CN105168199A - 莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞ezh2蛋白的药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物的应用，所述莪术醇用于抑制EZH2基因的转录和蛋白水平的表达，抑制EZH2蛋白活力或降低其表达水平对乳腺癌、肝癌和鼻咽癌等多种肿瘤乃至其它类型的疾病具有重要的治疗作用。本发明公开了天然化合物莪术醇对肿瘤细胞EZH2基因的强烈抑制功能，这将为莪术醇治疗肿瘤提供直接的作用靶点。通过实验证明天然化合物莪术醇对EZH2蛋白在肿瘤细中的表达具有显著抑制作用，对EZH2理论研究及其作为肿瘤治疗靶点的应用具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于医药应用领域，具体是莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物的应用。
背景技术
莪术醇又名姜黄醇，莪黄醇、姜黄环氧醇，为无色针状结晶，易溶于乙醚，二甲基亚砜，氯仿和无水乙醇等有机溶剂，难溶于水，是药用植物莪术挥发油中的活性成分之一。具有抗病毒，抗血栓和抗肿瘤的作用。近年来因其抗肿瘤效果明显且毒副作用小成了人们研究的热点，但其具体的抗肿瘤机制不清楚。
EZH2(enhancerofzestehomolog2)是果蝇Enhancerofzeste的人类同源物,是控制细胞转录记忆系统，抑制转录的PcG(PolycombGroup)基因家族重要成员之一，在细胞生长分化、肿瘤干细胞自我更新及多种恶性肿瘤发生发展中起着重要的作用。EZH2基因定位于人染色体7q35位置上,该基因cDNA全长约2.7kb，含有一个开放阅读框架，编码613个氨基酸，相对分子质量在80～90KD之间。研究发现，EZH2在多种恶性肿瘤组织中高表达，表达越高，恶性程度越高，是促进肿瘤发生和发展的致癌因子，也因此使其新近被鉴定为一种肿瘤相关抗原。EZH2作为的催化亚基，其编码的蛋白含有高度保守的结构域，可通过三甲基化核小体组蛋白的位赖氨酸（H3k27）或招募一系列效应蛋白如甲基转移酶等催化甲基化，来阻止转录因与启动子区结合，最终实现基因沉默。EZH2与EED、SUZ12和RbAp46/48共同组成PRC2，将靶基因组蛋白甲基化，导致相应的抑癌基因沉默。有研究报道表明EZH2可以下调RUNX3的水平，RUNX3的下调可以抑制p21WAF/Cip1的水平，从而解除了细胞周期素蛋白受p21调控的影响，促进了细胞周期的进程而促进了肿瘤的增生。同时EZH2的高表达还可以使FOXC1和CDH1表达下调，从而促进了肿瘤的浸润和转移。此外，有研究显示术后EZH2蛋白表达的水平还可以作为前列腺癌和乳腺癌病人预后判断的一个分子指标，高表达的患者生存率低，死亡率高。上述研究提示，EZH2能是一种新的抗肿瘤治疗分子靶点，并在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值，下调或抑制EZH2是临床肿瘤靶向治疗的潜在靶标。
莪术醇属于小分子天然产物，性质稳定，抗肿瘤作用明显，具有临床使用价值。莪术醇作为新近热点研究的抗肿瘤药物，本发明阐明其抗肿瘤的作用靶点将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的思路和手段，对于延长恶性肿瘤病人的生存期及提高生存率具有重要的意义。同时揭示莪术醇的抗肿瘤作用也有利于开发广西莪术的药用价值。
发明内容
本发明公开了莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物的应用。
所述莪术醇用于抑制EZH2基因的转录和蛋白水平的表达。
所述EZH2基因的扩增的PCR引物，其序列为：
正向引物：5’TACTTGTGGAGCCGCTGAC3’；
反向引物：5’TGAATTCATTTTTCTGCACAGG3’。
所述的肿瘤可以是上皮来源的恶性肿瘤。
所述莪术醇体外作用细胞的浓度为0-50ug/ml,作用的肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞，是鼻咽癌细胞，肺癌细胞和大肠癌细胞等。
本发明莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物的应用，通过莪术醇不同的作用浓度肿瘤细胞表型改变及其靶标基因EZH2下调的时间。莪术醇药物浓度在20-50ug/ml之间时，其药物作用出现表型的时间为2d,药物浓度在0-20ug/ml时，其药物作用出现表型的时间为5d-7d。
本发明公开了天然化合物莪术醇对肿瘤细胞EZH2基因的强烈抑制功能，这将为莪术醇治疗肿瘤提供直接的作用靶点。通过实验证明天然化合物莪术醇对EZH2蛋白在肿瘤细中的表达具有显著抑制作用，对EZH2理论研究及其作为肿瘤治疗靶点的应用具有重要的价值。
本发明公开了莪术醇在抑制肿瘤细胞中的作用靶点，是首次公开了从基因和蛋白水平上对靶标EZH2的抑制作用。莪术醇属于天然产物,能够明显抑制与肿瘤发生发展密切相关的EZH2分子。本发明揭示小分子化合物莪术醇作用的肿瘤靶向分子EZH2将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径。同时，也为进一步开发广西莪术提供理论基础。
附图说明
图1为实施例莪术醇处理肿瘤细胞后EZH2基因的表达情况；
图2为实施例莪术醇浓度对EZH2蛋白的表达情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。
实施例
本实施例采用的鼻咽癌癌细胞是5-8f细胞株，肺癌细胞是A549细胞株，大肠癌细胞是LOVO细胞株。
1.细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞,迅速投入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。将融化好的细胞液体加入到37℃水浴的完全培养基中，1000转离心5分钟，弃上清，用新的完全培养基重悬细胞加入到10cm皿中。将细胞放入到5%CO2，37℃培养箱中培养。三种细胞株均是用的高糖DMEM培养基加上10%FBS完全培养基。
2.每天观察细胞一次，当细胞贴壁长至80%左右即到细胞的对数生长期可以开始进行传代。
3.细胞传代：弃掉旧培养基，用PBS洗两遍细胞，用胰酶消化细胞，待细胞变圆脱落时加入完全培养基中和胰酶，1000转离心5分钟，弃上清，根据细胞的生长速度及数量进行分瓶，一般来说一皿细胞分三皿。
4.传至3-4代后，取对数期的肿瘤细胞种于7cm皿中，贴壁后的细胞密度大致为20%-30%左右，加药干预细胞，选取阴性对照组（0ug），20ug/ml和50ug/ml三个浓度干预细胞。
5.莪术醇体外干预细胞药液的配制：称取40mg莪术醇，用2ml无水乙醇溶解后，0.22um的滤膜过滤后4℃保存，干预细胞时用完全培养基稀释至所需要的浓度，阴性对照组用0.1%的无水乙醇做对照。
6.细胞长满时传代继续用药干预，干预5-7天后收集细胞，一部分用于提取RNA，一部分用于提取蛋白。
7.检测用药后EZH2mRNA表达实验：将收集的细胞用Trizol法进行RNA抽提后逆转录成CDNA，用SYBERGREEN染料在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行Real-time基因表达实验分析，结果显示随着莪术醇药物浓度的增加，EZH2mRNA表达下降，结果见附图1。
8.检测用药后EZH2蛋白表达实验：将收集的细胞用细胞裂解液裂解后，12000转4℃离心30min,取上清，进行BCA法蛋白定量，按照50ug/40ul的体积上样SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，孵育EZH2一抗，PBST洗4遍，孵育二抗，ECL发光，观察各组细胞的蛋白表达水平，结果显示随着莪术醇浓度的升高，EZH2蛋白表达减少，结果见附图2。
通过实施例说明莪术醇可用于制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物。
Claims (3)
1.莪术醇在制备靶向抑制肿瘤细胞EZH2蛋白的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述莪术醇用于抑制EZH2基因的转录和蛋白水平的表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞为EZH2高表达的肿瘤细胞。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110441533A (zh) * | 2019-09-03 | 2019-11-12 | 桂林医学院 | 一种莪术醇靶标蛋白核仁素及其应用 |
| CN113549669A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-26 | 洛阳职业技术学院 | 一种鸡ezh2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法 |
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2015
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
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