CN1963511B - Dkk-1蛋白在癌症诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤诊断试剂盒，其含有抗DKK-1抗体。还公开了一种肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤诊断试剂盒，含有DKK-1蛋白特异性核酸探针。还公开了DKK-1蛋白在制备肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤基因诊断试剂盒中的用途。

Description

DKK-1蛋白在癌症诊断中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学特别是基因诊断领域，尤其是DKK-1蛋白在诊断癌症中的应用。

背景技术

1998年，Glinka A等在《Nature》杂志上发表研究文章(Nature，1998；391(6665)：357-362)宣布：他们在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎发育研究中发现了一种新的分泌性蛋白，命名为dickkopf-1(dkk-1)。他们的研究工作证实：dkk-1是Wnt信号通路的抑制因子，是非洲爪蟾胚胎发育过程“头部(head induction)”形成的“引发者(inducer)”。稍后，1999年Fedi P等(J Biol Chem，1999；274(27)：19465-72)采用条件色谱分离方法和PCR方法，从人平滑肌肉瘤细胞SK-LMS-1及相应cDNA文库中，分离获得了dkk-1的人的同源基因，其mRNA转录本约为2kb，编码266个氨基酸。从此，科学家通过近5年的研究，初步揭示了DKK-1作为Wnt信号通路抑制因子的分子机制。

在研究DKK-1的功能和作用机制的过程中，科学家亦注意到DKK-1与某些人类疾病有关。如骨质疏松症(Biochem Biophys Res Commun，2004；318(1)：259-264.N Engl J Med，2002；346(20)：1513-1521)、多发性骨髓瘤引发的骨损害(N Engl J Med，2003；349(26)：2483-2494)以及某些人类恶性肿瘤，如Mikheev AM等(Carcinogenesis，2004；25(1)：47-59)利用人子宫颈癌Hela细胞系建立了两株非致瘤性的回复突变型(non-tumorigenicrevertant)细胞系，并利用cDNA芯片技术发现DKK-1在上述两株非致瘤性的回复突变型Hela细胞系中高表达，其研究发现DKK-1表达的缺失是Hela致瘤性所必需的，因此认为DKK-1是一个候选肿瘤抑制基因；另外，Wirths O等(Lab Invest，2003；83(3)：429-434)利用“抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization approach)”发现DKK-1在儿童肝母细胞瘤(hepatoblastoma)和Wilms’肿瘤中高表达，其结果表明：32例儿童肝母细胞瘤中26例DKK-1高表达(26/32，81％)、6例Wilms’肿瘤中5例DKK-1高表达(5/6，83％)，而在20例肝癌病人中仅2例DKK-1高表达(2/20，10％)、5株成神经管细胞瘤(medulloblastoma)细胞系中仅1例DKK-1高表达(1/5，20％)，在恶性胶质瘤和乳腺癌中未检测到DKK-1表达。

因此，本领域对于特定癌症的准确和特异性的检测有迫切的需求。

发明内容

因此，本发明的目的是提供能够准确诊断选自的癌症的诊断试剂盒、DKK-1蛋白的诊断试剂盒的用途，以及体外检测其表达量的方法。

在本发明的一个方面，提供了一种癌症诊断试剂盒，所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤，该试剂盒含有容器，所述容器中含有抗DKK-1抗体。在该方面的一个优选例中，抗-DKK-1抗体偶联有可检测基团。在更优选的实施例中，可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

在本发明的第二个方面，提供了一种癌症诊断试剂盒，所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤，该试剂盒含有容器，其中含有DKK-1蛋白特异性核酸探针。在该发明的另一个优选例中，探针偶联有可检测基团。在一个更优选的实施例中，可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

在本发明的第三个方面，DKK-1蛋白或其核酸序列在制备诊断试剂或试剂盒，针对癌症，选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤的用途。在该方面的一个优选例中，癌症诊断试剂是抗DKK-1蛋白特异性抗体或DKK-1蛋白特异性核酸探针。

在本发明的第四个方面，提供了一种体外检测特异性DKK-1蛋白表达的方法，包括：

用抗DKK-1蛋白特异性抗体或DKK-1特异性核酸探针与细胞样品反应，以正常细胞为对照；

比较抗体或探针的结合量，其中高于对照的量表明该细胞为癌细胞，低于或等于对照的量表明该细胞为正常细胞。

在该方面的一个优选例中，结合量是通过检测与探针或抗体偶联的可检测基团测得的。

附图说明

图1显示了生物素标记的cRNA的电泳图谱。1-5为样品编号。

图2显示了片段化的生物素标记的cRNA的电泳图谱。1-5为样品编号。

图3显示了DKK-1基因在12例肝癌病人中的Northern杂交表达情况的分析。

图4显示了DKK-1基因在16种人正常组织中表达情况的分析。其中标号分别表示：1脾；2胸腺；3前列腺；4睾丸；5卵巢；6小肠；7大肠；8外周血淋巴细胞；9心脏；10脑；11胎盘；12肺；13肝脏；14肌肉；15肾脏；16胰腺。

具体实施方式

发明人采用基因芯片技术，通过比较肝癌组织和相应的癌旁肝组织基因表达谱的差异，发现与Wirths O等(Lab Invest，2003；83(3)：429-434)报道的DKK-1仅在少数人肝癌病人(2/20，10％)中表达的结果相反。在发明人分析和验证的12例肝癌病人中7例在肝癌组织中高表达DKK-1(7/12，58％)，明显高于Wirths O等在肝癌中报道的结果。因此，还进一步采用ELISA方法，首次对肝癌病人血清中DKK-1的含量进行了检测分析，提示其高表达和分泌DKK-1蛋白，为其应用于肝癌的临床诊断和治疗奠定了的基础。

如本文所用，术语“DKK-1”指非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎发育研究中发现了一种新的分泌性蛋白，命名为dickkopf-1(dkk-1)。该蛋白的序列可通过NCBI以登录号NP 571078找到。本发明所指的DKK-1蛋白包括其完整的氨基酸序列，其分泌蛋白，其突变体，以及其功能上活性的片段。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生的保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了DKK-1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的DKK-1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人DKK-1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，DKK-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DKK-1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在获得了核酸序列后，可根据核酸序列设计特异性核酸探针。设计探针的方法是本领域常规的，可见Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述。检测生物样品中是否存在DKK-1蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品，使该生物样品接触能与DKK-1mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是，例如人的核酸或及一部分，如长至少15、30、50、100个核苷酸并能在严谨条件下与DKK-1mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本文所述。

核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记。在另一个实施例中，探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。

在传统的方法中，检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等，1989)。常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。

另一方面，本发明还包括对DKK-1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于DKK-1基因产物或片段。较佳地，指那些能与DKK-1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

抗DKK-1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的DKK-1蛋白。

血样或尿液中的DKK-1的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。

抗体可以通过ELISA、Western印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光等来检测。

本发明也包括试剂盒，以进行这里描述的任何方法。在一个非限制的实例中，所述试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包含用于RNA分离、扩增细胞中RNA的纯化的试剂、标记等。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.肝癌病人癌组织和癌旁肝组织样品的收集

12例人原发性肝癌患者的癌组织(Tumor tissues from humanhepatocellular carcinomas，简称T)及癌旁肝组织(Non-cancerous livertissues，简称N)标本，分别来自中国的上海、广西、江苏启东和杭州地区的肝癌患者。其中，上海地区1例(D129)，广西地区2例(G65和G319)，江苏启东地区4例(Q130，Q135，Q142，Q162)，杭州地区5例(HK114，HK120，HK121，HK164，HK165)。手术后组织标本立即置液氮中冷冻，随后保存于-80℃超低温冰箱。

实施例2.RNA的分离

1)取组织样品约1克，液氮中研磨成粉末状，加入到10毫升TRIZOL(Invitrogen，目录号15596-026)中立即匀浆，室温下放置10-15分钟。

2)加入2毫升氯仿，剧烈震荡15秒，室温下放置2～3分钟，10,000g于4℃离心15分钟。

3)取出上清液，加入等体积的异丙醇，室温下放置15分钟，10,000g于4℃离心15分钟。

4)弃上清，加入6毫升75％乙醇洗涤沉淀，10,000g于4℃离心5分钟。

5)轻微干燥RNA沉淀，DEPC水溶解。

6)上述粗提的总RNA样品，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，目录号74104)纯化，纯化步骤遵照Qiagen公司该试剂盒提供的说明书进行。纯化的RNA样品-70℃保存备用。

实施例3cDNA芯片杂交分析

1)紫外定量和检测：用紫外分光光度计检测RNA的量，在260nm处的吸光度，1个吸光值(OD)约为40μg/ml的RNA。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，较纯RNA的OD_260nm/OD_280nm比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

2)cDNA的合成和纯化：

第一链cDNA的合成。取总RNA约5μg，用RNase-free水补至总体积20μl，加入T7-(dT)₂₄引物1μl(100pmol/μl)，混匀，70℃温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻。然后，加入5×第一链cDNA的合成缓冲液4μl、DTT(0.1M)2μl和dNTP(10mM)1μl，混匀，42℃，温浴2分钟。再加入SuperScript II RT(200u/μl)1μL(5～8μg起始RNA)。混匀，42℃，温浴1小时。

第二链cDNA的合成。将上述逆转录合成的第一链cDNA产物置于冰上，加入下列试剂：RNase-Free水92μl、5×第二链cDNA的合成缓冲液30μl、dNTP(10mM)3μl、E.coli DNA连接酶(10u/μl)1μl、E.coli DNA聚合酶(10u/μl)4μl、E.coli RNase H(10u/μl)0.2μl，混匀，16℃，反应2小时。再加入T4DNA聚合酶3.3μl，混匀，16℃，5分钟。加入10μl EDTA(0.5M)，混匀，终止反应，-20℃保存。

cDNA纯化。用Eppendorf公司PLG(Phase Lock Gel)纯化上述cDNA，12,000g离心PLG管30秒，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)以1∶1的比例加入到cDNA反应产物中，剧烈振荡后将全部液体移入PLG管中，不要振荡，12,000g室温离心2分钟。吸取上层液体到一新的离心管，加入0.5倍体积醋酸铵(7.5M，pH 8.0)和预冷2.5倍体积无水乙醇，振荡混匀，12,000g室温离心20分钟。倒出上清，加入75％的乙醇500μl，12,000g室温离心5分钟；重复用75％的乙醇洗涤cDNA沉淀一次。倒出离心管中的液体，晾干；沉淀用RNase-Free的水溶解。

3)生物素标记的(Biotin-labeled)cRNA合成：

采用BioArray^TM HighYield^TM RNA转录标记试剂盒(Enzo lifesciences，INC)制备Biotin-labeled cRNA。取上述cDNA 5μl，用RNase-Free水补足至22μl，加入10×HY反应缓冲液(1号管)4μl、10×生物素标记的核苷酸(2号管)4μl、10×DTT(3号管)4μl、10×RNase抑制剂混合液(4号管)4μl、20×T7聚合酶(5号管)2μl，混匀，稍离心，37℃温浴4.5小时，每隔35分钟以600rpm振荡10秒。合成产物可保存在-20℃或直接进行下一步纯化。

纯化cRNA。用Qiagen公司提供的试剂盒纯化cRNA，方法基本与总RNA的纯化相同(见步骤2-6)。

cRNA的定量和检测。用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260/OD280比值，变性胶检测cRNA质量。取2μg cRNA在1.2％的甲醛变性凝胶上电泳，纯化的cRNA应该呈弥散状长条带(见图1)。

cRNA片段化。cRNA约30μg，加入5×片段化缓冲液12μl，补充RNase-Free水至60μl。混匀，94℃温浴35分钟，之后置于冰上。片段化cRNA的质检：取2μg片段化cRNA在1.2％的甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳，可见片段化的cRNA约为35～200bp(图2)。

4)芯片杂交：

配制杂交液。根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液，一张样品芯片需250μl杂交液，一张测试芯片需90μl杂交液。配制方法见表1。

表1.芯片杂交液配制

根据Affymetrix公司提供的芯片杂交方法，先进行测试芯片的杂交、洗染和分析。然后，根据测试芯片的结果再进行样品芯片杂交分析。芯片杂交分析过程简述如下，“步骤一”和“步骤二”同时进行，直到“步骤三”完成。

步骤一：预杂交芯片。取出芯片，平衡至室温；加入1×杂交缓冲液；45℃，60rpm，预杂交10分钟。

步骤二：杂交液的准备。杂交液混匀，离心片刻；99℃，温浴5分钟；将杂交液转至45℃，温浴5分钟；离心机最大转速离心5分钟。

步骤三：杂交芯片。吸出芯片中的1×杂交缓冲液；将杂交液加入到芯片中；45℃，60rpm，杂交16小时。杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液A，进行后面的洗染过程。

5)洗脱芯片

在洗脱工作站上按照芯片类型，根据Affymetrix公司提供的芯片洗脱方法，运行洗脱程序。

6)扫描芯片

根据Affymetrix公司提供的芯片扫描方法，在扫描仪上完成芯片扫描。

Affymetrix公司的人全基因组表达芯片(Affymetrix，

humangenome U133 plus 2.0 arrays)包含人类全基因组约3.85万基因的4.7万个基因转录本及其剪切变体。我们采用该芯片对人肝癌病人的癌组织和癌旁肝组织的基因表达谱进行了研究分析，发现DKK-1基因在肝癌中高表达，肝癌组织中的表达倍数约高于癌旁肝组织30倍。

实施例4.Northern杂交

1)Northern膜片的制备：

准备工作。电泳槽，制胶板，梳子均用3％双氧水浸泡15分钟以上，再用高压后的DEPC处理水冲洗干净。量筒，三角烧瓶DEPC水浸泡过液后，180℃干烤8小时。10×MOPS甲醛凝胶电泳缓冲液(华舜公司，目录号W67)。配制1×甲醛凝胶电泳缓冲液1000ml：取10×MOPS甲醛凝胶电泳缓冲液100ml、37％甲醛20ml，加无RNA酶的水880ml。5×RNA上样缓冲液的配制：80μl 500mMEDTA(pH8.0)、720μl 37％甲醛、2ml 100％甘油、3084μl甲酰胺和4ml 10×MOPS甲醛凝胶电泳缓冲液，加入适量的溴酚蓝，用无RNA酶的水补充体积至10ml。1％甲醛变性凝胶的制备：称取琼脂糖1克(GIBCO BRL，目录号15510-027)，加入无RNase水90ml，微波融化后加入1.8ml 37％的甲醛、10ml的10×MOPS甲醛凝胶电泳缓冲液，混匀后灌胶。电泳之前，把胶置于1×甲醛凝胶电泳缓冲液中至少平衡30分钟。RNA样品的变性：每份样品取总RNA10μg，按照每4倍体积的样品加入1倍体积的5×RNA上样缓冲液，混匀后65℃温浴10分钟，立即置于冰上。

电泳、转移。变性处理的RNA样品进行甲醛凝胶变性电泳，电泳时间4小时。上行毛细管法将凝胶上的RNA转移到尼龙膜(S&S，目录号99J071)上，压重物500克，转移时间18～24小时。取出膜片，在Milli Q水中漂洗数分钟，将膜片置于37℃干燥，80℃干烤1.5小时使RNA固定于尼龙膜上。

2)DNA探针的标记与纯化：

探针的制备。PCR扩增DKK-1基因，根据NCBI网站提供的人DKK-1基因的cDNA序列设计包括其编码区的特异引物(使用引物设计软件primer3.cgiv 0.2a)，正向引物5’GACCCAGGCTTGCAAAGTGACGGT3’和反向引物5’AGGAGTTCACTGCATTTGGATAGCTGG3’，以人胎盘cDNA(BD Clontech)为模板扩增DKK-1，PCR试剂盒为BD Advantage^TM 2PCR kit(目录号639206)反应体系如下：10×反应缓冲液1.25μl、正反向引物(10μM)各1μl、人胎盘cDNA模板1μl、Advantage2聚合酶0.5μl和无菌水7.75μl，总反应体积为12.5μl。温度条件为：94℃ 30sec，72℃ 3min，5个循环；94℃ 30sec，70℃ 30sec，72℃ 3min，5个循环；94℃ 30sec，68℃ 30sec，72℃ 3min，27个循环。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳，将特异条带回收、纯化。PCR产物连接TA克隆后转化感受态菌E.coli.TOP10^F，挑取白色菌斑，接种于LB培养液中，37℃过夜。抽质粒DNA，用PCR方法和EcoRI(Promega，目录号R6011)酶切鉴定，含插入片段的阳性克隆送测序分析。测序正确的阳性克隆，提取质粒、EcoR I酶切，电泳回收DKK-1片段，-20℃保存作为探针备用。

探针标记。随机引物法用放射性[α-³²P]dCTP(Amersham Biosciences，目录号PB10205)标记DNA探针(NEBlot kit，目录号N1500S)，方法如下：用无核酸酶的水(1～33μl)溶解25ng的DKK-1探针DNA，在沸水中煮5min，变性DNA，立即置冰上5min，迅速冷冻离心。于上述DNA样品中按以下顺序添加试剂，10×标记缓冲液(包含随机引物)5μl、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP各2μl)6μl、[α-³²P]dCTP(3000Ci/mmol，50μCi)5μl、DNA多聚酶I-klenow片段(5u)1μl。于37℃孵育1hr。

标记好的DNA探针用QIAquick Nucleotide Removal kit(Qiagen，目录号28304)纯化，方法参照公司提供的说明书。

3)杂交：

将制备好的膜片用Milli Q水润湿，置入68℃预热的杂交液(BDBioscience，目录号636832)中预杂交3小时以上，补充鱼精DNA至100μg/ml。

将纯化的探针在95～100℃水中煮5min，立即置于冰浴上5min，加入到杂交管中，68℃杂交18～24小时。

洗膜除去多余的以及非特异杂交上探针，洗膜所用的溶液是溶液1(2×SSC，0.05％SDS)与溶液2(0.5×SSC，0.1％SDS)。

4)压片：

将洗好的膜片用塑料膜封闭，压上X-光片，-70℃曝光。

我们采用Northern杂交实验对12例肝癌病人的癌组织和癌旁肝组织中DKK-1的表达情况进行了分析，发现有7例患者只在癌组织中高表达DKK-1，而在同一患者相应的癌旁肝组织中不表达(图3)，每份样品的上样量约为10μg总RNA。另外，在分析的全部16种人正常组织中DKK-1仅表达于胎盘组织，而在其它15种正常成人组织中不表达(图4)，每份正常人组织约2μgpolyA⁺ RNA。

实施例5.ELISA方法对肝癌病人外周血中DKK-1蛋白含量的测定

96孔酶标板的包被。将50μl羊抗人DKK-1多体(R&D systems，Inc.，目录号AF1096，100ng/μl)稀释在4,950μl的PBS溶液中，96孔酶标板每孔加入50μl上述稀释液，4℃过夜。0.05％PBST溶液200μl洗3次，每次3分钟。

每孔加入100μl含4％BSA(Sigma，目录号A3059-50G)的PBS溶液，室温封闭2小时。200μl 0.05％PBST洗三次，每次3分钟。

取血清10μl加至90μl的含有0.1％Tween和1％BSA的PBS中，每个样品加复孔，50μl/孔。取2μl重组人DKK-1蛋白标准品(R&D systems，Inc.，目录号1096-DK，10ng/μl)加至400μl的含有0.1％BSA的PBS中，然后作倍比稀释，设7个稀释度，每个标准品加复孔，50μl/孔。室温2小时，200μl0.05％PBST洗三次，每次3分钟。

取20μl生物素标记的羊抗人DKK-1抗体(R&D systems，Inc.，目录号BAF1144，50ng/μl)稀释在4,980μl含0.1％BSA的TBS溶液中，每孔加入50μl的上述稀释液。室温2小时，200μl 0.05％PBST洗三次，每次3分钟。

取链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(Vector laboratories，Inc.，目录号SA-5004)0.5μl，加入到5ml的缓冲液(10mM磷酸盐，0.15M氯化钠，0.1％Tween20，pH7.8)中进行稀释，每孔加入50μl的上述稀释液，室温30分钟。200ul 0.05％PBST洗3次，每次3分钟。

每孔加入100μl OPD底物溶液[8mg OPD(DakoCytomation，目录号S2045)溶于12ml水和5μl H₂O₂中]显色，室温30分钟。

每孔加入100μl的0.5M H₂SO4终止液，将未加标准品的孔设为空白对照，酶标仪490nm处测各孔OD值。

根据标准品作log-log标准曲线(浓度对数为横坐标，OD值对数为纵坐标)，再计算出每个血清样品中的DKK-1含量。

肝癌病人血清DKK-1的ELISA检测结果：34例正常人血清中DKK-1的平均值约为3.61μg/L(其中最高值为8.21μg/L)。14例肝硬化病人的平均值约为2.93μg/L(其中最高值为10.73μg/L)。128例肝癌病人的平均值约为4.85μg/L[其中：10例10μg/L＜DKK-1＜20μg/L；1例DKK-1＝144.4μg/L。11/128约占本次总检测肝癌病人的8.59％。在这11例检出高DKK-1的肝癌病人中，有2例是AFP阴性的肝癌病人，1例是AFP＜200μg/L的肝癌病人(AFP＝60.15μg/L)，占27.3％(3/11)]。

实施例6.ELISA方法检测和分析体外培养的多种人肿瘤细胞分泌的DKK-1蛋白

35mm皿复苏细胞，待细胞长至90％满度时传代于35mm皿中，每个皿加入约3×10⁵的细胞数和1mL培液，24小时后收集细胞培养上清液。

96孔酶标板的包被条件和方法与实施例5完全相同。取细胞培养上清20μl加至80μl的含有0.1％Tween和1％BSA的PBS中，每个样品加复孔，50μl/孔。余下实验完全按实施例5进行操作。

在对照的小牛血清全培养液和胎牛血清全培养液中，DKK-1蛋白浓度基本为零(表2)；在对照的小鼠成纤维细胞NIH3T3和小鼠正常肝纤维样细胞HSC-T6的培养上清中也未检出DKK-1蛋白(表2)；但在8种人类肿瘤细胞或人胚肾细胞293的培养上清中检出有高表达的DKK-1蛋白，其中人脑胶质瘤细胞U251为最高(214.6μg/L)(表2)。

表2.肿瘤细胞培养上清中DKK-1蛋白含量的测定

实施例7

试剂盒

制备了一试剂盒，其含有针对DKK-1的核酸探针(实施例4所述制备)，PCR反应液(用于扩增DKK-1)。根据标准方法扩增了100个肝癌病人的正常组织和癌细胞的cDNA。检测结果发现，100个肝癌病人中的肝癌细胞的DKK-1表达量是正常细胞的将近100倍。

同理，对肺癌、乳腺癌、胶质瘤患者进行了检测，也得到了同样的高达50-100倍的DKK-1表达量的结果。

实施例8

根据实施例5的方法，用一试剂盒，其含有针对DKK-1的特异性抗体(实施例5所述制备)以及ELISA所需的相关试剂。根据标准方法对100个肝癌病人的正常组织和癌细胞进行ELISA分析。检测结果发现，100个肝癌病人中的肝癌细胞的DKK-1表达量是正常细胞的将近100倍。

同理，对肺癌、乳腺癌、胶质瘤患者进行了检测，也得到了同样的高达50-100倍的DKK-1表达量的结果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种癌症诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有抗体，其中的抗体是抗DKK-1抗体，所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌、和胶质瘤。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗DKK-1抗体偶联有可检测基团。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

4.一种癌症诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有核酸探针，其中的核酸探针为DKK-1蛋白特异性核酸探针，所述癌症是肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针偶联有可检测基团。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。

7.DKK-1蛋白或其核酸序列在制备癌症诊断试剂或试剂盒的用途，所述癌症选自肝癌、肺癌、乳腺癌和胶质瘤。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌症诊断试剂是抗DKK-1蛋白特异性抗体或DKK-1蛋白特异性核酸探针。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌症是肝癌。

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