CN116801890A - 用于增强治疗性免疫细胞功效的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开文本总体上尤其涉及已经被工程化以表达介体复合物的降低水平的一个或多个亚基的重组免疫细胞，并且特别涉及展现出增强的效应子功能的工程化免疫细胞。还提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的方法、包含所述具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的药物组合物、以及用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法和试剂盒。

Description

用于增强治疗性免疫细胞功效的方法和组合物
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是根据由美国国立卫生研究院授予的合同CA232568和CA049605在美国政府支持下完成的。政府享有本发明的一定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月4日提交的美国临时专利申请序列号63/109,517的优先权，将其公开内容通过引用以其整体并入本文，包括任何附图。
序列表的并入
本申请包含序列表，其通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“078430-527001WO_Sequence Listing_ST25.txt”的序列表文本文件创建于2021年10月5日，并且为3.4KB。
技术领域
本公开文本总体上尤其涉及已经被工程化以表达介体复合物的降低水平的一个或多个亚基的重组免疫细胞，并且特别涉及具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞。还提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的方法、包含所述具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的药物组合物、以及用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法和试剂盒。
背景技术
免疫细胞具有靶向肿瘤细胞同时保留正常组织的潜力，因此免疫细胞可以是有效的和特异性的“活药物”。一些临床观察结果表明它们可能具有主要的抗癌活性。出于这个原因，基因修饰的免疫细胞的过继转移已经成为各种恶性肿瘤的有效疗法。例如，当前模式的过继T细胞疗法包括经修饰以表达癌症抗原特异性受体(如嵌合抗原受体(CAR)和高亲和力T细胞受体(TCR))的细胞。在过继T细胞疗法中，经修饰的T细胞典型地通过体外或离体暴露于同源抗原而被激活，扩增，然后将其施用于个体，在所述个体中它们扩增并展现出细胞溶解活性和/或发送信号以启动针对靶癌症的免疫应答。
使用CAR修饰的自体T细胞(CART)疗法(其依赖于将T细胞重定向到癌细胞(如B细胞恶性肿瘤)上合适的细胞表面分子)的最新研发在利用免疫系统的力量治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症方面显示出有希望的结果。例如，使用对B细胞恶性肿瘤上表达的CD19蛋白具有特异性的CAR-T细胞进行的最新临床试验表明，在一部分患有晚期癌症的患者中疾病明显消退。这一成功导致FDA批准两种CD19-CAR T细胞治疗剂(阿基仑赛()和替沙仑赛(/>))以及在用于治疗大B细胞淋巴瘤(LBCL)和B细胞急性淋巴母细胞白血病(B-ALL)的药物的临床开发中的其他疗法。
然而，将这种疗法扩展到其他类型的癌症(尤其是实体瘤)带来了一些挑战。例如，与血液恶性细胞(如表达CD19的B细胞，所述CD19几乎是要靶向的肿瘤独有抗原，这允许特异性和因此宽的治疗窗口)形成对照，实体瘤通常驻留在经由淋巴血管循环不易到达的部位，所述部位被致密的基质和含有免疫抑制性白细胞和细胞因子的肿瘤微环境隔离。细胞毒性T细胞(CTL)迁移的障碍还包括偏好于非靶器官(如肺、肝和脾)、由于异常血管形成引起的膨胀压而导致的淋巴细胞外渗受限、肿瘤脉管系统上粘附分子的表达下调以及吸引淋巴细胞的趋化因子的释放减少。此外，实体瘤中的肿瘤异质性对抗原选择提出了挑战。此外，肿瘤微环境引发了许多耐受性和免疫抑制机制，所述机制可以降低过继细胞疗法的有效性。此外，除了CAR-T细胞识别和破坏所靶向的细胞的能力外，成功的治疗性T细胞疗法还需要具有增殖、随着时间的推移持续存在以及进一步监测癌细胞逃逸物的能力。据报道，T细胞的可变表型状态(无论是呈无效能、抑制或耗竭状态)对CAR-T细胞的功效具有多种影响。此外，为了有效性，CAR-T细胞需要施用后在体内持续存在，例如存活，并维持响应于CAR抗原的增殖能力。
因此，需要新的组合物和策略来产生用于过继细胞疗法的改进的治疗性细胞。本发明公开的方面和实施方案解决了这些需求并提供了其他相关的优点。
发明内容
本文尤其提供了用于预防和/或治疗各种健康状况的新方法和组合物。特别地，本文描述了对例如癌症疗法具有增强的治疗功效的工程化免疫细胞。本公开文本的一些实施方案涉及已经被工程化以表达介体复合物的降低水平的一个或多个亚基的免疫细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞展现出增强的效应子功能。还提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞群体的方法、和含有这种具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞群体的药物组合物、以及用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法和试剂盒。
在一个方面，本文提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将能够降低所述免疫细胞中介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入所述免疫细胞中。
所公开的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是中部模块亚基。在一些实施方案中，所述中部模块亚基是MED19或MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。在一些实施方案中，所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13。在一些实施方案中，将所述核酸掺入以下中的一种或多种中：(i)CRISPR/Cas基因组编辑系统的指导RNA(gRNA)、(ii)TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)基因组编辑系统，(iii)用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑、(iv)反义核酸分子、(v)双链RNAi分子、或(vi)能够诱导mRNA的抑制或降解的发夹RNA分子。在一些实施方案中，所述核酸包括与内源性基因组基因座内编码所述介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T细胞(NKT)。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是选自以下的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞、大量CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是选自以下的CD4+T辅助性淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量CD4+T细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的方法进一步包括将一种或多种重组免疫受体(如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))掺入所述免疫细胞中。
在一个方面，本文提供了工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含能够降低所述免疫细胞中介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在另一个方面，本文提供了通过本公开文本的方法产生的工程化免疫细胞。本文所述的工程化免疫细胞的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一种或多种。在一些实施方案中，所述免疫细胞是在体外、离体或体内的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是耗竭性免疫细胞或非耗竭性免疫细胞。在相关方面，本文提供的细胞培养物包含至少一种本公开文本的工程化免疫细胞和培养基。
在另一个方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和a)本公开文本的工程化免疫细胞；和/或b)含有与基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
本文所述的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种本公开文本的工程化免疫细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物包含含有与基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在一些实施方案中，包含所述核酸的组合物被包封在病毒衣壳、脂质体或脂质颗粒(LNP)中。
在另一个方面，本文提供了用于治疗有需要的受试者的健康状况的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：(a)本公开文本的工程化免疫细胞；b)含有与基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26；和/或c)本公开文本的药物组合物。
本文所述的治疗方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述健康状况是增殖性疾病、自身免疫性疾病或感染。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，所述哺乳动物受试者是人受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有或怀疑患有增殖性疾病、自身免疫性疾病或感染。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是白血病或骨肉瘤。在一些实施方案中，所施用的组合物赋予增强的效应子功能，所述效应子功能选自生长速率(增殖)、细胞因子产生、靶细胞抑制(例如，抗癌细胞毒性)、巨噬细胞激活、T细胞激活、NK细胞激活和体内持久性(例如，存活)。在一些实施方案中，所述增强的效应子功能包括干扰素γ(INFγ)、白介素-2(IL-2)和/或肿瘤坏死因子α(TNFα)的增加的产生。在一些实施方案中，所述增强的效应子功能包括增加的效应记忆T细胞表型。在一些实施方案中，所述增强的效应子功能包括增加的氧消耗率和细胞外酸化率。在一些实施方案中，将所述组合物单独地(单一疗法)或作为第一疗法与第二疗法组合施用于所述受试者，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。
在又另一方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)本公开文本的工程化免疫细胞；(b)含有与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基；和/或c)本公开文本的药物组合物。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
图1示意性地描绘了CAR-T细胞CRISPR敲除文库的产生。从两个人供体纯化T细胞。使用慢病毒载体将以每个基因10个指导物靶向所有约20,000个蛋白质编码基因的CRISPR文库以低感染复数(10％阳性)整合到2亿个T细胞中。在第3天将纯化的Cas9蛋白电穿孔到T细胞中，并在激活后第3天和第4天通过逆转录病毒整合CAR。
图2示意性地描绘了CRISPR筛选实验设计。将基因编辑的CAR-T细胞在体外培养2周。强直性信号传导CAR的表达诱导了进行性T细胞功能异常。为了针对细胞因子产生进行筛选，将一小部分群体用肿瘤细胞刺激，并通过FACS对表达高水平IL-2和TNFα的T细胞进行分选。为了针对增殖进行筛选，将T细胞与表达CAR-T靶标的肿瘤细胞一起再共培养7天。
图3以图形方式总结了用于说明从增殖筛选选择的基因显示出重复供体之间的再现性而进行的实验的结果。在第0天和第23天量化指导RNA的丰度。图显示了靶向每个基因的所有指导RNA的平均log2(变化倍数)。绘制在右上象限中的基因在缺失时增强增殖，而左下象限中的基因在缺失时降低增殖。
图4A-图4B以图形方式总结了用于说明可鉴定统计学上显著的基因的全基因组CRISPR筛选而进行的实验的结果。使用MAGECK算法分析指导物的相对丰度并计算每个基因的调整后P值(Li 2014)。如图4A所示，细胞因子产生筛选将总的第15天群体中的指导物丰度与高细胞因子群体中的指导物丰度进行比较。如图4B所示，增殖筛选将第23天的丰度与第0天的丰度进行比较。靶向基因组的安全非编码区的指导物被包括在内以作为对照，并且对于安全靶向指导物的平均log2(变化倍数)由竖直虚线指示。对于统计学显著性的阈值由水平虚线指示。细胞因子产生筛选鉴定了1个统计学上显著的基因，而增殖测定鉴定了若干个统计学上显著的基因。
图5A-图5B以图形方式总结了用于说明在增殖筛选中可检测到所有33个介体复合物亚基而进行的实验的结果。绘制靶向每个基因的所有指导物的平均log2(变化倍数)。首先，通过对供体1和供体2取平均值来计算每个指导物的平均富集。然后，通过对指导物平均值取平均值来计算每个基因的平均富集。误差条描绘了指导物的标准差。MED12和CCNC两者均存在于CDK8激酶模块(CKM)中。除在T细胞中不表达的MED12L外，CKM的所有成员的丢失都增强了增殖。除MED26和MED19(预计它们会在中间结构域与CKM之间形成物理接触)之外，在头部、骨架和中间结构域中发现的介体亚基的丢失减少了增殖。此外，尾部区域的一些成员(例如MED27、MED15、MED16和MED24)在缺失时略微增强了增殖。
图6A-图6F以图形方式总结了用于说明MED12无效和CCNC无效CAR T细胞产生更多的IL-2和IFNγ而进行的实验的结果。激活后第3天缺失靶基因CCNC和MED12以及对照基因AAVS1。使用CD19-28ζ、HA-28ζ和HER2-4-1BBζ受体产生CAR-T细胞，将其培养至第10天或第15天，随后分别与NALM6、NALM6-GD2或143B共培养。添加肿瘤细胞后24小时收集上清液。通过ELISA量化细胞因子。模拟物转导的T细胞不表达CAR，并且被包括在内以用于阴性对照。条形图描绘了两个技术重复实验的平均值，并且误差条显示了标准差。
图7以图形方式总结了用于说明在单细胞基础上MED12无效CAR-T细胞产生更多的IL-2和TNFα而进行的实验的结果。在第15天，在存在莫能菌素的情况下，将CD19-28ζCAR-T细胞用NALM6肿瘤细胞刺激6小时。将未刺激的(上图)和刺激的细胞(下图)固定并针对IL-2和TNFα染色，并且通过流式细胞术分析。在每个图上方展示了IL-2+TNFα+细胞占总CD4+细胞的百分比。
图8以图形方式总结了用于证明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在培养中增殖更多而进行的实验的结果。在激活后第3天使靶基因CCNC和MED12和对照基因AAVS1缺失，并且将细胞与IL-2一起培养直到第28天。绘制平均总活细胞计数，并且误差条描绘了三个技术重复实验的标准差。
图9以图形方式总结了用于证明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞的存活依赖于IL-2而进行的实验的结果。在第9天，将细胞洗涤并且在有或没有IL-2的培养基中铺板。将细胞密度维持在每mL培养基50万与100万个细胞之间。将细胞用吖啶橙和碘化丙啶染色，并且用CellacaMX细胞计数器监测活力。在不存在IL-2的情况下，到第28天，在任何条件下均未检测到活细胞。
图10A-图10C以图形方式总结了用于说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在体内显示出增加的肿瘤清除率而进行的实验的结果。在第0天输注100万个表达萤光素酶转基因的NALM6细胞，并且在第3天输注250,000个CAR-T细胞或模拟物转导的T细胞。使用SII Lago(Spectral Instruments Imaging)通过生物发光成像监测肿瘤负荷，并且用Aura成像软件量化每秒光子数(p/s)。30秒曝光如图10A所示，并且使用较短的曝光进行量化以避免饱和(图10B和图10C)。对于单个小鼠的值示于图B中，并且平均值示于图C中。误差条描绘了标准差。
图11以图形方式总结了用于说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞显示出增加的体内扩增而进行的实验的结果。T细胞输注后十天从小鼠收集血液(如图10所示)。将血液与等体积的CountBright绝对计数珠(Invitrogen)混合，针对人CD45染色，并且将红细胞用BD FACS裂解溶液(BD)裂解。通过流式细胞术量化人CD45+细胞。
图12以图形方式总结了用于说明MED12无效CD19-28ζCAR-T增加CAR-T细胞处理的存活益处而进行的实验的结果。向小鼠输注100万个NALM6肿瘤细胞，并且在第3天用1×105、2.5×105或5×105个T细胞处理。MED12无效CAR-T细胞增加了存活期，而CCNC无效CAR-T细胞与AAVS1无效CAR-T细胞等效。
图13以图形方式总结了用于说明MED12无效和CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞降低实体瘤生长并增加CAR-T细胞处理的存活益处而进行的实验的结果。在第0天肌内注射100万个143B骨肉瘤细胞，并且在第4天输注500万个CAR-T细胞或模拟物转导的T细胞。用卡尺测量实体瘤。当肿瘤直径≥17mm时，对小鼠实施安乐死。
图14以图形方式总结了用于说明通过靶向MED12外显子2中的2个切割位点增加基因缺失频率而进行的实验的结果。将S.p.Cas9核酸酶V3(IDT)在Duplex Buffer稀释至5mg/mL。将sgRNA(Synthego)在TE缓冲液中以100μM重悬。将1μL CAS9和1μLsgRNA合并，并且在室温下孵育30分钟。对于两个指导物条件，添加0.5μl的每种sgRNA。将200万个T细胞重悬于18μL P3缓冲液中，与CAS9混合，并且使用P3原代细胞4D-NucleofectorTM S试剂盒和4D-NucleofectorTM系统(Lonza)用方案EO115脉冲。将细胞立即用100μL温热的培养基回收，然后转移到1mL温热的培养基中持续6小时，然后用CAR转导。在第3天进行编辑，并且在第11天评估基因缺失。
图15A-图15B以图形方式总结了用于说明MED12或CCNC的丢失增加CAR-T细胞或非转导T细胞中的细胞因子产生而进行的实验的结果。
图16A-图16B以图形方式总结了用于说明MED12的丢失增加CAR-T细胞和不表达CAR的T细胞的扩增而进行的实验的结果。
图17以图形方式总结了用于说明MED12或CCNC的丢失增加体内扩增而进行的实验的结果。
图18A-图18B以图形方式总结了用于说明CCNC无效HER2-4-1BBζCAR T细胞处理减少肿瘤面积以及增加CAR处理的小鼠的存活期而进行的实验的结果。
图19A-图19D以图形方式总结了用于说明在用CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理后CAR处理的小鼠的存活期增加而进行的实验的结果。
图20A-图20B以图形方式总结了用于说明MED12的丢失增加T细胞中IL2RA的表达而进行的实验的结果。
图21A-图21B以图形方式总结了用于说明MED12的丢失增加效应记忆T细胞表型而进行的实验的结果。SCM：干细胞样记忆T细胞；CM：中枢记忆T细胞；EM：效应记忆T细胞；TE：终末分化T细胞。
图22以图形方式总结了用于说明激活后15天MED12的缺乏增加CD19-28zCAR-T细胞的氧消耗率和细胞外酸化率而进行的实验的结果。
具体实施方式
本公开文本总体上尤其涉及用于预防和/或治疗各种健康状况的方法和组合物。特别地，本文描述了已经被工程化以表达介体复合物的降低水平的一个或多个亚基的免疫细胞，并且特别涉及展现出增强的效应子功能的工程化免疫细胞。还提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞群体的方法、包含所述具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞群体的药物组合物、以及用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康状况的方法和试剂盒。
使用CAR-T细胞疗法(其依赖于将T细胞重定向到癌细胞(如B细胞恶性肿瘤)上合适的细胞表面分子)的最新研发在利用免疫系统的力量治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症方面显示出有希望的结果。在过继T细胞疗法中，经修饰的T细胞典型地通过体外或离体暴露于同源抗原而被激活，扩增，然后将其施用于个体，在所述个体中它们扩增并展现出细胞溶解活性和/或发送信号以启动针对靶癌症的免疫应答。
本文呈现的实验数据表明，通过下调免疫细胞中介体复合物亚基(例如MED12或CCNC)的表达和/或活性导致增强的免疫细胞激活、细胞因子分泌和肿瘤杀伤。特别地，当编码介体复合物的细胞周期蛋白依赖性激酶模块(CKM)的亚基的基因在T细胞中被遗传破坏时，经基因修饰的T细胞更具增殖性，产生更多的炎性细胞因子，并显示出增加的抗癌细胞毒性。如下文更详细描述的，当缺失时展现出这种效应的基因包括CCNC、MED12、MED13、CDK8和CDK19。此外，本文所述的实验结果已经证明，使编码形成CKM与核心介体复合物(MED19和MED26)之间物理接触的介体复合物亚基的基因缺失对T细胞功能产生相同的影响。
本公开文本中所述的发现可能在过继免疫疗法(其中如在CAR免疫细胞疗法(包括T细胞、NK细胞和NKT细胞)、TCR修饰的T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中需要特定的受体接合，并且其中肿瘤反应性细胞与肿瘤细胞竞争营养素)的背景下具有很大的价值。特别地，本文所述的方法可能对于实体瘤的治疗(其中记录了具有有限营养素的敌对的肿瘤微环境(TME))特别有价值。此外，这种方法可以用于在整个制造过程中增加免疫细胞产物的增殖和扩增。
如下文更详细地讨论的，一个或多个编码介体复合物亚基的基因的缺失可以用CRISPR/Cas系统、或用同源重组、或任何其他基因工程化方法来完成。可以将具有这些基因修饰中的任一种的人原代T细胞用嵌合抗原受体(CAR)或自然T细胞受体(TCR)转化，以产生随后可用于治疗人癌症的CAR T细胞。可替代地，这些基因修饰可以在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中进行，从患者肿瘤中收集所述肿瘤浸润淋巴细胞、将其离体扩增并重新输注到癌症患者。这些基因变化也可用于其他淋巴细胞，如自然杀伤细胞或巨噬细胞，它们也可用于过继细胞疗法。换句话说，本文所述的方法表明，表达自然受体的免疫细胞或经工程化以表达抗原特异性受体(如嵌合抗原受体(CAR)、重组TCR或其他受体)的免疫细胞可以通过下调一个或多个介体复合物亚基来进行代谢重编程以改善其细胞毒性功能、增殖和体内持久性。
此外，在不受任何特定理论束缚的情况下，考虑了通过CDK8或CDK19的药理学抑制来抑制介体复合物的催化功能可能导致与编码细胞周期蛋白依赖性激酶8模块(CKM)的亚基的基因的基因缺失类似的效果。此外，考虑了使CDK8或CDK19的催化结构域内的氨基酸突变，从而消除激酶活性，以产生与CKM的丢失引起的效果相似的效果。此外，减少CKM功能的其他方法(如上述基因的RNAi敲低、或核心介体亚基的过表达或另外的基因工程化)也可以产生相同的效果。例如，在介体复合物的中间结构域内对亚基进行蛋白质工程化以消除CKM与核心介体复合物的缔合，预计这引起与CKM的丢失所引起的效果相同的效果。这种蛋白质工程化可以通过使形成CKM与核心介体之间的接触的氨基酸突变来完成。本文呈现的实验数据表明，接触的关键点在MED26和MED19内。术语“抑制”包括部分抑制和完全抑制。例如，可以通过一种或多种药理学方法、化合物或手段，抑制介体复合物的催化功能至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包含其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
如本文所用，术语“约”具有其通常的含义，即大约。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在提供范围的情况下，所述范围包括边界值。在一些实施方案中，术语“约”指示指定值±至多10％、至多±5％或至多±1％。
如本文所用，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指通过如下施用途径递送生物活性组合物或配制品：包括但不限于口服、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内和外用施用或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
“癌症”是指具有致癌细胞的几种典型特征(如不受控制的增殖、永生性、转移潜能、快速的生长和增殖速率，以及某些特征性的形态特征)的细胞的存在。癌细胞可以聚集成团块，例如肿瘤，或者可以单独存在于受试者体内。肿瘤可以是实体瘤、软组织瘤或转移性病变。如本文所用，术语“癌症”还包括其他类型的非肿瘤癌症。非限制性例子包括血癌或血液癌症，例如白血病。癌症可包括恶化前癌症以及恶性癌症。
术语“细胞”、“细胞培养物”和“细胞系”不仅指代特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指代这样的细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观基因修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。例如，当在本文所述的核酸分子或核酸分子中的编码序列和启动子序列的背景下使用时，术语“可操作连接”意指编码序列和启动子序列是框内的并且在远离的适当空间和距离内，以允许通过转录因子或RNA聚合酶的相应结合对转录的影响。应当理解，可操作连接的元件可以是连续的或非连续的(例如，通过接头彼此连接)。在多肽构建体的背景下，“可操作地连接”是指氨基酸序列(例如，不同的区段、部分、区域或结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接连接)以提供构建体的所述活性。本文公开的多肽或核酸分子的可操作连接的区段、部分、区域和结构域可以是连续的或非连续的(例如通过接头彼此连接)。
如本文所用的术语“重组”或“工程化的”核酸分子、多肽或细胞是指已经通过人类干预改变的核酸分子、多肽或细胞。
如本文所用并且除非另外指明，否则药剂的“治疗有效量”或“治疗有效数量”是足以在疾病(例如癌症)的治疗或管理中提供治疗益处，或足以延迟或最小化与疾病相关的一种或多种症状的量或数量。化合物的治疗有效量或数量意指单独或与其他治疗剂组合的治疗剂在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的量或数量。术语“治疗有效量”可涵盖改善疾病的整体治疗、减少或避免疾病的症状或病因、或增强另一治疗剂的治疗功效的量或数量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,2010)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(2016)；Pickar,Dosage Calculations(2012)；以及Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第22版,2012,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人受试者)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或受试者。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的病症的风险的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如啮齿动物(例如小鼠)、非人灵长类动物和其他哺乳动物(例如像，绵羊、狗、牛))、鸡以及非哺乳动物(如两栖动物、爬行动物等)。
在提供值范围的情况下，应理解的是除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他所陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开文本内，属于陈述的范围内的任何明确排除的界限。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开文本中。
某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。本文中使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似所述术语后的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在一些实施方案中，术语“约”指示指定值±至多10％、至多±5％或至多±1％。
应当理解，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)方面和实施方案”，“由方面和实施方案组成(consisting)”，以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”并不排除不会实质性地影响要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，被理解为涵盖基本上由所列举组分或步骤组成以及由所列举组分或步骤组成的那些组合物和方法。
呈现标题(例如，(a)、(b)、(i)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中的标题的使用不要求步骤或要素按字母或数字顺序或它们呈现的顺序进行。
应当了解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个这样的子组合都单独且明确地在本文中公开一样。
介体复合物
介体复合物是多亚基组装物，据报道它是调节大多数RNA聚合酶II(pol II)转录物(包括蛋白质编码RNA基因和大多数蛋白质非编码RNA基因)的表达所必需的。介体和polII在起始前复合物(PIC)中发挥作用，所述起始前复合物由介体复合物、pol II、TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH组成。介体用作PIC内的中心支架，并以人们对其了解甚少的方式帮助调节pol II活性。介体通常也被序列特异性的DNA结合转录因子(TF)靶向，所述DNA结合转录因子可响应于发育或环境提示来发挥作用以控制基因表达程序。在基本水平上，介体复合物通过将来自TF的信号直接传递到pol II酶而发挥功能，从而促进基因表达的TF依赖性调控。
因此，据信介体对于将生物输入(通过TF通信)转化为生理反应(经由基因表达的变化)至关重要。出于这个原因，介体复合物被认为是基因表达的整体调节因子，并且因此被认为是通用转录因子。然而，将介体与其他通用转录因子(TFIID可能除外)区别开来的是其高度的结构灵活性、其可变亚基组成以及其对激活的(例如增强子驱动的)转录的一般要求。与刺激激活的转录的能力一致，介体显现出是PIC内DNA结合TF的主要结合界面。这些特征对于通用功能和背景特定功能两者都很重要，因此此“通用转录因子”可以在不同基因或不同细胞类型中以机械上不同的方式起作用。
介体亚基和模块
在所有研究的真核生物中，介体复合物由以下的至少31个亚基构成：MED1、MED4、MED6、MED7、MED8、MED9、MED10、MED11、MED12、MED13、MED13L、MED14、MED15、MED16、MED17、MED18、MED19、MED20、MED21、MED22、MED23、MED24、MED25、MED26、MED27、MED28、MED29、MED30、MED31、CCNC和CDK8。例如，组成上不同形式的人介体可以分离为稳定实体，其中最常见的是26个亚基“核心”复合物(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的21个亚基)和29个亚基“CDK8-介体”复合物(酿酒酵母(S.cerevisiae)中的25个亚基)。人核心介体复合物的亚基组成包括MED1、MED4、MED6、MED7、MED8、MED9、MED10、MED11、MED14、MED15、MED16、MED17、MED18、MED19、MED20、MED21、MED22、MED23、MED24、MED25、MED26、MED27、MED28、MED29、MED30和MED31。人CDK8-介体复合物的亚基组成包括CDK8、CCNC、MED12和MED13。此外，还存在三种真菌特异性组分，分别称为Med2、Med3和Med5。
从结构上讲，介体可以分为4个主要部分：头部、中部、尾部和暂时缔合的CDK8激酶模块。头部和中部模块直接与RNA聚合酶II相互作用，而延长的尾部模块与基因特异性调节蛋白相互作用。在支持转录激活方面，含有CDK8模块的介体的活性小于缺乏此模块的介体的活性。头部模块含有MED6、MED8、MED11、SRB4/MED17、SRB5/MED18、SRB2/MED20和SRB6/MED22。中部模块含有：MED1、MED4、NUT1/MED5、MED7、CSE2/MED9、NUT2/MED10、ROX3/MED19、SRB7/MED21、MED26和SOH1/MED31。CSE2/MED9与MED4直接相互作用。尾部模块含有：MED2、PGD1/MED3、MED5、GAL11/MED15、SIN4/MED16、MED23、MED24、MED25、MED27、MED28和MED30。骨架由MED14构成。CDK8模块含有：MED12(或MED12L)、MED13(或MED13L)、CCNC和CDK8(或CDK19)。此外，缺少一个或多个不同亚基的介体复合物的单独制剂被不同地称为ARC、CRSP、DRIP、PC2、SMCC和TRAP。关于人和其他真核生物中介体复合物的其他信息可以在例如PossZ.C.等人的综述(The Mediator complex and transcription regulation.Crit RevBiochem Mol Biol.2013年12月；48(6):575-608)以及Allen B.L.和Taatjes D.J.的综述(The Mediator complex:a central integrator of transcription.Nat Rev Mol CellBiol.2015年3月；16(3):155-166)中找到，将这两个参考文献通过引用并入本文。
用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的方法。
如本文更详细描述的，本公开文本的一些实施方案提供了用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的各种方法，所述方法包括将能够调节免疫细胞中一个或多个介体复合物亚基水平的核酸和/或多肽引入免疫细胞中。关于介体复合物亚基的水平，术语“调节”是指表达(例如，转录和/或翻译)水平、介体复合物亚基的至少一种生物活性(例如，与其天然配体结合)的水平的变化。调节包括增加(例如，诱导、刺激)和减少(例如，降低、抑制)两者，或者以其他方式影响介体复合物亚基的水平。例如，据报道，MED1过表达可导致JUN、EGFR和其他增殖相关基因的增加的表达。MED1在50％的乳腺癌中过表达。描述了骨肉瘤中MED20和MED31的过表达，进一步支持了一些亚基的过表达可能增加增殖的观点。在一些实施方案中，所述方法包括将能够诱导免疫细胞中一个或多个介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入免疫细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括将能够诱导MED1、MED20、MED31或其任何组合的核酸和/或多肽引入免疫细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括将能够降低(例如，减轻)免疫细胞中一个或多个介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入免疫细胞中。所公开的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述方法包括将这样的核酸和/或多肽引入免疫细胞中，所述核酸和/或多肽导致免疫细胞中编码一个或多个介体复合物亚基的一个或多个内源性基因的降低的表达水平(例如，减少的表达)。在一些实施方案中，所引入的核酸和/或多肽导致一个或多个介体复合物亚基的表达水平与对照(例如，非工程化免疫细胞或未转导的免疫细胞)相比降低至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所引入的核酸和/或多肽导致与对照(例如，非工程化免疫细胞或未转导的免疫细胞)相比的约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％、或约100％。介体复合物亚基的表达水平降低100％的免疫细胞的例子包括工程化免疫细胞，其中编码介体复合物亚基的内源性基因已被敲除或缺失(例如，无效突变体)。还参见例如，实施例3-实施例12。
合适的介体复合物亚基包括但不限于属于核心介体复合物、CDK8-介体模块、头部模块、中部模块或尾部模块的介体复合物亚基。在一些实施方案中，所述方法包括将这样的核酸和/或多肽引入免疫细胞中，所述核酸和/或多肽能够降低核心介体复合物亚基(如MED1、MED4、MED6、MED7、MED8、MED9、MED10、MED11、MED14、MED15、MED16、MED17、MED18、MED19、MED20、MED21、MED22、MED23、MED24、MED25、MED26、MED27、MED28、MED29、MED30和MED31)的表达水平。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基属于头部模块并且选自MED6、MED8、MED11、SRB4/MED17、SRB5/MED18、SRB2/MED20和SRB6/MED22。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是骨架亚基，例如MED14。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基属于中部模块并且选自MED1、MED4、NUT1/MED5、MED7、CSE2/MED9、NUT2/MED10、ROX3/MED19、SRB7/MED21、MED26和SOH1/MED31。在一些实施方案中，所述中部模块的亚基是MED19。在一些实施方案中，所述中部模块的亚基是MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基属于尾部模块并且选自MED2、PGD1/MED3、MED5、GAL11/MED15、SIN4/MED16、MED23、MED24、MED25、MED27、MED28和MED30。在一些实施方案中，所述尾部模块的亚基是MED15。在一些实施方案中，所述尾部模块的亚基是MED16。在一些实施方案中，所述尾部模块的亚基是MED24。在一些实施方案中，所述尾部模块的亚基是MED27。
在一些实施方案中，所述介体复合物亚基属于CDK8模块(CKM)并且选自MED12(或MED12L)、MED13(或MED13L)、CCNC和CDK8(或CDK19)。在一些实施方案中，所述CKM的亚基是MED12。在一些实施方案中，所述CKM的亚基是MED13。在一些实施方案中，所述CKM的亚基是CCNC。在一些实施方案中，所述CDK8模块的亚基是CDK8。在一些实施方案中，所述CDK8模块的亚基是CDK19。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将能够降低(例如，减小)免疫细胞中一个或多个介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入免疫细胞中，其中所述一个或多个介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是中部模块亚基。在一些实施方案中，所述中部模块亚基是MED19或MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。在一些实施方案中，所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基是CCNC。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基是MED12。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括将能够降低免疫细胞中一个或多个介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入免疫细胞中。在一些实施方案中，所述核酸包括与内源性基因组基因座内编码所述介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够的序列互补性，以允许多核苷酸序列与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列杂交。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与其内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，除了一个、两个、三个、四个或五个错配之外，所述多核苷酸序列与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有100％序列同一性。在一些实施方案中，所述靶序列在内源性基因组基因座的启动子区域内，例如在转录起始位点上游的1kb内。在一些实施方案中，所述靶序列在内源性基因组基因座的编码区内。
例如，在一些实施方案中，将核酸掺入基因组靶向核酸中，所述基因组靶向核酸可以将相关多肽(例如定点核酸内切酶或DNA核酸内切酶)的活性引导至靶核酸内的特定靶序列。在一些实施方案中，基因组靶向核酸是RNA。在一些实施方案中，基因组靶向RNA在本文中是“指导RNA”或“gRNA”。通常，指导RNA至少具有与目的靶核酸序列杂交的间隔子序列和CRISPR重复序列。例如，在II型系统中，gRNA还具有第二RNA，其称为tracrRNA序列。在II型指导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交形成双链体。在V型指导RNA(gRNA)中，crRNA形成双链体。在这两个系统中，所述双链体结合定点核酸内切酶，使得指导RNA和定点核酸内切酶形成复合物。所述基因组靶向核酸凭借其与定点核酸内切酶的缔合为复合物提供靶特异性。因此，所述基因组靶向核酸引导定点核酸内切酶的活性。如下文更详细地描述的，CRISPR核酸内切酶(如Cas9)可用于本公开文本的方法的各种实施方案中。其他合适形式的核酸内切酶包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶(HE)或MegaTAL、或核酸酶的组合。
在一些实施方案中，所述基因组靶向核酸是双分子指导RNA。在一些实施方案中，所述基因组靶向核酸是单分子指导RNA(sgRNA)。双分子指导RNA(dgRNA)具有两条RNA链。所述第一链在5'至3'方向上具有任选的间隔子延伸序列、间隔子序列和最小CRISPR重复序列。第二链具有最小tracrRNA序列(与最小CRISPR重复序列互补)、3’tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。II型系统中的单分子指导RNA(sgRNA)在5'至3'方向上具有任选的间隔子延伸序列、间隔子序列、最小CRISPR重复序列、单分子指导接头、最小tracrRNA序列、3'tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以具有对指导RNA贡献另外的功能性(例如稳定性)的元件。单分子指导接头将最小CRISPR重复序列和最小tracrRNA序列连接起来形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸具有一个或多个发夹。V型系统中的单分子指导RNA(sgRNA)在5'至3'方向上具有最小CRISPR重复序列和间隔子序列。
作为说明，在CRISPR/Cas/Cpf1系统中使用的指导RNA或其他较小的RNA可以通过如下所示和本领域所描述的化学手段容易地合成。尽管化学合成程序正在不断扩展，但是通过诸如高效液相色谱法(HPLC)的程序来纯化此类RNA(避免使用诸如PAGE的凝胶)往往变得更具挑战性，因为多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸。
因此，在一些实施方案中，将所述核酸掺入CRISPR/Cas基因组编辑系统的指导RNA(gRNA)中，所述系统可以诱导在编码介体复合物亚基的内源性基因座中引入一种或多种分子改变(例如突变、缺失、插入、插入/缺失(In/Del)、取代)。
在一些其他实施方案中，将所述核酸掺入TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)基因组编辑系统中，所述系统可以将一个或多个分子改变引入免疫细胞中编码介体复合物亚基的内源性基因座中。在一些其他实施方案中，将所述核酸掺入到免疫细胞中用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑中。在一些其他实施方案中，将所述核酸掺入能够诱导免疫细胞中编码介体复合物亚基的内源性基因座的表达抑制的反义核酸分子中。在一些其他实施方案中，将所述核酸掺入能够引起免疫细胞中编码介体复合物亚基的内源性基因座的表达抑制的双链RNAi分子中。在一些其他实施方案中，将所述核酸掺入能够通知发夹结构并且能够诱导mRNA的抑制或降解的单链RNA分子中。
用于将DNA的两个或更多个序列可操作地连接在一起的基本技术是熟练工作者所熟悉的，并且这些方法已经在用于标准分子生物学操作的许多文本中进行了描述。可以构建和表征这些核酸分子的分子技术和方法在下面和本文的实施例中更全面地描述。
在本公开文本的一些实施方案中，所述核酸与异源核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述异源核酸序列包括转录控制元件或用于可选择标记物的编码序列。在一些实施方案中，具有与介体复合物亚基的内源性基因座具有足够序列互补性的多核苷酸序列与转录控制元件可操作地连接。在一些实施方案中，所述转录控制元件是启动子序列。合适启动子的非限制性例示是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是一种能够驱动与之可操作连接的任何多核苷酸序列的高表达水平的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子、延伸因子-la启动子以及人基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。此外，本公开文本不应局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本公开文本的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种能够开启多核苷酸序列的表达的分子开关，在需要此类表达时所述多核苷酸序列可操作地连接，或者在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施方案中，可以将与内源性基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的核酸掺入表达盒或表达载体中。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，所述构建体含有编码序列和足以引导所述编码序列在细胞中、在体内和/或离体的正确转录和/或翻译的调控信息。通常，可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或插入期望的宿主细胞中和/或插入个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含如本文公开的与介体复合物亚基的内源性基因组具有足够序列互补性的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至表达控制元件(如启动子)以及任选地影响所述编码序列的转录或翻译的任何其他核酸序列或其组合。可以将表达盒插入呈线性或环状的、单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子形式、源自任何来源、能够进行基因组整合或自主复制的质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体(包括其中一个或多个核酸序列已经以功能上操作性的方式连接即可操作地连接的核酸分子)中。
本文还提供了含有一种或多种核酸分子的载体、质粒或病毒，所述核酸分子包括具有与如本文所述的介体复合物亚基的内源性基因座具有足够序列互补性的多核苷酸序列。核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已经用载体转化/转导的细胞中表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的，并且是可商购的或容易由熟练技术人员制备的。参见例如，Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in MolecularBiology.New York,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).ProteinMethods.New York,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for GeneTherapy.San Diego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:GeneTherapy and Neuroscience Applications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook ofTechniques.San Diego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:BirkhauserPublisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).NewYork,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括至2014年的增刊)；和Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in MammalianCells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将其披露内容通过引用并入本文)。
可以经由常规转化或转染技术将DNA载体引入真核细胞中。用于转化或转染细胞的合适方法可以在Sambrook等人(2012,同上)和其他标准分子生物学实验室手册中找到，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载、弹道引入、核穿孔、流体动力冲击和感染。
可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编辑),Eukaryotic Viral Vectors,CSH Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)。例如，如本文公开的嵌合受体可以在真核细胞如哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)在内的许多来源获得。在选择表达系统时，应谨慎确保组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。另外，如果在选择表达系统时需要指导，则技术人员可以查询P.Jones,“Vectors:Cloning Applications”,John Wiley and Sons,NewYork,N.Y.,2009)。因此，可以将包含与介体复合物亚基的内源性基因座具有足够序列互补性的多核苷酸序列的核酸序列掺入病毒载体中。在一些实施方案中，所述载体是源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒的病毒载体。在一些实施方案中，将核酸掺入核酸构建体中用于指导RNA-引导的CRISPR介导的敲入程序、CRISPR/Cas9基因组编辑或用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA-指导的核酸内切酶基因组编辑或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如，抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA或合成DNA(如通过基于亚磷酰胺的合成产生者))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，所述核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。
核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)或巨噬细胞。在一些特定实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是选自以下的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞、大量CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是选自以下的CD4+T辅助性淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是离体的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是在体外的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是在体内的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，可以通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得免疫细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的方法进一步包括将一种或多种重组免疫受体(如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))和/或编码所述一种或多种重组免疫受体的核酸掺入所述免疫细胞中。例如，免疫细胞可以包括和/或表达抗原特异性受体，例如，可以免疫识别和/或特异性结合抗原或其表位的受体，使得抗原特异性受体与抗原或其表位的结合引发免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原特异性受体对癌症抗原(如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA))具有抗原特异性。
在一些实施方案中，抗原特异性受体是T细胞受体(TCR)。TCR通常包括两个多肽(例如多肽链)，如TCR的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链或其组合。TCR的这种多肽链是本领域已知的。所述抗原特异性TCR可以包括任何氨基酸序列，条件是所述TCR可以特异性结合和/或免疫识别抗原，如癌症抗原或其表位。在一些实施方案中，TCR是内源性TCR，例如对T细胞来说是内源的或天然(天然存在)的TCR。在这种情况下，表达内源性TCR的T细胞可以是从已知表达特定癌症抗原的哺乳动物分离的T细胞。例如，在一些实施方案中，所述T细胞是从患有癌症的哺乳动物分离的原代T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是从人癌症患者分离的TIL或T细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞包括和/或表达嵌合抗原受体(CAR)。通常，CAR包含与跨膜结构域和细胞内结构域融合的抗原结合结构域，例如抗体的单链可变片段(scFv)。在这种情况下，CAR的抗原特异性可以由特异性结合抗原或其表位的scFv编码。CAR及其制造方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，免疫细胞包括编码外源(例如重组)抗原特异性受体的一种或多种核酸。在一些实施方案中，这种外源性抗原特异性受体例如外源性TCR和CAR可以赋予T细胞对除内源性TCR天然特异性的抗原以外的其他抗原的特异性。
在一些实施方案中，所述一种或多种介体复合物亚基的表达水平降低导致CAR T细胞的改善的功能，如通过例如相对于参考对照细胞(例如具有天然表达水平的介体复合物亚基的细胞)中干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白介素-2(IL-2)的产生，这些分子的增加的产生所指示的。在一些实施方案中，所述一种或多种介体复合物亚基的表达降低导致更高的CAR T细胞增殖潜力。在一些实施方案中，所述一种或多种介体复合物亚基的表达降低导致所述CAR T细胞的增强的效应子功能，例如像增加的生长速率(增殖)、细胞因子产生、靶细胞抑制(例如，抗癌细胞毒性)、巨噬细胞激活、T细胞激活、NK细胞激活和体内持久性(例如，存活)。在一些实施方案中，所述一种或多种介体复合物亚基的表达降低导致增加的效应记忆T细胞表型。在一些实施方案中，所述一种或多种介体复合物亚基的表达降低导致增加的氧消耗率和细胞外酸化率。
在一个方面，本文提供了已经被工程化以具有降低(例如减少)水平的一个或多个介体复合物亚基的免疫细胞。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是中部模块亚基。在一些实施方案中，所述中部模块亚基是MED19或MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。在一些实施方案中，所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CCNC。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是MED12。本公开文本的一些实施方案提供了已经通过本文所述的方法产生的工程化免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是在体外的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是离体的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是在体内的。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是耗竭性免疫细胞或非耗竭性免疫细胞。因此，包含至少一种如本文公开的工程化免疫细胞和培养基的细胞培养物也在本申请的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
本公开文本的组合物
可以将本公开文本的工程化免疫细胞和核酸掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常可以包含一种或多种本公开文本的工程化免疫细胞和核酸。因此，在一个方面，本公开文本的一些实施方案涉及组合物，所述组合物包含a)本公开文本的工程化免疫细胞；和/或b)含有与基因组基因座内编码一个或多个介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸。在一些实施方案中，所述一个或多个介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
药物组合物
可以将本公开文本的工程化免疫细胞和核酸掺入药物组合物中。此类组合物通常可以包含一种或多种本公开文本的工程化免疫细胞和核酸，以及药学上可接受的赋形剂，例如载体。因此，在一个方面，本公开文本的一些实施方案涉及药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和a)本公开文本的工程化免疫细胞；和/或b)含有与基因组基因座内编码一个或多个介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的核酸。在一些实施方案中，所述一个或多个介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是中部模块亚基。在一些实施方案中，所述中部模块亚基是MED19或MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。在一些实施方案中，所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CCNC。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是MED12。
本文所述的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述组合物包含编码一个或多个介体复合物亚基的核酸分子和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，将所述核酸分子掺入表达盒或表达载体中。在一些实施方案中，所述表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以将所述核酸分子引入宿主免疫细胞，例如T淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞，以产生含有核酸的重组(例如工程化)免疫细胞。在一些实施方案中，可以将所述核酸分子施用于有需要的受试者中。
将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
因此，在一些实施方案中，所述核酸分子可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物递送。例如，核酸分子可以稳定地整合在宿主基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于宿主细胞中用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，所述核酸分子在宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，将所述核酸分子稳定地整合到宿主细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典的随机基因组重组技术或使用更精确的技术来实现，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas9基因组编辑、或用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑、或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，所述核酸分子作为微环表达载体存在于宿主细胞中以用于瞬时表达。在一些实施方案中，将所述核酸分子掺入反义核酸分子中，所述反义核酸分子靶向并抑制编码介体复合物亚基的内源性基因组基因座的表达。在一些实施方案中，将所述核酸分子掺入双链干扰RNA(RNAi)分子中，所述RNAi分子靶向并抑制编码介体复合物亚基的内源性基因组基因座的表达。在一些实施方案中，将所述核酸分子掺入具有能够靶向和降解编码介体复合物亚基的mRNA的发夹结构的RNA分子中。
所述核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质体或脂质纳米颗粒中(LNP)中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法(如电穿孔)来递送。例如，可以通过病毒转导实现将核酸引入细胞中。在非限制性例子中，将腺相关病毒(AAV)工程化以经由病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了几种AAV血清型，并且所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织而没有明显毒性，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
源自慢病毒的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了几种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织嗜性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)在载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种本公开文本的工程化免疫细胞和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述至少一种工程化免疫细胞在被引入受试者中时展现出增强的效应子功能。在工程化免疫细胞中增强的效应子功能的例子包括但不限于生长速率(增殖)、细胞因子产生、靶细胞抑制(例如，抗癌细胞毒性)、巨噬细胞激活、T细胞激活、NK细胞激活和体内持久性(例如，存活)。在一些实施方案中，所述至少一种工程化免疫细胞具有增加的干扰素γ(INFγ)、白介素-2(IL-2)和/或肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生。
在某些实施方案中，根据本文公开的一些实施方案的药物组合物包括工程化免疫细胞的培养物，所述工程化免疫细胞的培养物可以在向有需要的个体施用之前被洗涤、处理、合并、补充或以其他方式改变。此外，施用可以以不同的剂量、时间间隔或以多次施用。
本文提供的药物组合物可以呈允许将组合物施用至受试者的任何形式。在一些特定实施方案中，所述药物组合物适用于人施用。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其他公认药典中列示用于动物，更特别是用于人。载体可以是与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，包括可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。在一些实施方案中，所述药物组合物经无菌配制以用于施用至个体中。在一些实施方案中，所述个体是人。本领域普通技术人员将理解，所述配制品应适合施用方式。
在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物被配制成适合于向个体施用的预期途径。例如，所述药物组合物可以被配制成适合于肠胃外、腹膜内、结直肠、腹膜内和肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物可以被配制用于静脉内、口服、腹膜内、气管内、皮下、肌内、局部或肿瘤内施用。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西帕尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，组合物中通常将包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和/或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。
在一些实施方案中，本公开文本的工程化免疫细胞可以被配制用于使用本领域技术人员已知的技术向受试者施用。例如，包含工程化免疫细胞群体的配制品可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。包含在配制品中的赋形剂将具有不同的目的，这取决于例如所使用的工程化免疫细胞和施用方式。通常使用的赋形剂的例子包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张力剂、填充剂和润滑剂。可以在不存在非人组分的情况下，例如在不存在动物血清的情况下制备和培养包含工程化免疫细胞的配制品。配制品可以包括一个工程化免疫细胞群体，或者多于一个，如两个、三个、四个、五个、六个或更多个工程化免疫细胞群体。
可以使用本领域技术人员已知的模式和技术，将包含一个或多个工程化免疫细胞群体的配制品施用于受试者。示例性模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于肿瘤内、皮内、皮下(S.C.、s.q.、sub-Q、Hypo)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区)、颅内、脊柱内和鞘内(脊髓液)。可以使用可用于配制品的肠胃外注射或输注的装置来实现这种施用。
治疗方法
本文所述的治疗组合物(例如工程化免疫细胞、核酸和药物组合物)中的任一种的施用可用于治疗患者以治疗相关健康状况如增殖性疾病(例如癌症)、自身免疫性疾病和微生物感染(例如病毒感染)。在一些实施方案中，可以将如本文所述的一种或多种工程化免疫细胞、核酸和药物组合物掺入治疗剂中以用于治疗患有、怀疑患有或可能有高风险患上一种或多种健康状况(如增殖性疾病(例如癌症)、自身免疫性疾病和慢性感染)的受试者的方法中。在一些实施方案中，所述个体是在医生护理下的患者。
因此，在一个方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于预防和/或治疗有需要的受试者的健康情况的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用本公开文本的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用包含本公开文本的工程化免疫细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用包含核酸的组合物，所述核酸包含与基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列。在一些实施方案中，所述核酸包含与基因组基因座内的靶序列具有足够序列互补性的序列，所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是中部模块亚基。在一些实施方案中，所述中部模块亚基是MED19或MED26。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。在一些实施方案中，所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。在一些实施方案中，所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是CCNC。在一些实施方案中，所述介体复合物亚基是MED12。在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开文本的组合物(例如工程化免疫细胞、核酸分子和药物组合物)。本公开文本的主题工程化免疫细胞或药物组合物的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”通常是指相对于不存在工程化免疫细胞群体或药物组合物，足以完成所述目的(例如，实现施用的效果、治疗疾病、减少信号传导途径或减轻疾病或健康状况的一种或多种症状)的工程化免疫细胞群体或药物组合物的量或数量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。T细胞群体或组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本文所述的治疗方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述健康状况是增殖性疾病或感染。示例性增殖性疾病可以包括但不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是儿科癌症。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、尿道上皮癌、肝癌、头颈癌、肉瘤、宫颈癌、胃癌、胃癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆管癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是白血病。
在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。考虑此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症两者。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制所述受试者的癌症的转移。在一些实施方案中，所施用的组合物抑制所述受试者的肿瘤生长。
示例性增殖性疾病可以包括但不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。术语“癌症”通常是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。所述异常细胞可形成实体瘤或构成血液恶性肿瘤。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分。对于可通过本公开文本的组合物和方法治疗的癌症没有具体限制。合适的癌症的非限制性例子包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌等。
可适合使用本公开文本的组合物和方法治疗的其他癌症包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑癌、中枢神经系统(CNS)癌、外周神经系统(PNS)癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因氏家族肿瘤(例如尤因氏肉瘤)、眼癌、移行细胞癌、阴道癌、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、胆囊癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(例如，子宫肉瘤)、移行细胞癌、阴道癌、外阴癌、间皮瘤、鳞状细胞或表皮样癌、支气管腺瘤、恶性蜕膜瘤、头颈癌、畸胎癌或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在一些实施方案中，所述癌症是肉瘤。
特别合适的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、间皮瘤、白血病、淋巴瘤、脑癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、膀胱癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、成视网膜细胞瘤、肾肿瘤、成神经细胞瘤和癌。
在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。考虑此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症两者。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制所述受试者的癌症的转移。例如，在一些实施方案中，施用于受试者的组合物可减少所述受试者中的转移性结节。在一些实施方案中，所施用的组合物抑制所述受试者的肿瘤生长。
在一些实施方案中，所述增殖性疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、溶血性贫血、风湿热、甲状腺炎、克罗恩病、重症肌无力、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎、多发性硬化、斑秃、银屑病、白癜风、营养不良性大疱性表皮松解症、系统性红斑狼疮、中度至重度斑块型银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和移植物抗宿主病。
在一些实施方案中，所施用的组合物抑制受试者中靶癌细胞的增殖，和/或抑制癌症的肿瘤生长。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果靶细胞的病理性或致病行为减少，如果靶细胞被破坏或杀死等，则所述靶细胞可能被抑制。抑制包括将所测量的病理性或致病行为减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用有效数量的本文公开的工程化免疫细胞，其中与未施用所述工程化免疫细胞的受试者中的靶细胞的增殖和/或所述靶癌症的肿瘤生长相比，所述工程化免疫细胞抑制所述受试者中的靶细胞的增殖和/或抑制所述靶癌症的肿瘤生长。
本文所述的组合物(例如工程化免疫细胞、核酸和药物组合物)的施用可用于刺激免疫应答。在一些实施方案中，在用化学疗法诱导癌症缓解后，或在自体或同种异体造血干细胞移植后，将如本文所述的一种或多种工程化免疫细胞、核酸和/或药物组合物施用于个体。在一些实施方案中，相对于未施用本文公开的治疗组合物之一的受试者中这些分子的产生，将本文所述的组合物施用于有需要的受试者增加了所治疗的受试者中的干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白介素-2(IL-2)的产生。
在一些实施方案中，所施用的组合物赋予免疫细胞增强的效应子功能。可以在工程化免疫细胞中增强的免疫细胞的效应子功能的例子包括但不限于生长速率(增殖)、死亡率、死亡率类型、靶细胞抑制(细胞毒性)、靶细胞杀伤、靶细胞存活、分化簇改变、巨噬细胞激活、B细胞激活、细胞因子产生、体内持久性。在一些实施方案中，所施用的组合物赋予增加的效应记忆T细胞表型。在一些实施方案中，所施用的组合物赋予增加的氧消耗率和细胞外酸化率。在一些实施方案中，包含本公开文本的组合物的免疫细胞的效应子功能是以以下水平增加的：与参考免疫细胞相比高至少10％，如至少10％、高约10％、至少高约20％、至少高约30％、至少高约40％、至少高约50％、至少高约60％、至少高约70％、至少高约80％、至少高约90％、至少高约2倍、高约三倍、高约四倍、高约五倍、高约六倍、高约七倍、高约八倍、高约九倍、高约20倍、高约50倍、高约100倍、或高约200倍。在一些实施方案中，所述参考免疫细胞不包括本公开文本的组合物。在一些实施方案中，所施用的组合物赋予免疫细胞中增强的糖酵解通量。在一些实施方案中，与参考免疫细胞(例如，非工程化免疫细胞或未转导的免疫细胞)相比，所施用的组合物赋予增加至少10％，如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、约三倍、约四倍、约五倍、约六倍、约七倍、约八倍、约九倍、约20倍、约50倍、约100倍或约200倍的糖酵解通量。
本文所述的组合物(例如工程化免疫细胞、核酸和/或药物组合物)的有效量可以基于预期目标(例如癌症消退)来确定。例如，在治疗现有癌症的情况下，待施用的本文公开的组合物的量可以大于施用所述组合物用于预防癌症的情况下的量。鉴于本公开文本，本领域普通技术人员将能够确定待施用的组合物的量和施用频率。根据治疗的数量和剂量两者，待施用的量还取决于待治疗的个体、个体的状态和所需的保护。组合物的精确量也取决于从业者的判断，并且对于每个受试者是独特的。根据从业者的判断，施用频率范围可能为从1-2天至2-6小时、至6-10小时、至1-2周或更长时间。
待施用的组合物的量的确定将由本领域技术人员进行，并且将部分取决于癌症的程度和严重程度，以及是否正在施用工程化免疫细胞以用于治疗现有癌症或预防癌症。例如，在目标是预防的情况下，可以采用较长的施用间隔和较低量的组合物。例如，每剂量施用的组合物的量可以是在治疗活动性疾病中施用的剂量的50％，并且可以以每周间隔施用。根据本公开文本，本领域普通技术人员将能够确定组合物的有效量和施用频率。此决定将部分取决于存在的特定临床情况(例如癌症的类型、癌症的严重程度)。
在一些实施方案中，可能希望向待治疗的受试者(例如患者)提供本文公开的组合物的连续供应。在一些实施方案中，目的区域(如肿瘤)的连续灌注可能是合适的。灌注的时间段将由临床医生针对特定的受试者和情况选择，但是时间范围可以为从约1-2小时至2-6小时、至约6-10小时、至约10-24小时、至约1-2天、至约1-2周或更长时间。通常，经由连续灌注的组合物的剂量将等效于通过单次注射或多次注射给予的剂量，并在施用剂量的时间段内进行调整。
在一些实施方案中，通过静脉内输注施用。本文公开的工程化免疫细胞、核酸和/或药物组合物的有效量可以基于预期目标(例如癌症消退)来确定。例如，在治疗现有癌症的情况下，待施用的细胞的数量可以大于施用本文公开的工程化免疫细胞用于预防癌症的情况下的量。鉴于本公开文本，本领域普通技术人员将能够确定待施用的细胞的数量和施用频率。根据治疗的数量和剂量两者，待施用的量还取决于待治疗的个体、个体的状态和所需的保护。治疗组合物的精确量也取决于从业者的判断，并且对于每个个体是独特的。根据从业者的判断，施用频率范围可能为从1-2天至2-6小时、至6-10小时、至1-2周或更长时间。通常，经由连续灌注的治疗组合物的剂量将等效于通过单次注射或多次注射给予的剂量，并在施用剂量的时间段内进行调整。
向受试者施用工程化免疫细胞
在一些实施方案中，本公开文本的方法涉及向有需要的受试者施用有效量或数量的在此提供的工程化免疫细胞。此施用步骤可以使用本领域中的任何植入递送方法来完成。例如，可以将工程化免疫细胞直接输注于受试者的血流中或者以其他方式施用于受试者。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括将工程化免疫细胞通过导致将引入的细胞至少部分定位在期望部位从而产生一种或多种期望的作用的方法或途径施用(所述术语与术语“引入”、“植入”和“移植”可互换使用)于个体。可以通过任何适当的途径施用工程化免疫细胞或其分化的后代，所述适当的途径导致递送至个体的期望位置，所施用的细胞或细胞组分的至少一部分在此位置保持存活。在施用于受试者后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至个体的寿命，例如长期移植。
当预防性提供时，可以将本文所述的工程化免疫细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用于受试者。因此，在一些实施方案中，工程化免疫细胞群体的预防性施用预防疾病或健康状况的症状的发生。
当在一些实施方案中以治疗方式提供时，在疾病或健康状况的症状或适应证发作时(或之后)，例如在疾病或健康状况发作时，提供工程化免疫细胞。
为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的工程化免疫细胞的有效量可以是至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞、或其倍数。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞对于需要治疗的受试者是非自体的。在一些实施方案中，过继细胞疗法是同种异体过继细胞疗法。例如，在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞对于需要治疗的受试者是同种异体的。在同种异体过继细胞疗法中，工程化免疫细胞并非源自接受过继细胞疗法的个体。同种异体细胞疗法通常是指这样一种疗法，其中提供免疫细胞的个体(供体)与接受细胞疗法的个体是不同的个体(同一物种的)。例如，向个体施用的工程化免疫细胞群体源自一个或多个不相关的供体，或者来自一个或多个不同的氏族成员。因此，工程化免疫细胞可以源自一个或多个供体，或者可以从自体来源获得。在一些实施方案中，将工程化免疫细胞在施用于有需要的受试者之前在培养中扩增。
在一些实施方案中，通过方法或途径将细胞组合物(例如，包括根据本文所述的任何细胞的多个工程化免疫细胞的组合物)递送至受试者中导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。可以通过任何导致受试者中的有效治疗的适当途径施用包括工程化免疫细胞的组合物，例如，施用导致递送至受试者中的期望位置，在所述期望位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×104个细胞被递送至期望部位保持一段时间。施用方式包括注射、输液、滴注。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，通过注射或输注进行递送是通常考虑的标准的施用方式。
在一些实施方案中，将所述工程化免疫细胞例如经由输注或注射全身施用。例如，不是直接将如本文所述的工程化免疫细胞群体施用于靶部位、组织或器官，而是使其进入受试者的循环系统，从而进行代谢和其他类似的生物过程。
包含本文提供的任何组合物的用于预防或治疗疾病或健康状况的治疗的功效可以由熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员将理解，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或缓解，则认为预防或治疗是有效的。还可以通过如由减少住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的受试者恶化的失败来测量疗效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对受试者或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。
功效程度的衡量指标是基于针对所治疗的疾病和所经历的症状而选择的参数。通常，选择已知或被接受为与疾病的程度或严重程度相关的参数，如医学界接受或使用的参数。例如，在实体癌症的治疗中，合适的参数可以包括转移的数量和/或大小的减少、无进展存活期的月数、总存活期、疾病的分期或分级、疾病进展的速率、诊断性生物标记物的减少(例如但不限于循环肿瘤DNA或RNA的减少、循环无细胞肿瘤DNA或RNA的减少等)及其组合。应理解，有效剂量和功效程度通常将相对于单个受试者和/或受试者的组或群体来确定。本公开文本的治疗方法使症状和/或疾病严重程度和/或疾病生物标记物减少至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如上文所讨论的，药物组合物的治疗有效量可以是药物组合物当被施用于受试者(如已经患有、怀疑患有或有风险患上疾病或健康状况的受试者)时足以促进特定有益效果的量。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病或健康状况的症状的发展、改变疾病或健康状况的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病或健康状况的症状的量。应当理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。
另外的疗法
如上文所讨论的，如本文公开的任何一种组合物(例如工程化免疫细胞和药物组合物)可以作为单药疗法(例如，单一疗法)施用于有需要的受试者。另外地或可替代地，在本公开文本的一些实施方案中，本文所述的一种或多种工程化免疫细胞和药物组合物可以与一种或多种另外的疗法(例如至少一种、两种、三种、四种或五种另外的疗法)组合施用于受试者。有待与本公开文本的组合物组合施用的合适疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。其他合适的疗法包括治疗剂如化疗剂、抗癌剂和抗癌疗法。
与一种或多种另外的疗法“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，一种或多种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。本文所用的术语化学疗法包括抗癌剂。各类抗癌剂可适用于本文公开的方法。抗癌剂的非限制性例子包括：烷基化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如，单克隆或多克隆)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(或/>))、激素治疗、可溶性受体和其他抗肿瘤药。
拓扑异构酶抑制剂也是可用于本文的另一类抗癌剂。拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构的必需酶。I型或II型拓扑异构酶的抑制通过扰乱适当的DNA超螺旋而干扰DNA的转录和复制。一些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱如伊立替康和拓扑替康。II型抑制剂的例子包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。这些是表鬼臼毒素的半合成衍生物，表鬼臼毒素是在美洲鬼臼(盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum))根中天然存在的生物碱。
抗肿瘤药包括免疫抑制剂放线菌素D、多柔比星、表柔比星、博来霉素、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺。所述抗肿瘤化合物通常通过化学修饰细胞的DNA起作用。
烷基化剂可以在细胞中存在的条件下使许多亲核官能团烷基化。顺铂和卡铂以及奥沙利铂是烷基化剂。它们通过与生物重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键而损害细胞功能。
长春花生物碱与微管蛋白上的特定位点结合，从而抑制微管蛋白组装成微管(细胞周期的M期)。长春花生物碱包括：长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛。
抗代谢物类似于嘌呤(硫唑嘌呤、巯基嘌呤)或嘧啶，并防止这些物质在细胞周期的“S”期期间被整合到DNA中，从而停止正常发育和分裂。抗代谢物也影响RNA合成。
植物生物碱和萜类化合物获自植物并通过阻止微管功能而阻断细胞分裂。由于微管对于细胞分裂是至关重要的，没有它们，细胞分裂不能发生。主要的例子是长春花生物碱和紫杉烷。
鬼臼毒素是植物来源的化合物，据报道其有助于消化以及用于产生两种其他细胞抑制药物依托泊苷和替尼泊苷。它们阻止细胞进入G1期(DNA复制的开始)和DNA复制(S期)。
紫杉烷类包括紫杉醇和多西他赛。紫杉醇是一种天然产物，最初称为泰素(Taxol)，首先来源于太平洋紫杉树的树皮。多西他赛是紫杉醇的半合成类似物。紫杉烷增强微管的稳定性，防止染色体在后期分离。
在一些实施方案中，所述抗癌剂可以选自类克(remicade)、多西紫杉醇、塞来昔布、美法仑、地塞米松()、类固醇、吉西他滨、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、环磷酰胺、特莫达(temodar)、卡铂、丙卡巴肼、格立得(gliadel)、他莫昔芬、拓扑替康、甲氨蝶呤、吉非替尼(/>)、泰素、泰素帝、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、希罗达(xeloda)、CPT-11、干扰素α、聚乙二醇化干扰素α(例如，PEG INTRON-A)、卡培他滨、顺铂、噻替帕、氟达拉滨、卡铂、脂质体道诺霉素、阿糖胞苷、doxetaxol、紫杉醇、长春碱、IL-2、GM-CSF、达卡巴嗪、长春瑞滨、唑来膦酸、棕榈酸酯、克拉霉素(biaxin)、白消安、泼尼松、硼替佐米()、二膦酸盐、三氧化二砷、长春新碱、多柔比星(/>)、紫杉醇、更昔洛韦、阿霉素、雌莫司汀磷酸钠(/>)、舒林酸、依托泊苷及其任何组合。
在其他实施方案中，抗癌剂可以选自硼替佐米、环磷酰胺、地塞米松、多柔比星、干扰素-α、来那度胺、美法仑、聚乙二醇化干扰素-α、泼尼松、沙利度胺或长春新碱。
在一些实施方案中，本文所述的预防和/或治疗方法进一步包括免疫疗法。在一些实施方案中，所述免疫疗法包括施用一种或多种检查点抑制剂。因此，本文所述的治疗方法的一些实施方案包括进一步施用抑制一种或多种免疫检查点分子的化合物。免疫检查点分子的非限制性例子包括CTLA4、PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、TIM3及其中任一种的组合。在一些实施方案中，抑制一种或多种免疫检查点分子的化合物包括拮抗性抗体。适用于本文公开的组合物和方法的拮抗性抗体的例子包括但不限于伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、替西木单抗和阿维单抗。
在一些方面，一种或多种抗癌疗法是辐射疗法。在一些实施方案中，所述辐射疗法可包括施用辐射以杀死癌细胞。辐射与细胞中的分子如DNA相互作用以诱导细胞死亡。辐射也可损伤细胞膜和核膜以及其他细胞器。根据辐射类型，DNA损伤的机制可能随着相对生物有效性而变化。例如，重粒子(即质子、中子)直接损伤DNA并具有更大的相对生物有效性。电磁辐射导致间接电离，其通过主要由细胞水的电离产生的短寿命羟基自由基起作用。辐射的临床应用由外射束辐射(来自外源)和近距离放射治疗(使用植入或插入患者体内的辐射源)组成。外射束辐射由X射线和/或γ射线组成，而近距离放射治疗使用衰变并发射α粒子或β粒子以及γ射线的放射性核。本文还考虑的辐射包括例如将放射性同位素定向递送到癌细胞。本文还考虑了其他形式的DNA损伤因子，如微波和UV辐照。
辐射可以单剂量或按剂量分割方案以一系列小剂量给予。本文考虑的辐射量的范围为约1至约100Gy，包括例如约5至约80Gy、约10至约50Gy或约10Gy。总剂量可以以分割方案施用。例如，所述方案可包括2Gy的分割单个剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于所述同位素的半衰期和发射的辐射的强度和类型。当辐射包括使用放射性同位素时，所述同位素可以缀合至靶向剂，例如治疗性抗体，其将放射性核苷酸携带到靶组织(例如，肿瘤组织)。
本文所述的手术包括切除，其中癌组织的全部或部分被物理去除、切除和/或破坏。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(Mohs手术)。本文还考虑去除癌前组织或正常组织。
因此，在一些实施方案中，本公开文本的方法包括将本文公开的组合物作为单药疗法(例如，单一疗法)单独施用至受试者。在一些实施方案中，将本公开文本的组合物作为与第二疗法组合的第一疗法施用至受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法伴随施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。
试剂盒
本文还提供了用于实践本文所述方法的试剂盒。试剂盒可以包含如本文所述和提供的工程化免疫细胞和药物组合物中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，本文提供了包含本公开文本的一种或多种工程化免疫细胞的试剂盒。在一些实施方案中，本文提供了包含本公开文本的一种或多种药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含用于制备本公开文本的工程化免疫细胞、核酸和药物组合物以及使用它们的书面说明书。
在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管(包括预填充注射器)，用于向有需要的受试者施用所提供的免疫细胞、核酸和药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，它们可以与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于所需目的，例如用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的受试者的健康状况。
例如，任何上述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照T细胞群体、阳性对照T细胞群体、用于离体产生T细胞群体的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒的组分可以在单独容器中。在一些其他实施方案中，试剂盒的组分可以在单个容器中合并。
在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材上，如纸或塑料等。所述说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(例如，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的手段。这个实施方案的例子是包含网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
除非明确地或清楚地从实施方案或方面的上下文中排除，否则本文所述的方面和实施方案中的每一个均能够一起使用。
将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论内容陈述了其作者所主张的观点，并且本申请人保留对所引用文件的准确性和针对性提出质疑的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
实施例
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这样的技术充分解释于以下文献中，如Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.NewYork,NY:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.NewYork,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.SanDiego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy andNeuroscience Applications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).TheImmunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.SanDiego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols inNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括至2014年的增刊)；和Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.Amsterdam,NL:ElsevierSciences B.V.，将所述文献的披露内容通过引用并入本文。
在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例1
通用实验程序
T细胞分离
全血血沉棕黄层是从斯坦福血液中心从小于41岁的志愿者获得的。使用RosetteSepTM人T细胞富集混合物(StemCell Technologies)分离出T细胞。将T细胞储存于液氮中的细胞低温保存培养基CS10(Sigma Aldrich)中。
CRISPR筛选
T细胞激活和培养
在第0天解冻2亿个T细胞，并将其用CD3/CD28 Dynabeads(Invitrogen)以每个T细胞三个珠的比率激活。将细胞在补充有5％FBS、HEPES、青霉素、链霉素和10mg/LIL-2的AIM-V培养基(Gibco)中培养。在T175烧瓶中，将细胞维持在50万与100万/mL之间的密度。
慢病毒转导
从Addgene获得Bassik人CRISPR敲除文库的所有9个库，并且将其用Endura电转感受态细胞(Lucigen)扩增。将LentiX细胞(Takara)铺板在包被有聚-D-赖氨酸(Corning)的150mm板上，并且用每板18μg REV、18μg GAG/POL、7μg VSVg、15μg文库载体、3.38mL Opti-MEM(Gibco)和135μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染。针对每个供体准备10个板。在转染后24小时更换培养基，并且在转染后48小时收获上清液。将慢病毒上清液用lentiX(Takara)浓缩，并且在激活后2天添加到T细胞培养基中。在第3天，通过流式检测评估细胞的mCherry阳性以确认转导在8％与12％之间。
CAS9电穿孔
在第3天，将100μl反应用10万个T细胞、30μgS.p.Cas9核酸酶V3(IDT)、90μl P3缓冲液(Lonza)和7μL Duplex缓冲液(IDT)组装。将细胞使用P3原代细胞4D-NucleofectorTM L试剂盒和4D NucleofectorTM系统(Lonza)用方案EO115脉冲。将细胞立即用1mL温热的培养基回收，然后转移到200mL温热的培养基中持续6小时，然后用CAR转导。
逆转录病毒转导
将293GP细胞铺板在包被有聚-D-赖氨酸(Corning)的150mm板上，并且用每板11μgRD114、22μg HA-28z CAR编码质粒、3.38mL Opti-MEM(Gibco)和135μLLipofectamine 2000(Invitrogen)转染。在本实验中使用的HA-28z CAR编码14g2a-E101KscFv，其显示出对GD2(一种在肿瘤细胞上自然表达的双唾液酸神经节苷脂)具有更高的亲和力(HA)(Lynn等人,Nature,2019)。在转染后24小时更换培养基，并且在转染后48小时和72小时收获上清液。针对每个供体准备10个板。在第2天和第3天，将非组织培养物处理的12孔板(Falcon)用RetroNectin(Takara)包被，并在4℃下孵育过夜。在第3和第4天，将12孔板用2％BSA封闭5分钟，并在32℃、3200rpm下与每孔1mL逆转录病毒上清液一起孵育2小时。去除780μl上清液，并且将100万个T细胞添加到每孔1mL培养基中。在第5天，使用磁分离去除Dynabeads。从第7天到第10天将细胞与2.5μg/mL的嘌呤霉素一起培养以消除不表达指导物的细胞。
增殖筛选
在T175瓶中培养CAR-T细胞文库，其中每隔一天传代一次。在第15天，将1亿个NALM6-GD2细胞添加到1亿个T细胞中，并共培养到第23天。在每次传代时弃去50％的培养体积。
细胞因子产生筛选
在第15天，将1亿个CAR-T细胞与1亿个NALM6-GD2-GFP肿瘤细胞用200mL的eBioscience莫能菌素溶液(Invitrogen)共培养6小时。使用BD Cytofix/CytopermTM固定/透化溶液试剂盒进行细胞内细胞因子染色。将细胞用从Biolegend购买的对CD4(克隆SK3)、CD8(克隆SK1)、TNF-α(克隆MAb11)和IL-2(克隆MQ1-17H12)具有特异性的抗体和固定活性染料eFluor 506(eBioscience)染色。在斯坦福大学共享FACS设施(Stanford Shared FACSFacility)处的配备有70μm喷嘴的FACSAria II上进行细胞分选。使用CD4+和CD8+细胞的各个门对前10％的TNFα+和IL-2+进行分选。汇集高CD4+和CD8+细胞因子细胞以进行基因组DNA提取。
基因组DNA提取及测序文库制备
进行了基因组DNA提取、文库制备和测序的技术重复实验。在每个时间点收集2000-3000万个细胞，但如下分选条件除外：在所述分选条件下对于每个供体仅处理一个样品，并且每个样品具有约500万个细胞。如前所述，在第0天，将大量制备(maxiprep)的慢病毒载体质粒文库用作模拟在实验开始时T细胞中指导物的相对丰度的代替物，并且从大量制备的DNA制备重复测序文库，所述大量制备的DNA是在37℃下使用在具有蛋白酶K的SDS中的过夜裂解物从细胞沉淀物中提取的基因组DNA。简言之，将蛋白质用乙酸铵沉淀，将基因组DNA用异丙醇沉淀。将所有回收的基因组DNA用作PCR模板以产生测序文库。如Morgens等人2017所述制备文库。使用定制引物添加Illumina衔接子并且在lllumina NovaSeq6000PE150平台上进行深度测序。通过Novogene(加利福尼亚州萨克拉门托)进行测序。
CRISPR筛选数据分析
使用bcl2fastq2转换软件v2.20将BCL文件转换为FASTQ文件。从FASTQ文件中提取指导序列，并使用定制R脚本将其与Bassik文库索引匹配。提供每个指导物的原始计数作为MAGECK算法(Li 2014)的输入。对于增殖筛选，将“第0天”的两个重复实验与第23天收集的4个样品(每个供体两个)进行比较。对于细胞因子产生筛选，将在第15天收集的4个样品(每个供体两个)与针对高细胞因子表达分选的2个样品(每个供体1个)进行比较。MAGECK算法执行归一化，计算指导物和基因的log变化倍数，并计算调整后p值。
表1：本文所述的嵌合抗原受体的特性。
表2：本研究中使用的合成单指导RNA的特性。使用Synthego ICE分析工具(v2)进行基因缺失效率的分析。
表3：用于扩增用于检测CRISPR/Cas9编辑的基因组DNA序列的引物。
引物 序列 靶标
oKM.061 CACCTAGGACGCACCATTCTCACA(SEQ ID NO:6) AAVS1正向
oKM.062 CTTCTCCGACGGATGTCTCCCT(SEQ ID NO:7) AAVS1反向
oKM.160 GAGTGATGTTTGAGGGCGCG(SEQ ID NO:8) MED12正向
oKM.161 CGACCAGTGTCAGGAAGGGTAT(SEQ ID NO:9) MED12反向
oKM.139 CAACAAGTTATTGCCACTGCTACGG(SEQ ID NO:10) CCNC正向
oKM.140 ATCAGGATGATGGGAGGGAAGACAG(SEQ ID NO:11) CCNC反向
实施例2
CRISPR介导的敲除CAR-T细胞文库的增殖筛选
本实施例描述了实验设计和CRISPR介导的敲除CAR-T细胞文库的增殖筛选的结果，其中发现许多介体亚基的丢失导致CAR-T细胞的增殖减少。
图1示意性地描绘了这些实验中使用的CAR-T细胞CRISPR敲除文库的产生。从两个人供体纯化T细胞。使用慢病毒载体将以每个基因10个指导物靶向所有约20,000个蛋白质编码基因的CRISPR文库以低感染复数(10％阳性)整合到2亿个T细胞中。在第3天将纯化的Cas9蛋白电穿孔到T细胞中，并在激活后第3天和第4天通过逆转录病毒整合CAR。
CRISPR筛选的实验设计描绘于图2中。在此筛选中，将基因编辑的CAR-T细胞体外培养2周，其中强直性信号传导CAR的表达诱导进行性T细胞功能异常。为了针对细胞因子产生进行筛选，将一小部分培养群体用肿瘤刺激，并通过FACS对表达高水平IL-2和TNFα的细胞进行分选。为了针对增殖进行筛选，将T细胞与表达CAR-T靶标的肿瘤细胞一起再共培养7天。筛选结果呈现于图3中，其中观察到在选自增殖筛选的基因中具有敲除突变的CAR-T细胞在重复供体之间展现出再现性。在这些实验中，在第0天和第23天量化指导RNA的丰度。图显示了靶向每个基因的所有指导物的平均log2(变化倍数)。发现绘制在右上象限中的基因在缺失时增强增殖(例如MED12和CCNC)，并且发现绘制在左下象限中的基因在缺失时降低增殖(例如MYC和RHOA)。
此外，还进行了全基因组CRISPR筛选，以鉴定统计学上显著的基因。在这些实验中，使用MAGECK算法来分析指导物的相对丰度并计算每个基因的调整后P值(Li2014)。如图4A所示，细胞因子产生筛选将总的第15天群体中的指导物丰度与高细胞因子群体中的指导物丰度进行比较。如图4B所示，增殖筛选将第23天的丰度与第0天的丰度进行比较。在这些实验中，靶向基因组的安全非编码区的指导物被包括在内以作为对照，并且对于安全靶向指导物的平均log2(变化倍数)由竖直虚线指示。对于统计学显著性的阈值由水平虚线指示。细胞因子产生筛选鉴定了1个统计学上显著的基因，而增殖测定鉴定了若干个统计学上显著的基因。
特别地，如图5A-图5B所示，所有33个介体复合物亚基在上述增殖筛选中均可检测到。在这些图中，绘制靶向每个基因的所有指导物的平均log2(变化倍数)。首先，通过对供体1和供体2取平均值来计算每个指导物的平均富集。然后，通过对指导物平均值取平均值来计算每个基因的平均富集。误差条描绘了指导物的标准差。MED12和CCNC两者均存在于CDK8激酶模块(CKM)中。观察到除在T细胞中不表达的MED12L外，CKD8模块(CKM)的所有成员的丢失都增强了增殖。还观察到，发现除MED26和MED19外，在头部模块、骨架和中间结构域中的介体亚基的丢失减少了增殖。在不受任何特定理论束缚的情况下，可以预期MED26和MED19可能在中间结构域与CKM之间形成物理接触。
此外，还观察到尾部区域的一些成员在缺失时略微增强了增殖(例如MED15、MED16、MED24和MED27)。
特别地，本文所述的CRISPR筛选表明，工程化T细胞中MED12表达的减少导致T细胞的优异的增殖和细胞因子产生。发现在两个不同的人供体中，MED12的结果是一致的。针对CCNC观察到类似的结果，这强烈暗示CKM在调节T细胞增殖中具有关键作用，因为MED12和CCNC两者均是CKM的亚基。此外，如下文更详细描述的，对所有介体亚基的检查表明介体复合物在调节T细胞增殖中的重要作用。
实施例3
缺乏MED12或CCNC亚基的工程化CAR-T细胞产生更多的IL-2和IFN
本实施例描述了用于证明缺乏MED12或CCNC亚基的工程化CAR-T细胞(MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞)展现出增强的细胞因子(例如IL-2和IFNγ)产生而进行的实验的结果。
在这些实验中，激活后第3天使靶基因CCNC和MED12以及对照基因AAVS1缺失。使用CD19-28ζ、HA-28ζ和HER2-4-1BBζ受体产生CAR-T细胞，将其培养至第10天或第15天，随后分别与NALM6、NALM6-GD2或143B细胞系共培养。添加肿瘤细胞后24小时，收集上清液并通过ELISA量化细胞因子。模拟物转导的T细胞不表达CAR，并且被包括在内以用于阴性对照。条形图描绘了两个技术重复实验的平均值，并且误差条显示了标准差。
如图6A-图6F所示，观察到MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞能够增强IL-2和IFNγ的产生。
实施例4
MED12无效CAR-T细胞在单细胞基础上产生更多的IL-2和TNFα
本实施例描述了用于说明MED12无效CAR-T细胞在单细胞基础上产生更多的IL-2和TNFα而进行的实验的结果。
在这些实验中，在第15天，在存在莫能菌素的情况下，将CD19-28ζCAR-T细胞用NALM6肿瘤细胞刺激6小时。将未刺激的(上图)和刺激的细胞(下图)固定并针对IL-2和TNFα染色，并且通过流式细胞术分析。在每个图上方展示了IL-2+TNFα+细胞占总CD4+细胞的百分比。
实施例3和实施例4中呈现的实验数据表明，CKM模块中的功能丧失突变增加了具有分泌多种促炎细胞因子能力的T细胞的数量。INFγ和TNFα具有直接的抗肿瘤作用，而IL-2促进T细胞增殖。在不受任何特定理论束缚的情况下，这种增加的细胞因子分泌能力有助于解释为什么CCNC无效和MED12无效CAR-T细胞具有增强的增殖和增加的肿瘤清除率。
实施例5
MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在培养中展现出增强的增殖
本实施例描述了用于说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在培养中增殖更多而进行的实验的结果。
在这些实验中，在激活后第3天使靶基因CCNC和MED12和对照基因AAVS1缺失，并且将细胞与IL-2一起培养直到第28天。绘制平均总活细胞计数，并且误差条描绘了三个技术重复实验的标准差。如图8所示，观察到MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在培养中增殖更多。
实施例6
MED12无效和CCNC无效CD19-28ζ CAR-T细胞的存活依赖于IL-2
本实施例描述了用于说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞的存活依赖于IL-2而进行的实验的结果。
在这些实验中，在第9天，将细胞洗涤并且在有或没有IL-2的培养基中铺板。将细胞密度维持在每mL培养基50万与100万个细胞之间。将细胞用吖啶橙和碘化丙啶染色，并且用CellacaMX细胞计数器监测活力。在不存在IL-2的情况下，到第28天，在任何条件下均未检测到活细胞。如图9所示，观察到MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞的存活依赖于IL-2。
虽然以上实施例5中呈现的实验数据验证了CRISPR筛选的结果，并且表明MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞在培养的20天内具有5-10倍的扩增。实施例6中呈现的实验数据证明，MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞的存活仍然依赖IL-2，这表明这些T细胞没有转化为癌细胞。这是一个重要的观察结果，因为MED12和CCNC突变与一些类型的癌症有关。特别地，CCNC被描述为肿瘤抑制基因，但是本实验表明，仅CCNC的丢失不足以进行转化。进行另外的实验以证明MED12或CCNC的丢失增加CAR-T细胞或非转导T细胞中的细胞因子产生。在这些实验中，将5x 104个T细胞和5x 104个肿瘤细胞在圆底96孔板中在250μl不含IL-2的培养基中共培养24小时。在与肿瘤细胞共培养24小时后收集培养上清液，并通过ELISA(参见例如图15A)或CD3/CD28激活珠(参见例如图15B)量化细胞因子。用ELISA MAX试剂盒(Biolegend)检测IL-2和IFNγ，并且用Quantikine试剂盒(R&D Systems)检测TNF-α。图15A-图15B中描述的实验也描述于以上实施例3中。
实施例7
MED12无效和CCNC无效CD19-28ζ CAR-T细胞在体内展现出增加的肿瘤清除率
本实施例描述了说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在体内显示出增加的肿瘤清除率的实验的结果。
在这些实验中，在第0天输注约100万个表达萤光素酶转基因的NALM6细胞，并且在第3天输注250,000个CAR-T细胞或模拟物转导的T细胞。使用SII Lago(SpectralInstruments Imaging)通过生物发光成像监测肿瘤负荷，并且用Aura成像软件量化每秒光子数(p/s)。图10A示出了30秒曝光结果，而使用较短的曝光量化以避免饱和(图10B和图10C)。对于单个小鼠的值示于图B中，并且平均值示于图C中。误差条描绘了标准差l。观察到MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在体内显示出增加的肿瘤清除率。
值得注意的是，在实施例7中观察到MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞在早期时间点展现出显著和相等的肿瘤清除率。然而，到第42天，与用CCNC无效CAR-T细胞处理的小鼠相比，用CCNC无效CAR-T细胞处理的小鼠具有显著更多的肿瘤负荷，这表明在几周内体内T细胞可能更耐受MED12的丢失。
实施例8
MED12无效和CCNC无效CD19-28ζ CAR-T细胞在体内显示出增加的扩增
本实施例描述了说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在体内显示出增加的扩增的实验的结果。
在这些实验中，T细胞输注后十天从小鼠收集血液(如以上图10所示)。将血液与等体积的CountBright绝对计数珠(Invitrogen)混合，针对人CD45染色，并且将红细胞用BDFACS裂解溶液(BD)裂解。通过流式细胞术量化人CD45+细胞。如图11所示,观察到MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞在体内显示出增加的肿瘤清除率。
进行了另外的实验以证明MED12的丢失增加CAR-T细胞和不表达CAR的T细胞的扩增。在这些实验中，从血沉棕黄层中分离CD4和CD8 T细胞，并将其用抗CD3/CD28珠激活。在第3天对细胞进行CRISPR编辑，并且与IL-2一起培养直到第23天(参见例如图16A)或第12天(参见例如图16B)。在这些实验中，使用Cellaca Mx自动细胞计数器(Nexcelom)获得了细胞计数和活力测量结果。将细胞用吖啶橙和碘化丙啶染色以评估活力。在每次传代时弃去一部分培养物体积，并且使用维持在培养物中的细胞的级分来计算总细胞计数。
在不受任何特定理论束缚的情况下，实施例8中所示的数据提供了关于为什么增强肿瘤清除率的解释。MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞数量的增加可以解释为何在这个时间点烧伤的肿瘤减少。此外，本实施例是尤其相关的，因为没有施用支持细胞因子(如IL-2或IL-7)的T细胞。这些细胞产生的IL-2增加可能解释了体内增殖的增加。
实施例9
MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞增加CAR-T细胞处理的存活益处
本实施例描述了说明MED12无效和CCNC无效CD19-28ζCAR-T细胞增加CAR-T细胞处理的存活益处的实验的结果。
在这些实验中，向小鼠输注100万个NALM6肿瘤细胞，并且在第3天用1×105、2.5×105或5×105个T细胞处理。如图12所示，MED12无效CAR-T细胞增加了存活期，而CCNC无效CAR-T细胞与AAVS1无效CAR-T细胞等效。
实施例9和实施例10中呈现的实验数据表明，MED12无效和CCNC无效CAR-T细胞在减缓液体瘤和实体瘤两者的进展方面是有效的。此外，这些实施例表明，MED12/CCNC丢失的影响可推广到靶向不同抗原并利用不同共刺激结构域的CAR。此结果表明此策略适用于所有CAR-T细胞治疗剂。
实施例10
MED12无效和CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞降低实体瘤生长
本实施例描述了说明MED12无效和CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞降低实体瘤生长并增加CAR-T细胞处理的存活益处的实验的结果。
在这些实验中，在第0天肌内注射约100万个143B骨肉瘤细胞，并且在第4天输注500万个CAR-T细胞或模拟物转导的T细胞。用卡尺测量实体瘤。当肿瘤直径≥17mm时，对小鼠实施安乐死。如图13所示，观察到MED12无效和CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞降低实体瘤生长(图1)并增加CAR-T细胞处理的存活益处(图13B)。
实施例11
通过靶向MED12外显子2中的2个切割位点增加基因缺失频率
本实施例描述了说明通过靶向MED12外显子2中的2个切割位点增加基因缺失频率的实验的结果。
在这些实验中，将S.p.Cas9核酸酶V3(IDT)在Duplex Buffer(IDT)中稀释至5mg/mL。将sgRNA(Synthego)在TE缓冲液中以100μM重悬。将1μL CAS9和1μL sgRNA合并，并且在室温下孵育30分钟。对于两个指导物条件，添加0.5μl的每种sgRNA。将200万个T细胞重悬于18μL P3缓冲液中，与CAS9混合，并且使用P3原代细胞4D-NucleofectorTM S试剂盒和4D-NucleofectorTM系统(Lonza)用方案EO115脉冲。将细胞立即用100μL温热的培养基回收，然后转移到1mL温热的培养基中持续6小时，然后用CAR转导。在第3天进行编辑，并且在第11天评估基因缺失。
进行另外的实验以证明MED12或CCNC的丢失增加体内扩增。在输注到荷瘤小鼠中10天后评估外周血中T细胞的频率(参见例如图17)。在这些实验中，将来自眶后窦的血液收集到具有EDTA的Microvette血液收集管(Fisher Scientific)中。根据制造商的说明，将全血用抗CD45(HI30，ThermoFisher)标记，并且将红细胞用FACS裂解溶液(BD)裂解。将样品与CountBright绝对计数珠(ThermoFisher)混合，然后进行流式细胞术分析。
实施例11中呈现的实验数据例示了以高效率有效优化MED12缺失的方法。典型的CRISPR修饰方案包括使用一个指导RNA。本实施例中描述的方法包括使用间隔约50bp的两个指导物。这种方法以高于通过使用单个指导物产生的1bp插入缺失突变的频率产生47bp插入缺失。
实施例12
用CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理减少肿瘤面积并增加存活期
本实施例描述了说明CCNC无效HER2-4-1BBζCAR T细胞处理减少肿瘤面积并增加CAR处理的小鼠的存活期的实验的结果。
在这些实验中，向NSG小鼠的肿瘤面积肌内注射1x 106个143B骨肉瘤细胞，并在4天后用5x 106个模拟物或CCNC―或MED12无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理。通过卡尺测量肿瘤面积。双因素方差分析检验与Dunnett多重比较检验。*P<0.01。如图18A所示，用CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理的小鼠的肿瘤面积最低。图18B示出了图18A中的CAR处理的小鼠的存活百分比。将存活曲线用Log-rank Mantel-Cox检验进行比较。*P<0.01。
细胞系：
NALM-6白血病细胞和143B骨肉瘤细胞是从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得的。将细胞系用GFP和萤火虫萤光素酶稳定转导。将Nalm6-GD2工程化以稳定表达GD2合酶和GD3合酶以获得GD2双唾液酸神经节苷脂的表面表达。选择单细胞克隆以用于GFP、萤光素酶和GD2的高表达。将细胞系维持在补充有10mM HEPES、10％FBS和1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺补充剂(Gibco)的RPMI(Gibco)中。
小鼠：
免疫受损的NOD scid IL2Rγ无效(NSG)小鼠是从JAX购买的，并将其在无菌条件下进行内部繁殖。每天监测小鼠。护理和处理符合斯坦福大学的标准方案。经由静脉内注射施用白血病细胞和CAR-T细胞。通过肌内注射施用143B骨肉瘤细胞。对于一些实验，在治疗前评估肿瘤负荷，并且将小鼠随机分组以确保处理组之间的肿瘤负荷相等。处理和施用的时间在图中指示。研究人员在施用T细胞期间是设盲的。使用Lago SII(SpectralInstruments Imaging)监测白血病进展。用Aura软件(Spectral Instruments Imaging)进行生物发光的量化。使用对注射的腿部区域的卡尺测量跟踪实体瘤进展。在实体瘤测量期间，研究人员对处理组也是设盲的。在表现为瘫痪、活动能力受损、身体状况不佳(BC2-的得分)或肿瘤直径超过17mm时，对小鼠实施安乐死。根据先前使用这些模型的经验，选择每组5只小鼠的样本量。将所有实验用不同的供体重复两次，并且用于体内实验的供体与筛选实验不同。
实施例13
用CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理增加存活期
本实施例描述了说明用CCNC无效HER2-4-1BBζCAR-T细胞处理后CAR处理的小鼠的存活期增加的实验的结果。图19A-图19B示出了CAR处理的小鼠的存活期。每组的小鼠数量在图例中指示。通过生物发光成像监测肿瘤生长。双因素方差分析检验与Dunnett多重比较检验。*P<0.01。
在实验中，向NSG小鼠静脉内注射1.0x 106个NALM6-GD2-Luc白血病细胞，并且在肿瘤输注后9天用2.0x 105个模拟物或CCNC-或MED12无效HA-28ζCAR-T细胞处理(n＝5只小鼠)(参见例如图19C)。在其他实验中，向NSG小鼠静脉内注射1.0x106个NALM6-Luc白血病，并且在肿瘤输注后3天用2.5x 105个模拟物或CCNC无效或MED12无效CD19-28ζCAR-T细胞处理(n＝5只小鼠)(参见例如图19D)。在以上实施例12中提供了在这些实验中使用的细胞系和小鼠的其他细节。
实施例14
MED12的丢失增加IL2RA的表达
本实施例描述了说明MED12的丢失增加T细胞中IL2RA的表达的实验的结果。在实验中，在激活后第3天对细胞进行CRISPR编辑，随后用CD19-28z CAR转导。通过流式细胞术在激活后第15天评估IL2RA的表达。观察到MED12缺陷型细胞表现出增强的效应子表型。通过ATAC-seq分析，观察到的效应子表型的增强可以归因于IL2RA下游的转录因子STAT5的活性增加。因此，在不受任何特定理论束缚的情况下，预期IL2RA表达是MED12缺陷型CAR-T细胞的重要表型特征。值得注意的是，在未修饰的T细胞和CAR-T细胞两者中均发现了在不存在MED12的情况下IL2RA表达升高，这表明MED12丢失的机制并不取决于CAR的存在。
图20A和图20B以图形方式总结了这些实验。图20A显示了表达CD19-28z CAR构建体的T细胞的结果，而图20B显示了未转导的T细胞的结果。在这些实验中，将T细胞在FACS缓冲液中洗涤(不含钙、不含镁的DPBS(Gibco)，具有2％FBS)。将细胞与对细胞表面标记物具有特异性的抗体一起在FACS缓冲液中在冰上孵育二十分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤，并且在LSRFortessa(BD)上用BD FACSDiva软件分析。
实施例15
MED12的丢失增加效应记忆T细胞表型
本实施例描述了说明MED12的丢失增加效应记忆T细胞表型(CCR7低，CD45RO高)的实验的结果。
在这些实验中，激活后22天通过流式细胞术评估细胞。图21A示出了CD19-28zCAR-T细胞的细胞计数结果，其中对以下细胞类型设门：干细胞样记忆T细胞(SCM)、中枢记忆T细胞(CM)、效应记忆T细胞(EM)和终末分化T细胞(TE)。图21B示出了对非转导的T细胞进行的平行实验的结果。
实施例16
MED12缺陷型CD19-28z CAR-T细胞中增加的氧消耗率和细胞外酸化率
本实施例描述了用于说明激活后15天MED12的缺乏增加CD19-28z CAR-T细胞的氧消耗率和细胞外酸化率而进行的实验的结果。在不受任何特定理论束缚的情况下，代谢活性的增加(如升高的氧消耗和细胞外酸化所指示)可以被认为是效应T细胞的特征，这进而又与MED12的丢失引起增强的效应表型的假设一致。
根据制造商的说明，使用海马测定(Agilent)进行线粒体应激测试。图22展示了线粒体应激测试的结果。在这些实验中，使用Seahorse Bioscience分析仪XFe96进行代谢分析。简言之，将2×106个细胞重悬于补充有25mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的XF测定培养基中，并铺板在Cell-Tak(Corning)包被的微孔板上，从而允许CAR T细胞粘附。使用实时注射寡霉素(1.5μM)、羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP；1μM)以及鱼藤酮和抗霉素(二者均为1μM)分别经由氧消耗率(OCR)(pmol/min)和细胞外酸化率(ECAR)(mpH/min)测量线粒体应激和糖酵解参数。按照制造商的说明(Seahorse Bioscience)计算呼吸参数。除非另有说明，否则所有化学品均从Agilent购买。
虽然已经公开了本公开文本的特定替代方案，但应理解的是，各种修改和组合是可能的并且被考虑在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，不旨在限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。
参考文献
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SEQUENCE LISTING
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<120> 用于增强治疗性免疫细胞功效的方法和组合物
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Claims (41)

1.一种用于产生具有增强的效应子功能的工程化免疫细胞的方法，所述方法包括将能够降低所述免疫细胞中介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽引入所述免疫细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述介体复合物亚基是中部模块亚基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述中部模块亚基是MED19或MED26。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述介体复合物亚基是尾部模块亚基。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述尾部模块亚基是MED15、MED16或MED24。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述介体复合物亚基是CDK8模块亚基。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CDK8模块亚基选自CCNC、CDK18、CDK19、MED12、MED12L和MED13L。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将所述核酸掺入以下中的一种或多种中：(i)CRISPR/Cas基因组编辑系统的指导RNA(gRNA)、(ii)TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)基因组编辑系统、(iii)用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌Argonaute)进行的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑、(iv)反义核酸分子、(v)双链RNAi分子、和(vi)能够诱导mRNA的抑制或降解的发夹RNA分子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述核酸包含与内源性基因组基因座内编码所述介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的多核苷酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述T淋巴细胞是：
选自幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞、大量CD8+T细胞的CD8+T细胞毒性淋巴细胞；或
选自幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和大量CD4+T细胞的CD4+T辅助性淋巴细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种重组免疫受体引入所述免疫细胞中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种重组免疫受体包括嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。
16.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞由根据权利要求1-14中任一项所述的方法产生。
17.一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞包含能够降低所述免疫细胞中介体复合物亚基的表达水平的核酸和/或多肽。
18.根据权利要求17所述的工程化免疫细胞，其中所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是在体外、离体或体内的。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是T淋巴细胞。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是耗竭性免疫细胞或非耗竭性免疫细胞。
22.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求16-21中任一项所述的工程化免疫细胞和培养基。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和：
a)根据权利要求16-22中任一项所述的工程化免疫细胞；和/或
b)含有与基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的重组核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和根据权利要求16-22中任一项所述的工程化免疫细胞。
26.根据权利要求23-24中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂以及与内源性基因组基因座内编码所述介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的重组核酸。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述组合物包含被包封在病毒衣壳、脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)中的核酸。
28.一种用于治疗有需要的受试者的健康状况的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含以下的组合物：
a)根据权利要求16-22中任一项所述的工程化免疫细胞；
b)包含与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的重组核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基；和/或
c)根据权利要求23-27中任一项所述的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述介体复合物亚基选自CCNC、CDK8、CDK19、MED12、MED12L、MED13、MED13L、MED19、MED24和MED26。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中所述健康状况是增殖性疾病、自身免疫性疾病或感染。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。
33.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述受试者患有或怀疑患有增殖性疾病、自身免疫性疾病或感染。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述增殖性疾病是癌症。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症是白血病或骨肉瘤。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中所施用的组合物赋予增强的效应子功能，所述效应子功能选自生长速率(增殖)、细胞因子产生、靶细胞抑制(例如，抗癌细胞毒性)、巨噬细胞激活、T细胞激活、NK细胞激活和体内持久性(例如，存活)。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述增强的效应子功能包括干扰素γ(INFγ)、白介素-2(IL-2)和/或肿瘤坏死因子α(TNFα)的增加的产生。
38.根据权利要求37-37中任一项所述的方法，其中所述增强的效应子功能包括增加的效应记忆T细胞表型。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述增强的效应子功能包括增加的氧消耗率和细胞外酸化率。
40.根据权利要求28-39中任一项所述的方法，其中将所述组合物单独地或作为第一疗法与第二疗法组合施用于所述受试者，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。
41.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的病症的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)根据权利要求16-22中任一项所述的工程化免疫细胞；
b)包含与内源性基因组基因座内编码介体复合物亚基的靶序列具有足够序列互补性的序列的重组核酸，其中所述介体复合物亚基选自所述介体复合物的中部模块亚基、尾部模块亚基和细胞周期蛋白依赖性激酶8(CDK8)模块亚基；和/或
c)根据权利要求23-27中任一项所述的药物组合物。
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