PL 240 585 B1 jest dopasowanych lub homologicznych, to te dwie sekwencje są homologiczne w 60%. Jako przykład sekwencje DNA ATTGCC i TATGGC wykazują 50% homologii. Na ogół porównania dokonuje się, gdy dwie sekwencje dopasowuje się, by uzyskać maksimum homologii.
„Izolowany” oznacza zmieniony lub usunięty z naturalnego stanu. Na przykład kwas nukleinowy lub peptyd naturalnie obecny w żyjącym zwierzęciu nie jest „izolowany”, lecz ten sam kwas nukleinowy lub peptyd częściowo lub całkowicie izolowany z współistniejących materiałów jego naturalnego stanu jest „izolowany”. Izolowany kwas nukleinowy lub białko może istnieć w zasadniczo oczyszczonej postaci lub może istnieć w środowisku innym niż natywne, takim jak na przykład komórka gospodarza.
W kontekście według niniejszego wynalazku zastosowano poniższe skróty dla powszechnie występujących zasad kwasu nukleinowego. A dotyczy adenozyny, C dotyczy cytozyny, G dotyczy guanozyny, T dotyczy tymidyny i U dotyczy urydyny.
O ile nie określono inaczej, „sekwencja nukleotydowa kodująca sekwencję aminokwasową” obejmuje wszystkie sekwencje nukleotydowe, które są zdegenerowanymi wersjami siebie, i które kodują tę samą sekwencję aminokwasową. Wyrażenie sekwencja nukleotydowa, która koduje białko lub RNA może również obejmować introny w stopniu, w którym sekwencja nukleotydowa kodująca białko może w pewnej wersji zawierać intron(y).
„Lentiwirus” Jak zastosowano w niniejszym opisie, dotyczy rodzaju z rodziny Retroviridae. Lentiwirusy są unikalne wśród retrowirusów poprzez to, że są zdolne do zakażania komórek niedzielących się, mogą dostarczać istotną ilość informacji genetycznej do DNA komórki gospodarza, tak że są jednym z najskuteczniejszych sposobów dla wektorów dostarczających gen. HIV, SIV i FIV wszystkie są przykładami lentiwirusów. Wektory pochodzące z lentiwirusów oferują środki do osiągnięcia istotnych poziomów transferu genu in vivo.
Transpozon” lub „element transpozonowy” jest sekwencją DNA, która może zmieniać swoją pozycję w obrębie genomu, czasami tworząc lub odwracając mutacje i zmieniając wielkość genomu komórki. Transpozycja często skutkuje duplikacją transpozonu. Istnieją dwa różne typy transpozonów: transpozony klasy II, które składają się z DNA, który porusza się bezpośrednio z miejsca na miejsce; i transpozony klasy I, które są retrotranspozonami, która najpierw transkrybują DNA do RNA i następnie wykorzystują odwrotną transkryptazę do utworzenia kopii DNA z RNA do wstawienia do nowej lokalizacji. Transpozony typowo oddziałują z transpozazą, która pośredniczy w poruszaniu się transpozonu. Nieograniczające przykłady systemu transpozon/transpozaza obejmują typ Śpiącej Królewny (ang. Sleeping Beauty), typ Piggybac (ang. Piggybac), typ Żabi Książę (ang. Frog Prince) i typ Książę z Bajki (ang. Prince Charming).
Przez określenie „modulowanie”, jak zastosowano w niniejszym opisie, rozumie się pośredniczenie w wykrywalnym wzroście lub zmniejszeniu poziomu odpowiedzi u osobnika w porównaniu z poziomem odpowiedzi u osobnika pod nieobecność traktowania lub związku i/lub w porównaniu z poziomem odpowiedzi u skąd inąd identycznego, lecz nietraktowanego osobnika. Określenie obejmuje zakłócenie i/lub naruszenie natywnego sygnału, lub odpowiedzi, z pośredniczeniem w ten sposób w korzystnej odpowiedzi terapeutycznej u osobnika, typowo człowieka.
Określenie „operacyjnie połączony” dotyczy funkcjonalnego wiązania między sekwencją regulatorową i heterologiczną sekwencją kwasu nukleinowego skutkującym ekspresją tej ostatniej. Na przykład pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z drugą sekwencją kwasu nukleinowego, gdy pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego znajduje się w funkcjonalnej zależności z drugą sekwencją kwasu nukleinowego. Na przykład promotor jest operacyjnie połączony z sekwencją kodującą, gdy promotor wpływa na transkrypcję lub ekspresję sekwencji kodującej. Na ogół operacyjnie połączone sekwencje DNA są przyległe do siebie i, gdy wymagane jest połączenie dwóch regionów kodujących białko, są w tej samej ramce odczytu.
Określenie „ulegający nadekspresji” (nadeksprymowany) antygen nowotworowy lub „nadekspresja” antygenu nowotworowego ma wskazywać na nieprawidłowy poziom ekspresji antygenu nowotworowego w komórce z chorego obszaru jak guza litego w obrębie specyficznej tkanki lub narządu pacjenta względem poziomu ekspresji w prawidłowej komórce z tej tkanki lub narządu. Pacjentów mających guzy lite lub hematologiczne nowotwory złośliwe charakteryzujące się nadekspresją antygenu nowotworowego można określić standardowymi testami znanymi w dziedzinie.
Podawanie „pozajelitowe” kompozycji immunogennej obejmuje, np. wstrzyknięcie podskórne (s.c.), dożylne (i.v.), domięśniowe (i.m.) lub domostkowe lub techniki wlewu.
PL 240 585 B1
Określenia „pacjent”, „osobnik”, „jednostka” i tym podobne stosuje się zamiennie w niniejszym opisie i dotyczą zwierzęcia lub jego komórek, czy to in vitro czy in situ, podlegających sposobom opisanym w niniejszym opisie.
Ponadto określenia „pacjent”, „osobnik” i „jednostka” obejmują żyjące organizmy, w których można wywołać odpowiedź immunologiczną (np. ssaki). W pewnych nieograniczających aspektach pacjent, osobnik lub jednostka jest ssakiem i obejmuje ludzi, psy, koty myszy, szczury i ich gatunki transgeniczne.
Określenie „polinukleotyd”, jak zastosowano w niniejszym opisie, zdefiniowano jako łańcuch nukleotydów. Ponadto kwasy nukleinowe są polimerami nukleotydów. Zatem kwasy nukleinowe i polinukleotydy, jak zastosowano w niniejszym opisie, są zamienne. Znawca w dziedzinie ma ogólną wiedzę, że kwasy nukleinowe są polinukleotydami, które można hydrolizować do monomerycznych „nukleotydów”. Monomeryczne nukleotydy można hydrolizować do nukleozydów. Jak zastosowano w niniejszym opisie, polinukleotydy obejmują, w sposób nieograniczający, wszystkie sekwencje kwasu nukleinowego, które uzyskuje się za pomocą dowolnych środków dostępnych w dziedzinie, w tym, w sposób nieograniczający, środków rekombinacyjnych, tj., klonowania sekwencji kwasu nukleinowego z rekombinowanej biblioteki lub genomu komórki stosując zwykłą technologię klonowania i PCR i tym podobne oraz za pomocą środków syntetycznych.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenia „peptyd”, „polipeptyd” i „białko” stosuje się zamiennie i dotyczą związku złożonego z reszt aminokwasowych połączonych kowalencyjnie przez wiązania peptydowe. Białko lub peptyd musi zawierać co najmniej dwa aminokwasy i nie ma żadnych ograniczeń dotyczących maksymalnej liczby aminokwasów, które może zawierać sekwencja białka lub peptydu. Polipeptydy obejmują dowolny peptyd lub białko zawierające dwa lub większą liczbę aminokwasów połączonych ze sobą przez wiązania peptydowe. Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenie dotyczy zarówno krótkich łańcuchów, które również powszechnie nazywa się w dziedzinie peptydami, oligopeptydami i oligomerami, przykładowo, i dłuższych łańcuchów, które na ogół w dziedzinie dotyczą białek, których istnieje wiele typów. „Polipeptydy” obejmują na przykład między innymi, biologicznie aktywne fragmenty, zasadniczo homologiczne polipeptydy, oligopeptydy, homodimery, heterodimery, warianty polipeptydów, modyfikowane polipeptydy, pochodne, analogi, białka fuzyjne. Polipeptydy obejmują naturalne peptydy, rekombinowane peptydy, peptydy syntetyczne lub ich połączenia.
Określenie „promotor”, jak zastosowano w niniejszym opisie, zdefiniowano jako sekwencję DNA rozpoznawaną przez maszynerię syntetyczną komórki lub wprowadzoną maszynerię syntetyczną, wymaganą do zapoczątkowania specyficznej transkrypcji sekwencji polinukleotydowej.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenie „promotor/sekwencja regulatorowa” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, która jest wymagana do ekspresji produktu genu operacyjnie połączonego z promotorem/sekwencją regulatorową. W niektórych przypadkach sekwencja ta może być sekwencją rdzenia promotora, a w innych przypadkach sekwencja ta może obejmować również sekwencję wzmacniającą i inne elementy regulatorowe, które są wymagane do ekspresji produktu genu. Promotor/sekwencja regulatorowa może na przykład być tą, która wyraża produkt genu w sposób specyficzny względem tkanki.
„Konstytutywny” promotor jest sekwencją nukleotydową, która, gdy połączona operacyjnie z polinukleotydem, który koduje lub określa produkt genu, powoduje, że produkt genu jest wytwarzany w komórce w większości lub wszystkich warunkach fizjologicznych komórki.
„Indukowalny” promotor jest sekwencją nukleotydową, która, gdy połączona operacyjnie z polinukleotydem, który koduje lub określa produkt genu, powoduje, że produkt genu jest wytwarzany w komórce zasadniczo tylko wtedy, gdy induktor, który odpowiada promotorowi jest obecny w komórce.
Promotor „specyficzny względem tkanki” jest sekwencją nukleotydową, która, gdy połączona operacyjnie z polinukleotydem, koduje lub określa produkt genu, powoduje, że produkt genu jest wytwarzany w komórce zasadniczo tylko wtedy, gdy komórka jest komórką typu odpowiadającego promotorowi.
Przez określenie „specyficznie wiąże”, jak zastosowano w niniejszym opisie w odniesieniu do przeciwciała, rozumie się przeciwciało, które rozpoznaje specyficzny antygen, lecz zasadniczo nie rozpoznaje lub wiąże innych cząsteczek w próbce. Na przykład przeciwciało, które specyficznie wiąże się z antygenem z jednego gatunku może również wiązać się z tym antygenem z jednego lub większej liczby gatunków. Lecz taka krzyżowa reaktywność między gatunkami sama nie zmienia klasyfikacji przeciwciała jako specyficznego. W innym przykładzie przeciwciało, które specyficznie wiąże się z antyge
PL 240 585 B1 nem może również wiązać się z innymi postaciami allelicznymi antygenu. Jednak taka krzyżowa reaktywność sama nie zmienia klasyfikacji przeciwciała jako specyficznego. W niektórych przypadkach określenia „specyficzne wiązanie” lub „specyficznie wiążący” można zastosować w odniesieniu do oddziaływania przeciwciała, białka lub peptydu z innym elementem chemicznym, w znaczeniu, że oddziaływanie zależy od obecności szczególnej struktury (np. determinanty antygenowej lub epitopu) na elemencie chemicznym, na przykład przeciwciało rozpoznaje i wiąże się ze specyficzną strukturą białka raczej niż z białkami ogólnie. Jeżeli przeciwciało jest specyficzne dla epitopu „A”, wtedy obecność cząsteczki zawierającej epitop A (lub wolny, nieznakowany A) w reakcji zawierającej znakowany „A” i przeciwciało zmniejszy ilość znakowanego A związanego z przeciwciałem.
Określenie „epitop” oznacza determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania przeciwciała. Epitopy zwykle składają się z aktywnych chemicznie ugrupowań powierzchniowych cząsteczek takich jak aminokwasy lub cukrowe łańcuchy boczne i zwykle mają specyficzne trójwymiarowe cechy strukturalne, jak również specyficzne cechy ładunku. Epitopy konformacyjne i niekonformacyjne rozróżnia się tym, że wiązanie pierwszego, lecz nie drugiego, jest utracone w obecności rozpuszczalników denaturujących.
Przez określenie „stymulacja” rozumie się pierwotną odpowiedź indukowaną przez wiązanie cząsteczki stymulatorowej (np. kompleksu TCR/CD3) z jej pokrewnym ligandem, pośrednicząc w ten sposób w zdarzeniu przekazywania sygnału, takim jak, w sposób nieograniczający, przekazywanie sygnału przez kompleks TCR/CD3. Stymulacja może pośredniczyć w zmienionej ekspresji pewnych cząsteczek, takiej jak hamowanie TGF-β i/lub reorganizacja struktur cytoszkieletu, i tym podobne.
„Cząsteczka stymulatorowa”, jak określenie to zastosowano w niniejszym opisie, oznacza cząsteczkę na komórce T, która specyficznie wiąże się z pokrewnym ligandem stymulatorowym obecnym na komórce prezentującej antygen.
„Ligand stymulatorowy”, jak zastosowano w niniejszym opisie, oznacza ligand, który, gdy obecny na komórce prezentującej antygen (np. aAPC, komórce dendrytycznej, komórce B i tym podobnych), może specyficznie wiązać się z pokrewnym partnerem wiążącym (określanym w niniejszym opisie jako „cząsteczka stymulatorowa”) na komórce T, pośrednicząc w ten sposób w pierwotnej odpowiedzi przez komórkę T, obejmującej, w sposób nieograniczający, aktywację, inicjację odpowiedzi immunologicznej, proliferację i tym podobne. Ligandy stymulatorowe są dobrze znane w dziedzinie i obejmują między innymi cząsteczkę MHC klasy I załadowaną peptydem, przeciwciało anty-CD3, superagonistyczne przeciwciało anty-CD28 i superagonistyczne przeciwciało anty-CD2.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, „zasadniczo oczyszczona” komórka jest komórką, która jest zasadniczo wolna od innych typów komórek. Zasadniczo oczyszczona komórka również dotyczy komórki, którą oddzielono od innych typów komórek, z którymi jest normalnie związana w jej naturalnym stanie występowania. W niektórych przypadkach populacja zasadniczo oczyszczonych komórek dotyczy jednorodnej populacji komórek. W innych przypadkach określenie to dotyczy po prostu komórki, którą oddzielono od komórek, z którymi jest ona naturalnie związana w ich naturalnym stanie. W niektórych aspektach komórki hoduje się in vitro. W innych aspektach komórek nie hoduje się in vitro.
Jak zastosowano w niniejszym opisie, leczenie lub „terapia” jest podejściem do uzyskania korzystnych lub pożądanych rezultatów klinicznych. Dla celów opisanych w niniejszym opisie korzystne lub pożądane rezultaty kliniczne obejmują, w sposób nieograniczający, łagodzenie objawów, zmniejszenie zakresu choroby, ustabilizowanie (tj. niepogorszenie) stanu choroby, opóźnienie lub zwolnienie postępu choroby, polepszenie lub uśmierzenie stanu choroby i remisję (albo częściową, albo całkowitą), albo wykrywalne, albo niewykrywalne. Leczenie i „terapia” może także oznaczać przedłużanie przeżycia w porównaniu z oczekiwanym przeżyciem w przypadku braku otrzymania leczenia lub terapii. Zatem leczenie” lub „terapia” jest interwencją przeprowadzoną z zamiarem zmiany patologii zaburzenia. Specyficznie leczenie lub terapia mogą bezpośrednio zapobiegać, spowalniać lub w inny sposób zmniejszać patologię choroby lub zaburzenia, takiego jak nowotwór, lub mogą czynić komórki bardziej podatnymi na leczenie lub terapię przez inne środki terapeutyczne.
Określenie „terapeutyczny”, jak zastosowano w niniejszym opisie, oznacza leczenie i/lub profilaktykę. Efekt terapeutyczny uzyskuje się poprzez hamowanie, remisję lub wyeliminowanie stanu choroby.
Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” dotyczy ilości danego związku, która wywoła biologiczną lub medyczną odpowiedź tkanki, układu lub osobnika, pożądaną przez naukowca, weterynarza, lekarza lub innego klinicystę. Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” obejmuje ilość związku, która, gdy podawana, jest wystarczająca do zapobiegania rozwojowi lub łagodzenia w pewnym stopniu jednej
PL 240 585 B1 lub większej liczby oznak lub objawów leczonego zaburzenia lub choroby. Terapeutycznie skuteczna ilość różni się w zależności od związku, choroby i jej nasilenia i wieku, wagi itd. leczonego osobnika.
„Leczyć” chorobę, jak określenie to zastosowano w niniejszym opisie, oznacza zmniejszać częstość lub ciężkość co najmniej jednej oznaki lub objawu choroby lub zaburzenia doświadczanego przez osobnika.
Ponadto reżim leczenia osobnika terapeutycznie skuteczną ilością może składać się z pojedynczego podawania lub alternatywnie obejmować serię zastosowań. Długość okresu leczenia zależy od różnych czynników, takich jak nasilenie choroby, wiek osobnika, stężenie środka, responsywność pacjenta na środek lub ich połączenia. Należy również zauważyć, że skuteczne dawkowanie środka stosowane do leczenia może zwiększać lub zmniejszać się w trakcie danego schematu leczenia. Zmiany w dawkowaniu mogą skutkować i stać się widoczne poprzez standardowe testy diagnostyczne znane w dziedzinie. Przeciwciała opisane w niniejszym opisie w aspektach można podawać przed, podczas lub po leczeniu konwencjonalnymi terapiami dla danej choroby lub zaburzenia, takiego jak nowotwór.
Określenie „transfekowany” lub „transformowany” lub „transdukowany”, jak zastosowano w niniejszym opisie, dotyczy sposobu, poprzez który egzogenny kwas nukleinowy przenosi się lub wprowadza się do komórki gospodarza. „Transfekowana” lub „transformowana” lub „transdukowana” komórka jest tą, którą transfekowano, transformowano lub transdukowano egzogennym kwasem nukleinowym. Komórka obejmuje daną pierwotną komórkę i jej potomstwo.
Wyrażenie „pod kontrolą transkrypcyjną” lub „operacyjnie połączony”, jak zastosowano w niniejszym opisie, oznacza, że promotor jest w prawidłowej lokalizacji i orientacji w odniesieniu do polinukleotydu do kontrolowania inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA i ekspresji polinukleotydu.
„Wektor” oznacza daną kompozycję, która zawiera izolowany kwas nukleinowy i którą można zastosować do dostarczania izolowanego kwasu nukleinowego do wnętrza komórki. Liczne wektory są znane w dziedzinie, w tym, w sposób nieograniczający, liniowe polinukleotydy, polinukleotydy związane ze związkami jonowymi lub amfifilowymi, plazmidy i wirusy. Zatem określenie „wektor” obejmuje autonomicznie replikujący się plazmid lub wirusa. Określenie powinno się również interpretować jako obejmujące związki inne niż plazmid i inne niż wirusowe, która ułatwiają przeniesienie kwasu nukleinowego do komórek, takie jak związki polilizyny, liposomy i tym podobne. Przykłady wektorów wirusowych obejmują, w sposób nieograniczający, wektory adenowirusowe, wektory wirusów związanych z adenowirusami, wektory retrowirusowe i tym podobne.
Zakresy: w całym tym ujawnieniu, różne aspekty opisane w niniejszym opisie można prezentować w formacie zakresu. Należy rozumieć, że opis w formacie zakresu służy wyłącznie wygodzie i zwięzłości, i nie należy go interpretować jako sztywne ograniczenie zakresu opisanego w niniejszym opisie. Odpowiednio opis zakresu należy uważać za szczegółowo ujawniający wszystkie możliwe podzakresy jak również poszczególne wartości liczbowe mieszczące się w tym zakresie. Na przykład opis zakresu takiego jak od 1 do 6, należy uważać za szczególnie ujawniający podzakresy takie jak od 1 do 3, od 1 do 4, od 1 do 5, od 2 do 4, od 2 do 6, od 3 do 6 itd., jak również pojedyncze liczby w tym zakresie, na przykład 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 i 6. Stosuje się to bez względu na szerokość zakresu.
Rozumie się, że dowolne aspekty opisane jako „zawierające” pewne składniki mogą również „składać się z” lub „składać się zasadniczo z”, przy czym „składający się z” ma zamknięte lub ograniczające znaczenie i „składający się zasadniczo z” oznacza obejmujący określone składniki, lecz wykluczający inne składniki poza materiałami obecnymi jako zanieczyszczenia, nie dającymi się uniknąć materiałami obecnymi jako wynik sposobów stosowanych do dostarczenia składników i składnikami dodanych w celu innym niż osiągnięcie technicznego efektu opisanego w niniejszym opisie. Na przykład kompozycja zdefiniowana z zastosowaniem wyrażenia „składająca się zasadniczo z” obejmuje dowolny znany farmaceutycznie dopuszczalny dodatek, rozczynnik, rozcieńczalnik, nośnik i tym podobne. Typowo kompozycja składająca się zasadniczo z zestawu składników zawiera mniej niż 5% wagowych, typowo mniej niż 3% wagowe, bardziej typowo mniej niż 1% wagowy niespecyficznych składników.
Rozumie się, że dowolny składnik zdefiniowany w niniejszym opisie jako włączony może być wyraźnie wyłączony z zastrzeganego wynalazku tytułem warunku lub negatywnego ograniczenia.
Podawanie „w połączeniu z” jednego lub większej liczby kolejnych środków terapeutycznych obejmuje podawanie jednoczesne (równoczesne) i kolejne w dowolnej kolejności.
Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza, że związek lub połączenie związków jest kompatybilne z pozostałymi składnikami formulacji do zastosowania farmaceutycznego i że jest ogólnie bezpieczne do podawania ludziom według ustanowionych standardów rządowych, w tym tych opublikowanych przez Agencję Żywności i Leków Stanów Zjednoczonych.
PL 240 585 B1
Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje, w sposób nieograniczający, rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybiczne, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie i tym podobne. Zastosowanie farmaceutycznie dopuszczalnych nośników jest dobrze znane.
Izolowany: „Izolowany” składnik biologiczny (taki jak białko) zasadniczo oddzielono lub oczyszczono z innych składników biologicznych w komórce organizmu, w której naturalnie występuje składnik, tj., chromosomowego i pozachromosomowego DNA i RNA, innych białek i organelli. Białka i peptydy, które „izolowano” obejmują białka i peptydy oczyszczone standardowymi sposobami oczyszczania. Określenie obejmuje również białka i peptydy otrzymane poprzez ekspresję rekombinacyjną w komórce gospodarza, jak również chemicznie syntetyzowane białka i peptydy.
Nowotwór (ang. tumour), jak zastosowano w niniejszym opisie, dotyczy wzrostu i proliferacji wszystkich komórek nowotworowych czy to złośliwych, czy łagodnych i wszystkich przed-nowotworowych i nowotworowych komórek, i tkanek.
Określenia „nowotwór” (ang. cancer, rak) lub „nowotworowy” (rakowy) dotyczy lub opisuje stan fizjologiczny u ssaków, który typowo charakteryzuje się nieustabilizowanym wzrostem komórkowym. Nowotwór do leczenia może być dowolnym typem nowotworu złośliwego i w aspekcie jest rakiem płuc, w tym drobnokomórkowym rakiem płuc i niedrobnokomórkowym rakiem płuc (np. gruczolakorakiem), rakiem trzustki, rakiem okrężnicy (np. rakiem okrężnicy i odbytnicy, takim jak, na przykład gruczolakorak okrężnicy i gruczolak okrężnicy), rakiem przełyku, rakiem płaskonabłonkowym błony śluzowej jamy ustnej, rakiem języka, rakiem żołądka, rakiem wątroby, rakiem nosowej części gardła, nowotworami hematopoetycznymi linii limfoidalnej (np. ostrą białaczką limfocytową, chłoniakiem komórek B, chłoniakiem Burkitta), chłoniakiem innym niż Hodgkina (np. chłoniakiem komórek płaszcza), chorobą Hodgkina, białaczką szpikową (na przykład ostrą białaczką szpikową (AML) lub przewlekłą białaczką szpikową (CML)), ostrą białaczką limfoblastyczną, przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), rakiem pęcherzykowymi tarczycy, zespołem mielodysplastycznym (MDS), nowotworami pochodzenia mezenchymalnego, mięsakiem tkanki miękkiej, tłuszczakomięsakiem, mięsakiem podścieliska przewodu pokarmowego, nowotworem złośliwym osłonki nerwów obwodowych (MPNST), mięsakiem Ewinga, mięsakiem gładkokomórkowym, chrzęstniakomięsakiem mezenchymalnym, mięsakiem limfatycznym, włókniakomięsakiem, mięsakiem prążkowanokomórkowym, czerniakiem, potworniakiem złośliwym, nerwiakiem płodowym, nowotworami mózgu, rdzeniakiem zarodkowym, glejakiem, łagodnym nowotworem skóry (np. rogowiakiem kolczystokomórkowym), rakiem piersi (np. zaawansowanym rakiem piersi), rakiem nerek, nerczakiem zarodkowym, rakiem jajników, rakiem szyjki macicy, rakiem błony śluzowej macicy, rakiem pęcherza moczowego, rakiem prostaty, w tym chorobą zaawansowaną i hormonoopornym rakiem prostaty, rakiem jąder, kostniakomięsakiem, rakiem głowy i szyi, rakiem naskórkowym, szpiczakiem mnogim (np. opornym szpiczakiem mnogim) lub międzybłoniakiem. W aspekcie komórki nowotworowe pochodzą z guza litego. Typowo komórki nowotworowe pochodzą z raka piersi, raka okrężnicy i odbytnicy, czerniaka, raka jajnika, raka trzustki, raka żołądka, raka płuc lub raka prostaty. Bardziej typowo komórki nowotworowe pochodzą z raka prostaty, raka płuc, raka piersi lub czerniaka.
„Środek chemoterapeutyczny” jest związkiem chemicznym przydatnym w leczeniu nowotworu. Przykłady środków chemoterapeutycznych obejmują środki alkilujące, takie jak tiotepa, CYTOXAN™ cyklofosfamid; sulfoniany alkilowe, takie jak busulfan, improsulfan i piposulfan; azyrydyny, takie jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metyloameloaminy, w tym altretamina, trietylenomelamina, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelamina; acetogeniny, takie jak bulatacyna i bulatacynon; kamptotecyny, takie jak topotekan; briostatynę; kalistatynę; CC-1065 i jego syntetyczne analogi adozelesynę, karzelesynę i bizelesynę; kryptoficyny, takie jak kryptoficyna 1 i kryptoficyna 8; dolastatynę; duokarmycyny, takie jak syntetyczne analogi KW-2189 i CB1-TM1; eleuterobinę; pankratystatynę; sarkodyktyny; spongistatynę; iperyty azotowe, takie jak chlorambucyl, chlornafazyna, chlorofosfamid estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, newembichina, fenestryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrosomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna i ranimustyna; antybiotyki, takie jak antybiotyki enedynowe, na przykład kalicheamycyna, szczególnie kalicheamycyna gamma II i kalicheamycyna omega II, dynemycyna, w tym dynemycyna A, bifosfoniany, takie jak klodronian, esperamicyny, chromofor neokarcynostatyny i odpowiednie chromofory chromoporteinowych antybiotyków enedynowych; aklacynomyzyny; aktynomycynę; autramycynę; azaserynę; bleomycyny; kaktynomycynę; karabicynę; karminomycynę; karcynofilinę; 6-diazo-5-okso-L-norleucynę; ADRIAMYCIN™
PL 240 585 B1 doksorubicynę, w tym morfolino-doksorubicynę, cyjanom orfolino-doksorubicynę, 2-pirolino-doksorubicynę i deoksydoksorubicynę; epirubicynę; ezombicynę; idarubicynę; marcelomycynę; mitomycyny, takie jak mitomycyna C, kwas mikofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zinostatyna i zorubicyna; antymetabolity, takie jak metotreksat i 5-fluorouracyl (5-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; analogi puryny, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna i tioguanina; analogi pirymidyny, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina i floksurydyna; androgeny, takie jak kalusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan i testolakton; środki przeciwnadnerczowe, takie jak aminoglutetymid, mitotan i trilostan; środki uzupełniające kwas foliowy, takie jak kwas frolinowy; aceglaton; glikozyd aldofosfamidu; kwas aminolewulinowy; enilouracyl; amsakrynę; bestrabucyl; bizantren; edatraksat; defofaminę; demekolcynę; diazykwon; elfomitynę; octan eliptynium; epotilony; etoglucyd, azotan galu; hydroksymocznik; lentinan; lonidainina; majtansynoidy, takie jak majtansyna i ansamitocyny; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerynę; pentostatynę; fenamet; pirarubicynę; lozoksantron; kwas podofilynowy; 2-etylohydrazyd; prokarbazynę; kompleks polisacharydowy PSKTM; razoksan; ryzoksynę; sizofiran; spirogerman; kwas tenuazonowy; trazykwon; 2,2',2-trichlorotrietyloaminę; trichloroteceny, takie jak toksyna T-2, werakuryna A, rorydyna A i anguidyna; uratan; windezynę; gacytozynę; arabinozyd (Ara-C); taksoidy, takie jak TAXOL™ paklitaksel, ABRAXANE™ wolny od kremoforu, formulacja paklitakselu w postaci nanocząstek z modyfikowaną albuminą, TAXOTERE™ i doksetaksel; chloranbucyl; GEMZAR™ gemcytabinę; 6-tioguaninę; merkaptopurynę; metotreksat; komplesy koordynacyjne platyny, takie jak cisplatyna, oksaliplatyna i karboplatyna; winblastynę; platynę; etopozyd (VP-16); ifosfamid; winkrystynę; NAVELBINE™ winorelbinę; nowantron; tenipozyd; edatreksat; daunomycynę; aminopterynę; kselodę; ibandronat; irynotekany, takie jak CPT-11; inhibitory topoizomerazy, takie jak RFS 2000; difluorometyloomitynę (DMFO); retinoidy, takie jak kwas retinowy; kapecytabinę; i farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne dowolnych z powyższych.
Do tej definicji włączono również środki przeciwhormonalne, które działają tak, by regulować lub hamować działanie hormonów na nowotwory, takie jak antyestrogeny i selektywne modulatory receptorów estrogenów (SERM), w tym na przykład tamoksyfen (w tym NOLVADEX™ tamoksyfen), raloksyfen, droloksyfen, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY117018, onapryston i FARESTON toremifen; inhibitory aromatazy, które hamują enzym aromatazę, który reguluje produkcję estrogenów w gruczołach adrenergicznych, takie jak na przykład 4(5)-imidazole, aminoglutetimid, MEGASE™ octan megestrolu, AROMASIN™ egzemastan, formestan, fadrozol, RIVISOR™ worozol, FEMARA™ letrozol i ARIMIDEX™ anastrozol; i antyandrogeny takie jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelina; jak również troksacytabina (1,3-dioksolanowy analog nukleozydu cytozyny); oligonukleotydy antysensowne, w szczególności te, które hamują ekspresję genów w szlakach przekazywania sygnału zaangażowanych w nieprawidłową proliferację komórek, takich jak na przykład PKC-alfa, Ralf i H-Ras; rybozymy, takie jak inhibitor ekspresji VEGF (np. rybozym ANGIOZYME™) i inhibitor ekspresji HER2; przeciwciała, takie jak przeciwciało anty-VEGF (np. przeciwciało AVASTIN™); szczepionki, takie jak szczepionki do terapii genowej, na przykład szczepionka ALLOVECTIN™, szczepionka LEUVECTIN™ i szczepionka VAXID™; PROLEUKIN™ rIL-2; LURTOTECAN™ inhibitor topoizomerazy 1; AB ARELIX™ rmRH; i farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne dowolnego z powyższych.
W aspektach przeciwciała opisane w niniejszym opisie działają addytywnie lub synergistycznie z innymi konwencjonalnymi terapiami przeciwnowotworowymi.
Do wielu zgłoszeń patentowych, patentów i publikacji odniesiono się tu do wspomagania zrozumienia opisanych aspektów. Każde z tych odniesień włączono w niniejszym opisie w całości przez odniesienie.
Ujawnienie dotyczy kompozycji, sposobów leczenia nowotworu i zastosowania w aspektach guzów litych. Niniejsze ujawnienie dotyczy strategii adoptywnego transferu komórek dla komórek immunologicznych transdukowanych dla ekspresji chimerycznego receptora antygenowego (CAR). CAR są cząsteczkami, które łączą specyficzność opartą na przeciwciele dla pożądanego antygenu (np. antygenu nowotworowego) z domeną wewnątrzkomórkową aktywującą receptor komórek T do generowania białka chimerycznego, które wykazuje specyficzną przeciwnowotworową komórkową aktywność immunologiczną. Terapia komórek T z modyfikowaniem genu obejmuje wprowadzenie kwasu nukleinowego kodującego chimeryczny receptor antygenowy (CAR) do komórki T, przy czym CAR ma specyficzność
PL 240 585 B1 dla antygenu powierzchniowego komórki nowotworowej i zdolność do aktywowania komórki T, hodowanie ex vivo komórki T z wprowadzonym genem w ten sposób uzyskanej i następnie przeniesienie komórki do pacjenta.
Niniejszy wynalazek dotyczy ogólnie zastosowania takich komórek T modyfikowanych genetycznie do trwałej ekspresji CAR specyficznych dla antygenów guza litego, bardziej specyficznie, guzów litych wyrażających antygen CEACAM6, jego fragmenty i/lub epitopy i ich warianty. Komórki T wyrażające CAR nazywa się w niniejszym opisie komórkami CAR-T lub komórkami T modyfikowanymi pod względem CAR. W aspektach niniejszego wynalazku komórka T jest modyfikowana genetycznie do trwałej ekspresji CAR, który łączy domenę rozpoznawania antygenu z sdAb specyficznego dla CEACAM6 z jedną lub większą liczbą wewnątrzkomórkowych domen kostymulatorowych i domen przekazywania sygnału w pojedyncze białko chimeryczne.
Chimeryczny Receptor Antygenowy (CAR)
W jednym aspekcie poddane inżynierii CAR opisano w niniejszym opisie. CAR zawiera ugrupowanie wiążące CEACAM6, które wiąże się z CEACAM6, jego epitopem, jego fragmentem lub wariantami wspomnianych powyżej i ponadto zawiera domenę aktywacyjną komórki immunologicznej. Gdy wyrażane jest przez komórkę immunologiczną, ugrupowanie wiążące CEACAM6 jest lub jest częścią domeny zewnątrzkomórkowej i domena aktywacyjna komórki immunologicznej jest lub jest częścią wewnątrzkomórkowej domeny przekazywania sygnału, typowo łańcucha zeta kompleksu receptora antygenowego komórki T (np. CD3 zeta). Kostymulatorowe regiony przekazywania sygnału mogą również być włączone w domenę wewnątrzkomórkową i są cząsteczkami powierzchni komórki innymi niż receptory antygenowe lub ich ligandy, które są wymagane dla skutecznej odpowiedzi limfocytów na antygen. Ugrupowanie elementu dystansowego (nazywane również ugrupowaniem zawiasowym) typowo jest włączone do domeny zewnątrzkomórkowej dla umożliwiania ugrupowaniu wiążącemu CEACAM6 skutecznego wiązania do jego epitopu. Domeny wewnątrzkomórkowa i zewnątrzkomórkowa są połączone przez domenę transbłonową, która przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną.
Reprezentatywna nieograniczająca struktura CAR zawiera przeciwciało jednodomenowe rozpoznające antygen powierzchniowy CEACAM6 komórki nowotworowej, domenę transbłonową i domenę wewnątrzkomórkową CD3ξ kompleksu TCR, który aktywuje komórkę T (nazywana CAR pierwszej generacji). Sekwencję kwasu nukleinowego takiego przeciwciała jednodomenowego można uzyskać różnymi sposobami, co jest zrozumiałe dla znawcy w dziedzinie. Komórka T wyrażająca CAR bezpośrednio rozpoznaje antygen powierzchniowy komórki nowotworowej niezależnie od ekspresji głównego antygenu zgodności tkankowej klasy I na komórce nowotworowej i w tym samym czasie aktywuje komórkę T i w ten sposób komórka T wyrażająca CAR może skutecznie zabijać komórkę nowotworową.
Dla wzmocnienia zdolności CAR pierwszej generacji do aktywowania komórki T, można wytworzyć CAR drugiej generacji, w których domena wewnątrzkomórkowa CD28, która jest cząsteczką kostymulatorową komórki T, jest połączona z CAR pierwszej generacji. Można również wytworzyć CAR trzeciej generacji, w których domena wewnątrzkomórkowa pochodząca z (na prz ykład) CD137 (4-1BB) lub CD134 (OX40), która jest z nadrodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (TNF) jest połączona tandemowo z CAR pierwszej generacji. Zatem wiele cząsteczek CAR ukierunkowanych na CEACAM6 włączono do niniejszego ujawnienia.
Ugrupowanie wiążące CEACAM6
W typowych aspektach CAR opisany w niniejszym opisie jest specyficzny względem cząsteczki adhezji komórkowej 6 związanej z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6), jego fragmentów, jego epitopów i wariantów dowolnego z powyższych. CEACAM6 jest również znana w dziedzinie jako niespecyficzny reagujący krzyżowo antygen (NCA) lub CD66c. Ugrupowanie wiążące CEACAM6 jest takie, że wiąże się z pożądanym powinowactwem z CEACAM6 niesionym na powierzchni komórki/nowotworu prowadząc do aktywacji komórki immunologicznej, do której je dostarczono do wywołania aktywności cytotoksycznej i uwolnienia cytokin w obrębie mikrośrodowiska nowotworu i dalszej proliferacji.
Sekwencją CEACAM6 może być, w sposób nieograniczający, SEQ ID NO: 7 lub sekwencją zasadniczo do niej identyczną.
PL 240 585 Β1
SEQ ID NO: 7:
MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLAHNLPQNR
1GYSWYKGERVDGNSLIVGYV1GTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQV IKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCEPEVQNTTYLWWVNGQSL PVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQNPASANRSDPVTLNVLYGPDGPTISPSKA NYRPGENLNLSCHAASNPPAQYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQAHNSATGL
NRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI.
W szczególnych aspektach przeciwciało i/lub epitop mogą być tymi opisanymi w US 9,066,986, który włączono w niniejszym opisie w całości przez odniesienie. Specyficznie domena wiążąca CEACAM6 może zawierać przeciwciało 2A3 anty-CEACAM6 lub jego fragment lub wariant. Bez wiązania się teorią, uważa się, że to oddziaływanie przeciwciało/epitop ma korzystny poziom powinowactwa (nie zbyt wysoki i nie zbyt niski), tak że przeciwciało może wiązać epitop na pierwszej komórce i aktywować zabijanie komórki, następnie przemieszczać się do wiązania kolejnego epitopu na drugiej lub kolejnej komórce i aktywować dalsze zabijanie komórki.
Zatem w niniejszym opisie opisano również CAR zawierający, w obrębie ugrupowania wiążącego CEACAM6, region determinujący komplementarność (CDR) 1 zawierający sekwencję GRTNSVYTMG (SEQ ID NO: 1); CDR2 zawierający sekwencję IMWGAGTNTHYADSVKG (SEQ ID NO: 2); i CDR3 zawierający sekwencję AANRGIPIAGROYDY (SEQ ID NO: 3), przy czym przeciwciało lub jego fragment jest specyficzny dla CEACAM6. Ugrupowanie wiążące CEACAM6, jak właśnie opisano, może rozpoznawać i wiązać się z epitopem zawierającym lub składającym się z sekwencji NRIGYSWYKG (SEQIDNO:6).
W specyficznym nieograniczającym przykładzie, przeciwciało lub jego fragment może zawierać sekwencję o SEQ ID NO: 4 lub sekwencję zasadniczo do niej identyczną.
SEQ ID NO: 4:
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTMGWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNT HYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQV TVSS.
Określenia „przeciwciało” i „fragment przeciwciała” („jego fragment”) są takie jak zdefiniowano powyżej. Jak wcześniej stwierdzono, przeciwciałem lub jego fragmentem może być sdAb. sdAb może pochodzić z wielbłądowatych (np. z gatunku Camelidae) lub może pochodzić z Vhh wielbłądowatych i może być na bazie regionów zrębu wielbłądowatych; alternatywnie, CDR opisany powyżej może być przeszczepiony na regiony zrębu Vnar, Vhh lub Vl. W jeszcze innej alternatywie pętle hiperzmienne opisane powyżej można przeszczepiać na regiony zrębu innych typów fragmentów przeciwciała (Fv, scFv, Fab).
Niniejszy aspekt ponadto obejmuje fragment przeciwciała, który jest „humanizowany” z zastosowaniem dowolnego odpowiedniego sposobu znanego w dziedzinie, na przykład lecz w sposób nieograniczający przeszczepianie CDR i pokrywanie. Humanizowanie przeciwciała lub fragmentu przeciwciała obejmuje zastąpienie aminokwasu w sekwencji jego ludzkim odpowiednikiem, jaki stwierdza się w ludzkiej sekwencji konsensusowej, bez utraty zdolności do wiązania antygenu lub specyficzności; podejście to zmniejsza immunogenność przeciwciała lub jego fragmentu, gdy wprowadzane do osobników ludzkich. W sposobie przeszczepiania CDR, jeden lub większą liczbę CDR łańcuchów ciężkich zdefiniowanych w niniejszym opisie można połączyć lub przeszczepić na ludzki region zmienny (Vh lub Vl) lub na inne regiony zrębu fragmentu ludzkiego przeciwciała (Fv, scFv, Fab). W takim przypadku konformacja wspomnianej jednej lub większej liczby pętli hiperzmiennych jest zachowana, a powinowactwo i specyficzność sdAb dla jego celu (tj., toksyn A i B) są również zachowane.
Przeszczepianie CDR opisano co najmniej w następujących: patent U.S. nr 6,180,370, patent U.S. nr 5,693,761, patent U.S. nr 6,054,297, patent U.S. nr 5,859,205 i patent europejski nr 626390 (których ujawnienie włączono tu w całości przez odniesienie). Pokrywanie (ang. veneering, zastępowanie), nazywane również w dziedzinie jako „ponowne pokrycie regionu zmiennego”, obejmuje humanizowanie pozycji przeciwciała lub fragmentu eksponowanych na rozpuszczalnik; zatem schowane reszty niehumanizowane, które mogą być ważne dla konformacji CDR, są zachowane, podczas gdy zminimalizowano potencjał dla reakcji immunologicznej przeciwko regionom eksponowanym na rozpuszczalnik.
PL 240 585 B1
Pokrywanie opisano co najmniej w następujących: patent U.S. nr 5,869,619, patent U.S. nr 5,766,886, patent U.S. nr 5,821,123 i patent europejski nr 519596 (których ujawnienie włączono tu w całości przez odniesienie). Znawcy w dziedzinie dokładnie znają sposoby otrzymywania takich humanizowanych fragmentów przeciwciała.
Zasadniczo identyczna sekwencja może zawierać jedną lub większą liczbę zachowanych mutacji aminokwasowych. Wiadomo w dziedzinie, że jedna lub większa liczba zachowanych mutacji aminokwasowych względem sekwencji odniesienia może dawać zmutowany peptyd bez zasadniczej zmiany we własnościach fizjologicznych, chemicznych lub funkcjonalnych w porównaniu z sekwencją odniesienia; w takim przypadku, sekwencje odniesienia i zmutowaną uważa się za „zasadniczo identyczne” polipeptydy. Konserwatywna mutacja aminokwasowa może obejmować addycję, delecję lub podstawienie aminokwasu; konserwatywne podstawienie aminokwasowe zdefiniowano w niniejszym opisie jako podstawienie reszty aminokwasowej na inną resztę aminokwasową o podobnych własnościach chemicznych (np. wielkości, ładunku lub polarności).
W nieograniczającym przykładzie konserwatywną mutacją może być podstawienie aminokwasowe. Takie konserwatywne podstawienie aminokwasowe może podstawiać aminokwas zasadowy, obojętny, hydrofobowy lub kwasowy na inny z tej samej grupy. Przez określenie „zasadowy aminokwas” rozumie się aminokwasy hydrofilowe mające wartość pK łańcucha bocznego wynoszącą więcej niż 7, które są typowo naładowane dodatnio w fizjologicznym pH. Aminokwasy zasadowe obejmują histydynę (His lub H), argininę (Arg lub R) i lizynę (Lys lub K). Przez określenie „aminokwas obojętny” (również „aminokwas polarny”) rozumie się aminokwasy hydrofilowe mające łańcuch boczny, który jest nienaładowany w fizjologicznym pH, lecz który ma co najmniej jedno wiązanie, w którym para elektronów wspólna dla dwóch atomów jest utrzymywana bliżej przez jeden z atomów. Aminokwasy polarne obejmują serynę (Ser lub S), treoninę (The lub T), cysteinę (Cys lub C), tyrozynę (Tyr lub Y), asparaginę (Asn lub N) i glutaminę (Gln lub Q). Określenie „aminokwas hydrofobowy” (również „aminokwas niepolarny”) obejmuje aminokwasy wykazujące hydrofobowość większą niż zero według normalizowanej konsensusowej skali hydrofobowości Eisenberga (1984). Aminokwasy hydrofobowe obejmują prolinę (Pro lub P), izoleucynę (Ile lub I), fenyloalaninę (Phe lub F), walinę (Val lub V), leucynę (Leu lub L), tryptofan (Trp lub W), metioninę (Met lub M), alaninę (Ala lub A) i glicynę (Gly lub G). „Aminokwas kwasowy” dotyczy aminokwasów hydrofilowych mających wartość pK łańcucha bocznego wynoszącą mniej niż 7, które są typowo naładowane ujemnie w fizjologicznym pH. Aminokwasy kwasowe obejmują glutaminian (Glu lub E) i asparaginian (Asp lub D).
Identyczność sekwencji stosuje się do oceny podobieństwa dwóch sekwencji; określa się ją przez obliczenie procentu reszt, które są takie same, gdy dwie sekwencje dopasowuje się (uliniowuje się) dla maksymalnego odpowiadania sobie między pozycjami reszt. Dowolny znany sposób można zastosować do obliczenia identyczności sekwencji, na przykład dostępne jest oprogramowanie komputerowe do obliczania identyczności sekwencji. Nie ograniczając, identyczność sekwencji można obliczyć przez oprogramowanie, takie jak serwis NCBIBLAST2 utrzymywany przez Szwajcarski Instytut Bioinformatyki (i do znalezienia w ca.expasy.org/tools/blast/), BLAST-P, Blast-N lub FASTA-N lub dowolne inne odpowiednie oprogramowanie, które jest znane w dziedzinie.
Zasadniczo identyczne sekwencje mogą być co najmniej w 85% identyczne; w innym przykładzie zasadniczo identyczne sekwencje mogą być w co najmniej 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 lub 100% (lub dowolnym procencie pomiędzy) identyczne na poziomie aminokwasowym z sekwencjami opisanymi w niniejszym opisie. Co ważne, zasadniczo identyczne sekwencje utrzymują aktywność i specyficzność sekwencji odniesienia. W nieograniczającym aspekcie różnica w identyczności sekwencji może być ze względu na mutację(e) aminokwasową(e).
Przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment może również zawierać dodatkowe sekwencje do wspomagania ekspresji, wykrywania lub oczyszczania rekombinowanego przeciwciała lub jego fragmentu. Można zastosować dowolne takie sekwencje lub tagi znane znawcom w dziedzinie. Na przykład w sposób nieograniczający przeciwciało lub jego fragment mogą zawierać sekwencję ukierunkowującą lub sygnałową (na przykład, w sposób nieograniczający, ompA), tag (ang. tag, etykieta, wyróżnik, znacznik) do wykrywania, przykładowe kasety tagów obejmują Strep tag lub jego dowolny wariant; patrz, np. patent U.S. nr 7,981,632, His tag, Flag tag mający motyw sekwencji DYKDDDDK, Xpress tag, Avi tag, tag kalmoduliny, tag poliglutaminianu, HA tag, Myc tag, Nus tag, S tag, SBP tag, Softag 1, Softag 3, V5 tag, białko wiążące CREB (CBP), S-transferazę glutationu (GST), białko wiążące maltozę (MBP), zielone białko fluorescencyjne (GFP), tag tioredoksyny lub ich dowolne połączenia; tag do oczyszczania (na przykład w sposób nieograniczający, His5 lub His6) lub ich połączenia.
PL 240 585 B1
W innym przykładzie dodatkową sekwencją może być miejsce rozpoznawania biotyny, takie jak to opisane przez Cronan et al w WO 95/04069 lub Voges et al w WO/2004/076670. Jak wiadomo znawcom w dziedzinie, sekwencje łącznikowe można zastosować w połączeniu z dodatkowymi sekwencjami lub tagami.
Bardziej specyficznie kaseta taga może zawierać składnik zewnątrzkomórkowy, który specyficznie wiąże się z przeciwciałem z wysokim powinowactwem lub awidnością. W obrębie struktury pojedynczego łańcucha białka fuzyjnego, kaseta taga może lokalizować się (a) bezpośrednio amino-końcowo względem regionu złącza, (b) umieszczona pomiędzy łączącymi modułami łącznikowymi, (c) bezpośrednio karboksy-końcowo względem domeny wiążącej, (d) umieszczona pomiędzy i łącząca domenę wiążącą (np. scFv) z domeną efektorową, (e) umieszczona pomiędzy i łącząca podjednostki domeny wiążącej lub (f) na końcu aminowym białka fuzyjnego pojedynczego łańcucha. W pewnych przykładach wykonania jeden lub większa liczba łączących aminokwasów może być umieszczona pomiędzy i łączyć kasetę taga z częścią hydrofobową lub umieszczona pomiędzy, i łączyć kasetę taga z regionem złącza lub umieszczona pomiędzy, i łączyć kasetę taga z modułem łącznikowym lub umieszczona pomiędzy, i łączyć kasetę taga z domeną wiążącą.
Domena transbłonowa
W szczególnych aspektach CAR zawiera domenę transbłonową, która łączy się z domeną zewnątrzkomórkową i domeną wewnątrzkomórkową CAR. W jednym aspekcie zastosowano domenę transbłonową, która naturalnie łączy się z jedną z domen w CAR. W niektórych przykładach domena transbłonowa może być wybrana lub modyfikowana przez podstawienie aminokwasowe dla uniknięcia wiązania takich domen z domenami transbłonowymi tego samego lub innych białek powierzchni błony dla zminimalizowania oddziaływań z innymi członkami kompleksu receptora.
Domena transbłonowa może pochodzić z naturalnego lub z syntetycznego źródła. Gdy źródło jest naturalne, domena może pochodzić z dowolnego białka związanego z błoną lub transbłonowego. Regiony transbłonowe o szczególnym zastosowaniu w tym ujawnieniu mogą pochodzić z (tj., zawierać co najmniej region(y) transbłonowy(e)) łańcucha alfa, beta lub zeta receptora komórki T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Typowo, domeną transbłonową w CAR opisanym w niniejszym opisie jest domena transbłonową CD28.
Alternatywnie domena transbłonowa może być syntetyczna, w którym to przypadku zawiera przeważnie reszty hydrofobowe, takie jak leucyna i walina. Typowo triplet fenyloalaniny, tryptofanu i waliny stwierdza się na każdym końcu syntetycznej domeny transbłonowej. Opcjonalnie krótki łącznik oligolub polipeptydowy, typowo między 2 i 10 aminokwasów długości może tworzyć wiązanie między domeną transbłonową i cytoplazmatyczną domeną przekazywania sygnału CAR. Dublet glicyny-seryny dostarcza szczególnie odpowiedni łącznik.
Domena elementu dystansowego
Między domeną zewnątrzkomórkową i domeną transbłonową CAR lub między domeną cytoplazmatyczną i domeną transbłonową CAR można wprowadzić domenę elementu dystansowego (ang. spacer domain), nazywaną również domeną zawiasową. Jak zastosowano w niniejszym opisie, określenie „domena elementu dystansowego” na ogół oznacza dowolny oligo- lub polipeptyd, który funkcjonuje do połączenia domeny transbłonowej do albo domeny zewnątrzkomórkowej albo domeny cytoplazmatycznej w łańcuchu polipeptydowym i podnosi domenę wiążącą CEACAM6 z powierzchni komórki. Domena elementu dystansowego może zawierać do 300 aminokwasów, typowo od 10 do 100 aminokwasów i najbardziej typowo od 25 do 50 aminokwasów. Element dystansowy może zawierać jeden z następujących, na przykład: ludzką domenę Fc IgG1; zawias IgG1; zawias IgG1-trzon CD8; trzon CD8; zawias IgG1-trzon CD28 i trzon CD28.
Domena cytoplazmatyczna
Domena cytoplazmatyczna lub inaczej wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału CAR opisanego w niniejszym opisie jest odpowiedzialna za aktywację co najmniej jednej z prawidłowych funkcji efektorowych komórki immunologicznej, w której umieszczono CAR. Określenie „funkcja efektorowa” dotyczy wyspecjalizowanej funkcji komórki. Funkcja efektorowa komórki T, na przykład może być aktywnością cytolityczną lub aktywnością pomocniczą obejmującą wydzielanie cytokin. Zatem określenie „wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału” dotyczy części białka, które przekazuje sygnał funkcji efektorowej i ukierunkowuje komórkę do wykonania wyspecjalizowanej funkcji. Podczas gdy
PL 240 585 B1 zwykle można wykorzystać całą wewnątrzkomórkową domenę przekazywania sygnału, w wielu przypadkach nie jest konieczne zastosowanie całego łańcucha. W stopniu w jakim stosuje się skróconą część wewnątrzkomórkowej domeny przekazywania sygnału, taką skróconą część można zastosować w miejsce nienaruszonego łańcucha dopóki przekazuje ona sygnał funkcji efektorowej. Określenie wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zatem obejmuje dowolną skróconą część wewnątrzkomórkowej domeny przekazywania sygnału wystarczającą do przekazywania sygnału funkcji efektorowej.
Typowe przykłady wewnątrzkomórkowych domen przekazywania sygnału do zastosowania w CAR opisanych w niniejszym opisie obejmują sekwencje cytoplazmatyczne receptora komórki T (TCR) i koreceptory, które działają razem do inicjowania przekazywania sygnału po zaangażowaniu receptora antygenu, jak również dowolne pochodne lub warianty tych sekwencji i dowolną sekwencję syntetyczną, która ma taką samą zdolność funkcjonalną.
Pierwotne cytoplazmatyczne sekwencje przekazywania sygnału regulują pierwotną aktywację kompleksu TCR albo w sposób stymulatorowy lub w sposób hamujący. Pierwotne cytoplazmatyczne sekwencje przekazywania sygnału, które działają w sposób stymulatorowy mogą zawierać motywy przekazywania sygnału, które są znane jako aktywujące motywy immunoreceptora na bazie tyrozyny lub ITAM.
Przykłady ITAM zawierających pierwotne cytoplazmatyczne sekwencje przekazywania sygnału, które mają szczególne zastosowanie w wynalazku, obejmują te pochodzące z TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, ‘CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. Szczególnie typowe jest, że cytoplazmatyczna cząsteczka przekazywania sygnału w CAR opisana w niniejszym opisie zawiera cytoplazmatyczną sekwencję przekazywania sygnału pochodzącą z CD3 zeta.
W typowym aspekcie domena cytoplazmatyczną CAR może być zaprojektowana tak, żeby zawierała samą domenę przekazywania sygnału CD3-zeta lub połączoną z dowolną(ymi) inną(ymi) domeną(ami) cytoplazmatyczną(ymi) przydatnymi w kontekście CAR opisanych w niniejszym opisie. Na przykład domena cytoplazmatyczna CAR może zawierać część łańcucha CD3 zeta i jeden lub większą liczbę kostymulatorowych regionów przekazywania sygnału. Kostymulatorowy region przekazywania sygnału dotyczy części CAR zawierającej domenę wewnątrzkomórkową cząsteczki kostymulatorowej. Cząsteczka kostymulatorowa jest cząsteczką powierzchni komórki inną niż receptor antygenowy lub ich ligandy, która jest wymagana dla skutecznej odpowiedzi limfocytów na antygen. Przykłady takich cząsteczek obejmują CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antygen 1 związany z funkcją limfocytu (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 i ligand, który specyficznie wiąże się z CD83 i tym podobne.
Cytoplazmatyczne sekwencje przekazywania sygnału w obrębie cytoplazmatycznej części przekazywania sygnału CAR opisanego w niniejszym opisie można połączyć ze sobą w kolejności losowej lub określonej. Opcjonalnie krótki łącznik oligo- lub polipeptydowy, typowo między 2 i 10 aminokwasów długości może tworzyć wiązanie. Dublet glicyny-seryny dostarcza szczególnie odpowiedni łącznik.
W jednym aspekcie domenę cytoplazmatyczną zaprojektowano tak, aby zawierała domenę przekazywania sygnału CD3-zeta i domenę przekazywania sygnału CD28. W innym aspekcie domenę cytoplazmatyczną zaprojektowano tak, aby zawierała domenę przekazywania sygnału CD3-zeta i domenę przekazywania sygnału 4-1BB. W jeszcze innym aspekcie domenę cytoplazmatyczną zaprojektowano tak, aby zawierała domenę przekazywania sygnału CD3-zeta i domenę przekazywania sygnału CD28 i 4-1BB.
W jednym aspekcie domenę cytoplazmatyczną w CAR opisanym w niniejszym opisie zaprojektowano tak, aby zawierała domenę przekazywania sygnału CD28 i/lub 4-1BB i domenę przekazywania sygnału CD3-zeta.
W odniesieniu do domeny cytoplazmatycznej, CAR może być zaprojektowany tak, żeby zawierał samą domenę przekazywania sygnału CD28 i/lub 4-1BB lub był połączony z dowolną(ymi) inną(ymi) pożądaną(ymi) domeną(ami) cytoplazmatyczną(ymi) przydatnymi w kontekście CAR. W jednym z przykładów wykonania domena cytoplazmatyczną CAR może być zaprojektowana tak, aby ponadto zawierała domenę przekazywania sygnału CD3-zeta. Na przykład domena cytoplazmatyczna CAR może obejmować, w sposób nieograniczający moduły przekazywania sygnału CD3-zeta, 4-1BB i CD28 i ich połączenia. Odpowiednio dostarczone są komórki T CAR i sposoby ich zastosowania do terapii adoptywnej.
PL 240 585 B1
Wektory
W niniejszym opisie opisano wektory, do których wstawiono DNA według niniejszego wynalazku. Wektory pochodzące z retrowirusów, takich jak lentiwirusy, są odpowiednimi narzędziami do osiągnięcia długoterminowego transferu genu, ponieważ umożliwiają długoterminową trwałą integrację transgenu i jego propagację w komórkach potomnych. Wektory lentiwirusowe mają dodaną korzyść względem wektorów pochodzących z onko-retrowirusów, takich jak wirusów białaczki mysiej polegającą na tym, że mogą transdukować komórki nieproliferujące, takie jak hepatocyty. Mają one również dodaną korzyść niskiej immunogenności.
Krótko podsumowując, ekspresję naturalnych lub syntetycznych kwasów nukleinowych kodujących CAR typowo osiąga się przez operacyjne połączenie kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd CAR lub jego części z promotorem i wbudowanie konstruktu do wektora ekspresyjnego. Wektory mogą być odpowiednie do replikacji i integracji u eukariontów. Typowe wektory do klonowania zawierają terminatory transkrypcji i translacji, sekwencje inicjacji i promotory przydatne do regulacji ekspresji pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego.
Konstrukty ekspresyjne według niniejszego wynalazku można również zastosować do immunizacji kwasem nukleinowym i terapii genowej, stosując standardowe protokoły dostarczania genu. Sposoby dostarczania genu są znane w dziedzinie. Patrz np. patenty U.S. nr 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466, włączone w ich całości w niniejszym opisie przez odniesienie. W innym aspekcie wynalazek dostarcza wektor do terapii genowej.
Kwas nukleinowy może być klonowany do wielu typów wektorów. Na przykład kwas nukleinowy można wklonować do wektora, obejmującego, w sposób nieograniczający, plazmid, fagmid, pochodną faga, wirusa zwierzęcego i kosmidu. Wektory będące przedmiotem szczególnego zainteresowania obejmują wektory ekspresyjne, wektory do replikacji, wektory do generowania sond i wektory do sekwencjonowania.
Ponadto, wektor ekspresyjny można dostarczać do komórki w postaci wektora wirusowego.
Technologia wektora wirusowego jest dobrze znana w dziedzinie i opisana, na przykład w Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork) i w innych podręcznikach wirusologii i biologii molekularnej. Wirusy, które są przydatne jako wektory obejmują, w sposób nieograniczający, retrowirusy, adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami, herpeswirusy i lentiwirusy. Ogólnie, odpowiedni wektor zawiera początek replikacji funkcjonalny w co najmniej jednym organizmie, sekwencję promotorową, dogodne miejsca dla endonukleazy restrykcyjnej i jeden lub większą liczbę markerów selekcyjnych (np. WO 01/96584; WO 01/29058; i patent U.S. nr 6,326,193, których ujawnienie włączono tu w całości przez odniesienie.
Liczne systemy na bazie wirusowej opracowano dla przeniesienia (transferu) genu do komórek ssaczych. Na przykład retrowirusy dostarczają dogodną platformę dla systemów dostarczania genu. Wybrany gen można wstawiać do wektora i zapakować do cząstek retrowirusowych z zastosowaniem technik znanych w dziedzinie. Rekombinowanego wirusa można następnie izolować i dostarczać do komórek osobnika in vivo lub ex vivo. W dziedzinie znane są liczne systemy retrowirusowe. W niektórych aspektach stosuje się wektory adenowirusowe. W dziedzinie znane są liczne systemy adenowirusowe. W jednym aspekcie stosuje się wektory lentiwirusowe.
Dodatkowe elementy promotorowe, np. sekwencje wzmacniające (enhancery), regulują częstość inicjacji transkrypcyjnej. Typowo lokalizują się one w regionie 30-110 pz powyżej miejsca początku (startu), chociaż wykazano ostatnio, że liczne promotory zawierają elementy funkcjonalne również poniżej miejsca początku. Odległość między elementami promotorowymi często jest elastyczna, tak że zachowana jest funkcja promotora, gdy elementy są odwrócone lub przemieszczone względem siebie nawzajem. W promotorze kinazy tymidynowej (tk) odległość między elementami promotorowymi może być zwiększona do 50 pz przed rozpoczęciem spadania aktywności. W zależności od promotora, wydaje się, że pojedyncze elementy mogą funkcjonować albo wspólnie albo niezależnie do aktywowania transkrypcji.
Jednym przykładem odpowiedniego promotora jest sekwencja natychmiastowego wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV, wirusa cytomegalii). Ta sekwencja promotorowa jest sekwencją silnego konstytutywnego promotora zdolnego do napędzania wysokich poziomów ekspresji dowolnej sekwencji polinukleotydowej operacyjnie z nią połączonej. Innym przykładem odpowiedniego promotora jest czynnik elongacji 1α (EF-1a). Jednak można również zastosować inne sekwencje promotora konstytutywnego, w tym, w sposób nieograniczający, wczesnego promotora wirusa małpiego 40 (SV40), mysiego wirusa nowotworu sutka (MMTY), promotora długich końcowych powtórzeń (LTR) ludzkiego
PL 240 585 B1 wirusa niedoboru odporności (HIV), promotora MoMuLV, promotora wirusa białaczki ptasiej, natychmiastowego wczesnego promotora wirusa Epsteina-Barra, promotora wirusa mięsaka Rousa, jak również promotorów ludzkich genów, takich jak, w sposób nieograniczający, promotora aktyny, promotora miozyny, promotora hemoglobiny i promotora kinazy kreatynowej. Ponadto, wynalazek nie powinien ograniczać się do zastosowania promotorów konstytutywnych. Promotory indukowalne również rozważa się jako część opisaną w niniejszym opisie. Zastosowanie indukowalnego promotora dostarcza przełączenia cząsteczki zdolnego do włączenia ekspresji sekwencji polinukleotydowej, z którą jest operacyjnie powiązana, gdy ekspresja jest pożądana lub wyłączenia ekspresji, gdy ekspresja nie jest pożądana. Przykłady promotorów indukowalnych obejmują, w sposób nieograniczający, promotor metalotioniny, promotor glukokortykoidu, promotor progesteronu i promotor tetracykliny.
Dla oceny ekspresji polipeptydu CAR lub jego części, wektor ekspresyjny do wprowadzenia do komórki może również zawierać gen markera selekcyjnego lub gen reporterowy lub oba dla ułatwienia identyfikacji i selekcji komórek wyrażających z populacji komórek, które powinny być transfekowane lub zakażone przez wektory wirusowe. W innych aspektach marker selekcyjny może być niesiony na oddzielnym kawałku DNA i stosowany w procedurze kotransfekcji. Oba geny markerów selekcyjnych i reporterowe mogą być flankowane odpowiednimi sekwencjami regulatorowymi do umożliwienia ekspresji w komórkach gospodarza. Przydatne markery selekcyjne obejmują, na przykład geny oporności na antybiotyki, takie jak neo i tym podobne.
Geny reporterowe stosuje się do identyfikowania potencjalnie transfekowanych komórek do oceny funkcjonalności sekwencji regulatorowych. Ogólnie, gen reporterowy jest genem, który nie jest obecny w lub wyrażany przez organizm lub tkankę biorcy, i który koduje polipeptyd, którego ekspresja manifestuje się przez pewną łatwo wykrywalną własność, np. aktywność enzymatyczną. Ekspresję genu reporterowego bada się w odpowiednim czasie po wprowadzeniu DNA do komórek biorcy. Odpowiednie geny reporterowe mogą obejmować geny kodujące lucyferazę, beta-galaktozydazę, acetylotransferazę chloramfenikolu, wydzielaną fosfatazę alkaliczną lub gen zielonego białka fluorescencyjnego (np. Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Odpowiednie systemy ekspresji są dobrze znane i można je otrzymywać z zastosowaniem znanych technik lub uzyskać komercyjnie. Ogólnie, konstrukt z minimalnym regionem 5’ flankującym wykazujący najwyższy poziom ekspresji genu reporterowego identyfikuje się jako promotor. Takie regiony promotorowe można połączyć z genem reporterowym i stosować do oceny środków pod względem zdolności do modulowania transkrypcji napędzanej promotorem.
Sposoby wprowadzania i ekspresji genów do komórki są znane w dziedzinie. W kontekście wektora ekspresyjnego, wektor można łatwo wprowadzić do komórki gospodarza, np. komórki ssaczej, bakteryjnej, drożdżowej lub owadziej dowolnym sposobem znanym w dziedzinie. Na przykład wektor ekspresyjny można przenieść do komórki gospodarza za pomocą środków fizycznych, chemicznych lub biologicznych.
Sposoby fizyczne do wprowadzenia polinukleotydu do komórki gospodarza obejmują wytrącania fosforanem wapnia, lipofekcję, bombardowanie cząstkami, mikroiniekcję, elektroporację i tym podobne. Sposoby wytwarzania komórek zawierających wektory i/lub egzogenne kwasy nukleinowe są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, na przykład Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork). Typowym sposobem do wprowadzania polinukleotydy do komórki gospodarza jest transfekcja fosforanem wapnia.
Sposoby biologiczne wprowadzania polinukleotydu będącego przedmiotem zainteresowania do komórki gospodarza obejmują zastosowanie wektorów DNA i RNA. Wektory wirusowe i szczególnie wektory retrowirusowe stały się najszerzej stosowanym sposobem wprowadzania genów do komórek ssaczych, np. ludzkich. Inne wektory wirusowe mogą pochodzić z lentiwirusa, wirusów ospy, wirusa opryszczki pospolitej I, adenowirusów i wirusów związanych z adenowirusami i tym podobnych. Patrz na przykład patenty U.S. nr 5,350,674 i 5,585,362.
Środki chemiczne do wprowadzania polinukleotydu do komórki gospodarza obejmują systemy dyspersji koloidalnej, takie jak kompleksy makrocząsteczkowe, nanokapsułki, mikrosfery, kulki i systemy na bazie lipidów, w tym emulsje olej w wodzie, micelle, mieszane micelle i liposomy. Przykładowym systemem koloidalnym do zastosowania jako nośnik dostarczania in vitro i in vivo jest liposom (np. sztuczny pęcherzyk błonowy).
W przypadku, gdy wykorzystuje się inny niż wirusowy system dostarczania, przykładowym nośnikiem dostarczania jest liposom. Zastosowanie formulacji lipidowych rozważa się do wprowadzenia kwasów nukleinowych do komórki gospodarza (in vitro, ex vivo lub in vivo). W innym aspekcie kwas nukleinowy może być związany z lipidem. Kwas nukleinowy związany z lipidem może być kapsułkowany
PL 240 585 B1 w wodnym wnętrzu liposomu, rozrzucony w obrębie dwuwarstwy lipidowej liposomu, przyłączony do liposomu przez cząsteczkę łączącą, która wiąże się zarówno z liposomem jak i oligonukleotydem, zamknięty w liposomie, kompleksowany liposomem, rozproszony w roztworze zawierającym lipid, mieszany z lipidem, połączony z lipidem, zawarty jako zawiesina w lipidzie, zawarty lub kompleksowany micellą lub w inny sposób związany z lipidem. Kompozycje związane z lipidem, lipidem/DNA lub lipidem/wektorem ekspresyjnym nie ograniczają się do żadnej poszczególnej struktury w roztworze. Na przykład mogą być obecne w strukturze dwuwarstwy jako micelle lub o strukturze „zapadniętej”. Mogą być również po prostu rozrzucone w roztworze, możliwie tworząc agregaty, które nie są jednorodne pod względem wielkości lub kształtu. Lipidy są substancjami tłuszczowymi, które mogą być naturalnie występującymi lub syntetycznymi lipidami. Na przykład lipidy obejmują tłuste kropelki, które naturalnie występują w cytoplazmie, jak również jako klasa związków, która zawiera długołańcuchowe węglowodory alifatyczne i ich pochodne, takie jak kwasy tłuszczowe, alkohole, aminy, alkohole aminowe i aldehydy.
Lipidy odpowiednie do zastosowania można uzyskać ze źródeł komercyjnych. Na przykład dimirystylofosfatydylocholinę („DMPC”) można uzyskać od Sigma, St. Louis, Mo.; fosforan dicetylu („DCP”) można uzyskać od K & K Laboratories (Plainview, N. Y.); cholesterol („Chol”) można uzyskać od Calbiochem-Behring; dimirystlofosfatydyloglicerol („DMPG”) i inne lipidy można uzyskać od Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Roztwory wyjściowe lipidów w chloroformie lub chloroformie/metanolu można przechowywać w około -20 stopniach C. Chloroform stosuje się jako jedyny rozpuszczalnik, ponieważ łatwiej odparowuje niż etanol. „Liposom” jest określeniem generycznym obejmującym różne z pojedynczo- i wielolamelarnych lipidowych nośników poprzez generowanie zamkniętych dwuwarstw lipidowych lub agregatów. Liposomy można charakteryzować jako mające struktury pęcherzykowe z błoną z dwuwarstwy fosfolipidowej i wewnętrznym ośrodkiem wodnym. Liposomy wielolamelarne mają wiele warstw lipidowych oddzielonych przez ośrodek wodny. Tworzą się spontanicznie, gdy fosfolipidy zawiesza się w nadmiarze roztworu wodnego. Składniki lipidowe przechodzą samo-rearanżację przed utworzeniem zamkniętych struktur i zamykają wodę i rozpuszczone substancje rozpuszczone między dwuwarstwami lipidowymi (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Jednak, kompozycje, które mają inne struktury w roztworze niż normalna struktura pęcherzykowa również są objęte. Na przykład lipidy mogą przyjmować strukturę micellarną lub jedynie występować jako niejednorodne agregaty cząsteczek lipidowych. Rozważa się również kompleksy lipofektaminy - kwasu nukleinowego.
Bez względu na zastosowany sposób do wprowadzania egzogennych kwasów nukleinowych do komórki gospodarza lub innej ekspozycji na inhibitor według niniejszego wynalazku, do potwierdzenia obecności rekombinowanej sekwencji DNA w komórce gospodarza, można przeprowadzić różne testy. Takie testy obejmują, na przykład testy „biologii molekularnej” dobrze znane znawcom w dziedzinie, takie jak Southern i Northern blot, RT-PCR i PCR; testy „biochemiczne”, takie jak wykrywanie obecności lub nieobecności poszczególnego peptydu, np. poprzez środki immunologiczne (ELISA i Western blot) lub poprzez testy opisane w niniejszym opisie do identyfikowania środków będących w zakresie opisanym w niniejszym opisie.
System transpozon/transpozaza
Typowe sposoby do wprowadzenia DNA do komórki obejmują odczynniki zagęszczające DNA, takie jak fosforan wapnia, glikol polietylenowy i tym podobne, odczynniki zawierające lipidy, takie jak liposomy, pęcherzyki wielolamelarne i tym podobne, jak również strategie, za pośrednictwem wirusa.
Jednak, wszystkie z tych sposobów mają swoje ograniczenia. Na przykład, istnieją ograniczenia wielkości związane z odczynnikami zagęszczającymi DNA i strategiami, za pośrednictwem wirusa. Ponadto ilość kwasu nukleinowego, którą można transfekować do komórki jest ograniczona w strategiach wirusowych. Nie wszystkie sposoby ułatwiają wprowadzania dostarczanego kwasu nukleinowego do komórkowego kwasu nukleinowego, i podczas gdy sposoby zagęszczania DNA i odczynniki zawierające lipidy są względnie łatwe do otrzymania, wstawienie kwasu nukleinowego do wektorów wirusowych może być pracochłonne. Ponadto strategie za pośrednictwem wirusa mogą być specyficzne względem typu komórki lub typu tkanki i zastosowanie strategii za pośrednictwem wirusa może stwarzać problemy immunologiczne, gdy stosowane in vivo.
Jednym odpowiednim narzędziem do przezwyciężenia tych problemów są transpozony. Transpozony lub elementy transpozonowe obejmują (krótką) sekwencję kwasu nukleinowego z końcowymi sekwencjami powtórzonymi powyżej i poniżej ich. Aktywne transpozony kodują enzymy, które ułatwiają wycinanie i wstawianie kwasu nukleinowego do docelowych sekwencji DNA.
PL 240 585 B1
Obecnie znane są dwie klasy transpozonów, tj., klasa I i klasa II transpozonów.
Klasa I transpozonów, nazywanych również retrotranspozonami lub retropozonami, obejmuje retrotranspozony podobne do retrowirusów i retrotranspozony inne niż podobne do retrowirusów. Działają one przez kopiowanie się i przeklejanie kopii z powrotem do genomu w wielu miejscach. Początkowo retrotraspozony kopiują się do RNA (transkrypcja), lecz, zamiast ulegać translacji, RNA kopiuje się do DNA przez odwrotną transkryptazę (często kodowaną przez sam transpozon) i wstawiane z powrotem do genomu. Typowi przedstawiciele transpozonów klasy I obejmują, np. Copia (Drosophila), Ty 1 (drożdże), THE-1 (człowiek), Bs1 (kukurydza), element F, L1 (człowiek) lub Cin4 (kukurydza).
Jako pierwszy etap, transpozonami klasy II transfekuje się komórki z zastosowaniem standardowych sposobów, jak zakażenie wirusem itd. Następnie, transpozony klasy II, nazywane również „transpozonami tylko z DNA”, przenoszą się przez mechanizm wycięcia i wklejenia, raczej niż kopiowania i wklejenia i w tym mechanizmie stosują enzym transpozazę. Różne typy transpozaz mogą działać na różne sposoby. Niektóre mogą wiązać się z dowolną częścią cząsteczki DNA i miejsce docelowe może lokalizować się w dowolnej pozycji, podczas gdy inne wiążą się ze specyficznymi sekwencjami. Transpozaza następnie tnie miejsce docelowe do wytwarzania lepkich końców, uwalnia transpozon i liguje go z miejscem docelowym. Typowi przedstawiciele klasy II obejmują element P (Drosophila), Ac-Ds (kukurydza), TN3 i IS1 (E. coli), Tam3 (lwia paszcza) itd.
Szczególnie, przy transpozonach klasy II, transpozaza kodowana przez element katalizuje wycinanie transpozonu z jego oryginalnego miejsca i promuje jego wstawienie w innym miejscu w genomie (Plasterk, 1996 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204, 125-143). Autonomicznie członkowie rodziny transpozonów mogą wyrażać aktywną transpozazę, czynnik działający in trans do transpozycji i zatem są zdolne do transpozycji ich samych. Elementy nieautonomiczne mają zmutowane geny transpozazy, lecz mogą utrzymywać sekwencje DNA działające in cis. Te sekwencje DNA działające in cis również nazywa się odwróconymi powtórzeniami końcowymi (IR). Niektóre odwrócone sekwencje powtórzeń mogą obejmować jedną lub większą liczbę bezpośrednich sekwencji powtórzonych. Sekwencje te zwykle osadza się w końcowych odwróconych powtórzeniach (IR) elementów, które są wymagane do mobilizowania w obecności komplementarnej transpozazy z innego elementu. Do tej pory nie wyizolowano ani jednego autonomicznego elementu z kręgowców, z wyjątkiem Tol2 (patrz poniżej); wszystkie sekwencje podobne do transpozonów są defektywne, widocznie jako wynik procesu nazywanego „inaktywacją wertykalną” (Lohe et al., 1995 Mol. Biol. Evol. 12, 62-72). Według jednego modelu filogenetycznego (Hartl et al., 1997 Trends Genet. 13, 197-201), stosunek elementów nieautonomicznych do autonomicznych w genomach eukariotycznych zwiększa się jako wynik trans-komplementarnego charakteru transpozycji. Proces ten prowadzi do stanu, gdzie nieuniknione jest ostateczne zanikanie aktywnych kopii wytwarzających transpozazę w genomie. Konsekwentnie transpozony DNA można postrzegać jako przejściowe składniki genomów, które, aby uniknąć wygaszenia, muszą odnaleźć sposoby do ustanowienia się w nowym gospodarzu. Rzeczywiście, horyzontalne przeniesienie genu między gatunkami uważa się za jeden z ważnych procesów w ewolucji transpozonów (Lohe et al., 1995 powyżej i Kidwell, 1992. Curr. Opin. Genet Dev. 2, 868-873).
Naturalny proces horyzontalnego transferu genów można naśladować w warunkach laboratoryjnych. W roślinach transpozony rodzin Ac/Ds i Spm rutynowo transfekowano do gatunków heterologicznych (Osborne i Baker, 1995 Curr. Opin. Cell Biol. 7, 406-413). W zwierzętach, jednak, główną przeszkodą w transferze aktywnego systemu transpozonów z jednego gatunku do innego jest specyficzność gatunkowa transpozycji ze względu na wymaganie czynników wytwarzanych przez naturalnego gospodarza.
Systemy transpozonów, jak omówiono powyżej, mogą występować w systemach kręgowców i bezkręgowców. U kręgowców odkrycie transpozonów DNA, ruchomych elementów, która przenoszą się przez pośredni DNA, jest względnie niedawne (Radice, A. D., et al., 1994. Mol. Gen. Genet. 244, 606-612). Od tamtej pory, wysoce zmutowane elementy nadrodzin Td/mariner, jak również hAT (hobo/Ac/Tam) transpozonów eukariotycznych były izolowane z genomów różnych gatunków ryb, Xenopus i ludzkich (Oosumi et al., 1995. Nature 378, 873; Ivies et al. 1995. Mol. Gen. Genet. 247, 312322; Koga et al., 1996. Nature 383, 30; Lam et al., 1996. J. Mol. Biol. 257, 359-366 i Lam, W. L., et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 10870-10875).
Zarówno transpozony bezkręgowców jak i kręgowców utrzymują potencjał do transgenezy i mutagenezy insercyjnej w organizmach modelowych. Szczególnie dostępność alternatywnych systemów transpozonowych w tym samym gatunku otwiera nowe możliwości dla analiz genetycznych. Na przykład transpozony piggyBac można mobilizować w Drosophila w obecności stabilnie wstawionych elementów
PL 240 585 B1
P (Hacker et al., (2003), Proc Natl Acad Sci U S A 100, 7720-5.). Ponieważ systemy na bazie elementu P i piggyBac wykazują różne preferencje miejsca wstawienia (Spradling et al. (1995), Proc Natl Acad Sci USA 92, 10824-30, Hacker et al., (2003), Proc Natl Acad Sci USA 100, 7720-5), można znacznie zwiększyć liczbę genów muchy, które można inaktywować insercyjnie przez transpozony. Wektory elementu P również stosowano do wstawiania składników transpozonu mariner do genomu D. melanogaster przez stabilną transformację linii zarodkowej. W tych muchach transgenicznych, transpozycję mariner można badać bez przypadkowej mobilizacji elementów P (Lohe i Hartl, (2002), Genetics 160, 519-26).
U kręgowców obecnie znane są i stosowane trzy aktywne transpozony: element Tol2 z medaka i rekostruowane transpozony typu Śpiącej Królewny (SB) i Żabiego Księcia (FP). Kolejnym interesującym systemem transpozonowym u kręgowców jest system transpozonowy PiggyBac (Ding et al., Cell, 2005).
Element Tol2 jest aktywnym członkiem rodziny transpozonów hAT w medaka (Ryżanka japońska). Odkryto go przez recesywną mutację powodującą fenotyp albinotyczny japońskiej medaka (Oryzias latipes), małej ryby słodkowodnej ze wschodniej Azji. Stwierdzono, że mutacja te jest ze względu na 4,7 kpz długą wstawkę TE do piątego eksonu genu tyrozynazy. Sekwencja DNA elementu, nazywana To/2, jest podobna do transpozonów rodziny hAT, w tym hobo z Drosophila, Acoi kukurydzy i Tam3 lwiej paszczy.
Typ Śpiącej Królewny (SB) jest elementem podobnym do TcI/mariner z ryby i wykazuje wysoką aktywność transpozycyjną w różnych z hodowanych linii komórek kręgowców, zarodkowych komórek macierzystych zarówno z komórek linii somatycznych jak i zarodkowych myszy in vivo.
Również typ Żabiego Księcia (FP) jest elementem podobnym do TcI/mariner, który ostatnio reaktywowano z genomowych kopii transpozonu żaby lamparciej (Rana pipiens). Sposób pułapkowania otwartej ramki odczytu zastosowano do identyfikowania regionów kodujących nieuszkodzoną transpozazę i zasada większości konsensusu tych sekwencji ujawniła aktywny gen transpozazy. Zatem, w przeciwieństwie do procedury „wskrzeszania” SB, względnie młody stan elementów genomowych w Rana pipiens umożliwił ugruntowanie zasady większości konsensusu kopii transpozonu pochodzących z pojedynczego gatunku. Transpozony SB i FP są wyraźnie różne, dzielą jedynie -50% identyczności w ich sekwencjach transpozazy.
Transpozony jak powyżej, szczególnie Tol2, SB i FP, jak również piggyback (Ding et al., Cell 2005), nie oddziałują i zatem można je zastosować jako narzędzie genetyczne w obecności innych, co istotnie rozszerza wykorzystanie tych elementów. Preferencje tych transpozonów do wstawienia do wyrażanych genów względem niekodującego DNA i preferencje dla miejsc wstawienia w obrębie genów mogą być zasadniczo różne. Jeśli tak, różne wzory wstawiania tych systemów transpozonowych można wykorzystywać w sposób komplementarny. Na przykład można zastosować różne systemy transpozonowe do transfekowania kilku transgenów do komórek po kolei, bez przypadkowej lub niepożądanej mobilizacji już wstawionych transgenów. Dodatkowo liczne docelowe loci, które można mutagenizować przez wektory transpozonowe mogą dramatycznie zwiększać się poprzez połączenie różnych systemów transpozonowych w badaniach przesiewowych całych genomów.
Dodatkowo do zmienności w transpozycyjnej aktywności w gospodarzach i różnic w specyficzności względem miejsca docelowego, różne własności strukturalne różnych elementów również mogą być korzystne w pewnych zastosowaniach. Na przykład insercje transpozonu można wykorzystać do nieprawidłowej ekspresji genów i poszukiwania fenotypów uzyskania funkcji. Rorth, P. (1996, A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes. Proc Natl Acad Sci USA 93, 12418-22.) stosuje modyfikowany transpozonowy element P, który niesie promotor indukowalny skierowany z elementu do wymuszenia ekspresji genów gospodarza w pobliżu miejsc insercji transpozonu i wykrywania fenotypów specyficznych względem tkanki. Warunkiem wstępnym takiego ustawienia doświadczalnego jest to, że IR transpozonów umożliwiają odczyt transkrypcji/translacji przez IR.
Jak już wyjaśniono powyżej, transpozony DNA opracowano jako wektory to transferu genów w modelowych organizmach bezkręgowców i ostatnio, również w kręgowcach. Stały się one również silnymi konkurentami systemów retrowirusowych w ludzkiej terapii genowej. Jak wspomniano wcześniej, najbardziej przydatnymi elementami transpozonowymi (TE) do analiz genetycznych i do podejść terapeutycznych są TE klasy II przemieszczające się do genomu gospodarza poprzez mechanizm „wycięcia i wklejenia”, ze względu na ich łatwą obróbkę laboratoryjną i dający się kontrolować charakter. Typ Śpiącej Królewny (poniżej w skrócie jako „SB”) należy do rodziny TcI/mariner transpozonów typu „wycięcia i wklejenia”. Te mobilne elementy DNA są prosto zorganizowane, kodujące białko transpozazę w ich genomie oflankowane przez odwrócone końcowe powtórzenia (ITR). ITR niosą miejsca wiązania
PL 240 585 Β1 transpozazy konieczne do transpozycji. Ich aktywności można łatwo kontrolować poprzez oddzielenie źródła transpozazy od transpozonowego DNA niosącego ITR, tworząc w ten sposób nieautonomiczne TE. W takim dwuskładnikowym systemie, transpozon może przemieszczać się tylko przez fr3/75 uzupełniającej białko transpozazy. Praktycznie dowolną sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania można umieścić między elementami ITR według potrzeb doświadczalnych. Transpozycja skutkuje wycięciem elementu z wektorowego DNA i następnie integrację pojedynczej kopii w nowym środowisku sekwencji.
Na ogół wejście do chromosomu za pośrednictwem transpozonu wydaje się być korzystne względem podejść wirusowych, ponieważ z jednej strony transpozony, jeśli porównywane z systemami wirusowymi, nie faworyzują tak bardzo aktywnych genów i regionów 5’ regulatorowych i zatem nie są tak podatne na mutagenezę, a z drugiej strony ze względu na ich specjalny mechanizm wejścia do chromosomu genu będącego przedmiotem zainteresowania są bardziej kontrolowane fizjologicznie.
Udowodniono już, że SB są cennym narzędziem dla genomiki funkcjonalnej w kilku modelowych organizmach kręgowców (Miskey, C, lzsvak, Z., Kawakami, K. i lvies, Z. (2005); DNA transposons in vertebrate functional genomics. Celi Mol. Life. Sci. 62: 629-641) i są obiecujące dla zastosowań terapii genowej u człowieka (lvies, Z. i lzsvak, Z. (2006). Transposons for gene therapy; Curr. Gene Ther. 6: 593-607). Jednak dla wszystkich z tych zastosowań aktywność transpozycyjna systemu jest kluczową kwestią dla użyteczności i skuteczności. Nawet jeśli funkcjonalna i cenna jak powszechnie wiadomo i opisano, obecnie aktywność transpozazy prawdopodobnie jest jednym z czynników, która nadal powodują ograniczenia systemu SB. Zatem niezwykła poprawa aktywności transpozycyjnej mogłaby przełamać obecne bariery doświadczalne w obu kierunkach.
W aspektach wariant hiperaktywny transpozazy SB10 stosuje się w sposobach opisanych w niniejszym opisie. W szczególnych aspektach wariant hiperaktywny może być tym opisanym w WO 2009/003671, który włączono w niniejszym opisie w całości przez odniesienie. Na przykład polipeptyd wybrany z wariantów transpozazy SB10 zawierającej sekwencję aminokwasową różniącą się od sekwencji natywnej transpozazy SB10 według SEQ ID NO: 8 o 1 do 20 aminokwasów obejmującej co najmniej jedną z poniższych mutacji lub grup mutacji wybranych z K14R, K13D, K13A, K30R, K33A, T83A, I100U R115H, R143L, R147E, A205K/H207V/K208R/D210E; H207V/K208R/D210E; R214D/K215A/E216V/N217Q; M243H; M243O; E267D; T314N; i G317E.
SEQ ID NO: 8 jest następująca:
MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRR VLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLL QNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTI PTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVF QMDNDPKHTSKWAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQL HQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY
Mutacja” lub „mutacje” zdefiniowano w niniejszym opisie jako wymianę 1 lub większej liczby aminokwasów znanej sekwencji aminokwasowej na 1 lub większą liczbę innych aminokwasów, odpowiednio, i możliwie - jeśli specyficznie wskazano - również „grupę mutacji” lub „grupy mutacji”. „Grupa mutacji” lub „grupy mutacji” zdefiniowano w niniejszym opisie jako wymianę grup, np. 3 lub 4 aminokwasów z oryginalnej sekwencji na, odpowiednio, 3 lub 4 inne aminokwasy w identycznych pozycjach. Jako definicję poniższy kod zastosowano do identyfikacji powyższych mutacji. XNrZ” oznacza, że aminokwas „X” oryginalnej sekwencji aminokwasowej w pozycji „Nr” wymieniono na aminokwas „Z”, podczas gdy „XNrY/X'Nr'Z7XNrZ oznacza, że w tej mutacji aminokwasy „X” w pozycji „Nr”, „X”’ w pozycji „Nr”’ i „X”” w pozycji „Nr”” są równocześnie wymienione na aminokwas, odpowiednio, „Z”, „Z”’ i „Z””. Jeśli definiuje się „połączenie mutacji”, „U stosuje się do oddzielenia i wskazania „równoczesnych mutacji” w tym połączeniu, lecz w innym wypadku jest identyczny z pojedynczym ukośnikiem „/”.
W innym typowym aspekcie warianty różnią się o co najmniej 2 lub o co najmniej od 1 do 8, typowo od 2 do 7 powyżej wymienionych mutacji lub grup mutacji, jeszcze bardziej typowo o co najmniej od 4 do 7 w powyżej wymienionych mutacji lub grup mutacji.
W innych wariantach transpozazy SB10 wybrano z wariantów zawierających następujące połączenia mutacji:
PL 240 585 B1 • Wariant 1: K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q;
• Wariant 2: K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
• Wariant 3: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
• Wariant 4: K13D/K33A/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q;
• Wariant 5: K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q;
• Wariant 6: K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E;
• Wariant 7: K14R/T83A/M243Q;
• Wariant 8: K14R/T83A/1100L/M243Q;
• Wariant 9: K14R/T83A/R143L/M243Q;
• Wariant 10: K14R/T83A/R147E/M243Q;
• Wariant 11: K14R/T83A/M243Q/E267D;
• Wariant 12: K14R/T83A/M243Q/T314N;
• Wariant 13: K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217Q//M243H;
• Wariant 14: K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/ N217Q//M243H;
• Wariant 15: K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217Q//M243H;
• Wariant 16: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//
M243H/E267D;
• Wariant 17: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//
M243H/T314N;
• Wariant 18: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//
M243H/G317E;
• Wariant 19: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
• Wariant 20: K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217Q//M243H/T314N;
• Wariant 21: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217 Q//M243H/E267D;
• Wariant 22: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217Q//M243H/T314N;
• Wariant 23: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/
N217Q//M243H/G317E;
• Wariant 24: K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
• Wariant 25: K14R/K33A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
• Wariant 26: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D;
• Wariant 27: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N;
• Wariant 28: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E;
• Wariant 29: K14R/T83A/M243Q/G317E;
• Wariant 30: K13 A/K33A/T83A//R214D/K215 A/E216V/N217Q.
W typowym aspekcie transpozaza jest transpozazą SB100X, która jest zapisana jako wariant 27 na powyższej liście.
Komórki immunologiczne
Przed ekspansją i modyfikacją genetyczną komórek immunologicznych opisanych w niniejszym opisie, źródło komórek immunologicznych uzyskuje się od osobnika. Rozumie się, że można zastosować dowolne źródło komórek immunologicznych i mogą być one autologiczne, allogeniczne, syngeniczne lub ksenogeniczne. W typowych aspektach komórki immunologiczne są autologiczne lub allogeniczne.
Na przykład PBMC można uzyskać dowolnym znanym sposobem i następnie stymulować, aby stały się komórkami CIK, jak opisano w na przykład WO 2016/071513, który włączono w całości poprzez odniesienie. Komórki CIK mogą następnie stać się komórkami CIK CAR. Alternatywnie, komórki T można uzyskać dowolnym znanym sposobem i następnie zastosować do wytworzenia komórek CAR-T.
Czy to przed lub po modyfikacji genetycznej komórek immunologicznych do ekspresji CAR, jak opisano w niniejszym opisie, komórki immunologiczne można aktywować i namnażać na ogół stosując sposoby, jak opisano, na przykład w patentach U.S. nr 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964;
PL 240 585 B1
5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 20060121005; i WO 2016/071513, włączonych w niniejszym opisie przez odniesienie w ich całości.
Zastosowanie terapeutyczne
CAR opisane w niniejszym opisie i komórki immunologiczne wyrażające CAR mogą blokować antygen CEACAM6 i zmniejszać jego inwazyjność. Wiązanie również aktywuje komórkę CAR-T lub komórkę CIK CAR i stymuluje zabijanie przez komórki immunologiczne komórek nowotworowych. Korzyścią tych przeciwciał względem leków stosowanych do chemioterapii jest to, że są bardziej specyficzne wobec nowotworów z nadekspresją antygenu CEACAM6. Zatem może to skutkować zmniejszoną ogólną toksycznością komórki i chemo-opornością komórek nowotworowych. Dodatkowo, CAR opisane w niniejszym opisie mają zdolność penetrowania tkanki ze względu na ich małą wielkość.
Niniejszy wynalazek obejmuje komórkę (np. komórkę T) transdukowną wektorem lentiwirusowym (LV) lub transfekowaną transpozonem. Na przykład LV lub transpozon koduje CAR, który łączy domenę rozpoznawania antygenu specyficznego przeciwciała z domeną wewnątrzkomórkową CD3-zeta, CD28, 4-1BB lub ich dowolnych połączeń. Zatem transdukowana komórka T wyzwala odpowiedź komórki T za pośrednictwem CAR, zatem może wspomagać zmniejszenie wzrostu nowotworu i indukowanie zabijania komórek.
Opisano zastosowanie CAR do przekierowania specyficzności pierwotnych komórek T na antygen nowotworowy. Zatem, niniejszy wynalazek dostarcza również sposób stymulowania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek T na docelową populację komórek lub tkankę u ssaka, obejmujący etap podawania ssakowi komórki T, która wyraża CAR, przy czym CAR zawiera ugrupowanie wiążące, które specyficznie oddziałuje z wcześniej określonym celem, część łańcucha zeta zawierającą, na przykład domenę wewnątrzkomórkową ludzkiego CD3 zeta i ko stymulatorowy region przekazywania sygnału.
W jednym aspekcie ujawniono typ terapii komórkowej, gdzie komórki T lub komórki CIK są modyfikowane genetycznie do ekspresji CAR i komórki CAR-T lub CIK-CAR podaje się w infuzji potrzebującemu biorcy. Komórki podawane w infuzji są zdolne do zabijania komórek nowotworowych u biorcy. W przeciwieństwie do terapii przeciwciałem komórki CAR-T i CIK- CAR są zdolne do replikowania się in vivo, co skutkuje długoterminową trwałością, która może prowadzić do podtrzymywanej kontroli nowotworu.
W jednym aspekcie komórki CAR-T lub CIK-CAR opisane w niniejszym opisie mogą przechodzić silną ekspansję komórek in vivo i mogą trwać przez wydłużony czas. W innym aspekcie komórki CAR-T opisane w niniejszym opisie ewoluują do specyficznych komórek T pamięci, które mogą być reaktywowane do hamowania jakiegokolwiek dodatkowego tworzenia się lub wzrostu nowotworu. Bez wiązania się żadną szczególną teorią, komórki CAR-T mogą różnicować in vivo do środkowego stanu podobnego do pamięci po napotkaniu i następnie eliminacji komórek docelowych wyrażających antygen zastępczy.
Ponadto przeciwnowotworowa odpowiedź immunologiczna wywołana przez komórki T lub CIK modyfikowane CAR może być aktywną lub bierną odpowiedzią immunologiczną. Dodatkowo odpowiedź immunologiczna za pośrednictwem CAR może być częścią podejścia adoptywnej immunoterapii, w której komórki T modyfikowane CAR indukują odpowiedź immunologiczną specyficzną dla ugrupowania wiążącego antygen w CAR. Na przykład komórki CAR-T lub CIK specyficzne względem CEACAM6 wywołują odpowiedź immunologiczną specyficzną przeciwko komórkom wyrażającym CEACAM6.
W jednym aspekcie część ugrupowania wiążącego antygen CAR opisanego w niniejszym opisie zaprojektowano do leczenia poszczególnego nowotworu wyrażającego poszczególny antygen. Na przykład CAR opisany w niniejszym opisie typowo jest specyficzny dla CEACAM6 i może być zastosowany do leczenia nowotworów i zaburzeń związanych z CEACAM6, takich jak rak trzustki, rak jajnika, rak pęcherza moczowego, rak piersi, rak płuc, rak wątrobowokomórkowy i rak okrężnicy.
Komórki T modyfikowane CAR opisane w niniejszym opisie mogą również służyć jako typ szczepionki dla immunizacji ex vivo i/lub terapii in vivo u ssaka. Typowo, ssak jest człowiekiem.
Pod względem immunizacji ex vivo, co najmniej jedno z poniższych występuje in vitro przed podaniem komórki ssakowi: i) ekspansja komórek, ii) wprowadzenie kwasu nukleinowego kodującego CAR do komórek i/lub iii) kriokonserwowanie komórek.
Procedury ex vivo są dobrze znane w dziedzinie i są omówione pełniej poniżej. Krótko, komórki izoluje się z ssaka (typowo człowieka) i modyfikuje się genetycznie (tj., transdukuje lub transfekuje in vitro) wektorem wyrażającym CAR opisany w niniejszym opisie. Komórki modyfikowane CAR można podawać ssaczemu biorcy dla zapewnienia korzyści terapeutycznej. Ssaczym biorcą może być człowiek
PL 240 585 B1 i komórka modyfikowana CAR może być autologiczna pod względem biorcy. Alternatywnie, komórki mogą być allogeniczne, syngeniczne lub ksenogeniczne pod względem biorcy.
Procedurę ekspansji ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych opisaną w patencie U.S. nr 5,199,942, włączono w niniejszym opisie przez odniesienie, i można zastosować do komórek opisanych w niniejszym opisie. Inne odpowiednie sposoby są znane w dziedzinie, zatem niniejszy wynalazek nie ogranicza się do żadnego poszczególnego sposobu ekspansji ex vivo komórek. Krótko, hodowla i ekspansja ex vivo komórek T obejmuje: (1) zebranie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ od ssaka z pobrania krwi obwodowej lub eksplantów szpiku kostnego; i (2) namnażanie takich komórek ex vivo. Dodatkowo do komórkowych czynników wzrostu opisanych w patencie U.S. nr 5,199,942, inne czynniki, takie jak flt3-L, IL-1, IL-3 i ligand c-kit można zastosować do hodowania i ekspansji komórek.
Dodatkowo do zastosowania szczepionki na bazie komórek pod względem immunizacji ex vivo, niniejszym ujawniono również kompozycje i sposoby immunizacji in vivo do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko antygenowi u pacjenta.
W szczególności, komórki T modyfikowane CAR tutaj opisane stosuje się w leczeniu nowotworu wyrażającego CEACAM6. W pewnych aspektach komórki opisane w niniejszym opisie stosuje się do leczenia pacjentów narażonych na ryzyko rozwinięcia nowotworu wyrażającego CEACAM6. Zatem ujawniono sposoby leczenia lub zapobiegania nowotworowi wyrażającemu CEACAM6 obejmujące podawanie osobnikowi w potrzebie terapeutycznie skutecznej ilości komórek T modyfikowanych CAR opisanych w niniejszym opisie.
Komórki modyfikowane CAR według niniejszego wynalazku można podawać same lub jako kompozycję farmaceutyczną w połączeniu z rozcieńczalnikami i/lub innymi składnikami, takimi jak IL-2 lub cytokiny lub populacje komórkowe. Krótko, kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku mogą zawierać docelową populację komórek, jak opisano w niniejszym opisie, w połączeniu z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie lub fizjologicznie dopuszczalnych nośników, rozcieńczalników lub rozczynników. Takie kompozycje mogą zawierać bufory, takie jak neutralna buforowana sól fizjologiczna, sól fizjologiczna buforowana fosforanami i tym podobne; węglowodany, takie jak glukozę, mannozę, sacharozę lub dekstrany, mannitol; białka; polipeptydy lub aminokwasy, takie jak glicyna; przeciwutleniacze; środki chelatujące, takie jak EDTA lub glutation; adiuwanty (np. wodorotlenek glinu); i konserwanty. Kompozycje według niniejszego wynalazku typowo formułuje się do podawania dożylnego.
Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można podawać w sposób odpowiedni do leczonej choroby (lub do zapobiegania). Ilość i częstość podawania określa się według takich czynników jak stan pacjenta oraz typ i nasilenia choroby pacjenta, chociaż odpowiednie dawkowania można określać przez badania kliniczne.
Gdy wskazana jest „immunologicznie skuteczna ilość”, „przeciwnowotworowo skuteczna ilość”, „ilość skuteczna w hamowaniu nowotworu” lub „ilość terapeutyczna”, dokładną ilość kompozycji według niniejszego wynalazku do podawania może określić lekarz biorąc pod uwagę pojedyncze różnice w wieku, masie, wielkości nowotworu, stopniu zakażenia lub przerzutów i stanie pacjenta (osobnika). Ogólnie można stwierdzić, że kompozycję farmaceutyczną zawierającą komórki T opisane w niniejszym opisie można podawać w dawkowaniu wynoszącym od 104 do 109 komórek/kg masy ciała, typowo od 105 do 106 komórek /kg masy ciała, w tym wszystkie całkowite w obrębie tych zakresów. Kompozycje komórek T można również podawać wiele razy w tych dawkowaniach. Komórki można podawać poprzez zastosowanie technik wlewu, które są powszechnie znane w immunoterapii (patrz, np. Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). Optymalne dawkowanie i schemat leczenia dla poszczególnego pacjenta może łatwo określić znawca w dziedzinie medycyny poprzez monitorowanie pacjenta pod względem oznak choroby i dopasowanie odpowiednio leczenia.
W pewnych aspektach może być pożądane podawanie aktywowanych komórek T osobnikowi i następnie ponowne pobranie krwi (lub przeprowadzenie aferezy), aktywowanie pochodzących z niej komórek T według niniejszego ujawnienia i ponowny wlew tych aktywowanych i namnożonych komórek T do pacjenta. Sposób ten można przeprowadzić wiele razy co kilka tygodni. W pewnych aspektach komórki T można aktywować z pobrań krwi wynoszących od 10 cc do 400 cc. W pewnych aspektach komórki T aktywuje się z pobrań krwi wynoszących 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc lub 100 cc. Nie będąc związanym teorią, stosowanie tego protokołu wielu pobrań/wielu ponownych wlewów krwi może służyć do wybrania pewnych populacji komórek T.
PL 240 585 B1
Podawanie danych kompozycji można przeprowadzić w dowolny dogodny sposób, w tym przez wdychanie aerozolu, wstrzykiwanie, spożycie, transfuzję, wszczepienie lub przeszczepienie. Kompozycje opisane w niniejszym opisie można podawać pacjentowi podskórnie, śródskórnie, do nowotworu, do węzłów chłonnych, doszpikowo, domięśniowo, poprzez wstrzykiwanie dożylne (i.v.) lub dootrzewnowo. W jednym aspekcie kompozycje komórek T według niniejszego ujawnienia podaje się pacjentowi przez wstrzyknięcie śródskórne lub podskórne. W innym aspekcie kompozycje komórek T według niniejszego ujawnienia typowo podaje się przez wstrzyknięcie i.v. Kompozycje komórek T można wstrzykiwać bezpośrednio do nowotworu, węzłów chłonnych lub miejsca zakażenia.
W pewnych aspektach według niniejszego ujawnienia komórki aktywowane i namnażane z zastosowaniem sposobów opisanych w niniejszym opisie lub innych sposobów znanych w dziedzinie, gdzie komórki T namnaża się do poziomów terapeutycznych, podaje się pacjentowi w połączeniu z (np. przed, równocześnie lub po) dowolną liczbą odpowiednich sposobów leczenia, w tym, w sposób nieograniczający, chemioterapią, radiacją, środkami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklosporyna, azatiopryna, metotreksat, mykofenolan i FK506, przeciwciałami lub innymi środkami immunoablacyjnymi, takimi jak CAM PATH, przeciwciała anty-CD3 lub innymi terapiami przeciwciałami, cytoksyną, fludarabiną, cyklosporyną, FK506, rapamycyną, kwasem mykofenolowym, steroidami, FR901228, cytokinami i napromieniowaniem. Leki te hamują albo zależną od wapnia fosfatazę kalcyneuryny (cyklosporyna i FK506) lub hamują kinazę p70S6, która jest ważna dla przekazywania sygnału indukowanego czynnikiem wzrostu (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993). W kolejnym aspekcie kompozycje komórek według niniejszego ujawnienia podaje się pacjentowi w połączeniu z (np. przed, równocześnie lub po) przeszczepem szpiku kostnego, terapią ablacyjną komórek T z zastosowaniem środków chemoterapeutycznych, takich jak fludarabina, terapią radiacyjną zewnętrzną wiązką (XRT), cyklofosfamidem lub przeciwciałami, takimi jak OKT3 lub CAMPATH. W innym aspekcie kompozycje komórkowe według niniejszego wynalazku podaje się po terapii ablacyjnej komórek B, takiej jak środkami, które reagują z CD20, np., Rituksanem. Na przykład w jednym aspekcie osobnicy mogą przechodzić standardowe leczenie wysoką dawką chemioterapii, następnie przeszczepem komórek macierzystych krwi obwodowej. W pewnych aspektach po przeszczepie, osobnicy otrzymują wlew namnożonych komórek immunologicznych opisanych w niniejszym opisie. W dodatkowym aspekcie namnożone komórki podaje się przed lub po operacji.
Dawkowanie powyższego leczenia do podawania pacjentowi różni się w zależności od dokładnego charakteru leczonego stanu i biorcy leczenia. Skalowanie dawkowania dla podawania człowiekowi można przeprowadzić według praktyk dopuszczonych w dziedzinie. Dawka dla CAMPATH, na przykład na ogół będzie w zakresie od 1 do około 100 mg na dorosłego pacjenta, zwykle podawania codziennie przez okres między 1 i 30 dni. Typowa dzienna dawka wynosi od 1 do 10 mg na dzień, chociaż w niektórych przypadkach można zastosować większe dawki wynoszące do 40 mg na dzień (opisane w patencie U.S. nr 6,120,766).
W aspektach według wynalazku kompozycje zawierające CAR-T według wynalazku można przechowywać schłodzone do zastosowania lub zamrożone (następnie rozmrożone) aż będą wymagane do zastosowania. Kompozycje można formułować i dostarczać jako „bank” komórek CAR-T do leczenia terapeutycznego nowotworów CEACAM6.
W przykładach wykonania wynalazku komórki, które stosuje się do terapii komórkowej dostarcza się w zestawie, a w niektórych przypadkach komórki są zasadniczo jedynym składnikiem zestawu. Zestaw może zawierać odczynniki i materiały do wytworzenia pożądanej komórki. W specyficznych przykładach wykonania, odczynniki i materiały obejmują startery do amplifikowania pożądanych sekwencji, nukleotydy, odpowiednie bufory lub odczynniki buforowe, sól i tak dalej, a w niektórych przypadkach odczynniki obejmują wektory i/lub DNA, który koduje CAR, jak opisano w niniejszym opisie i/lub jego elementy regulatorowe.
W szczególnych przykładach wykonania istnieje jeden lub większa liczba aparatów w zestawie odpowiednich do ekstrakcji jednej lub większej liczby próbek z osobnika. Aparatem może być strzykawka, skalpel i tak dalej.
W niektórych przypadkach zestaw, w dodatku do przykładów wykonania terapii komórkowej, również obejmuje drugą terapię nowotworu, taką jak, na przykład chemioterapię, terapię hormonalną i/lub immunoterapię. Zestaw(y) może(mogą) być dopasowany(e) do poszczególnego nowotworu dla osobnika i zawierać odpowiednie drugie terapie nowotworowe dla osobnika.
PL 240 585 B1
PRZYKŁADY DOŚWIADCZALNE
Wynalazek ponadto opisano szczegółowo w odniesieniu do poniższych przykładów doświadczalnych. Przykłady te dostarczono jedynie w celu ilustracji i nie mają być one ograniczające, o ile nie określono inaczej. Zatem wynalazku w żaden sposób nie powinno się interpretować jako ograniczonego do poniższych przykładów, lecz raczej powinno się go interpretować jako obejmujący dowolne i wszystkie odmiany, które stają się oczywiste jako wynik dostarczonych w niniejszym opisie ujawnień.
Bez dalszego opisu uważa się, że znawca w dziedzinie może, stosując powyższy opis i poniższe ilustracyjne przykłady, wytworzyć i wykorzystać opisane związki i praktykować zastrzegane sposoby. Poniższe robocze przykłady zatem, specyficznie wskazują typowe aspekty według niniejszego wynalazku i nie interpretuje się ich jako ograniczające w jakikolwiek sposób resztę ujawnienia.
Podsumowanie ustaleń
CEACAM6 ulega nadekspresji w wielu typach ludzkich nowotworów, takich jak rak piersi, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, i niedrobnokomórkowy płuc i jest niezależnym predyktorem ogólnego przeżycia i przeżycia wolnego od choroby. Celowanie w tę cząsteczkę przeciwciałami spowalnia postęp nowotworu w pewnych modelach zwierzęcych. 2A3 jest jednodomenowym przeciwciałem wielbłądowatych izolowanym z pełnej immunizowanej komórkami nowotworowymi biblioteki lamy. Przeciwciało wiąże się specyficznie z antygenem CEACAM6 z wysokim powinowactwem (5 nM jak zmierzono przez SPR) i hamuje proliferację komórek nowotworu wyrażających CEACAM6 in vitro. W tym badaniu, komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) poddano inżynierii do ukierunkowania na ludzki antygen CEACAM6 przez transdukowanie sekwencji przeciwciała 2A3 do generowania modyfikowanej chimerycznej domeny przekazywania sygnału CD28 połączonej z chimerycznym CD3-zeta. Wydajność transdukcji i ekspresję przeciwciała 2A3 weryfikowano przez cytomerię przepływową. Koinkubacja komórek CAR-T specyficznych względem CEACAM6 (CEACAM6-CAR-T) z linią komórek trzustkowych BxPC-3 wyrażających CEACAM6 skutkuje zwiększoną cytotoksycznością i uwalnianiem cytokin (IL-2 i IFN-γ), co sugeruje potencjalną aktywność przeciwrakową komórek CAR-T. Dane z analizy komórek w czasie rzeczywistym wykazują istotne zwiększenie cytotoksyczności w komórkach BxPC-3 przez komórki CEACAM6-CAR-T, w porównaniu z komórkami T natywnymi. Jednak, komórki CEACAM6CAR-T wykazują znacznie niższą aktywność cytotoksyczną względem linii komórek kontroli negatywnych. Skuteczność komórek CEACAM6-CAR-T w modelu ksenoprzeszczepu badano in vivo. Komórki BxPC3 inokulowano podskórnie do tylnego boku myszy CIEA NOG. Trzy grupy myszy następnie otrzymały wstrzyknięcie dożylne PBS, natywnych komórek T lub komórek CEACAM6-CAR-T, odpowiednio, dnia 1, 8 i 15. Dane wykazały bardzo wysoką skuteczność komórek CEACAM6-CAR-T przeciwko ksenoprzeszczepowi raka trzustki. Komórki CEACAM6-CAR-T istotnie zmniejszały wzrost ksenoprzeszczepu BxPC-3 w porównaniu z natywnymi komórkami T (wartość p = 0,00025) i PBS (wartość p = 7,91x106). Nie zaobserwowano toksycznego wpływu na pomiar masy ciała. Wyniki silnie dokumentują, że komórki CEACAM6-CAR-T można zastosować jako skuteczny środek w immunoterapii przeciwko nowotworom wyrażającym CEACAM6, i że przeciwciała jednodomenowe wielbłądowatych można łatwo zaadaptować do terapii typu CAR-T.
P r z y k ł a d 1
CAR klonowano do miejsc klonowania Xbal i EcoRI plazmidu lentiwirusowego Lenti CMV-MCS-EF1a-puro (Alstem, Richmond, CA). Wszystkie wstawki plazmidu zweryfikowano pod względem sekwencji po syntezie i klonowaniu. Każdym plazmidem CAR transformowano komórki E. coli BL21 do wytwarzania i izolacji DNA gotowego do transfekcji do generowania lentiwirusowego roztworu wyjściowego. Miano wirusowe wykrywano przez analizę qRT-PCR genomowego lentiwirusowego RNA. Źródłem ludzkich komórek T do transdukcji były jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), izolowane z pełnej krwi przez gradient Ficoll-Paque.
Protokół testu komórkowego w czasie rzeczywistym (RTCA)
Dzień 1:
A. Otrzymanie (adherentnych) komórek docelowych:
1. Odessanie starej pożywki z butelki
2. Dodanie 5-10 ml zwykłej pożywki (bez surowicy) do butelki do wypłukania jakichkolwiek pozostałości surowicy. Następnie odessanie pożywki.
3. Dodanie 0,5 ml - 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do butelki do odłączenia komórek.
PL 240 585 B1
4. Dodanie 4,5 ml - 9,5 ml pożywki (z FBS) do butelki i pipetowanie pożywki w górę i w dół w dno butelki do rozbicia komórek do roztworu pojedynczych komórek.
5. Przeniesienie zawiesiny zawieszonych komórek do 15 ml probówki.
6. Pobieranie 10 μl zawiesiny komórkowej i zliczenie z zastosowaniem hemacytometru do określenia stężenia komórek.
7. Wirowanie zawiesiny komórkowej w 1000 rpm (lub 300 x g) przez 5 minut w 25°C.
8. Po wirowaniu odessanie supernatantu i ponowne zawieszenie osadu komórkowego w pożywce (z FBS) aż stężenie będzie wynosiło 1x105 komórek/ml.
B. Otrzymanie płytki RTCA:
1. Dodanie 50 μl samej pożywki (ta sama pożywka stosowana dla zawiesiny komórkowej) do dołków, które będą mierzone.
2. Umieszczenie E-płytki (ACEA Biosciences, Inc, katalog#: JL-10-156010-1A) ponownie na stanowisku.
3. Włączenie oprogramowania RTCA 2.0
a. Wprowadzenie informacji o układzie:
i. Na samym końcu wybieranie wszystkich dołków i kliknięcie „Apply”. To aktywuje dołki
b. Wprowadzenie schematu:
i. Etap 1 = Tło pomiaru. Nie zmieniać.
ii. Etap 2 = Monitorowanie komórek iii. Etap 3 = Krótkoterminowa cytotoksyczność iv. Etap 4 = Długoterminowa cytotoksyczność (zaznaczenie pola “Auto”) ** Można zmienić ilość cykli każdego etapu i odstęp między każdym cyklem **
4. Kliknięcie „Step 1” i naciśnięcie Start, aby nazwać doświadczenie i zmierzyć tło z pożywki
5. Po zakończeniu „Etapu 1”, usunięcie E-płytki ze stanowiska.
6. Dodanie 100 μl zawiesiny komórkowej z części A do dołków (nie usuwać poprzedniej pożywki. Łącznie powinno być końcowe 150 μl w każdym dołku).
7. Pozwolenie na osadzenie komórek przez 5 minut pod wyciągiem.
8. Umieszczenie E-płytki ponownie na stanowisku.
9. Kliknięcie „Etap 2” i naciśnięcie Start do wznowienia zapisywania
Dzień 2 - Traktowanie:
A. Otrzymywanie komórek efektorowych CAR-T:
1. Pobranie wszystkich zawieszonych komórek CAR-T z 6-dołkowej płytki i dobre wymieszanie.
2. Pobranie 10 μl zawiesiny komórkowej i określenie stężenia komórki z zastosowaniem hemacytometru.
3. Wirowanie zawiesiny komórkowej w 1000 rpm (lub 300 x g) przez 5 minut w 25°C.
4. Odessanie supernatantu i ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 2 ml buforu do oznaczanie cytotoksyczności (RPMI 1640 wolny od fenolu (Invitrogen)) + 1% P/S (Invitrogen) + 5% ludzka surowica AB (Gemini Bioproducts; 100-318).
5. Powtórzenie etapu 3.
6. Odessanie supernatantu i ponowne zawieszenie osadu komórkowego w pożywce do oznaczania cytotoksyczności (wolny od fenolu RPMI1640 (Invitrogen) plus 5% surowica AB (Gemini Bioproducts; 100-318)) do uzyskania końcowego stężenia 1x106 komórek/ml.
B. Otrzymanie płytki RTCA:
1. Po zakończeniu części A naciśnięcie przewijania do przodu do etapu 3.
2. Usunięcie E-płytki ze stanowiska.
3. Odessanie ostrożnie supernatantu z każdego dołka.
4. Dodanie 100 μl pożywki do oznaczania cytotoksyczności do każdego dołka.
5. Powtórzenie etapu 3.
6. Dodanie 50 μl pożywki do oznaczania cytotoksyczności do każdego dołka.
7. Rozdzielenie 100 μl zawiesiny komórek CAR-T (1x105 komórek) z części A do pożądanych dołków dla projektu.
8. Ponowne umieszczenie E-płytki na stanowisku.
9. Kliknięcie „Etap 3” i naciśnięcie Start do wznowienia zapisywania.
PL 240 585 Β1
Sekwencja CAR: CEACAM-6 scFv-CD28-CD3zeta drugiej generacji:
Sygnał wydzielania 2A3
MLLLVT SLLLCEL PH PAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTHGWFR.QAP _______________________________________2A3____________________________________
GKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAV¥YCAANRGIPIA
2A3 CD28 (region zawiasowy)
GRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDKIEKSNGTIIHVKGKHLCPSPŁFPGPSKPFWZŁVW
CD28 TM Domena stymulatorowa CD28
GGVLACYSLLVTVAFIIFWVR^^ RŁŁHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRSR7KF ________________________Domena stymulatorowa CD3zeta___________________________
S RSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAE ____________Domena stymulatorowa CD3zeta____________
AYSElGMKGERRRGKGHDGŁYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR—
Powyższą sekwencją CAR: CEACAM-6 scFv-CD28-CD3zeta drugiej generacji, jest SEQ ID NO: 12.
W obrębie sekwencji CAR: CEACAM-6 scFv-CD28-CD3zeta drugiej generacji, domenę CD3-zeta przedstawiono jako 112 aminokwasową sekwencję rozpoczynającą się od “RVKF... .PPR”, jak wskazano powyżej.
SEQ ID NO: 13, która dotyczy 112 aminokwasowej sekwencji domeny CD-3-zeta jest:
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gin Gly Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Len Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala Leu Pro Pro Arg
Protokół cytometrii przepływowej
Komórki przemywano i zawieszono w buforze FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) plus 0,1% azydek sodu i 0,4% BSA). Komórki następnie podzielono na części po 1x106.
Receptory Fc blokowano normalną kozią IgG (LifeTechnologies). Dodanie 100 μΙ rozcieńczonej 1:1000 normalnej koziej IgG do każdej probówki i inkubowanie na lodzie przez 10 min.
Dodanie 1,0 ml buforu FACS do każdej probówki, dobre wymieszanie i żwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
Dodanie znakowanych biotyną poliklonalnych kozich anty-mysich F(ab)2 przeciwciał (Life Technologies) do wykrywania CD 19 scFv; znakowane biotyną normalne poliklonalne kozie przeciwciała IgG (Life Technologies) dodaje się, aby służyły jako kontrola izotypowa. (Rozcieńczenie 1:200, objętość reakcji wynosi 100 μΙ).
Komórki inkubowano w 4°C przez 25 minut i przemyto raz buforem FACS.
Zawieszenie komórek w buforze FACS i blokowanie normalną mysią IgG (lnvitrogen) poprzez dodanie 100 μΙ rozcieńczonej 1:1000 normalnej mysiej IgG do każdej probówki. Inkubowanie na lodzie przez 10 minut. Przemycie komórek buforem FACS i ponowne zawieszenie w 100 μΙ buforu FACS.
Komórki następnie barwi się streptawidyną znakowaną fikoerytryną (PE) (BD Pharmingen, San Diego, CA) i CD3 znakowaną allofikocyjaniną (APC) (eBiocience, San Diego, CA). Dodanie po 1,0 μΙ PE i APC do probówki 2 i 3.
Pozyskiwanie danych za pomocą cytometrii przepływowej przeprowadzono na BD FacsCalibur (BD Biosciences), a analizę przeprowadzono za pomocą FlowJo (Treestar, Inc. Ashland, OR).
PL 240 585 Β1
Tabela 1: Wyniki dla G1 PBS, pozorowanych G2 i G3 CAR T podczas wskazanych dni
G1 PBS Pozorowane G2 G3 CAR T
DNI ŚREDNI A SD N ŚREDNI A SD N ŚREDNIA SD N
0 0 0 5 0 0 5 0 0 5
2 31,84 19,04 5 49,00 32,07 5 45,17 7,09 5
6 73,45 30,43 5 95,01 48,69 5 42,48 13,83 5
9 93,37 27,30 5 114,74 29,56 5 68,11 18,75 5
13 107,78 26,14 5 112,59 24,73 5 62,95 12,48 5
Poniższa sekwencja kwasu nukleinowego reprezentuje SEQ ID NO: 11 i poniższa sekwencja aminokwasowa reprezentuje SEQ ID NO: 9.
2A3, klonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego jako białko fuzyjne huFc (C-końcowy Fc):
fa&^ąccQCCaccA/TGCTTCWCTGGVGACMGCC^ rcĆn?.4?CCCACAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACT CTCCTGTAGAACCTCTGGACGĆACĆAACAGTGTCTATACCATGGGĆTGGTTĆCGĆĆftGŚĆtCCAGGGAAG GAGCGTGMTTTGTAGCACAAATTATGTGGGGTGCAGGTACTAACACGCACTATGCAGACTCCGTGAAGG GCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCGAGAGCACGGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGA GGACACGGCCGTTrATTACTGTGCAGCGAATCGGGGAATACCTATTGCTGGCCGGCAATATGACTACTGG GGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAg^cggcgjgtgg^cfli^ A<^TGĆ(XAĆCGf«XCAeęACc£$M^
ACCCTCArGATCTCCCGGACCCCTUAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT caactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtacc gtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaa GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCrGCC CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTOAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTZ.CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGGAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTĆTGCAęMCCACTACACGĆAG^
MLL'LVTSLLLCELPHPAFLLIPQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSWTMGWFRQAPGKEREFV AQIMWGAGTNTHYADSYKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPEDTAVY YCAANRG IPIAGRQYDYWGQGTQ VTVSSGGGGSRENTYFQGtHTCPPCPAP3LLGGPSVFŁFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAJ<TKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVrSNKALPAPIEKTISKAKGCPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP^7LDSDGSFFLYSKLTVDK SR^QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK~
Poniższa sekwencja aminokwasowa reprezentuje SEQ ID NO: 10.
2A3 konstrukt CAR 2-giej generacji, „pCD510-FMC63-2A3-hu28z:
2A3 z fuzją C-końcową CD28 (zawias, transbłonowa (TM) domena stymulatorowa) i CD3zeta (domena stymulowana)
PL 240 585 Β1 |gg|^gccgccaccATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCC TCCTGATCCCAictągriCAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTĆTCT GAGACTCTCCTGTAGAACCTCTGGACGCACCAACAGTGTCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCA GGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACAAATTATGTGGGGTGCAGGTACTAACACGCACTATGCAGACTCCG TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCGAGAGCACGGTGTACCTGCAAATGAACAGCCTGAA ACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCGAATCGGGGAATACCTATTGCTGGCCGGCAATATGAC TACTGGGG^AGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCJM^ga^^
TAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATT tcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgcta GTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGA ACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGC AGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAG CTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACC CTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAA GATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCT aatagMK
Przykład 2
Komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (komórki CAR-T) generowano z zastosowaniem specyficznego przeciwciała anty-wielbłądowate przeciwko ludzkiej CEACAM6. Wykazano, że te CAR-T początkowo wykazują silną aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom prezentującym antygen docelowy CEACAM6 i rozpoczęto dodatkowe badania do obserwowania zmienności efektu cytotoksycznego przeciwko wielu dawcom PBMC.
Dane sugerują, że anty-CEACAM6 CAR-T jest skuteczne dla szeregu ludzkich dawców komórek T.
Wytwarzanie lentiwirusa anty-CEACAM6 CAR:
Roztwór wyjściowy wirusa Konstrukt CAR Miano wirusowe (IFU/ml)
A Anty- CEACAM6 2,86±0,19xl08 (dla dawcy 1)
B AntyCEACAM6 3.08±0,13xl08 (dla dawcy 2 i 3)
Nadmiar roztworów wyjściowych wirusa wykonano do dostosowania transdukcji wielu niezależnych populacji komórek T, a niezastosowanego natychmiast wirusa przechowywano w - 80°C. Transdukcja następuje w wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 5:1 (stosunek wirusa do komórki).
PBMC dawcy 1 zastosowano do generowania początkowych danych anty-CEACAM6. Badano trzech dodatkowych dawców, lecz PBMC od jednego z dodatkowych dawców miały powtarzalne trudności w namnażaniu po aktywacji i transdukcji. Tylko dwóch z trzech dodatkowych dawców zatem zastosowano do następnych doświadczeń co zawiera „dawcę 2” i „dawcę 3” omówionych w tym raporcie. Roztwór wyjściowy wirusa A zastosowano do transdukowania PBMC dawcy 1 i roztwór wyjściowy wirusa B do transdukowania PBMC od, odpowiednio, dawcy 2 i dawcy 3.
Test komórkowy w czasie rzeczywistym (RTCA), cytotoksyczność komórek CAR-T
Komórki zastosowane w testach cytotoksyczności przedstawionych na Figurach 1 i 2 namnażano do 14-15 dni przed zastosowaniem (komórki od dawcy 1 namnażano do dnia 14, podczas gdy komórki od dawców 2 i 3 namnażano do dnia 15). BXPC3 zastosowano jako pozytywną linię komórek docelowych, podczas gdy komórki Pan02a zastosowano jako negatywną linię komórek docelowych. Komórki docelowe wysiano w 1 χ 104 komórek na dołek (z 96-dołkowej płytki) i inkubowano przez 24 godziny. Komórki anty-CEACAM6 CAR-T zastosowano jako komórki efektorowe, razem z nietransdukowanymi komórkami CAR-T jako kontrolę negatywną. Komórki anty-CEACAM6 CAR-T wprowadzono z zamrożonych roztworów wyjściowych po transdukcji anty-CEACAM6 CAR i ekspansji. Komórki CAR-T dodano do odpowiednich dołków zawierających komórki docelowe w stosunku wynoszącym 10:1.
PL 240 585 B1
Dane BXPC3 sugerują specyficzny i praktycznie identyczny profil cytotoksyczny jak prezentowany przez wartości współczynnika komórkowego RTCA i potwierdzają początkowe dane cytotoksyczności anty-CEACAM6 CAR-T.
Komórki Pan02a, mysia linia trzustkowa, która jest negatywna pod względem ekspresji ludzkiej CEACAM6, nie są naruszone przez komórki CEACAM6 CAR-T.
Test wydzielania cytokin
Komórki stosowane do testu wydzielania cytokin namnażano do 15 dni. Z 1x104 komórkami docelowymi wysianymi na dołek (z 96-dołkowej płytki) komórki efektorowe dodano jako efektor do docelowego stosunku komórek wynoszącego 1:1 i inkubowano razem przez w przybliżeniu 18 h przed usunięciem supernatantu do testu stężeń IFN-gamma i IL-2, odpowiednio, Figury 3A i 4A. Krzywe standardowe przedstawiono na Figurach 3B i 4B.
P r z y k ł a d 3
Skuteczność komórek CEACAM-6-CAR-T w komórkach raka trzustki, ksenoprzeszczepach BxPC3, badano in vivo. W poprzednim doświadczeniu wykazano wysoką cytotoksyczność komórek CEACAM-6-CAR-T przeciwko komórkom BxPC3 in vitro. W tym przykładzie myszy CIEA-NOG (Taconic) nastrzykiwano podskórnie komórkami BxPC3 do tylnego boku (2x106 komórek/mysz). Trzy grupy myszy: PBS, pozorowane (komórki T) i komórki CEACAM-6 CAR-T (5 myszy na grupę) otrzymały dnia 1, 8 i 15 wstrzyknięcie dożylne (i.v.) albo PBS albo 1x107 komórek T albo komórek CAR-T.
Dane wykazują bardzo wysoką skuteczność komórek CEACAM-6 CAR-T z zastosowaniem mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Komórki CEACAM-6 CAR-T istotnie zmniejszały wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu komórek trzustkowych BcPC3 względem pozorowanych dla komórek T (wartość p = 0,00025) i względem grupy PBS (wartość p = 7,90984E-06). Dane sugerują wysoki potencjał terapeutyczny komórek CEACAM-6 CAR-T przeciwko rakowi trzustki.
Weryfikacja skuteczności transdukcji po aktywacji komórek T, transdukcji i ekspansji komórek CEACAM-6 CAR-T in vitro.
Źródłem ludzkich komórek T do transdukcji były jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), izolowane z pełnej krwi przez gradient Ficoll-Paque (patrz Załącznik).
Komórki zawieszono w 1x106 komórek/ml z IL-2 (300 IU/ml), aktywowano za pomocą mikrokulek CD28/CD3 i transdukowano odpowiednimi roztworami wyjściowymi rekombinowanego lentiwirusa 24 h po aktywacji. Komórki następnie pasażowano w 2-3 dniowych odstępach ze stężeniami huIL-2 utrzymywanymi na 300 IU/ml. Świeże komórki CEACAM-6 CAR-T otrzymywano każdego tygodnia za pomocą nowej transdukcji lentiwirusem. Świeżego lentiwirusa otrzymywano z tego samego DNA (miano określono za pomocą PCR i równało się 3,40 +/- 0,31*108 IFU/ml) i zastosowano do transdukcji każdego tygodnia podczas 3 tygodni do generowania komórek CAR-T do 3 wstrzyknięć dożylnych (i.v.) do myszy w stężeniu 1x107 komórek na mysz w dniach 1, 8 i 15 po wstrzyknięciu komórek raka trzustki BxPC3 (2x106 komórek/mysz podskórnie). Kontrolne komórki T również hodowano do wstrzyknięcia kontroli pozorowanej myszom w tym samym stężeniu w tych samych dniach wstrzykiwania.
Ekspresję CEACAM-6 w komórkach CAR-T wykrywano poprzez cytometrię przepływową stosując przeciwciało anty-mysi Fab do wykrywania CEACAM-6 scFv. Nietransdukowane komórki T zastosowano jako kontrolę negatywną. Przeciwciała anty-CD3 również zastosowano do badania ogólnego rozmieszczenia komórek pozytywnych pod względem CD3 w populacji. Dane cytometrii przepływowej przedstawiono na Figurze 5 i wykazują skuteczność transdukcji wynoszącą > 26%.
Wysoka cytotoksyczność CEACAM-6 CAR-Tprzeciwko komórkom BxPC3
Test RTCA
Cytotoksyczność komórek CEACAM-6-CAR-T przeciwko docelowym komórkom BxPC3 zmierzono przez analizę komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) dla każdej serii komórek CAR-T (#1,2 i 3) (Figura 6A, B, C).
Obecnie RTCA dostarcza wiarygodnych danych, gdy stosuje się adherentne linie komórkowe. Nasze komórki docelowe są komórkami BxPC3 i komórkami efektorowymi są komórki CAR-T w stosunku 1:10.
Próbki doświadczalne RTCA obejmują następujące:
(i) Docelowe BxPC3 (ii) prawidłowe, nietransdukowane komórki CAR-T (kontrola negatywna komórek efektorowych)
PL 240 585 Β1 (iii) Komórki CEACAM-6-CAR-T, ludzkie komórki T transdukowane lentiwirusem CEACAM-6 CAR (pozytywne komórki efektorowe).
W skrócie, komórki wysiano w ilości 1x104 komórek na dołek 24 h przed wprowadzeniem komórek efektorowych CEACAM-6 CAR-T. Wartości impedancji na E-płytce zapisywano od tego momentu. Gdy komórki były konfluentne, dołki przemywano i dodawano odpowiednią liczbę komórek CAR-T, w zależności od pożądanego stosunku komórki efektorowej:docelowej.
Dane (Figura 6) wyraźnie przedstawiają istotny wzrost cytotoksyczności komórek BxPC3 przez CEACAM-6-CAR-T w porównaniu z komórkami T kontroli negatywnej. Komórki T mają pewną aktywność cytotoksyczną, którą obserwowano wcześniej u niektórych dawców.
Komórki CAR-T CEACAM-6 istotnie zmniejszały wzrost ksenoprzeszczepu nowotworu BxPC3 in vivo.
tygodniowe samice myszy CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdcscid H2rgtmlSug/JicTac) uzyskano od Taconic Bioscience (Hudson, NY). Komórki raka trzustki BxPC3 (2x10® komórek/mysz) wstrzykiwano podskórnie do tylnego boku myszy NOG. Następnego dnia po wstrzyknięciu komórek BxPC3 wstrzykiwano myszom PBS, komórki T lub komórki CEACAM-6-CAR-T (1x107)/mysz dożylnie do żyły ogonowej myszy. Wielkość nowotworu i masę ciała myszy mierzono dwa razy w tygodniu za pomocą suwmiarek, a objętość nowotworu obliczono z zastosowaniem następującego wzoru: długość x szerokość2)/2.
Komórki CEACAM-6 CAR-T istotnie zmniejszały wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu BxPC3 in vivo (wartość p względem PBS = 7.9E-06; wartość p względem kontroli pozorowanych dla komórek T = 0,00025, test t Studenta) (Figura 7).
Komórki CEACAM-6 CAR-T nie wpływają na masę ciała myszy.
Figura 8 przedstawia brak efektów toksycznych komórek CEACAM-6-CAR-T na masę ciała myszy i wszystkie myszy były żywe po 3 wstrzyknięciach komórek CEACAM-6-CAR-T (łącznie 3x107 komórek wstrzykiwanych podczas 3 wstrzyknięć, co równa się 3x1010 ludzkiej dawki).
Na zakończenie doświadczenia nowotwory ksenoprzeszczepu pobrano do analiz biochemicznych i genetycznych.
Figura 9 przedstawia zmniejszoną masę nowotworu i całkowitą eliminację jednego nowotworu w myszach traktowanych CEACAM-6.
Wnioski
Komórki CEACAM-6-CAR-T istotnie zmniejszają wzrost komórek raka trzustki BxPC3 in vitro i istotnie zmniejszają wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu raka trzustki BxPC3 in vivo.
Wyniki silnie wskazują, że CEACAM-6 można zastosować jako nowe i skuteczne leczenie immunoterapią przeciwko nowotworom trzustki.
Załącznik A
A1. Wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu w myszach NOG.
Tabela 2: Projekt badania
#Gr. Linia komórkowa Dzień 0 # myszy Traktowanie Dzień 1, 8 i 15 Ocena
I BxPC3 2xl06 komórek w 200μ1, s.c. 5 PBS 200μ1 przez IV, Codzienne obserwacje z boku klatki, pomiar' nowotworu i masy ciała dwa razy na tydzień. Wartość graniczna obciążenia nowotworem przy ÓOO-lOOOmm3.
2 BxPC3 2xl06 komórek w 200μ1, s.c. 5 Pozorowane dla komórek T lxl07 komórek w 200μ1, przez IV
3 BxPC3 2xl06 komórek w 200μ1, s.c. 5 Komórki CAR-T1 lxl07 komórek w 200μ1, przez IV
PL 240 585 B1
Procedura
1) 5 tygodniowe samice myszy CIEA NOG mouse® (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlSug/JicTac) uzyskano od Taconic Bioscience (Hudson, NY).
2) Po otrzymaniu, myszy zaaklimatyzowano w pomieszczeniu dla zwierząt przez 5 dni.
3) Linię komórek BxPC3 zastosowano do wstrzykiwania.
• W dniu wszczepienia (dzień 0), komórki BxPC3 zwirowano, przemyto raz PBS i ponownie zawieszono w PBS w 2x107 komórek na ml.
• Dwa miliony komórek (2x106) w objętości 0,10 ml wstrzykiwano s.c.
4) W dniu po wszczepieniu (dzień 1, 8 i 15), PBS, pozorowane komórki T i CAR-T wstrzykiwano do żyły ogonowej iv.
• W dniu traktowania, pozorowane komórki T i CAR-T zwirowano, przemyto raz i ponownie zawieszono w PBS w 5x107 komórek na ml.
• Dziesięć milionów komórek (1x107) w objętości 0,20 ml wstrzykiwano dożylnie poprzez żyłę ogonową.
i. Grupa 1 otrzymuje PBS.
ii. Grupa 2 otrzymuje pozorowane komórki T iii. Grupa 3 otrzymuje komórki CAR-T
5) Wszystkie zwierzęta obserwowano codziennie pod względem ogólnych poziomów aktywności i objawów klinicznych zachorowalności i dyskomfortu ambulatoryjnego. Masy ciała i pomiary nowotworu zapisywano dwa razy na tydzień.
• Objętość nowotworu obliczono w mm3 stosując następujący wzór:
• (długość x szerokość2)/2
6) Gdy objętość nowotworu osiąga punkt końcowy objętości nowotworu (600-1000 mm3), zwierzęta poddawano eutanazji i pobierano nowotwór. Po eutanazji pobierano cały nowotwór, przechowywano w kasecie na tkanki, gwałtowanie zamrażano i przechowywano w -80°C.
A2. Analiza statystyczna
Test t Studenta wykonano do pomiaru istotnych różnic między grupami. Wartość P wynoszącą <0,05 uważa się za istotną. Na zakończenie doświadczenia w dniu 29 wzrostu nowotworu ksenoprzeszczepu, istotną różnicę stwierdzono przy wartości p < 0,001.
P r z y k ł a d 4
Komórki CEACAM6 CAR-T badano przeciwko linii komórek raka przewodowego gruczołu sutkowego HCC1954, linii komórek gruczolakoraka okrężnicy LS-174T i linii komórek raka płuc A549 w analizie RTCA (test cytotoksyczności w czasie rzeczywistym). Linię komórek raka trzustki BxPC3 zastosowano jako kontrolę pozytywną. Dane przedstawiają, że anty-CEACAM6 CAR-T są wysoce skuteczne we wszystkich trzech analizowanych liniach komórek.
Generowanie komórek CAR-T, ekspresja CAR przez cytometrię przepływową
Świeżo otrzymane komórki CEACAM6 CAR-T namnażano przez 13 dni i zastosowano do cytometrii przepływowej z przeciwciałem anty-lama i drugorzędowym przeciwciałem anty-królik-FITC. Jak przedstawiono na Figurze 10, analiza cytometrii przepływowej z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym anty-lama i negatywną kontrolą izotypową IgG, następnie barwieniem przeciwciałem anty-królik-FITC, wykazała skuteczną transdukcję komórek T lentiwirusowym CAR i ekspresję CEACAM-6 scFv. Barwienie CD3-APC wykryło wysoki procent komórek T.
Test komórkowy w czasie rzeczywistym (RTCA), cytotoksyczność komórek CAR-T
Świeżo otrzymane komórki CAR-T namnażane przez 13 dni zastosowano w teście RTCA. BXPC3 zastosowano jako pozytywną docelową linię komórkową. Komórki docelowe wysiano w 1 x 104 komórek na dołek (z 96-dołkowej płytki) i inkubowano przez 24 godziny. Komórki anty- CEACAM6 CAR-T zastosowano jako komórki efektorowe, razem z nietransdukowanymi komórkami CAR-T jako kontrolę negatywną. Komórki CAR-T i nietransdukowane komórki T dodano do odpowiednich dołków zawierających komórki docelowe w stosunku wynoszącym 10:1 (komórki efektorowe do docelowych).
Wyniki dla komórek BxPC-3 przedstawiono na Figurze 11, wyniki dla komórek LS-174-T przedstawiono na Figurze 12, wyniki dla komórek HCC1954 przedstawiono na Figurze 13 i wyniki dla komórek A549 przedstawiono na Figurze 14. W każdym przypadku, oczywiste jest, że komórki CEACAM6 CAR-T mają wysoką aktywność cytotoksyczną przeciwko komórkom rakowym.
PL 240 585 B1
Dane te przedstawiają specyficzną i wysoką aktywność cytotoksyczną CEACAM-CAR-T przeciwko wszystkim czterem liniom komórkowym: komórkom raka trzustki BxPC3, raka piersi HCC1954, raka okrężnicy LS174T i raka płuc A549. Wszystkie te linie komórek rakowych można zastosować jako komórki modelowe dla badań in vivo z komórkami CEACAM-CAR-T. Dane te sugerują, że komórki CEACAM6 CAR-T mają aktywność cytotoksyczną przeciwko dowolnemu nowotworowi wyrażającemu CEACAM6.
P r z y k ł a d 5
Skuteczność komórek CEACAM-6-CAR-T w ustanowionych ksenoprzeszczepach raka trzustki BxPC3, badano in vivo. W powyższych przykładach, wysoka cytotoksyczność komórek CEACAM-6-CAR-T przeciwko komórkom BxPC3 in vitro i in vivo została wykazana, gdy komórki CAR-T wstrzykiwano po raz pierwszy dzień po wstrzyknięciach komórek nowotworowych. W tym przykładzie zastosowano myszy CIEA-NOG (Taconic) nastrzykiwane podskórnie komórkami BxPC3 do tylnego boku (2x106 komórek/mysz). Trzy grupy myszy: PBS, pozorowane (komórki T) i komórki CEACAM-6 CAR-T (5 myszy na grupę) traktowano dnia 12 (gdy nowotwory ksenoprzeszczepu osiągnęły objętość 100 mm3), 20 i 26 wstrzyknięciami dożylnymi (i.v.) albo 1 x PBS albo 1x107 komórek T albo komórek CAR-T.
Dane wykazują bardzo wysoką skuteczność komórek CEACAM-6 CAR-T z zastosowaniem ustanowionego mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Komórki CEACAM-6 CAR-T istotnie zmniejszały wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki BxPC3 względem grupy kontrolnej PBS (wartość p < 0,002). Dane wykazują wysoki potencjał terapeutyczny komórek CEACAM-6 CAR-T przeciwko rakowi trzustki i potwierdzają i powtarzają powyższy wynik badania in vivo. Wyniki te sugerują, że komórki CEACAM-6-CAR-T są przydatne w przyszłych badaniach klinicznych i sposobach leczenia.
Test RTCA
Cytotoksyczność komórek CEACAM-6-CAR-T przeciwko docelowym komórkom BxPC3 zmierzono przez analizę komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) dla każdej serii komórek CAR-T (#1,2 i 3) (Figury 15, 16 i 17). Obecnie RTCA dostarcza wiarygodnych danych, gdy stosuje się adherentne linie komórkowe. Komórki docelowe są komórkami BxPC3 i komórkami efektorowymi są komórki CAR-T w stosunku 1:10.
Próbki doświadczalne RTCA obejmują następujące:
(i) Docelowe komórki BxPC3;
(ii) prawidłowe, nietransdukowane komórki CAR-T (kontrola negatywna komórek efektorowych); i (iii) Komórki CEACAM-6-CAR-T, ludzkie komórki T transdukowane lentiwirusem CEACAM-6 CAR (pozytywne komórki efektorowe).
W skrócie, komórki wysiano w 1x104 komórek na dołek 24 h przed wprowadzeniem komórek efektorowych CEACAM-6 CAR-T. Wartości impedancji na E-płytce zapisywano od tego momentu. Gdy komórki były konfluentne, dołki przemywano i dodawano odpowiednią liczbę komórek CAR-T w stosunku do komórki docelowej 10:1.
Dane (Figury 15A, B i C) wyraźnie przedstawiają istotny wzrost cytotoksyczności komórek BxPC3 przez CEACAM-6-CAR-T w porównaniu z komórkami T kontroli negatywnej. Kontrolne komórki T mają pewną aktywność cytotoksyczną, którą obserwowano wcześniej u niektórych dawców.
Komórki CEACAM-6 CAR-T istotnie zmniejszały wzrost nowotworu ksenoprzeszczepu BxPC3 in vivo.
tygodniowe samice myszy CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlSug/JicTac) uzyskano od Taconic Bioscience (Hudson, NY). Komórki raka trzustki BxPC3 (2x106 komórek/mysz) wstrzykiwano podskórnie do tylnego boku myszy NOG. Gdy objętość nowotworu osiągnęła 100 mm3, PBS, komórki T lub komórki CEACAM-6-CAR-T wstrzykiwano (1x107/mysz) dożylnie do żyły ogonowej myszy w dniach 12, 20 i 26. Wielkość nowotworu i masę ciała myszy mierzono dwa razy w tygodniu za pomocą suwmiarek, a objętość nowotworu obliczono z zastosowaniem następującego wzoru: (długość x szerokość2)/2.
Komórki CEACAM-6 CAR-T istotnie zmniejszały wzrost ustanowionego nowotworu ksenoprzeszczepu BxPC3 in vivo (wartość p względem PBS = 0,0386, wartość p względem pozorowanych komórek T = 0,0005, dnia 3, 1-kierunkowa ANOVA z testem porównań wielokrotnych Tukey’a) (Figura 16).
Komórki CEACAM-6 CAR-Tzmniejszały wielkości nowotworów
Nie zaobserwowano efektów toksycznych komórek CEACAM-6-CAR-T na masę ciała myszy (Figura 17) i wszystkie myszy były żywe po 3 wstrzyknięciach komórek CEACAM-6-CAR-T (łącznie 3x107 komórek wstrzykiwanych podczas 3 wstrzyknięć, które w przybliżeniu są równoważne 3x10

Claims (36)

  1. PL 240 585 Β1 ludzkiej dawki). Nie było poważnych nieprawidłowych obserwacji w grupie CEACAM-CAR-T, podczas gdy były w grupach kontrolnych ze względu na wzrost nowotworu. Jak przedstawiono na Figurze 18, myszy traktowane CEACAM-6 CAR-T miały zmniejszone wielkości nowotworów i była całkowita eliminacją dwóch nowotworów.
    Komórki CEACAM-6-CAR-T istotnie zmniejszają wzrost komórek raka trzustki BxPC3 in vitro i istotnie zmniejszają wzrost ustanowionego nowotworu ksenoprzeszczepu raka trzustki BxPC3 in vivo. Wyniki, w połączeniu z tymi powyższymi, silnie wskazują, że CEACAM-6 można zastosować jako nowe i skuteczne leczenie immunoterapią przeciwko nowotworom wyrażającym CEACAM-6.
    Zastrzeżenia patentowe
    1. Chimeryczny receptor antygenowy (CAR) zawierający lub składający się z sekwencji: MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPASQVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCRTSGRTNSVYTM GWFRQAPGKEREFVAQIMWGAGTNTHYADSVKGRFTISRDSAESTVYLQMNSLKPE DTAVYYCAANRGIPIAGRQYDYWGQGTQVTVSSLEIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHV KGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYM NMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGR REEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:5) lub sekwencji w co najmniej 95% z nią identycznej na całej długości, specyficzne wiążący się z komórkową cząsteczką adhezyjną 6 związaną z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6).
  2. 2. CAR według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę elementu dystansowego, region transbłonowy i jedną albo większą liczbę domen przekazywania sygnału w komórce wybranych z grupy składającej się z ludzkiego białka CD8-alfa, ludzkiego białka CD28, ludzkiego białka CD3-zeta, ludzkiego białka FcRy, białka CD27, białka 0X40, ludzkiego białka 4-IBB, modyfikowanych wersji dowolnych z powyższych i dowolnych połączeń powyższych.
  3. 3. CAR według z zastrz. 1 lub 2, przy czym CAR jest humanizowany.
  4. 4. Komórka immunologiczna, znamienna tym, że jest komórką T lub komórką zabójcą indukowaną cytokiną (CIK) zawierającą CAR jak określony w zastrzeżeniu od 1 do 3.
  5. 5. Komórka immunologiczna według zastrz. 4, znamienna tym, że ponadto zawiera co najmniej drugi CAR.
  6. 6. Komórka immunologiczna według zastrz. 4-5, znamienna tym, że ponadto zawiera system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
  7. 7. Komórka immunologiczna według zastrz. 6, znamienna tym, że system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
  8. 8. Komórka immunologiczna według zastrz. 6 lub 7, znamienna tym, że system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
  9. 9. Komórka immunologiczna według zastrz. 4-8, znamienna tym, że ponadto zawiera gen samobójczy.
  10. 10. Komórka immunologiczna według zastrz. 4-9, znamienna tym, że jest formułowana do kompozycji zawierającej farmaceutyczny nośnik, rozcieńczalnik i/lub rozczynnik.
  11. 11. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje chimeryczny receptor antygenowy (CAR) jak określony w zastrzeżeniach od 1 do 3.
  12. 12. Cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą CAR jak określoną w zastrz. od 1 do 3, znamienna tym, że CAR zawiera w kolejności od N-końca do C-końca:
    i) przeciwciało jednodomenowe lub jego fragment specyficzny dla wiązania z komórkową cząsteczką adhezyjną 6 związaną z antygenem rakowo-płodowym (CEACAM6);
    ii) domenę transbłonową;
    iii) polipeptyd kostymulatorowy, przy czym polipeptyd kostymulatorowy jest polipeptydem 4-1BB i/lub polipeptydem ΟΧ-40; i iv) wewnątrzkomórkową domenę przekazywania sygnału.
    PL 240 585 B1
  13. 13. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera region zawiasowy umieszczony między przeciwciałem jednodomenowym i domeną transbłonową.
  14. 14. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że region zawiasowy jest regionem zawiasowym immunoglobuliny IgG lub zawiasem pochodzącym z CD8.
  15. 15. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12-14, znamienna tym, że wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawiera aktywujący motyw immunoreceptora na bazie tyrozyny (ITAM).
  16. 16. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 15, znamienna tym, że wewnątrzkomórkowa domena przekazywania sygnału zawierająca ITAM jest wybrana z CD3-zeta i ZAP70.
  17. 17. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12-16, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki T.
  18. 18. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12-17, znamienna tym, że sekwencja nukleotydową jest operacyjnie połączona z promotorem specyficznym dla komórki NK.
  19. 19. Chimeryczny receptor antygenowy (CAR) kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego zawierającą SEQ ID NO:9 lub SEQ ID NO: 10.
  20. 20. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń od 12 do 19.
  21. 21. Komórka immunologiczna gospodarza znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, jak określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń od 12 do 20.
  22. 22. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 21, znamienna tym, że komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z komórki T i komórki zabójcy indukowanej cytokiną CIK.
  23. 23. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 21-22, znamienna tym, że ponadto zawiera co najmniej drugi CAR.
  24. 24. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 21-23, znamienna tym, że ponadto zawiera system transpozonu/transpozazy, który jest opcjonalnie hiperaktywny.
  25. 25. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 24, znamienna tym, że system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy typu Śpiącej Królewny.
  26. 26. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 24, znamienna tym, że system transpozonu/transpozazy jest systemem transpozonu/transpozazy SB100X.
  27. 27. Komórka immunologiczna gospodarza według zastrz. 21-26, znamienna tym, że ponadto zawiera gen samobójczy.
  28. 28. Populacja komórek zawierająca co najmniej jedną komórkę gospodarza, jak określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń od 21 do 27.
  29. 29. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera komórkę immunologiczną, jak określona w którymkolwiek z zastrzeżeń od 21 do 27 lub komórkę gospodarza jak określoną w którymkolwiek z zastrzeżeń od 4 do 10.
  30. 30. Komórka immunologiczna jak określona zastrzeżeniach od 4 do 10 do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym komórka immunologiczna podawana jest ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka.
  31. 31. Komórka immunologiczna do zastosowania według zastrz. 30, znamienna tym, że nowotworem jest nowotwór wyrażający CEACAM6.
  32. 32. Komórka immunologiczna do zastosowania według zastrz. 30-31, znamienna tym, że nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
  33. 33. Komórka immunologiczna do zastosowania według zastrz. 30-32, znamienna tym, że zastosowanie ponadto obejmuje podawanie środka chemoterapeutycznego.
  34. 34. Komórka immunologiczna gospodarza jak określona w zastrzeżeniach od 25 do 31 do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka, przy czym komórka immunologiczna gospodarza podawana jest ssakowi w ilości skutecznej w leczeniu lub zapobieganiu nowotworowi u ssaka.
  35. 35. Komórka immunologiczna gospodarza do zastosowania według zastrz. 34, znamienna tym, że nowotworem jest nowotwór wyrażający CEACAM6.
  36. 36. Komórka immunologiczna gospodarza do zastosowania według zastrz. 34-35, znamienna tym, że nowotworem jest rak trzustki, rak piersi, rak okrężnicy i odbytnicy, rak płuc, rak żołądka, rak wątrobowokomórkowy, rak jajnika lub rak pęcherza moczowego.
PL422231A 2016-07-18 2017-07-17 Chimeryczny receptor antygenowy (CAR), komórki immunologiczne zawierające CAR oraz kompozycja farmaceutyczna je zawierająca do leczenia nowotworów PL240585B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662363541P 2016-07-18 2016-07-18
USUS62/363,541 2016-07-18
US201662410581P 2016-10-20 2016-10-20
USUS62/410,581 2016-10-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL422231A1 PL422231A1 (pl) 2018-01-29
PL240585B1 true PL240585B1 (pl) 2022-05-02

Family

ID=60941975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL422231A PL240585B1 (pl) 2016-07-18 2017-07-17 Chimeryczny receptor antygenowy (CAR), komórki immunologiczne zawierające CAR oraz kompozycja farmaceutyczna je zawierająca do leczenia nowotworów

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11242386B2 (pl)
EP (1) EP3485017A4 (pl)
JP (1) JP7178568B2 (pl)
KR (1) KR20190057275A (pl)
CN (1) CN109477114A (pl)
AU (1) AU2017299854A1 (pl)
CA (1) CA3031289A1 (pl)
IL (1) IL264223A (pl)
PL (1) PL240585B1 (pl)
WO (1) WO2018014122A1 (pl)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10617720B2 (en) * 2016-10-20 2020-04-14 Miltenyi Biotech, GmbH Chimeric antigen receptor specific for tumor cells
EP3898993A1 (en) * 2018-12-20 2021-10-27 Poseida Therapeutics, Inc. Nanotransposon compositions and methods of use
CN111041064A (zh) * 2019-07-22 2020-04-21 徐州医科大学 一种体外评价car-t杀伤活性的方法
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
JP2023545893A (ja) * 2020-08-19 2023-11-01 ▲蘇▼州易慕峰生物科技有限公司 ヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞及び応用
WO2022214835A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Achilles Therapeutics Uk Limited Batch release assay for pharmaceutical products relating to t cell therapies
WO2024084852A1 (ja) * 2022-10-20 2024-04-25 国立大学法人三重大学 Ｃａｒをコードする核酸分子とそれを含むベクター、ｃａｒ、ｃａｒを含む免疫細胞とその細胞を含む医薬組成物、並びにｃａｒを含む免疫細胞の製造方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9125768D0 (en) 1991-12-04 1992-02-05 Hale Geoffrey Therapeutic method
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
AU7516694A (en) 1993-07-30 1995-02-28 Affymax Technologies N.V. Biotinylation of proteins
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
CA2406864A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
EP1452601A1 (en) 2003-02-28 2004-09-01 Roche Diagnostics GmbH Enhanced expression of fusion polypeptides with a biotinylation tag
US9228180B2 (en) 2007-07-04 2016-01-05 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Polypeptide variants of sleeping beauty transposase
EP2621955B1 (en) * 2010-10-01 2018-01-17 National Research Council of Canada Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof
MX347078B (es) * 2010-12-09 2017-04-10 Univ Pennsylvania Uso de celulas t modificadas por receptor de antigeno quimerico para tratar cancer.
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP2997141B1 (en) * 2013-05-13 2022-10-12 Cellectis Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
EP3783098A1 (en) * 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
EP3066118B1 (en) 2013-11-06 2020-01-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Alk antibodies, conjugates, and chimeric antigen receptors, and their use
WO2015095895A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
US11041021B2 (en) * 2014-05-23 2021-06-22 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Car based immunotherapy
WO2016073381A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Cerus Corporation Compositions and methods for improved car-t cell therapies
EP3018200A1 (en) 2014-11-07 2016-05-11 Fondazione Matilde Tettamanti e Menotti de Machi Onlus Improved method for the generation of genetically modified cells

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190057275A (ko) 2019-05-28
JP2019524100A (ja) 2019-09-05
EP3485017A4 (en) 2020-03-04
WO2018014122A1 (en) 2018-01-25
IL264223A (en) 2019-02-28
PL422231A1 (pl) 2018-01-29
CN109477114A (zh) 2019-03-15
AU2017299854A1 (en) 2019-01-31
US11242386B2 (en) 2022-02-08
US20180016337A1 (en) 2018-01-18
EP3485017A1 (en) 2019-05-22
JP7178568B2 (ja) 2022-11-28
CA3031289A1 (en) 2018-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111133101B (zh) 可诱导分泌抗cd47抗体的工程化免疫细胞
US11242386B2 (en) CEACAM6 CAR immune cells to treat cancers
US20170296623A1 (en) INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (iCAR OR N-CAR) EXPRESSING NON-T CELL TRANSDUCTION DOMAIN
US11466088B2 (en) VEGFR-2 car immune cells to treat cancers
CN114634943A (zh) 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法
EP2904106A2 (en) Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
CN109575143B (zh) 双特异性cd20-cd19-car及其应用
US11439665B2 (en) Combined chimeric antigen receptor targeting CD19 and CD20 and application thereof
US20220267405A1 (en) Composition and method for adoptive immunotherapy
IL297916A (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using CD70-specific fusion proteins
WO2020151752A1 (zh) Cd20组合靶向的工程化免疫细胞
CN109897114B (zh) 具有自杀基因开关的靶向cd47的工程化免疫细胞
US20210395362A1 (en) Car-t cells with humanized cd19 scfv with mutation in cdr 1 region
WO2022151959A1 (zh) 靶向b7-h3的car-t细胞及其在急性髓系白血病治疗中的应用
CN116963771A (zh) 桥粒芯蛋白2-定向嵌合抗原受体(car)构建体和使用方法
CN114685684A (zh) MUC1-Tn嵌合抗原受体修饰的Vγ9Vδ2T细胞及其应用