CN112662704A - 提高细胞产生单克隆的能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供提高细胞增殖能力的方法。通过对特定基因进行基因编辑，能够显著提高难以生产单克隆的细胞株在低接种密度的增殖能力，从而可以利用其生产单克隆。获得的细胞的单克隆可以稳定永久的进行无限传代，并且在使用这样的细胞株生产单克隆的过程中，不需要添加外源生长因子或使用特殊的培养基。
Description
技术领域
本发明涉及通过基因编辑方法提高细胞增殖能力的方法。具体涉及提高难以形成单克隆的细胞系增殖能力，从其生产单克隆的方法。
背景技术
细胞单克隆广泛用于抗体的生产及基因功能研究、蛋白通路研究等科研领域，蛋白生产、抗体生产、药理研究、新药开发等生物医药领域等中，在单抗药物不断增多的今天，需要利用越来越多的细胞株形成单克隆。
但存在以下问题：细胞种类千差万别，并非所有细胞都能成功形成细胞单克隆，而且，为了提供细胞形成单克隆的个体化环境，有时需要向培养基中加入各种细胞因子，甚至配置特殊的培养基。而由于细胞之间的差异，许多细胞株所适用的细胞因子需要通过大量条件摸索才能确定，甚至无法找到对应的细胞因子。这两个问题限制了应用于生产单克隆的细胞种类。
具体地，对于细胞单克隆成功形成，受到单克隆的生长时间限制、存在获得单个阳性克隆的几率即单克隆形成率极低等问题。单克隆形成率受多种因素影响，其中，细胞的增殖活力最为重要。现有技术中，一般采用如下两种方法提高细胞的增殖活力：
(1)适当传代：使用梯度稀释法接种细胞后，培养至细胞形成克隆。将每个孔中的克隆进行逐级扩大培养，转移至96孔板的新孔中。当新孔中细胞生长至80％的汇合度，将孔中细胞转移至48孔板的一个孔中。使细胞继续增殖生长至获得足够数量的细胞用于验证分析。
(2)添加合适的辅助因子、细胞因子：尽管血清中含有细胞生长所必须的营养物质，在细胞培养基中添加适量的添加剂，例如胰岛素、转铁蛋白和硒可以促进细胞生长。对于某些细胞系，乙醇胺可能也很重要。在某些情况下，附着因子，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白和生长因子对细胞的生长也是有益的。
但是，由于细胞系来源的多样，有些细胞例如THP-1、Caco-2、SHY5Y等难以生产单克隆。这些细胞的增殖与其特性密切相关，必须依赖于细胞间的作用和细胞因子的调节，因此需要较高的接种密度，当在细胞密度低的时候则几乎无法形成单克隆。
具体例如，作为人B淋巴母细胞系的HMy2.CIR细胞，衍生自HMy.2B淋巴母细胞系，其为ARH-77细胞系(ATCC CRL-1621)的快速生长突变体，通过伽马射线照射和选择而缺失HLAI类抗原表达。该细胞系常用于电离辐射等条件下，对细胞功能及作用机制进行研究的细胞模型。HL-60细胞是来源于一个36岁患急性早幼粒细胞白血病的女性，主要为嗜中性的早幼粒细胞，其是血液肿瘤细胞中常用的细胞株系，经常应用于急性髓系白血病等血液肿瘤的药效学和机制研究。经单克隆测试发现，若以相当于96孔板中约10cells/孔的细胞接种密度培养，这两种细胞都无法在96孔板中生产单克隆。
对这些细胞而言，即使进行传代或添加合适的辅助因子，也不能使得这类细胞的单克隆存活生长。并且，这类依赖于细胞密度生长的细胞株由于在低接种密度下增殖能力差，不适用于形成单克隆常用的有限稀释、梯度稀释、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选等等实验方法，这制约了对这类细胞的应用开发和功能研究。因此，需要提高其在低接种密度下的增殖能力，使其获得形成单克隆的能力，从而得到稳定的细胞系。
发明内容
Tet2基因，全称为tet methylcytosine dioxygenase 2[Homo sapiens(human)]Gene ID:54790，其编码的蛋白质是催化甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶的甲基胞嘧啶双加氧酶，编码的蛋白质参与髓细胞生成。通常负责调节血细胞的形成，控制这些细胞的生长。有研究证实，该基因的缺陷与数种骨髓增殖性疾病相关。其作用模式示于图1。但对于Tet2基因在提高难生成单克隆的细胞在低接种密度下的体外增殖活力中的应用目前尚未报道。
发明人发现，通过沉默细胞中的Tet2基因表达，能够提高细胞在低接种密度下的增殖活力。并且在整个筛选、单克隆化的过程中，不需要添加外源生长因子等，获得的细胞株系可以稳定永久的进行无限传代，从而最终解决了部分细胞系不能用于生产单克隆，及需要额外加入生长因子来构建单克隆生长环境的问题。
具体而言，发明人通过CRISPR-Cas9技术构建Tet2沉默表达载体，利用脂质体、慢病毒、电转染等常用方式对例如HMy2.CIR细胞进行转染、筛选后，得到了稳定的细胞株。与未经Tet2沉默的细胞相比，该细胞株的单克隆形成率极大提高，能够使无法获得单克隆的细胞(例如，原本无法以在96孔板中以19.35cell/孔以下的接种密度下生长的细胞)，例如在以在96孔板中1cell/孔进行接种(60孔/板)时获得超过15个单克隆。
本发明包括以下内容。
1.提高细胞(优选体外细胞)增殖能力的方法，包括：
通过基因编辑使所述细胞中的Tet2基因表达降低，不表达或功能缺失，获得编辑细胞；
培养所述编辑细胞，并从该编辑细胞或其后代细胞中选择具有能够在较低的播种密度(例如，相当于96孔板中19.53cell/孔以下)生长的能力的细胞。
2.根据项1所述的方法，其中，所述基因编辑方法选自ZFN、TALEN技术、CRISPR-Cas9技术，优选为CRISPR-Cas9技术。
3.根据项1或2所述的方法，包括使用选自如下的组中的一种或多种shRNA靶点：
shRNA1，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列；
shRNA2，其包含如SEQ ID NO:2所示的序列；
shRNA3，其包含如SEQ ID NO:3所示的序列；
shRNA4，其包含如SEQ ID NO:4所示的序列；
shRNA5，其包含如SEQ ID NO:5所示的序列；和
shRNA6，其包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
4.根据项3所述的方法，包括使用针对所述shRNA靶点设计的引物，优选所述引物为：
TET2-shRNA-1F，其包含如SEQ ID NO:7所示的序列；
TET2-shRNA-1R，其包含如SEQ ID NO:8所示的序列；或
TET2-shRNA-2F，其包含如SEQ ID NO:9所示的序列；
TET2-shRNA-2R，其包含如SEQ ID NO:10所示的序列；或
TET2-shRNA-3F，其包含如SEQ ID NO:11所示的序列；
TET2-shRNA-3R，其包含如SEQ ID NO:12所示的序列；或
TET2-shRNA-4F，其包含如SEQ ID NO:13所示的序列；
TET2-shRNA-4R，其包含如SEQ ID NO:14所示的序列；或
TET2-shRNA-5F，其包含如SEQ ID NO:15所示的序列；
TET2-shRNA-5R，其包含如SEQ ID NO:16所示的序列；或
TET2-shRNA-6F，其包含如SEQ ID NO:17所示的序列；
TET2-shRNA-6R，其包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，包括通过选自梯度稀释法、有限稀释法、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选法中的一种或多种方法的组合进行选择，
所述选择包括筛选能在相当于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下，优选为1cell/孔；特别优选为0.5cell/孔的播种密度下长成单克隆的细胞，
在选择期间，在培养细胞的培养基中不含有除了血清以外的额外的生长因子或辅因子。
6.根据项1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞在进行编辑前，在以较低接种密度(例如在相当于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下)进行培养时不能形成克隆，或单克隆形成率较低，
所述细胞为哺乳动物或其他真菌、细菌的细胞，所述哺乳动物例如为人，大鼠，小鼠，猪，牛，马，犬，绵羊，山羊，鸡，鸭，猴，优选为人。
7.根据项1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞选自THP-1，Caco-2，SHY5Y，HMy2.CIR，HL-60。
8.项1-7中任一项所述的方法中使用的载体，所述载体为哺乳动物细胞表达载体，如原核载体，真核载体，腺病毒载体或重组慢病毒载体，优选为重组慢病毒载体，例如lentiCRISPR v2(addgene#52961)、pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(addgene#62988)、lentiGuide-Puro(addgene#52963)。
9.宿主细胞，其含有项7所述的载体。
10.项3所述的ShRNA靶点，项4所述的引物，项8所述的载体或项9所述的宿主细胞在提高细胞增殖能力中的应用。
需要说明的是，虽然在本发明的实施方案中使用了人细胞系，但本发明的方法可以应用在所有包含该基因或其同源基因的哺乳动物细胞株系或其他真菌、细菌等中。所述哺乳动物可举例例如，大鼠，小鼠，猪，牛，马，犬，绵羊，山羊，鸡，鸭，猴等等。所述细胞可以选自THP-1，Caco-2，SHY5Y，HMy2.CIR，HL-60。
本发明的方法应用的范围不限于不能形成克隆或单克隆形成率较低的细胞，也能够用于能形成单克隆的细胞。在这种情况下，由于解除了细胞必须在外源生长因子下生长的限制，从而可以使用细胞普通培养使用的培养基，有降低费用，简化步骤，和节省人力物力的优点。
本发明的优点
本发明提供了一种解决部分细胞株系无法以较低密度接种而培养，从而不能形成单克隆的问题的方法。通过CRISPR-Cas9基因沉默技术使细胞中的Tet2基因表达降低，不表达或功能缺失，实现了细胞系特性的改造，改造后的细胞系能够形成单克隆，且该特性能够稳定传代而不丢失，并且不需要添加外源生长因子或使用特殊的培养基。
另一方面，提供了Tet2基因在解决细胞单克隆生长方面的用途，可期待其在研究和商业化方面的应用。例如，对于单克隆抗体开发，针对于那些难生产单克隆的细胞株系或单克隆生长较慢的细胞株，可以通过敲除或沉默Tet2基因，来实现细胞的单克隆生长或提高单克隆细胞的增殖能力。
附图说明
图1为Tet2基因作用机理图。
图2为LentiGuide-Puro载体质粒图谱。
图3为本发明的技术方案的流程示意图。
图4PCR验证沉默载体构建的电泳图。
图5PCR检测细胞转染成功的电泳图。
图6荧光定量PCR确认细胞Tet2表达沉默的结果图。对照：空白细胞；1～6：分别为转染shRNA-1～6靶点的细胞。
图7中，A为梯度稀释铺板初始接种量，B、C为对照组A，B的梯度稀释法亚克隆生长结果统计图，D为阴性孔和阳性孔在显微镜下的照片。
图8第一轮培养亚克隆梯度稀释生长结果统计图。ABC分别示出1号靶点的细胞生长的A、B、C板的结果。
图9第二轮培养亚克隆梯度稀释生长结果统计图。A为接种3#克隆的板，B为接种4#克隆的板。
图10第二轮培养亚克隆中Tet2表达水平的荧光定量结果。
具体实施方式
在实施例中，发明人对HMy2.CIR进行了Tet2基因的沉默，比较了沉默后的细胞的单克隆生长情况，观察到Tet2基因沉默能够使这HMy2.CIR以较低接种密度在96孔板中进行生长，得到稳定的单克隆。
本发明中所指的“沉默”指使基因“表达降低，不表达或功能缺失”，即无法行使正常功能的状态，两种表述在上下文中可以进行互换。
虽然本发明的实施例中使用了lentiGuide-Puro作为沉默构建载体，但也可使用其他哺乳动物表达载体，如lentiCRISPR v2等等进行替换。
对于进行Tet2基因编辑的细胞株系，虽然本发明的实施例中使用了HMy2.CIR，但也可应用于不同物种，不同种类的原代细胞、肿瘤细胞、免疫细胞等所有细胞。
对于细胞的转染方式，也可以采用脂质体、电击转化、慢病毒等细胞转染方法进行替换。
对于细胞的筛选，能够使用通过选自梯度稀释法、有限稀释法、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选法中的一种或多种方法的组合。
对于初始接种密度，虽然在实施例中的有限稀释法使用了1cell/孔进行筛选，但也可以使用0.5cell/孔，尤其是当需要确认得到的单克隆为单克隆时。
对于细胞表达量的测定，可以采用本领域常用的任意方法，如荧光定量PCR、RT-PCR、WB等方式进行。
虽然本发明仅列出了使Tet2沉默(不表达或功能缺失)的6种具体靶点，但能够实现Tet2的沉默或降低，不表达或功能缺失即可，靶点不限于列出的6个靶点，沉默区域也不限于列出的区域，只要在能够实现本发明的效果的范围内即可。
能够采用其他通常用于进行基因编辑，沉默的方法。例如如下列举的基因敲除、基因插入等方法。进行沉默的技术不限于CRISPR-Cas9技术，也可以采用其他通用方法如同源重组、TALENs、锌指核酸酶(ZFNs)、Integration Operating System(IOS)、CRISPR-Cas12a等基因编辑技术。
实施例
下面通过具体的实施例进一步描述本发明，但并不意在限定本发明的范围。
实施例1沉默Tet2的序列及靶点设计，沉默载体的构建
首先，发明人在分别位于Homo sapiens tet methylcytosine dioxygenase 2(TET2),transcript variant 1,mRNA，NCBI Reference Sequence:NM_001127208.2，及Homo sapiens tet methylcytosine dioxygenase 2(TET2),transcript variant 2,mRNA，NCBI Reference Sequence:NM_017628.4中的两个转录本公共序列区域内，通过在线设计软件http://www.sirnawizard.com/design.php设计得到了6个沉默靶点：shRNA1(如SEQ ID NO:1)，shRNA2(如SEQ ID NO:2所示)，shRNA3(如SEQ ID NO:3所示)，shRNA4(如SEQID NO:4所示)，shRNA5(如SEQ ID NO:5所示)，shRNA6(如所示SEQ ID NO:6)。
这些靶点对应的沉默引物序列为：TET2-shRNA-1F(SEQ ID NO:7)，TET2-shRNA-1R(SEQ ID NO:8)；TET2-shRNA-2F(SEQ ID NO:9)；TET2-shRNA-2R(SEQ ID NO:10)；TET2-shRNA-3F(SEQ ID NO:11)；TET2-shRNA-3R(SEQ ID NO:12)；TET2-shRNA-4F(SEQ ID NO:13)；TET2-shRNA-4R(SEQ ID NO:14)；TET2-shRNA-5F(SEQ ID NO:15)；TET2-shRNA-5R(SEQID NO:16)；TET2-shRNA-6F(SEQ ID NO:17)；TET2-shRNA-6R(SEQ ID NO:18)。
发明人利用以上靶点及引物，使用慢病毒CRISPR基因编辑质粒LentiGuide-Puro(购自addgene#52963，质粒载体图谱示于图2)构建了Tet2沉默载体，通过对表达载体菌落进行PCR筛选，得到大肠杆菌感受态中转化成功的菌落。对转化成功的阳性菌落进行菌落PCR及测序，选择正确的测序结果对应的克隆，进行质粒大量抽提和去内毒素处理后备用。
其中，构建沉默载体使用的酶切位点为BsmBI，菌落的测序委托(上海生工生物工程有限公司)进行，具体步骤如下。
引物退火连接
用移液器将上述组分加样到200μL PCR管中，混匀，放置于PCR仪(Thermo，Veriti96-Well Thermal Cycler)中，95℃3min后自然冷却到室温。连接转化：
(1)将以上连接产物放置于PCR仪中，25℃连接1h后，直接进行转化
(2)从-80度冰箱中取出stbl3感受态大肠杆菌细胞100μL(购自通用生物系统(安徽)有限公司)，放置于冰上融化后，将连接产物全部量加入到感受态细胞中，冰上放置20min。感受态试剂盒：生工，货号：B529303-0200。
(3)提前将水浴锅温度调至42℃。将连接产物插入到浮漂中，热激转化90s后，迅速插入到冰上，冰浴5min。
(4)向热激产物EP管中加入提前放置于37℃培养箱预热的800μL无抗LB培养基，在37℃摇床中150rpm摇45min。
(5)5000rpm离心5min后，在超净工作台中，弃掉800μL左右培养基，保留约80-100μL细胞沉淀并轻轻吹打混匀。
(6)将混匀后的细胞用涂布棒均匀涂布于含有100μg/mL的Amp+固体LB培养皿中，待菌液在培养皿表面干后，盖上平皿，倒置放置于37℃培养箱中，静止过夜培养。
菌落的PCR筛选
(1)将过夜培养的连接平板拿出。
(2)提前准备好灭菌的1.5mLEP管，并在其中加入200μL左右的含Amp的LB培养基。
(3)用灭菌枪头或灭菌牙签，在平板上挑取合适的菌落至1.5mLEP管中，37℃，200rpm摇菌2h。
(4)取2μL摇菌后的产物作为模板，进行菌落PCR筛选，其余菌液继续在摇床上进行培养。
上述下游引物分别为：
TET2-shRNA-1R(SEQ ID NO:8)、TET2-shRNA-2R(SEQ ID NO:10)、TET2-shRNA-3R(SEQ ID NO:12)、TET2-shRNA-4R(SEQ ID NO:14)、TET2-shRNA-5R(SEQ ID NO:16)、TET2-shRNA-6R(SEQ ID NO:18)
PCR反应程序：
95℃3min；95℃30s，55℃20s，72℃1min，30cycles；72℃5min；4℃Forever
(1)PCR反应结束后，取5μL产物跑琼脂糖凝胶电泳，电泳图示于图4。电泳结果显示，靶点1～6号对应的泳道中均至少有一组出现了150bp左右大小的明亮条带。将150bp左右扩增大小的条带对应的菌落即1、4、5、7、9、11号克隆保留，其中，靶点1号对应的构建克隆为1#，靶点2号对应的构建克隆为4#，靶点3号对应的构建克隆为5#，靶点4号对应的构建克隆为7#，靶点5号对应的构建克隆为9#，靶点6号对应的构建克隆为11#。
(2)将上述克隆送测序，剩余菌液放置在4度冰箱中保存备份。测序结果证实上述克隆均构建正确。
质粒大量抽提和内毒素处理
取上述克隆的菌液按照试剂盒说明书操作进行质粒抽提和去内毒素。质粒抽提试剂盒：EndoFree Plasmid Maxi Kit，Qiagen,Cat No./ID:12362。质粒浓度要求：1μg/μL。得到用于沉默Tet2的6个靶点对应的载体质粒。
实施例2沉默靶点的筛选
在本实施例中，首先确认了Tet2基因在HMy2.CIR细胞中的正常表达水平，然后利用实施例1得到的载体质粒进行了细胞转染。而后，测试了6个靶点在细胞中对Tet2基因的沉默效果。
使用的细胞：HMy2.CIR(ATCC:CRL-1993)，从南京科佰生物科技有限公司购得。
具体方法及步骤如下。
细胞转染
(1)方法：电转化
(2)仪器信息：Neon MPK5000(Thermo)
(3)转化条件：HMy2.CIR细胞:1350V,30ms,pulse 1。
(4)转化的细胞量：HMy2.CIR:1×107，HL-60:5×106
对转染后的细胞分别提取基因组DNA进行PCR后电泳，PCR体系与程序同上，基因组验证引物：Puro-F(序列：SEQ ID NO:20)，Puro-R(序列：SEQ ID NO:21)。将PCR产物的电泳图示于图5中。
结果显示，Tet2沉默靶点1～6对应的载体的细胞均扩增出目的片段大小约为300bp的条带，说明靶点正常转进细胞中。由此，分别获得了转染六种不同Tet2沉默靶点载体的HMy2.CIR细胞。
细胞中的Tet2基因表达
为了确定细胞中Tet2的正常表达，利用荧光定量PCR法扩增cDNA模板，检测了未转染的HMy2.CIR细胞。结果证明，Tet2基因能够在HMy2.CIR细胞中正常表达，Ct值正常，数值为26.48。Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式，它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数，Ct值为每个反应管中荧光信号到达设定的阈值时，所对应的循环数。Ct值的正常范围为15-35。
进一步用荧光定量PCR法检测了转染六种Tet2沉默靶点的HMy2.CIR细胞中TET2的标准化表达量。结果示于图6中。同时设置了未经转染的HMy2.CIR细胞作为对照(空白细胞)。
使用的qPCR引物：TET2-qF1：如SEQ ID NO:22所示；TET2-qR1：如SEQ ID NO:23所示。
结果显示：如图所示，在对照组中，可以看到在150bp大小处有清晰的条带，证明在HMy2.CIR细胞中Tet2是表达的。但在HMy2.CIR细胞的6个Tet2沉默转染组的细胞中，Tet2的表达水平发生了降低，有效地发生了沉默。其中，如图6所示，与对照组相比，1，2，4三个靶点的Tet2的表达水平的降低均超过或达到一半(0.5)，其中，1号靶点使细胞的Tet2表达水平降低最大，表达量仅为空白细胞的约十分之一，沉默效果优于其他5个靶点，因此选用于后续试验。
实施例3Tet2沉默的细胞获得单克隆形成能力
在本实施例中，以利用1号靶点进行Tet2沉默的HMy2.CIR细胞为第一代，通过有限稀释或梯度稀释方法进行传代，经三轮的培养筛选，获得了稳定地具有产生单克隆能力的细胞系。
具体方法如下。
首先，以同上实施例1、2的条件对HMy2.CIR细胞电转了1号靶点的沉默载体质粒，获得转染沉默质粒的HMy2.CIR细胞。
3.1第一轮亚克隆筛选
将转染沉默质粒的HMy2.CIR细胞以细胞初始接种量1cell/孔(有限稀释法)或示于图7A的细胞初始接种量(梯度稀释法)接种到96孔板中，每板的试验孔数均为60孔，每种方法设置平行的3块板。
培养基：DMEM+10％FBS，每孔100μL培养基。四周空白孔加PBS缓冲液，防止96孔板中培养基蒸发。培养约10天，中间不换液，10天后每天进行观察，至第14天统计单细胞生长情况。以生长作为阳性(+)，未生长作为阴性(-)，阴性孔和阳性孔的示例照片示于图7D，将生长结果示于图8。同时，设置细胞对照组，将未转染的细胞同样地以梯度稀释法铺板2块96孔板，其生长结果示于图7B，C。重点观察了细胞在初始接种量低于19.53cell/孔的范围(例如，9-11B，8-11C，7-11D，6-11E，5-11F，4-11G，以下简称低密度区域)中的生长情况。
结果显示，在第14天，在细胞对照组中，未转染沉默质粒的细胞在高接种密度下能够生长，但在低密度区域中不能生长出细胞克隆，证实HMy2.CIR细胞的生长增殖依赖于细胞密度，因此难以直接获得单克隆。在以梯度稀释接种试验细胞的板A、B、C中，通过Tet沉默的细胞在低密度区域中以不同程度成功地生长出细胞克隆，板A为1个孔(7D)，板B为3个(7-8D，6E)。板C为4个(9C，7D，6E，8E)，证实通过Tet沉默，能够提高HMy2.CIR细胞在较低密度生长的概率。
在以有限稀释(1cell/孔)接种试验细胞的3块板中，在各孔都没有观察到单克隆生长。发明人推测，这是由于有限稀释法中每板细胞总数较低(约60个)引起的。虽然通过Tet沉默提高了细胞在较低密度生长的概率，但对于从每板60个细胞中进行初筛可能仍是稀疏的，不容易遇到生长孔。提示在初筛时，使用梯度稀释法能够大大提高筛选效率。
将以上在低密度区域中生长出的克隆进行保存，并进行扩大冻存。共得到了8株来自HMy2.CIR细胞的亚克隆，编号1#～8#。
3.2第二轮亚克隆筛选
将第一轮得到的亚克隆3#和4#继续同上地进行了梯度稀释铺板，观察生长结果，示于图9。同时通过qPCR检测长出的亚克隆3-1～3-10中Tet2基因的表达水平，将qPCR结果示于图10。
qPCR使用的引物为：TET2-qF1：SEQ ID NO:22和TET2-qR1：SEQ ID NO:23，以下均相同。
结果显示，在3#和4#亚克隆分别在低密度区域中成功地生长出细胞克隆，3#在低密度区域中长出10个孔，4#为5个孔。将从3#亚克隆获得的10个孔中的克隆分别编号为3-1～3-10。qPCR结果显示，与未转染的细胞相比，克隆3-1～3-10的细胞中Tet2表达水平全部出现了降低，其中，3-1，3-2，3-3，3-7这4株中Tet2表达水平更低。
由此证实了HMy2.CIR细胞在较低密度生长的概率的提高与Tet2基因沉默间的相关性。提示通过Tet2基因沉默，能够增加密度依赖性生长细胞在较低密度生长的概率。
3.3亚克隆的1cell/孔的有限稀释试验
对亚克隆3-7进行1cell/孔的有限稀释。通过这样的累积筛选，以期望得到更纯的单克隆。具体而言，同上操作进行了1cell/孔铺板，共铺5块96孔板，10天后在显微镜下观察细胞生长结果。
结果显示，通过1cell/孔的有限稀释，HMy2.CIR在5块板中均生长出了复数孔的单克隆。其中，各板生长单克隆的孔数分别为15个，16个，18个，20个，25个。可知通过基因沉默与筛选，成功地获得了能以1cell/孔96孔板进行接种而生产成单克隆的HMy2.CIR细胞系，发明人以0.5cell/孔进行铺板时，同样在各板中观察到了单克隆的生长。
综上所述：通过对TET2基因的基因编辑，使HMy2.CIR细胞获得了在1cell/孔96孔板的接种密度情况下生产成单克隆的能力。利用该方法，解决了该细胞之前在低密度下不能生长成单克隆的问题。
细胞能在1cell/孔96孔板的情况下生产成单克隆，意味着能够实现构建单克隆稳定细胞株系的要求，如果后续进行基因功能验证，可以在该细胞基础上，进行相应基因的功能研究。
工业实用性
本发明所得到的改造细胞株系的细胞能在96孔板1cell/孔的接种情况下生产单克隆，意味着能够实现构建单克隆稳定细胞株系的要求，如果后续进行基因功能验证，可以在该细胞基础上进行相应基因的功能研究。可以进行稳定遗传，不会因为传代次数的增加而影响单克隆生长的效果。本发明靶向的Tet2基因在大多数细胞中表达正常，理论上可以通过对其的基因编辑在所有或大多数细胞中产生效果，具有广泛适用性。
本发明采用的CRISPR-Cas9基因沉默技术为目前应用较为广泛的基因编辑工具，整个操作过程简单易上手，获得能生长为单克隆的细胞仅需两或三轮筛选。流程时间短，沉默效率高。所采取的实验操作均为分子和细胞生物学常用操作，在一般实验室即可实现。降低了利用难以长成单克隆的细胞进行基因功能研究的难度，能够满足在那些难生长成为单克隆细胞株系上进行基因功能研究的需求。
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Claims (10)
1.提高细胞(优选体外细胞)增殖能力的方法，包括：
通过基因编辑使所述细胞中的Tet2基因表达降低，不表达或功能缺失，获得编辑细胞；
培养所述编辑细胞，并从该编辑细胞或其后代细胞中选择具有能够在较低的播种密度(例如，相当于96孔板中19.53cell/孔以下)生长的能力的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因编辑方法选自ZFN、TALEN技术、CRISPR-Cas9技术，优选为CRISPR-Cas9技术。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括使用选自如下的组中的一种或多种shRNA靶点：
shRNA1，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列；
shRNA2，其包含如SEQ ID NO:2所示的序列；
shRNA3，其包含如SEQ ID NO:3所示的序列；
shRNA4，其包含如SEQ ID NO:4所示的序列；
shRNA5，其包含如SEQ ID NO:5所示的序列；和
shRNA6，其包含如SEQ ID NO:6所示的序列。
4.根据权利要求3所述的方法，包括使用针对所述shRNA靶点设计的引物，优选所述引物为：
TET2-shRNA-1F，其包含如SEQ ID NO:7所示的序列；
TET2-shRNA-1R，其包含如SEQ ID NO:8所示的序列；或
TET2-shRNA-2F，其包含如SEQ ID NO:9所示的序列；
TET2-shRNA-2R，其包含如SEQ ID NO:10所示的序列；或
TET2-shRNA-3F，其包含如SEQ ID NO:11所示的序列；
TET2-shRNA-3R，其包含如SEQ ID NO:12所示的序列；或
TET2-shRNA-4F，其包含如SEQ ID NO:13所示的序列；
TET2-shRNA-4R，其包含如SEQ ID NO:14所示的序列；或
TET2-shRNA-5F，其包含如SEQ ID NO:15所示的序列；
TET2-shRNA-5R，其包含如SEQ ID NO:16所示的序列；或
TET2-shRNA-6F，其包含如SEQ ID NO:17所示的序列；
TET2-shRNA-6R，其包含如SEQ ID NO:18所示的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，包括通过选自梯度稀释法、有限稀释法、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选法中的一种或多种方法的组合进行选择，
所述选择包括筛选能在相当于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下，优选为1cell/孔；特别优选为0.5cell/孔的播种密度下长成单克隆的细胞，
优选，在选择期间，在培养细胞的培养基中不含有除了血清以外的额外的生长因子或辅因子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞在进行编辑前，在以较低接种密度(例如在相当于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下)进行培养时不能形成克隆，或单克隆形成率较低，
所述细胞为哺乳动物或其他真菌、细菌的细胞，所述哺乳动物例如为人，大鼠，小鼠，猪，牛，马，犬，绵羊，山羊，鸡，鸭，猴，优选为人。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞选自THP-1，Caco-2，SHY5Y，HMy2.CIR，HL-60。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法中使用的载体，所述载体为哺乳动物细胞表达载体，如原核载体，真核载体，腺病毒载体或重组慢病毒载体，优选为重组慢病毒载体，例如lentiCRISPR v2(addgene#52961)、pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(addgene#62988)、lentiGuide-Puro(addgene#52963)。
9.宿主细胞，其含有权利要求7所述的载体。
10.权利要求3所述的ShRNA靶点，权利要求4所述的引物，权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞在提高细胞增殖能力中的应用。
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