CN104622903A - 抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以分泌特异性重组免疫毒素Gas6-PE38KDEL的间充质干细胞制剂，从而靶向治疗恶性黑色素瘤，为靶向治疗恶性黑色素瘤提供新的治疗方向。本发明干细胞制剂首先构建Axl配体(Gas6)和绿脓奸菌外毒素衍生物PE38KEDL组成的特异性免疫毒素Gas6-PE38KDEL腺病毒载体，体外感染间充质干细胞，感染后间充质千细胞分泌的Gas6-PE38KDEL能够特异性地靶向杀伤恶性黑色素瘤细胞。本发明还提供了该干细胞制剂的制备方法。

Description

抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂及其制备方法，属于生物医学研究技术领域。

背景技术

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是皮肤肿瘤的一种，是所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤，年增长率约3-5%。恶性黑色素瘤是由位于表皮基底部的黑色素细胞恶变形成的，多由痣或色素斑发展而来，一旦进入快速生长期，则预后差、死亡率高，尤其是转移性恶性黑色素瘤，患者中位生存期仅约5-11月，1年总生存率只有27%，5年生存率＜5%。恶性黑色素瘤90%发生于皮肤，最常见于背部，胸腹部和腿部，足底、指趾、甲下、头皮等部位也不少见；少数发生于外阴、消化道和眼内。

对于肿瘤的治疗，目前常采用的方案为化疗、放疗及手术治疗。化疗对于恶性黑色素瘤并不敏感；同时黑色素瘤被认为是一种抗辐射的恶性肿瘤，对于放疗也不敏感，对于淋巴转移或肿瘤很多手术效果不好的患者，此方法只能作为姑息治疗的一种手段。这些措施对于很多癌症病例的治疗效果不大，而且化疗和放疗方法副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。手术治疗对于早期实体瘤治疗效果较好，而大多数已发生转移的恶性黑色素瘤患者在多数组织中已存在广泛的病变，因此已无法进行切除些有孤立病灶未见远处播散，仅有黑色素瘤结节的患者，也常常因为存在微转移因而不能通过手术切除来控制其长期存活的可能。对于那些丧失手术机会的Ⅳ期黑色素瘤患者的化疗与放疗目前无明显进展。但手术仍然是恶性黑色素瘤的一项重要治疗手段。

因此，恶性黑色素瘤的治疗目前仍是医学界的一个难题，探索恶性黑色素瘤新的治疗方法十分必要。肿瘤的免疫毒素治疗是最近十几年发展起来的新疗法。免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是将具有导向能力的肿瘤特异性分子与毒素蛋白偶联而成的一种杂合分子。

由于导向分子可以特异地识别肿瘤细胞，所以免疫毒素在体内可以像“导弹”一样定向寻找肿瘤细胞，并将其杀死，但同时对正常组织又不会造成损伤，因此又被称为肿瘤治疗的“生物导弹”。用于构建免疫毒素“弹头”的是毒素蛋白，如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)、白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)以及萬麻毒素(Ricin)。这些毒素分子对细胞的杀伤能力非常强，一般认为，只要一个毒素分子进入细胞，就可以使该细胞死亡，而且肿瘤细胞一般不会对毒素产生耐药性。由于免疫毒素疗法采取的是一种杀伤性策略，避免了停药后复发和肿瘤产生耐药性的缺点，是极具潜力的一种抗肿瘤治疗方法。

肿瘤发生、发展的内外因素及分子生物学基础涉及多种癌基因与抑癌基因的异常表达。近年来原癌基因 Axl 成为研究的热点之一，可作为恶性黑色素瘤诊断、预后与治疗的靶向分子应用于临床工作中，已证实其作为新的靶向分子药物的有效性。

Axl(Anexelekto)是编码受体酪氨酸激酶基因之一，大小约140kD(1D=1u) 的跨膜分子，定位于19q13.1，全长 42185 kb，由 698 个腺嘌呤、972 个胞嘧啶、931 个鸟嘌呤和 626 个胸腺嘧啶构成，有 20 个外显子。与Tyro3 和Mer共同组成受体酪氨酸激酶亚家族(TAM family)，其核苷酸序列具有相似的分子结构，均由胞外区、胞内区和跨膜区 3 部分组成。Axl及其配体生长停滞特异性基因 6( grow th arrest-specific protein 6，Gas6)参与细胞增殖、凋亡、细胞黏附与转移、血液凝固的稳定性以及调节炎症因子释放等作用，在细胞恶性转化、肿瘤性血管生成及侵袭性等病理过程中扮演重要角色。

导向分子是免疫毒素治疗的基础，免疫毒素对肿瘤特异性的杀伤作用依赖于肿瘤细胞上特异性表达的标志物。Axl广泛高表达于多同的肿瘤组织和细胞系，包括恶性黑色素瘤。有研究表明，是一个重要的黑色素瘤致癌基因。许多证据表明，在肿瘤的血管形成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中，Axl发挥着重要作用。已证实应用Axl蛋白的抗体靶向抑制试验，下调即Axl蛋白表达的同时，也抑制了肿瘤细胞的生长，进而降低肿瘤的恶性程度。

免疫毒素靶向治疗肿瘤需要考虑的一个关键问题是如何确保免疫毒素选择性地靶向杀伤肿瘤组织而且保护周围的正常组织免受“误伤”。传统的免疫毒素虽然也能够选择性的靶向杀伤肿瘤细胞，但是由于其天然的局限性：（A）难以渗透到肿瘤局部并达到一定的药物浓度；（B）在非靶点组织的聚集降低了耐药浓度且缩窄了治疗窗口，因此临床应用受到很大的限制。因此，选择合适的载体工具使免疫毒素在肿瘤内起作用显得非常重要。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有取材方法简单，体外扩增容易，外源基因表达稳定具、分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等诸多优点，为我们展示了良好的研究及应用前景。大量文献已经证实间充质干细胞的优良特点，如迁移能力和肿瘤趋化作用，可以作为良好的基因治疗运载工具。根据这一特点，将恶性黑色素瘤细胞特异性的免疫毒素基因转染间充质干细胞(MSCs)，使其成为能够分泌产生免疫毒素的细胞，可将免疫毒素基因带到肿瘤局部持续表达并发挥作用。

基于以上背景，我们开发一种可以分泌特异性重组免疫毒素Gas6-PE38KDEL的间充质干细胞制剂，从而靶向治疗恶性黑色素瘤。本制剂首先构建Axl配体(Gas6)和绿脓奸菌外毒素衍生物PE38KEDL组成的特异性免疫毒素Gas6-PE38KDEL腺病毒载体，体外感染间充质干细胞，实验证实间充质千细胞分泌的Gas6-PE38KDEL能够特异性地靶向杀伤恶性黑色素瘤细胞。进一步可将表达该特异性免疫毒素的间充质干细胞回输体内，利用间充质干细胞的趋瘤性，实现在肿瘤组织局部持续表达特异性免疫毐素Gas6-PE38KDEL，从而对恶性黑色素瘤细胞产生特异性杀伤效应，为恶性黑色素瘤靶向治疗提供新的治疗策略。

发明内容

本发明的目的是结合基因工程技术和干细胞生物技术开发一种生物治疗制剂：抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂。

本发明同时提供了一种抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂是由可以分泌特异性重组免疫毒素GAS 6-PE38KDEL的间充质干细胞制备而成。

进一步的，所述的间充质干细胞来源于骨髓、脐带或胎盘，优选来自骨髓源的间充质干细胞。

上述的一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，由以下步骤组成：

步骤一，构建Axl配体(Gas6)和绿脓奸菌外毒素衍生物PE38KEDL组成的特异性免疫毒素Gas6-PE38KDEL腺病毒载体；

步骤二，以感染复数为800-1000的腺病毒体外感染间充质干细胞，收集感染后3-18天的间充质干细胞制备成干细胞制剂。

一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，所述的步骤一包括：

a、通过PCR获得Gas6胞外端基因片段和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因；

b、通过酶切手段及连接反应，构建出穿梭质粒pAdTrack- Gas6-PE38KDEL，氯化钙法制备含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌感受态细胞；

c、用限制性内切酶PmeⅠ线性化处理后与上述感受态细胞在细菌中进行同源性重组，构建重组腺病毒载pAd-Gas6-PE38KDEL；

d、构建重组腺病毒载pAd-Gas6-PE38KDEL的提取。

一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，所述的步骤二包括：

a、常规培养方法制备骨髓、脐带或胎盘源间充质干细胞，取其中生长状态良好的间充质干细胞进行感染处理；

b、将生长状态良好的间充质干细胞按4xl0⁵个/ml的密度接种于100mm培养皿，每皿加入8ml的含10%血清的正常细胞培养液(不含有抗生素)；

c、贴壁培养24h后，吸出培养液，PBS洗涤2遍；

d、加入重组腺病毒Ad-Gas6-PE38KDEL，感染复数(MOI)为800-1000， 37℃孵育4h，更换新鲜培养液并置于37℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；

e、当细胞融合至90%以上时并感染后72h后即可收集间充质干细胞备用。

本发明的显著效果是：

本发明开发了一种可以分泌特异性重组免疫毒素Gas6-PE38KDEL的间充质干细胞制剂，为靶向治疗恶性黑色素瘤提供新的治疗方向。

本发明制备的间充质干细胞可分泌抗黑色素瘤重组免疫毒素，能够特异地靶向抑制恶性黑色素瘤细胞的生长。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是感染后间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL的检测；

图2是倒置显微镜下间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对人恶性黑色素瘤细胞A375作用24h、48h和72h效果图，其中A、B和C为对照，D、E和F为实验效果图；

图3是倒置显微镜下间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对鼠恶性黑色素瘤细胞B16的作用24h、48h和72h效果图，其中A、B和C为对照，D、E和F为实验效果图；

图4是间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对人恶性黑色素瘤细胞A375、鼠恶性黑色素瘤细胞B16、鼻咽癌细胞 CNE和人胃癌细胞 BGC的抑制作用分析。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

具体实施例1：

1.氯化钙法制备感受态细胞（大肠杆菌DH5α、BJ5183）：

（1）大肠杆菌DH5α在琼脂培养基上划线，37℃培养16-20h；

（2）从平板中挑取一个约5mm大小的单菌落，接种于3-5ml    LB培养基中，在37℃、200rmp条件下强烈震荡培养12h，直至对数生长后期。将该菌液按照1：50的比例接种于100ml LB培养基，37℃、200rpm强烈震荡培养3h至OD600=0.5；

（3）将培养物置于冰上放置lO min，然后转移到两个50 ml离心管中，4000rpm，4℃离心lO min；

（4）弃上清，倒置离心管1min，尽量清除剩余液体，然后加入lOml用冰预冷的0.05mol/L CaCl₂溶液悬浮细菌，置于冰上lOmin；

（5）4000r/min，4℃离心lOmin并回收细菌，弃上清，每50ml原培养液沉淀中加入2ml冰冷的0.05mol/L CaCl₂溶液，200μl灭菌甘油，悬浮细胞，置于-70℃保存；

（6）同法制备含有骨架质粒pAdEasy-l的大肠杆菌BJ5183感受态细胞。

2. 质粒的转化、提取和鉴定

(1)感受态细胞从-86℃冰箱中取出后握于手中，迅速溶解；

(2)分别加入含约40ng的pCMV-Sport6-Gas6、pDsRed-Nl-PE38KDEL和pAdTrack-CMV DNA溶液，温和混匀，置于冰上30min；

(3) 42℃热休克90s，迅速放回冰中，将细胞冷却l-2min后，加入800μl LB培养基，37℃、225rpm，振荡培养90min，让细菌中的质粒表达抗性蛋白；

(4)取200μl转化混合物铺于90mm的LB琼脂板上(pCMV-Sport6-Gas6组含有 1OOug/ml 氨卞青霉素，pAdTrack-CMV 和 pDsRed-N 1-PE38KDEL组含有50ug/ml卡那霉素)，室温放置30min，待溶液被琼脂吸收后，倒置平皿于37℃培养12-16h，发现目的平板长出阳性菌落后进行下一步实验；

(5)设立两个对照：A：同体积无菌双蒸水代替DNA加至感受态细胞，铺入不含有抗生素的LB琼脂板，可见大量菌落产生，做阳性对照；B：同体积无菌双蒸水代替DNA加至感受态细胞，铺入含有抗生素的琼脂板，无菌落生长，作为阴性对照；

(6) 质粒的提取和鉴定均采用常规分子生物学实验操作，参见《分子克隆》第三版。

3.PE38KDEL基因构建及PCR扩增

从含PE基因的质粒出发，采用分步的PCR方法，结合酶切技术，将PE分子依次改造为PE40、PE38、PE38KDEL编码基因，经测序正确后在大肠杆菌中进行了表达。

引物a(正向)：5’-TAAGAAGGGAGCTCACATATGGCCGAGGGC-3’(下划线为SacⅠ酶切位点)；引物b(反向)：5’-CGGTCGCGAAGCTTACTTCAGGTCCTC-3’(下划线为HindⅠ酶切位点)；引物c(反向)：5’-AGTTCACAGGGCCCGCGTTGGCCGC-3’(下划线为ApaⅠ酶切位点)；引物d(反向)：5’-CGGGCTGGCTAGCGTAGTCCGGCAGG-3’(下划线为NheⅠ酶切位点，斜体为点突变)；单链寡核苷酸e(正向)：5’-CTAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAAGATGAACTGTAGTA -3’；单链寡核苷酸f(反向)：5’-AGCTTACTACAGTTCATCTTTCGGCGGTTTGCCGGGCTGG-3’。

（1）PE40的构建：以含天然PE基因为模板，用引物a、b进行PCR反应扩增出PE40，并在两端分别引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点；

（2）PE38的构建：以PE40为模板，用引物a、c扩增出Ⅱ区，其中C端含有ApaⅠ酶切位点。将PCR产物用SacⅠ和ApaⅠ双酶切；PE40用ApaⅠ和HindⅢ双酶切；将两个双酶切产物与经SacⅠ和HindⅢ双酶切的pMD18-T载体连接，得到的转化子即含有PE38序列；

（3）PE38KDEL的构建：以PE38为模板，用引物a、d进行PCR反应，在C端601位丙氨酸处通过点突变(GCC→GCT)引入一个NheⅠ酶切位点。将PCR产物用SacⅠ和NheⅠ双酶切；将单链寡核苷酸e、f链混合退火，得到两端含有NheⅠ和HindⅢ酶切位点的一段双链核苷酸序列，其中包含KDEL序列；将上述两段序列混合，并与经SacⅠ和HindⅢ双酶切的pMD18-T载体连接，得到的转化子即含有PE38KDEL序列。

4.PE38KDEL基因亚克隆入pAdTrack-CMV载体

首先分别对PE38KDEL基因PCR产物和pAdTrack-CMV质粒进行SacⅠ和HindⅢ双酶切，再将PE38KDEL基因PCR产物装载入pAdTrack-CMV载体，提取制备成pAdTrack-PE38KDEL质粒。

5.Gas6胞外端基因亚克隆入pAdTrack-PE38KDEL质粒

（1）Gas6胞外端基因的PCR扩增

Gas6片段引物的上下游中分别引入BgⅢ和HindⅢ酶切位点及其保护碱基，设计的引物如下:

上游引物   5’-GTATAGATCTATGGAGTTCCTCTGGGCCCCTCTCTTG-3’

下游引物   5’-GTCTAAGCTTTGTGACCGATGCTATGTAGAACCCGCACCTC-3’

通过PCR扩增获得Gas6胞外端基因PCR产物；

（2）Gas6胞外端基因PCR产物和pAdTrack-PE38KDEL的连接

首先分别对Gas6胞外端基因PCR产物和pAdTrack-PE38KDEL质粒进行BgⅢ、HindⅢ双酶切，再将Gas6胞外端基因PCR产物装载入pAdTrack-PE38KDEL质粒，获得连接产物pAdTrack-Gas6-PE38KDEL穿梭质粒；

6.重组腺病毒质粒pAdEasy-Gas6-PE38KDEL的构建与提取

将pAdTrack- Gas6-PE38进行Pme I 酶切线性化处理，然后进行质粒转化并提取重组腺病毒质粒pAdEasy-Gas6-PE38KDEL。

7.间充质干细胞的制备与感染

（1）常规培养方法制备骨髓、脐带或胎盘源间充质干细胞，取其中生长状态良好的间充质干细胞进行感染处理；

（2）将生长状态良好的间充质干细胞按4xl0⁵个/ml的密度接种于100mm培养皿，每皿加入8ml的含10%血清的正常细胞培养液(不含有抗生素)；

（3）贴壁培养24h后，吸出培养液，PBS洗涤2遍；

（4）加入重组腺病毒Ad-Gas6-PE38KDEL，感染复数(MOI)为800-1000， 37℃孵育4h，更换新鲜培养液并置于37℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；

（5）当细胞融合至90%以上时即可收集间充质干细胞备用。

8.间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL的ELISA检测

（1）将生长状态良好的间充质干细胞以4xl0⁵个/ml的密度接种于24孔培养板，每孔含有0.5ml的含10%血清的正常细胞培养液(不含有抗生素)；贴壁培养24h后，吸出培养液，PBS洗涤2遍；加入重组腺病毒Ad-Gas6-PE38KDEL，感染复数(MOI)为800-1000， 37℃孵育4h，更换新鲜培养液并置于37℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；

（2）72h后取上清液检测Gas6-PE38KDEL含量，以后每隔3天重复测量一次；

（3）按说明书将标准品以稀释液倍比稀释；将稀释后的标准品和上清液样品加入酶标板中，100μl/孔。37℃孵育1h；

（4）Washing Buffer冲洗酶标板3次，每次放置3分钟后除去，甩干；

（5）加入以封闭液1：1000稀释的辣根过氧化酶标记的小鼠抗体，100μl/孔，37℃孵育1 h；

（6）Washing Buffer冲洗酶标板3次，每次放置3分钟后除去，甩干。加入底物，100μl/孔，室温避光反应10分钟；

（7）每孔加入lOOμl终止液以终止显色反应。30分钟以内测A=410nm吸光度(OD值)。分别以标准品的滴度和OD值为横、纵坐标，绘出标准曲线；

（8）根据标准曲线和样品的0D值，计算样品滴度；

（9）ELISA检测Gas6-PE38KDEL在间充质干细胞中的分泌表达结果：感染后第3天即可以检测到Gas6-PE38KDEL的分泌，在第6天达到高峰并且持续约15天，此后开始下降，如图1所示。

9.间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对恶性黑色素瘤细胞生长的抑制作用

（1）取生长良好的人恶性黑色素瘤细胞A375、鼠恶性黑色素瘤细胞 B16、鼻咽癌细胞 CNE和人胃癌细胞 BGC消化分散后进行细胞计数，调整细胞浓度至 1×10⁵个/mL，并按100 μL/孔接种于 96 孔细胞板中；

（2）培养 5h 后弃去培养液，以PBS洗涤两次，分别加入间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL的上清液50μL/孔，每组重复4孔，以1孔未做处理的细胞做对照，将以上细胞置37℃、5% CO₂培养箱中培养4h 后，补加50μL/孔完全培养液；

（3）分别于作用24 h、36 h、48 h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL/孔，置 37 ℃、5% CO₂培养箱中作用 4 h，弃去培养液，每孔加入 DMSO，37 ℃充分震荡使结晶物溶解，将酶标板置酶标仪上于 490 nm 处检测各孔 OD 值。根据公式：细胞存活率(%)=实验组 OD 值/对照组 OD 值，计算细胞存活率，绘制存活率变化分析图。

实验结果：间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对恶性黑色素瘤细胞生长的抑制作用较强，如图2和图3所示，分别是倒置显微镜下间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对人恶性黑色素瘤细胞A375和鼠恶性黑色素瘤细胞B16的作用24h、48h和72h效果图，其中A、B和C为对照，D、E和F为实验效果图；图4是间充质干细胞分泌Gas6-PE38KDEL对人恶性黑色素瘤细胞A375、鼠恶性黑色素瘤细胞B16、鼻咽癌细胞 CNE和人胃癌细胞 BGC的抑制作用分析，恶性黑色素瘤细胞72h细胞存活率仅接近10%，而对非恶性黑色素瘤细胞抑制作用很小，鼻咽癌细胞和人胃癌细胞72h细胞存活率仅接近100%，证明了特异抑制恶性黑色素瘤的生长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂，其特征在于，是由可以分泌特异性重组免疫毒素GAS 6-PE38KDEL的间充质干细胞制备而成。

2.根据权利要求1所述的一种抗恶性黑色素瘤的干细胞制剂，其特征在于，所述的间充质干细胞来源于骨髓、脐带或胎盘，优选来自骨髓源的间充质干细胞。

3.权利要求1所述的一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

步骤一，构建Axl配体(Gas6)和绿脓奸菌外毒素衍生物PE38KEDL组成的特异性免疫毒素Gas6-PE38KDEL腺病毒载体；

步骤二，以感染复数为800-1000的腺病毒体外感染间充质干细胞，收集感染后3-18天的间充质干细胞制备成干细胞制剂。

4.根据权利要求3所述的一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤一包括：

a、通过PCR获得Gas6胞外端基因片段和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因；

b、通过酶切手段及连接反应，构建出穿梭质粒pAdTrack- Gas6-PE38KDEL，氯化钙法制备含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌感受态细胞；

c、用限制性内切酶PmeⅠ线性化处理后与上述感受态细胞在细菌中进行同源性重组，构建重组腺病毒载pAd-Gas6-PE38KDEL；

d、构建重组腺病毒载pAd-Gas6-PE38KDEL的提取。

5.根据权利要求3所述的一种抗黑色素瘤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤二包括：

a、常规培养方法制备骨髓、脐带或胎盘源间充质干细胞，取其中生长状态良好的间充质干细胞进行感染处理；

b、将生长状态良好的间充质干细胞按4xl0⁵个/ml的密度接种于100mm培养皿，每皿加入8ml的含10%血清的正常细胞培养液(不含有抗生素)；

c、贴壁培养24h后，吸出培养液，PBS洗涤2遍；

d、加入重组腺病毒Ad-Gas6-PE38KDEL，感染复数(MOI)为800-1000， 37℃孵育4h，更换新鲜培养液并置于37℃，5%二氧化碳培养箱继续培养；

e、当细胞融合至90%以上时并感染后72h后即可收集间充质干细胞备用。