CN105420195B

CN105420195B - 抑癌基因ATOH8及其编码蛋白在制备iPSC中的应用

Info

Publication number: CN105420195B
Application number: CN201510929129.5A
Authority: CN
Inventors: 关新元; 宋洋洋; 李焱
Original assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Current assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: CN105420195A; CN103736103B; CN103736103A

Abstract

本发明公开了抑癌基因ATOH8及其编码蛋白在制备iPSC中的应用。发明人发现了一种新的抑癌基因ATOH8，体内和体外的功能性研究分析表明，其在癌症的发生、发展过程中具有重要作用，ATOH8能够促进干细胞分化和降低癌症干细胞对化疗药物的耐药性，沉默ATOH8的表达为诱导iPSCs形成提供了新的有效途径。

Description

抑癌基因ATOH8及其编码蛋白在制备iPSC中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的抑癌基因及其编码蛋白的应用，特别涉及抑癌基因ATOH8及其编码蛋白的应用。

背景技术

肝细胞癌是世界第五大癌症，它每年影响上百万人的生活。外科手术的方法对肝癌患者的长期存活带来希望，但是只适用于少部分适应症患者。肝癌通常在晚期被诊断，并已经发生了转移和扩散。对于大多数肝癌患者，存活率只有大约6个月左右。对于非手术适应症的患者，化疗是主要的治疗方法。而肝癌病人的化疗平均生存率只有4个月。因此，开发更加可靠的生物标记物诊断方法，更加有效的治疗和预后恢复的靶点药物是被迫切需要的。

科学家已经提供了很多确凿的证据证实了肿瘤干细胞的存在及其重要性，肿瘤干细胞与正常干细胞有很多相似之处，具有众多相同的表面标记物，且都具有自我更新和分化的能力。另外，肿瘤干细胞具有很强的致瘤性。对肿瘤干细胞特性的进一步了解将有助于开发更加有效的癌症诊断/治疗手段，故肿瘤医生和科学家们致力于研究肝癌肿瘤干细胞的机理和解决其抗药性。最近，香港大学关新元教授的团队在世界上首度发现了以CD133作为标记物的肝癌干细胞。类似的报道也先后被其他科学家发现并报道，如CD90和CD24也被作为肝癌干细胞的表面标记物而被发现。即便如此，迄今对于肿瘤干细胞表面标记物的研究还知之甚少。

重编程已分化的体细胞成为多能干细胞在再生医学领域的研究中具有重要的意义。2007年诱导多能干细胞(iPSC)的发现是人类疾病(包括肝脏的遗传性疾病和肝癌)的研究过程中的革命性进展。iPSCs向肝细胞定向分化的方法也为肿瘤疾病提供了新的研究平台和药物筛选平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抑癌基因ATOH8(atonal homolog 8，无调性同源物质8)及其编码蛋白的应用。本发明研究了ATOH8在肿瘤组织特别是肝癌中的表达特点及其调控机制、研究ATOH8的新功能并提供ATOH8的新应用。

ATOH8基因和/或其编码的蛋白在诱导癌症非肿瘤干细胞重编程成为肿瘤干细胞中的应用。

优选的，所述癌症为肝癌。

ATOH8基因和/或其编码的蛋白在制备诱导多能干细胞中的应用。

本发明的有益效果是：

发明人在肝癌肿瘤细胞中发现了一种新的抑癌基因ATOH8，在242例病人组织样本中发现，ATOH8在肝癌病人中超过48％低表达，并且与原发性肝癌病人的生存率低和复发率高等问题显著相关。体内和体外的功能性研究分析表明，ATOH8能够抑制肝癌细胞的生长、迁移和转移。更令人兴奋的是，ATOH8能够促进肝癌细胞凋亡并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性。并且，ATOH8可抑制干细胞多能性基因和干细胞相关生物标记物的表达，这些多能性基因在人的胚胎干细胞保持其多能性的过程中具有重要的意义，并能够诱导体细胞重编程成为诱导多能干细胞，进一步的研究证实，ATOH8在诱导多能干细胞中低表达。综上所述，本研究发现ATOH8是干细胞相关基因的重要抑制物，在癌症的发生、发展过程中具有重要作用，ATOH8能够促进干细胞分化和降低癌症干细胞对化疗药物的耐药性，并且，沉默ATOH8的表达为诱导iPSCs形成提供了新的有效途径，本发明为肿瘤疾病提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选平台。

附图说明

图1显示RNA-seq高通量测序分析ATOH8在肝癌病人癌旁组织及癌组织中的表达情况。

图2显示ATOH8在242例肝癌病人癌旁组织及癌组织中的表达情况。

图3显示ATOH8低表达与肝癌病人生存率低的相关性。

图4显示ATOH8对干细胞相关基因表达的影响。

图5显示双荧光素酶报告基因检测法检测ATOH8对干细胞相关基因的抑制作用。

图6显示电泳迁移率实验结果。

图7显示ATOH8过表达对肿瘤细胞的生长、克隆形成、集落形成、转移能力的影响。

图8显示ATOH8过表达对肝癌细胞的侵袭能力、体内成瘤能力的影响。

图9显示沉默ATOH8将肝癌的普通肿瘤细胞重编程成为肝癌肿瘤干细胞。

图10显示沉默ATOH8可促进体细胞重编程成为诱导多能干细胞。

图11显示ATOH8提高肝癌细胞对于化疗药物的敏感性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明内容。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如，《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1ATOH8在肝癌组织中表达下调

1.RNA-seq高通量测序

通过提取3对肝癌病人的癌组织及其对应的癌旁组织的RNA进行高通量测序，发现ATOH8在3对病人的癌组织中全部低表达。结果如图1所示：448N(41)表示448样本癌旁组织在样本中被测到读数是41；448T(1)表示448样本癌组织在样本中被测到读数是1；473N(29)表示473样本癌旁组织在样本中被测到读数是29；473T(3)表示473样本癌组织在样本中被测到读数是3；510N(39)表示510样本癌旁组织在样本中被测到读数是39；510T(3)表示510样本癌组织在样本中被测到读数是3。

2.qRT-PCR检测ATOH8在肝癌病人的临床标本中的表达

设计qRT-PCR引物(引物序列为表2中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)。根据qRT-PCR的结果，定义ATOH8在癌旁组织中的表达超过其在癌组织中的表达4倍为ATOH8低表达。结果显示在242例肝癌病人的癌组织中超过48％低表达(见图2)。

3.ATOH8低表达具有临床意义

通过SPSS进行统计分析发现，肝癌病人的临床资料和ATOH8在临床样本中的表达，与肝癌病人的生存率低、体内AFP表达过高以及肝癌的低分化相关(见图3和表1)。

表1 临床资料与ATOH8表达情况的相关情况

^a部分数据无法使用，以现有数据进行统计；^b ATOH8在癌旁组织中的表达超过其在癌组织中的表达4倍定义为ATOH8低表达；*显著性差异(P<0.05)。

实施例2ATOH8对干细胞多能性基因的抑制作用

1、构建稳定的ATOH8过表达的细胞株

肝癌细胞株Huh7(日本北海道大学)和PLC8024(中国科学院武汉病毒研究所)由DMEM培养基(DMEM；Gibco BRL)辅以10％的胎牛血清(Gibco BRL)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。

①构建ATOH8的表达质粒

用PCR扩增ATOH8的cDNA全长序列，引物序列如下：

F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG(SEQ ID NO.1)；

R:ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT(SEQ ID NO.2)。

将纯化的ATOH8全长序列构建到表达载体上(Invitrogen，K4950-00)，获得ATOH8表达质粒pLenti6-ATOH8。

②转染肝癌细胞

分别利用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668)和优化的包装质粒(Invitrogen,K4975-00)将获得的pLenti6-ATOH8和作为对照的pLenti6空载体(pLenti6-vector)转入293FT细胞。并于12小时后更换DMEM培养基(DMEM；Gibco BRL)辅以10％的胎牛血清(Gibco BRL)。48小时及72小时后收集慢病毒上清，并转导进入Huh7和PLC8024细胞系。

用杀稻瘟菌素(6ug/mL；Sigma-aldrich)筛选2周左右可得到稳定的ATOH8过表达的细胞株8024-ATOH8和Huh7-ATOH8，对照细胞株分别为8024-Vec和Huh7-Vec。

2、构建稳定的ATOH8沉默的细胞株

肝癌细胞株QSG7701(中国科学院武汉病毒研究所)由DMEM培养基(DMEM；GibcoBRL)辅以10％的胎牛血清(FBS)(Gibco BRL)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。

带有特异性稳定表达的ATOH8-shRNA(sh4，TGTGCTCAACCATCTGCTT(SEQ ID NO.3)；sh7，GGTGCCGTGCTACTCATAT(SEQ ID NO.4))和阴性对照(psiHIV-Ctl)由GeneCopoeia公司提供，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668)和优化的包装质粒(GeneCopoeia,HPK-LvTR)将ATOH8-shRNA和作为对照的psiHIV-Ctl转入293FT细胞。并于12小时后更换培养基DMEM培养基(DMEM；Gibco BRL)辅以10％的胎牛血清(Gibco BRL)。48小时及72小时后收集慢病毒上清，并转导进入QSG7701细胞系。

转染48小时后用3μg/mL的嘌呤霉素(OriGene)筛选2周左右得到稳定的ATOH8沉默的细胞株7701-sh4、7701-sh7，和对照细胞株7701-Ctl。

3、检测干细胞相关基因的表达情况

用TRIzol试剂盒(invitrogen)提取ATOH8过表达和沉默的肝癌细胞及其对照细胞的总RNA。按试剂盒操作说明，取2μg RNA用逆转录PCR试剂盒(Clontech)合成cDNA。cDNA经PCR扩增后其产物用美国ABI公司的ABI PRISM 7900HT荧光定量PCR仪对ATOH8基因转录水平进行实时检测及定量。

结果显示ATOH8的过表达会抑制干细胞相关基因的表达，如Sox2、Nanog、Oct4、AFP、CD133和CD24(图4A)。而沉默ATOH8的表达将促进这些干细胞相关基因的表达(见图4B)。干细胞相关基因表达检测的引物见表2。

表2 相关基因表达检测的引物

4、利用双荧光素酶报告基因检测和电泳迁移率实验(EMSA)的方法证明ATOH8是否可以绑定在干细胞相关基因的启动子区域的E-box和bHLH motifs上。

①双荧光素酶报告基因检测法

克隆约2kb的Oct4、Nanog和CD133的启动子序列到载体pGL3-enhancer vector(Promega,E1771)上，得到pGL3-Otc4、pGL3-Nanog、pGL3-CD133。克隆引物序列见表3。按10:10:1混合在荧光霉素载体上构建的Oct4、Nanog和SOX2的启动子，pLenti6-ATOH8和海肾荧光素酶(Promega,E2241)根据操作说明同时用Lipofectamine2000转染进入Huh7细胞系。pGL3-ctl(pGL3-control)载体(Promega,E1741)作为实验的阳性对照，pGL3-enhancer载体(Promega,E1771)作为实验的阴性对照，而海肾荧光素酶作为内参。并于转染48小时后，利用双荧光素酶报告试剂盒(Promega,E2920)用酶标仪测定荧光霉素的表达量和内参海肾荧光素酶的表达量。结果显示ATOH8作用在Oct4、Nanog和CD133的启动子上抑制Oct4、Nanog和CD133的表达(如图5所示)。

表3 Oct4、Nanog和CD133的启动子序列构建引物

②电泳迁移率实验(EMSA)

用nucbuster蛋白提取试剂盒(NucBuster TM Protein Exaction Kit，MERCK)提取与DNA结合的蛋白。用DIG-labeled dUTP(Roche)标记核苷酸探针(探针序列见表4)，探针用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。这种结合的反应是在非变性聚丙烯酰胺凝胶并转移至尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，通过冷竞争反应检测ATOH8和Oct4的结合位点。复合物用UV crosslinker烘烤3分钟。用荧光检测试剂盒(罗氏)和BioMaxLight film(Kodak)检测相应的蛋白-DNA复合物。

表4 探针序列

实验结果证明ATOH8通过与Oct4的启动子序列上的结合位点结合来抑制Oct4的表达(见图6)。

实施例3ATOH8对肝癌细胞的生长、迁移和转移的抑制作用

本实施例中，实验组所用细胞为实施例2所述经pLenti6-ATOH8处理的过表达ATOH8的PLC8024和Huh7细胞系(8024-ATOH8、Huh7-ATOH8)，对照组所用细胞为空白载体pLenti6-vector处理的PLC8024和Huh7细胞系(8024-Vec、Huh7-Vec)。

1、细胞生长实验

通过XTT的含量检测过表达ATOH8的细胞生长率的变化。实验操作按照细胞增殖XTT试剂盒(Roche,Mannheim)说明书进行。简述如下：将实验组细胞或对照组细胞按1×10⁴个/孔接种于24孔培养板中，每隔24小时往一组细胞中加入终浓度为100μl 0.3mg/mL的XTT标记混合物，培养4小时后用酶标仪(Tecan)测量OD值，本实验平行重复3次。结果表明ATOH8的过表达抑制肝癌肿瘤细胞的生长(图7A)。

2、克隆形成实验

将实验组细胞或对照组细胞接种于6孔板中，每孔1×10³个。常规培养2到3周后，用吉姆萨染色，计数存活克隆(>50个细胞/克隆)，此实验平行重复3次，计算平均值和标准差。实验结果如图7C所示，显示ATOH8抑制肝癌细胞的克隆形成能力。

3、软琼脂集落形成实验

软琼脂集落形成实验是应用最为广泛的检测细胞无支持面增殖能力的实验。将1×10⁴个实验组细胞或对照组细胞分别接种在含0.4％琼脂的培养基中，并平铺于含0.6％琼脂的培养基固化凝胶上。2到4周后计数集落数目，并计算出集落形成率(集落形成率＝集落数目/所种细胞数×100％)，本实验平行重复3次。结果显示ATOH8抑制肝癌细胞的集落形成能力(图7B)(图7中横坐标V表示对照组，AT表示ATOH8过表达细胞株)。

4、划痕实验

为了证明ATOH8对细胞侵袭能力的影响，本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，利用经典细胞划痕法测定肿瘤细胞的转移运动特性。在体外培养的实验组或对照组单层细胞上，划痕至伤，常规培养24至48小时后通过对比实验组和对照组，评价ATOH8影响肿瘤细胞转移能力的效果，此实验平行重复3次。实验表明ATOH8的过表达减弱了肝癌细胞的细胞转移能力(图7D)。

5、基质胶侵袭实验

ATOH8对细胞侵袭能力的影响通过基质胶侵袭实验检测。将5×10⁴个实验组或对照组的细胞分别接种于含无血清培养基并包被有BD基质胶的上室中(Becton DickinsonLabware)，将上室置于含完全培养基的下室中，常规培养24小时后的所有实验操作严格按照试剂盒(Becton Dickinson Labware)说明书进行，计数进入下室的细胞量，此实验平行重复3次。结果表明ATOH8的过表达减弱了肝癌细胞的细胞侵袭能力(图8A)。

6、裸鼠成瘤实验

将1×10⁶个实验组细胞或对照组细胞分别注射到10只4周龄左右裸鼠的左、右测背部。监测注射后2个月内肿瘤的形成和肿瘤的大小。实验结果显示ATOH8的过表达减弱了肝癌细胞的体内成瘤能力(图8B)。

结论：

ATOH8的过表达显著抑制了肝癌细胞的生长、增殖、细胞转移及侵袭能力；并且动物的体内试验也证实了ATOH8的过表达明显削弱了肝癌细胞的成瘤能力。

实施例4ATOH8的沉默将肝癌的普通肿瘤细胞重编程成为肝癌肿瘤干细胞

1、ATOH8沉默促进肝癌干细胞标记CD133阳性细胞的数量。

由于沉默ATOH8的表达可以促进肝癌干细胞标记CD133的表达，所以我们认为ATOH8的沉默可以肝癌细胞系中提高CD133阳性细胞的数量。通过流式细胞仪检测CD133在ATOH8沉默的肝癌细胞系(QSG7701、Bel7402、Huh7和PLC8024)及其对照组中的比例。研究结果显示ATOH8可以显著提高肝癌细胞系中CD133阳性细胞的数量，同时ATOH8的过表达明显减少了CD133阳性细胞的数量(图9A)。尤其是QSG7701细胞系几乎不存在CD133阳性细胞，而ATOH8的沉默将CD133阳性的细胞群比例提升至大约10％。图中，红色框图shATOH8表示ATOH8沉默的细胞株；灰色框图+ATOH8表示ATOH8高表达的细胞株；蓝色框图ctl表示阴性对照。

2、由ATOH8的沉默诱导出的CD133阳性的细胞具有更强的体内和体外的成瘤能力。

我们利用流式分选的方法分选出CD133阳性和CD133阴性的细胞群。实验结果发现这些由ATOH8沉默诱导出现的CD133阳性的细胞具有更强的肿瘤成瘤能力(图9B-D)。

3、由ATOH8的沉默诱导出的CD133阳性的细胞具有肿瘤干细胞的特性。

1)类干细胞球体形成实验证实这些CD133阳性的细胞具有肿瘤干细胞自我更新的能力(图9E)。

2)利用促分化剂atRA处理CD133阳性和CD133阴性的细胞群，并通过RT-PCR检测肝癌分化相关基因白蛋白、CK8、CK18、AFP、NANOG和OCT4等(扩增引物如表2所示)证实CD133阳性具有肿瘤干细胞分化的能力(图9F、G)。

3)化疗药物抗药性实验证实CD133阳性的细胞具有更强的抗化疗药物的能力(图9H)。

结论：

ATOH8的沉默将普通的肝癌肿瘤细胞重编程成为肝癌肿瘤干细胞，这些被重编程的肿瘤干细胞具有所有肿瘤干细胞的特性。

实施例5ATOH8的沉默促进体细胞重编程成为诱导多能干细胞

由于ATOH8表达的沉默可以提高具有肿瘤干细胞特性的CD133阳性细胞的比例，本研究认为ATOH8的缺失或沉默会提高诱导多能干细胞的形成效率。

1、在已经成熟稳定的诱导多能干细胞及其来源的体细胞中检测ATOH8的表达。

通过RT-qPCR检测的结果显示，在4对诱导多能干细胞及其来源的体细胞(A153、G2F1、hNF1、SF002)中ATOH8在诱导多能干细胞中显著低表达(图10A)。

2、ATOH8的沉默对于诱导多能干细胞重编程过程的影响。

同时将重编程4因子(SOX2、KLF4、OCT4和c-MYC，简称SKOM)与ATOH8的shRNA(sh4、sh7)或者ATOH8的过表达质粒转染进入人的上皮成纤维细胞，碱性磷酸酶染色结果显示ATOH8的沉默会促进诱导多能干细胞重编程克隆形成的效率(图10B)，而过表达ATOH8会抑制重编程的过程(图10C)。

结论：

ATOH8的沉默提高了诱导多能干细胞重编程克隆形成的效率，并从侧面证实了ATOH8的沉默可以将普通的肝癌肿瘤细胞重编程成为肝癌肿瘤干细胞。而ATOH8是一个促进细胞分化的基因，可能会与干细胞分化相关。

实施例6ATOH8提高肝癌细胞对于化疗药物的敏感性

由于ATOH8的沉默可以提高肝癌细胞系对于化疗药物的抗性，因此ATOH8在提高肝癌细胞对于化疗药物的敏感性的方面有很大的意义。

1、利用化疗药物(顺-双氨双氯铂和5-氟脲嘧啶)处理ATOH8过表达细胞株。并用XTT细胞生长实验，检测ATOH8对于化疗药物的半数抑制浓度(IC₅₀)的影响。结果显示ATOH8显著提高了肝癌细胞株对于肿瘤化疗药物的敏感性(图11A)。

2、利用原位肝癌肿瘤模型评价ATOH8抗肿瘤效果及其化疗增效效果。

为了进一步检测ATOH8对肝癌的抑制作用，我们通过对裸鼠进行原位肿瘤接种，更好地模拟肝癌的自然发生过程。我们将Huh7接种的肿瘤切成1mm³的小块，并埋于不同裸鼠的皮下，待长到大约1cm³均一大小的肿瘤进行分组实验。第一组只在肿瘤上注射带有空白对照Vec的慢病毒；第二组只在肿瘤上注射带有ATOH8过表达的慢病毒；第三组在裸鼠腹腔注射顺一双氨双氯铂(CDDP)同时在肿瘤上注射带有空白对照Ctl的慢病毒；第四组在裸鼠腹腔注射CDDP同时在肿瘤上注射带有ATOH8过表达的慢病毒；第五组在裸鼠腹腔注射5-氟脲嘧啶(5-FU)同时在肿瘤上注射带有空白对照Ctl的慢病毒；第六组在裸鼠腹腔注射5-FU同时在肿瘤上注射带有ATOH8过表达的慢病毒。结果显示(图11B)只注射带有ATOH8的慢病毒会降低肿瘤的生长速度，而同时注射带有ATOH8的慢病毒和化疗药物会显著促进肿瘤的凋亡。

结论：

体内和体外实验均证实ATOH8可以显著提高肝癌细胞对于化疗药物的敏感性，具有深远的临床治疗意义。

<110> 中山大学附属肿瘤医院

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<213> 人工序列

<400> 32

gccgctcgag tccttcctat tcccaaac 28

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aggctctgca catcccagct gtctggaatc actcccacac ctccatgttc 50

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aggctctgca catccaagct gtctggaatc actcccacac ctccatgttc 50

<210> 35

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ataagcacaa tggccagctg ctcccttatg cctt 34

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ataagcacaa tggcaagccg ctcccttatg cctt 34

<210> 37

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atgggtgtcc cgtggccagc tgtcttcatc ttggtggcat c 41

<210> 38

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

atgggtgtcc cgtggcaagc cgtcttcatc ttggtggcat c 41

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gtctacaagg cagtggggtt gcagctgtgt tcacttctcg gcctttaa 48

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gtctacaagg cagtggggtt gaagccgtgt tcacttctcg gcctttaa 48

Claims

1.沉默ATOH8基因的表达在促进癌症非肿瘤干细胞重编程成为肿瘤干细胞中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述癌症为肝癌。

3.沉默ATOH8基因的表达在制备诱导多能干细胞中的应用。