CN113549669A - 一种鸡ezh2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，包括S1.纯化鸡EZH2原核蛋白，得到EZH2蛋白样品；S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；S3.于不同时间提取细胞总RNA，检测MDV相关基因的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因的表达水平的影响；实验证明，鸡EZH2蛋白可影响MSB1细胞的增殖，且影响该细胞中MDV Meq和gB基因的表达，为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域，具体涉及一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法。
背景技术
EZH2(enhancer of zeste homolog 2)即Zeste增强子同源物2，是PRC2(多梳蛋白抑制复合体2)的主要组成部分，又可以称之为组蛋白赖氨酸甲基转移酶，表观遗传学领域的研究和实验已经证明靶向EZH2抑制剂可抑制PRC2的致癌活性，能够对癌细胞的发生、入侵与扩散形成一定的阻碍作用；由此可见EZH2在靶向治疗恶性疾病领域中的重要意义；
马立克氏病(MD)是由马立克氏病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的高度传染性肿瘤性疾病，以引起T细胞瘤为特点，Meq(MDV Eco Q片段编码蛋白)是MDV基因组中重要的致癌基因，在潜伏肿瘤细胞中始终表达。Meq编码bZIP蛋白，其在N末端具有亮氨酸拉链结构域，在C末端具有富含脯氨酸的反式激活结构域；
而对于鸡EZH2基因与MDV基因组之间的靶向性关系，在现有技术中并没有相关记载。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，本方法通过对鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究，证明鸡EZH2蛋白可抑制MSB1的增殖，且影响该细胞中MDV Meq和gB基因的表达，为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，所述的研究方法包括步骤
S1.纯化鸡EZH2原核蛋白，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；
S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；
S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响。
优选的，步骤S1所述的鸡EZH2原核蛋白纯化的过程包括：
S101.将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta(PET-32a-EZH2)用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，收集细菌沉淀并称重，按每克细菌沉淀的湿重加入4ml非变性裂解液的比例加入非变性裂解液；
S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，冰水浴30min；
S103.冰上超声裂解细菌，4℃、10000g下离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；
S104.取1ml混合均匀的50％BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)后弃去储存液，向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，4℃离心弃平衡液，重复平衡2-3次之后加入细菌裂解液上清；
S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；
S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；
S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul；
S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品。
优选的，步骤S2所述的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养的具体应用过程包括：
S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×105个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；
S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD450。
优选的，步骤S3所述的鸡EZH2原核表达蛋白应用在MDV相关基因中的具体过程包括：
S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×106个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；
S302.继续培养24h和48h后，收集细胞，提取MSB1细胞总RNA；
S303.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达。
优选的，步骤S303所述的MSB1细胞总RNA的提取过程包括
(1)收集2×106-1×107的MSB1细胞。2000×g离心5分钟，弃上清液；
(2)加入400μl缓冲液R-I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中；
(3)加入150μl缓冲液R-II并涡旋1分钟，在4℃下以12000×g离心5分钟；
(4)将上清液转移到1.5ml微量离心管中，加入250μl异丙醇并充分混合；
(5)将制备管柱置于2ml微量离心管中，将来自步骤(4)的结合混合物转移到制备管中，6000×g离心1分钟；
(6)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，并向制备管中加入700μlBufferW1A，12000×g离心1分钟；
(7)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，加入700μl Buffer W2，12000×g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次；
(8)弃滤液，将制备管置回2ml微量离心管中，12000×g离心1分钟；
(9)将制备管放入一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加70-100μl BufferTE或RNase-free水，室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱得RNA。
优选的，步骤S304所述的实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达过程包括
(1)去除基因组DNA反应；
(2)进行MSB1细胞总RNA的反转录反应；
(3)利用TB Green Premix Ex Taq II方法进行Real Time PCR反应的操作方法配制Real Time反应反应液；
(4)进行Real Time PCR反应；
(5)计算MDV相关基因的表达量，进行数据分析。
优选的，步骤(3)所述的Real Time PCR反应过程中，Real Time反应反应液种需加入特异性引物和鸡内部参照基因，所述特异性引物和鸡内部参照基因包括
MDV Meq：F 5'-GTCCCCCCTCGATCTTTCTC-3′
R 5'-CGTCTGCTTCCTGCGTCTTC-3′；
gB：F 5'-ACCCCATTCGGTGGCTTTTC-3′
R 5'-GCGTCCAGTTGTCTGAGG-3′；
GAPDH：F 5'-TCTATCTCTTTGCTGGGACT-3′
R 5'-CTACAGCCAACTTTCATCAG-3′。
优选的，所述的鸡EZH2蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且影响该MSB1细胞中MDV Meq和gB基因的表达。
优选的，所述鸡EZH2蛋白具有活性，能够应用于其在鸡肿瘤性疾病中的作用机制研究。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
本发明通过以MDV感染的MSB1细胞为模型，纯化鸡EZH2蛋白并以不同浓度与MSB1共培养，于培养后24h和48h，采用CCK-8法测定鸡EZH2对MSB1细胞增殖的影响；同时以50ug/mL鸡EZH2蛋白作用MSB1细胞后，于不同时间点提取细胞总RNA，利用Real-time PCR检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析；
结果显示：以10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、50ug/mL不同浓度鸡EZH2作用于MSB1，CCK-8法检测MSB1细胞增殖，结果显示，低浓度(10ug/mL和20ug/mL)时，EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组无明显差异(P＞0.05)，而高浓度(40ug/mL和50ug/mL)时EZH2蛋白组的抑制率显著高于空载体蛋白对照组(P<0.05)；以50ug/mLEZH2蛋白与MSB1细胞共培养后24h，MSB1细胞抑制率与对照组无明显差异，而48h后显著高于对照组(P<0.05)；在研究鸡EZH2对MDV相关基因的影响时发现，Meq和gB基因的相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.05)，这说明鸡EZH2原核表达蛋白对Meq和gB基因表达起到了促进作用；以上结果证实，鸡EZH2蛋白可抑制MSB1的增殖，且上调该细胞中MDV Meq和gB基因的表达，为进一步探究鸡EZH2在MDV感染致肿瘤中的作用机制研究奠定了基础，也为将EZH2基因能够应用于制备抑制肿瘤性疾病治疗的药物提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法的流程图。
图2为本发明实施例1培养48h加入不同浓度EZH2蛋白MSB1细胞增殖能力检测柱状图。
图3为本发明实施例124h，48h后MSB1细胞的OD450比较图。
图4为本发明实施例1gB基因特异性检测曲线图。
图5为本发明实施例1Meq基因特异性检测曲线图。
图6为本发明实施例1gB基因的表达水平检测柱状图。
图7为本发明实施例1Meq基因的表达水平检测柱状图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：
参照附图1-7所示的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，具体包括材料准备过程、具体操作过程和实验结果分析过程，其中：
(一)材料准备过程过程包括：
1.载体与蛋白纯化
原核表达载体PET-32a原核表达载体及其宿主表达菌菌株Rosetta，含有EZH2目标基因重组的原核表达载体PET-32a-EZH2已构建得到，在河南科技大学动物疫病与公共安全实验室(动科楼404)保存，鸡EZH2原核表达蛋白纯化已完成；
2.本实验所用培养基
研究所用主要试剂及培养基如下表1：
表1：实验用培养基
3.主要仪器
本实验主要仪器如下表2：
表2：主要仪器
4.引物设计与合成
根据GenBank上已登录的EZH2(GenBank:Z48921.1)、gB(GenBank:NC_002229.3)、MDV Meq(GenBank:AB638843.1)以及鸡内部参照基因(GAPDH)(GenBank登录号：NM_204305.1)的mRNA序列；依照引物5.0来设计特异性引物，以避免形成稳定二聚体或引物和引物之间的发夹结构最终造成失配，Service bio有限公司合成用于扩增的引物序列示于表3所示：
表3：扩增引物
(二)具体研究过程，包括步骤
S1.纯化鸡EZH2原核蛋白
本实验采用BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin进行蛋白纯化：
S101.为了达到充分重悬菌体这一操作目的，针对于EZH2蛋白这一目标蛋白，将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta(PET-32a-EZH2)用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，按每克细菌沉淀的湿重和加入4ml(2-5ml均可)非变性裂解液的比例，以此为根据加入非变裂解液；
S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，准备一个烧杯，放入冰水混合物，将样品放置其中水浴30min；
其中：加入的溶菌酶：非变性裂解液＝1:10的体积比；
S103.将上述水浴后的鸡EZH2未纯化蛋白在进行冰上超声裂解细菌，具体为：4℃离心机10000×g/min离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；
S104.用移液枪来吸取混合均匀的50％BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(1ml)溶液，将溶液放于4℃离心机1000×g/min离心10s后弃去储存液，之后向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，在4℃离心机1000×g/min离心10s后弃去储存液，然后缓慢重复平衡2-3次后，弃去上清，加入4ml细菌裂解液上清；
S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；
S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；可预留下穿流液20ul以作备用；
S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul，以便用于接下来的分析检测用；
S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，将每次的洗脱液分别收集到10个标记好的EP管中，收集得到的洗脱液中含有纯化的His标签EZH2蛋白样品，即得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；
注意：上述鸡EZH2原核蛋白的纯化过程是在EZH2原核蛋白最优表达条件下进行的纯化，所述最优表达条件为：
(1)温度为29°；
(2)诱导剂浓度为1.0mM IPTG；
(3)诱导时间为8h。
S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，观察EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响：
S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×105个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；
S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD450。
S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响，具体包括步骤：
S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×106个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；
S302.然后将其接种至6孔内，每孔2mL，大约含有106个细胞，分别加入EZH2和空载体蛋白，使其总浓度均为50ug/mL,37℃孵育细胞48h；
S303.分别于6孔板中收集培养24h和48h的细胞，最后提取MSB1细胞总RNA，提取不同培养条件下的MSB1细胞总RNA的详细步骤如下：
(1)收集2×106-1×107的MSB1细胞，2000×g离心5分钟，弃上清液；
(2)加入400μl缓冲液R-I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管(试剂盒内提供)中。
(3)加入150μl缓冲液R-II并涡旋1分钟，在4℃下以12000×g离心5分钟；
(4)将上清液转移到1.5ml微量离心管中，加入250μl异丙醇并充分混合；
(5)将制备管柱置于2ml微量离心管中，将来自步骤(4)的结合混合物转移到制备管中，6000×g离心1分钟；
(7)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，并向制备管中加入700μlBufferW1A，12000×g离心1分钟；
(8)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，加入700μl Buffer W2，12000×g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
(9)弃滤液，将制备管置回2ml微量离心管中，12000×g离心1分钟；
(10)将制备管放入一干净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加70-100μl Buffer TE或RNase-free水。室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱得RNA；
S304.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达，其具体包括：
(1)去除基因组DNA反应
分别提取不同蛋白共培养MSB1细胞总RNA后，去除提取总RNA中的基因组；按如下表4成分于冰上配制反应混合液，在此过程中为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，可先按多于2个反应数量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品，反应液如表4：
表4:去除基因组DNA反应液
反应条件：42℃2min，4℃保存；
(2)进行MSB1细胞总RNA的反转录反应；
为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，可先按多于2个反应数量配制Master Mix，然后再分装10μl到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应，反应液配置在冰水混合物上进行，反应液如下表5所示：
表5：反转录反应反应液
反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃保存；
(3)Real time PCR
按照TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Code No。RR820A/B)进行Real Time PCR反应的操作方法；按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰水混合物进行)，如表6所示：
表6：Real Time反应反应液
(4)进行Real Time PCR反应；
两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性：95℃，30秒，一个循环
Stage 2：PCR反应：95℃，5秒；60℃，60秒；40个循环
(5)计算MDV相关基因的表达量，进行数据分析
采用2-△△Ct法计算各组MSB1细胞中MDV Meq和gB基因的相对表达量。
(三)实验结果分析过程
1.鸡EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响
1.1不同浓度鸡EZH2原核表达蛋白进入MSB1细胞48h后用CCK-8法检测MSB1细胞的增殖率，如图2所示；
从图2可以观察到不同浓度的EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞后，低浓度(10ug/mL和20ug/mL)时，EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组无明显差异(P＞0.05)，而高浓度(40ug/mL和50ug/mL)时EZH2蛋白组的抑制率显著高于空载体蛋白对照组(P<0.05)，由此证明EZH2原核表达蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且其具有浓度依赖性；
1.2不同时间鸡EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增值的影响
不同时间鸡EZH2原核表达蛋白进入MSB1细胞24h，48h后用CCK-8法检测MSB1细胞的增殖，如图3所示；
通过图3可以看出，不同浓度鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞后，24h时(P>0.05)EZH2蛋白组抑制率与空载体蛋白对照组差异不显著，而在48h时，与空载体蛋白相比，EZH2蛋白组显著抑制MSB1细胞增殖(P<0.01)；
2.利用Real-time PCR检测MDV Meq、gB的表达水平
2.1溶解曲线的鉴定
(1)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因gB的基因表达水平，并做溶解曲线鉴定，如图4所示；
(2)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因Meq的基因表达水平，并做溶解曲线鉴定，并做图5表示；
通过对gB，Meq扩增产物的溶解曲线(见图4，图5)分析表明，各目标基因溶解曲线仅为单峰，无杂峰，表明Real-time PCR过程中只有一个扩增，说明建立的Real-time PCR方法特异性良好。
2.2 MDV gB基因相对表达水平变化
(1)鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h，48h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因gB基因表达量，并做图6表示；结果显示，加入EZH2重组蛋白的MSB1细胞的MDV相关基因gB的相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.01)，表明与对照组相比较，gB的基因在鸡EZH2共培养的MSB1细胞中表达受到促进；
2.3MDV Meq基因相对表达水平变化
鸡EZH2原核表达蛋白加入MSB1细胞24h，48h后，利用Real-timePCR检测MDV相关基因Meq基因表达量，并图7表示；结果显示，加入EZH2蛋白的MSB1细胞的MDV相关基因Meq相对表达量在24h和48h较对照组显著上调(P<0.01)，表明与对照组相比较，Meq的基因在鸡EZH2共培养的MSB1细胞中表达受到促进。
通过本研究中我们发现：
(1)鸡EZH2原核表达蛋白影响了MSB1细胞的增殖能力，该蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且这种抑制具有一定的浓度依赖性；
(2)利用荧光定量PCR技术检测鸡EZH2蛋白对MSB1细胞中MDV相关基因表达影响证实，相对空载体蛋白组，鸡EZH2蛋白对MDV相关gB基因和Meq基因表达水平表现为上调。
(3)鸡EZH2原核表达蛋白能够应用于其在鸡肿瘤性疾病的作用机制研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：包括步骤
S1.纯化鸡EZH2原核蛋白，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品；
S2.将纯化后的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养，测定EZH2原核表达蛋白对MSB1细胞增殖的影响；
S3.在步骤S2的基础上，于不同时间点提取细胞总RNA，检测MDV相关基因Meq、gB的表达水平并进行分析，测定EZH2原核表达蛋白对MDV相关基因Meq、gB的表达水平的影响。
2.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S1所述的鸡EZH2原核蛋白纯化的过程包括：
S101.将含有鸡EZH2原核表达载体的大肠杆菌Rosetta用1mmol诱导剂IPTG、29℃、诱导培养8h，收集细菌沉淀并称重，按每克细菌沉淀的湿重加入4ml非变性裂解液的比例加入非变性裂解液；
S102.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，然后充分混匀，冰水浴30min；
S103.冰上超声裂解细菌，4℃、10000g下离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；
S104.取1ml混合均匀的50％BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin，4℃离心后弃去储存液，向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，4℃离心弃平衡液，重复平衡2-3次之后加入细菌裂解液上清；
S105.将穿流液收集并重复上柱3-5次；
S106.然后取下纯化柱底部的盖子，使柱内液体由于重力的影响自然流出；
S107.每次加入非变性洗涤液0.5ml，之后连续洗柱5-6次，每次收集洗涤液20ul；
S108.最后把目的蛋白洗脱6-10次，每次都用非变性洗脱液0.5ml进行洗脱，得到含有纯化的His标签EZH2蛋白样品。
3.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S2所述的鸡EZH2原核表达蛋白与MSB1细胞共同培养的具体应用过程包括：
S201.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至5.0×105个/mL，并取100μL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度分别为10、20、40、50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复，并设不含抗体的正常细胞培养对照，轻轻摇晃混匀；
S202.在37℃细胞培养箱中培养24h、48h后每孔加入CCK-8试剂10μl，继续培养4h后，空白对照调零，酶标仪上测OD450。
4.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S3所述的鸡EZH2原核表达蛋白应用在MDV相关基因中的具体过程包括：
S301.用1640生长液将离心收集的细胞稀释至1.0×106个/mL，并取1mL/孔接种于96孔细胞培养板，处理组每孔加入不同浓度鸡EZH2原核蛋白，使终浓度为50μg/mL，对照组加入等体积相应浓度pet-32a空载体蛋白，各浓度设4个重复；
S302.继续培养24h和48h后，收集细胞，提取MSB1细胞总RNA；
S303.利用实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达。
5.根据权利要求3所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S303所述的MSB1细胞总RNA的提取过程包括
(1)收集2×106-1×107的MSB1细胞。2000×g离心5分钟，弃上清液；
(2)加入400μl缓冲液R-I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中；
(3)加入150μl缓冲液R-II并涡旋1分钟，在4℃下以12000×g离心5分钟；
(4)将上清液转移到1.5ml微量离心管中，加入250μl异丙醇并充分混合；
(5)将制备管柱置于2ml微量离心管中，将来自步骤(4)的结合混合物转移到制备管中，6000×g离心1分钟；
(6)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，并向制备管中加入700μl BufferW1A，12000×g离心1分钟；
(7)弃滤液，将制备管放回2ml微量离心管中，加入700μl Buffer W2，12000×g离心1分钟，以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次；
(8)弃滤液，将制备管置回2ml微量离心管中，12000×g离心1分钟；
(9)将制备管放入一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加70-100μl Buffer TE或RNase-free水，室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱得RNA。
6.根据权利要求3所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤S304所述的实时荧光定量PCR方法检测MDV相关基因表达过程包括
(1)去除基因组DNA反应；
(2)进行MSB1细胞总RNA的反转录反应；
(3)利用TB Green Premix Ex Taq II方法进行Real Time PCR反应的操作方法配制Real Time反应反应液；
(4)进行Real Time PCR反应；
(5)计算MDV相关基因的表达量，进行数据分析。
7.根据权利要求6所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：步骤(3)所述的Real Time PCR反应过程中，Real Time反应反应液种需加入特异性引物和鸡内部参照基因，所述特异性引物和鸡内部参照基因包括
MDV Meq：F 5'-GTCCCCCCTCGATCTTTCTC-3′
R 5'-CGTCTGCTTCCTGCGTCTTC-3′；
gB：F 5'-ACCCCATTCGGTGGCTTTTC-3′
R 5'-GCGTCCAGTTGTCTGAGG-3′；
GAPDH：F 5'-TCTATCTCTTTGCTGGGACT-3′
R 5'-CTACAGCCAACTTTCATCAG-3′。
8.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：所述的鸡EZH2蛋白可抑制MSB1细胞的增殖，且影响该MSB1细胞中MDV Meq和gB基因的表达。
9.根据权利要求8所述的一种鸡EZH2基因对肿瘤性疾病影响的研究方法，其特征在于：所述鸡EZH2蛋白具有活性，能够应用于其在鸡肿瘤性疾病中的作用机制研究。
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2021
- 2021-06-29 CN CN202110728594.8A patent/CN113549669A/zh active Pending
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