CN113528520B - 环状RNAhas_circ_0000591及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤疾病研究领域，主要公开了环状RNAhas_circ_0000591及其应用。环状RNAhas_circ_0000591，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。过表达的环状RNAhas_circ_0000591在制备治疗肿瘤药物中的应用。环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。治疗肿瘤疾病的药物，包括环状RNAhas_circ_0000591基因表达促进剂。本发明通过促进环状RNAhsa_circ_0000591表达试剂在制备治疗肿瘤、膀胱癌免疫治疗药物上的应用，可以有效地缓解病情，增加患者对免疫靶向药物的敏感性，从而延长患者生存时间。

Description

环状RNAhas_circ_0000591及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤疾病研究技术领域，尤其涉及环状RNAhas_circ_0000591 及其应用。

背景技术

膀胱癌的治疗依然面临着严峻挑战，侵袭性膀胱癌是治疗的重点和难点，也是研究热点。膀胱癌具有易浸润、易复发、易耐药等特点，手术治疗效果有限，亟需更加有效的综合治疗手段。近年来免疫检查点抑制剂等相关药品的问世，标志着膀胱癌免疫治疗取得了部分突破性进展，但免疫治疗整体反应率仍偏低(21％)。对膀胱癌免疫治疗敏感性相关机制的进一步解析是膀胱癌治疗研究的重要方向，以此为基础制定的靶向治疗策略有可能为膀胱癌的治疗带来新选择，具有重要的临床意义。

肿瘤免疫浸润在肿瘤调控中发挥重要作用。免疫微环境中各种效应细胞通过不同途径执行细胞杀伤功能，其中CD8+T细胞通过诱导凋亡和细胞因子分泌杀死肿瘤细胞。

环状RNA分子主要以不编码蛋白的形式发挥作用，被证实与多种肿瘤密切相关，成为研究的热点。环状RNA结构较其他非编码RNA更稳定，具有较好的转录后调控功能，是膀胱癌诊断和治疗的潜在靶点。但是，在膀胱癌中环状RNA与免疫治疗的关系尚未见报道，需进一步的探索和研究。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了肿瘤治疗的一个新的作用靶点，主要解决了现有肿瘤治疗尤其是膀胱癌免疫治疗中治疗手段单一、效果不佳等问题。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

环状RNA has_circ_0000591，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或其结构是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转录后经反向剪接形成的3’端和5’端首尾相连的环状RNA结构。

过表达的环状RNA has_circ_0000591在制备治疗肿瘤药物中的应用。

环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌。

治疗肿瘤疾病的药物，包括所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂，和/或过表达的环状RNA has_circ_0000591；在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌。

环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂在制备提高肿瘤疾病免疫治疗敏感性药物中的应用，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌；

一些情况中，所述肿瘤疾病免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗的敏感性。

肿瘤疾病免疫治疗敏感性提高药物，包括权利要求1所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌；

一些情况中，所述肿瘤疾病免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗敏感性。

促进肿瘤细胞凋亡的药物，包括所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂；

一些情况中，所述药物为促进CD8+T细胞浸润的药物。

本发明的有益效果是：

促进环状RNA hsa_circ_0000591表达的试剂在制备治疗肿瘤膀胱癌免疫治疗药物上的应用，可以有效地缓解病情，增加患者对免疫靶向药物的敏感性，从而延长患者生存时间。

附图说明

图1为RNA has_circ_0000591的制备结果检测图；

图2为实施例1结果图；

图3为实施例2结果图；

图4为实施例3结果图；

图5为实施例4结果图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明：

环状RNA has_circ_0000591，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或其结构是由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转录后经反向剪接形成的3’端和5’端首尾相连的环状RNA结构。

过表达的环状RNA has_circ_0000591在制备治疗肿瘤药物中的应用。

环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌。

治疗肿瘤疾病的药物，包括所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂，和/或过表达的环状RNA has_circ_0000591；在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌。过表达的环状RNA has_circ_0000591可以由脂质体包裹，从而使其转到体内并表达，发挥作用。具体的转移和用药方式采用现有研究技术即可，能够等同替换的送药技术，不做特别限定。

环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂在制备提高肿瘤疾病免疫治疗敏感性药物中的应用，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌；

一些情况中，所述肿瘤疾病免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗的敏感性。

肿瘤疾病免疫治疗敏感性提高药物，包括权利要求1所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂和/或过表达所述环状RNA has_circ_0000591质粒，在一些情况中，所述肿瘤疾病包括膀胱癌；

一些情况中，所述肿瘤疾病免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗敏感性。

促进肿瘤细胞凋亡的药物，包括所述环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂和/或过表达所述环状RNA has_circ_0000591质粒；

一些情况中，所述药物为促进CD8+T细胞浸润的药物。

本发明环状RNA has_circ_0000591基因表达促进剂囊括了环状RNA has_circ_0000591基因过表达促进剂，过表达促进剂能够有效的促使环状RNA has_circ_0000591基因过表达，但是，其他促进RNA has_circ_0000591基因表达，且能够实现改善肿瘤治疗效果的基因表达促进剂也应当在本发明范围内。

前期对膀胱癌及癌旁组织测序发现hsa_circ_0000591表达明显下调，其表达量与患者生存呈显著正相关，并且高表达该环状RNA的肿瘤组织中有更多的CD8+T细胞浸润。进一步研究发现过表达hsa_circ_0000591能显著提高膀胱癌免疫治疗敏感性。

将膀胱癌细胞系种植于6孔板，次日其密度达60-80％作用时进行提取 RNA步骤,使用Ultraure RNA Kit试剂盒(CWBIO,China)，具体操作根据说明书进行。将提取得到的RNA进行逆转录得到cDNA,使用HiScript III RT SuperMix 试剂盒(Vazyme,China),再用SYBR Green Master Mix试剂盒(Vazyme,China)进行实时定量PCR(qRT-PCR)，qRT-PCR分析使用Step OnePlus Real Time PCR System(Applied Biosystems,USA)进行，将其产物进行sanger测序得到此图。图中箭头显示circ0000591的环化位点。图1说明circ0000591由MGA基因的2 号外显子环化形成。

实施例1

将73对膀胱癌标本及其对应的邻近的膀胱黏膜正常上皮标本各自提取 RNA，提取RNA步骤同上，再进行逆转录后实施实时定量PCR(同上)，检测膀胱癌标本相对于癌旁正常膀胱黏膜中的circ0000591的表达量，可以看出 circ0000591在膀胱癌标本中是低表达的。图2说明circ0000591在膀胱癌临床组织样本中相对于癌旁的正常组织的表达水平是降低的。

实施例2

将实施例1进行的73例膀胱癌标本检测出的circ0000591表达量分为两组(高、低表达)，根据临床患者术后随访相关资料，根据每例患者的生存时间(定义为从手术日期到死亡日期或幸存者最后一次随访日期)作图得到此生存曲线，可以看出circ0000591越高，生存时间越长。图3说明circ0000591 的表达量与患者的生存期呈正相关。

实施例3

将两种膀胱癌细胞EJ，T24T和UMUC3种于6孔板，次日其密度约60-80％时进行转染过表达circ0000591质粒,转染试剂使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)，步骤按照说明书进行(无血清培养基：质粒:转染试剂比例约 100ul：2ug：2ul)，24h后收取细胞进行RNA提取，逆转录，实时定量PCR 检测circ0000591过表达效率。图4验证过表达circ0000591的效率。

实施例4

将稳定表达circ0000591分子的膀胱癌细胞EJ接种于免疫系统人源化的小鼠皮下，构建好皮下瘤模型后，分别给与抗PD-1抗体及相应的IgG抗体对照处理，(100ug/只/次，每3天腹腔注射一次，连续注射4次)，40天后，收集皮下瘤拍照，分析数据。可以观察到过表达circ0000591之后可以提高膀胱癌对抗PD-1抗体为主的免疫治疗的敏感性。图5说明过表达circ0000591可以提高膀胱癌细胞抗PD1治疗的敏感性。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 环状RNAhascirc0000591及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人(Homo)

<400> 2

gatgggaagg ccattgtgac tatgtggtga ttacagttgt cttactactg agtttcctac 60

tgaaatcatg gaggagaaac agcagattat attggctaat caagatggtg gaacagtggc 120

aggagcagca cctaccttct ttgtcatctt aaagcagcca ggaaatggca aaactgatca 180

aggaattttg gttactaatc aggatgcctg tgctttggct agtagtgtgt catcaccagt 240

aaaatctaaa gggaagattt gccttccagc tgattgtact gtgggtggaa tcactgttac 300

cctcgataac aatagtatgt ggaatgagtt ctatcatcga agcacagaga tgattctgac 360

caagcaagga agacgcatgt ttccttactg tcgttattgg ataacaggtt tagattcaaa 420

tttgaagtat attcttgtca tggatatatc tcctgtggat aaccatcgtt ataagtggaa 480

tggtcgttgg tgggaaccta gtgggaaggc tgaacctcat gttttgggga gggttttcat 540

tcatccagaa tctccttcca caggtcatta ttggatgcat caaccagtat ctttctataa 600

actcaaactt accaacaata cactggacca agaagggcat atcatcttgc actctatgca 660

tcgttacctg ccgaggcttc atttggtgcc tgcagaaaag gctgtggagg tgatacaatt 720

aaatggccct ggtgtccaca cttttacctt cccacagact gaattctttg cagtaacagc 780

ttatcagaac attcagatta ctcagctgaa aatagattac aatccatttg ccaaaggctt 840

tcgggatgat gggctgaata ataagcccca gagagatgga aaacaaaaga acagctctga 900

ccaagaaggg aataatattt ccagttcttc tggtcatcgg gtccgtctta cagaaggtca 960

ggggtcagag atacaaccag gtgatttgga tcctttgtca aggggtcatg aaacatcagg 1020

caagggtttg gagaagactt cccttaatat aaaacgagac tttcttggtt tcatggatac 1080

tgattcagca cttagtgaag ttcctcaatt gaagcaagag atttctgaat g 1131

Claims (6)

1.过表达环状RNA has_circ_0000591的质粒在制备治疗膀胱癌药物中的应用，环状RNA has_circ_0000591的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.过表达环状RNA has_circ_0000591的质粒在制备提高膀胱癌免疫治疗敏感性药物中的应用，环状RNA has_circ_0000591的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗的敏感性。

4.膀胱癌免疫治疗敏感性提高药物，其特征在于，包括过表达环状RNA has_circ_0000591的质粒，环状RNA has_circ_0000591的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的膀胱癌免疫治疗敏感性提高药物，其特征在于，所述膀胱癌免疫治疗敏感性为癌细胞抗PD-1免疫治疗敏感性。

6.脂质体包裹的过表达环状RNA has_circ_0000591的质粒在制备治疗膀胱癌的药物中的应用，环状RNA has_circ_0000591的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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