KR20200018586A - 인간 감마-델타 t-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

인간 감마-델타 t-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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하이샨 리
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Abstract

본 개시 내용은 일반적으로 감마-델타 (GD) T 세포를 활성화시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법 및 조성물은 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

인간 감마-델타 T-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 "인간 감마-델타 T-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물"이라는 명칭으로 2017년 6월 16일 출원된 미국 가출원 제62/521,274호, 및 "인간 감마-델타 T-세포를 통한 종양 세포독성의 활성화를 위한 방법 및 조성물"이라는 명칭으로 2018년 2월 21일 출원된 미국 가출원 제62/633,461호에 대해 우선권을 청구하고, 이들은 각각 참조로 본 명세서에 편입된다.
분야
본 개시 내용은 일반적으로 유전자 요법 및 면역요법 분야에 관한 것이고, 특별히 감마 델타 ("GD") T 세포의 증가된 활성화 및 이펙터 세포 기능에 관한 것이다.
인간 T 세포는 T 세포 수용체 구조를 기반으로 구별된다. CD4+ 및 CD8+ 서브세트를 포함한 주요 개체군은 알파 및 베타 사슬로 구성된 수용체를 발현한다. 보다 작은 서브세트는 감마 및 델타 사슬로 구성되는 T 세포 수용체를 발현한다. 감마 델타 ("GD") T 세포는 순환성 림프구의 3 내지 10%를 구성하고, Vδ2+ 서브세트는 혈중 GD T 세포의 75%를 구성한다. Vδ2+ 세포는 비-펩티드 에피토프를 인식하고, 주요 조직적합성 복합체 ("MHC")에 의한 항원 제시 또는 인간 백혈구 항원 ("HLA")을 필요로 하지 않는다. Vδ2+ T 세포의 대부분은 또한 Vγ9 사슬을 발현하고, 메발로네이트 및 비-메발로네이트 스테롤/이소프레노이드 합성 경로의 중간체인 5-탄소 파이로포스페이트 화합물에 노출에 의해 자극된다. 이소펜테닐 파이로포스페이트 (5-탄소)에 대한 반응은 건강한 인간에서는 거의 보편적이다.
GD T 세포의 다른 세브세트, Vδ1+는 혈중에서 순환되는 T 세포 중 매우 작은 비율을 차지하지만, Vδ+1 세포는 상피 점막 및 피부에서는 가장 일반적으로 존재한다. 소수의 세포 개체군은 다른 Vδ 사슬을 발현하고, 알레르기, 이식 또는 바이러스 및 박테리아 질환 동안의 특이적 반응과 연관될 수 있다.
일반적으로, GD T 세포는 종양 세포 및 병원체-감염 세포의 사멸을 포함하여 몇몇 기능을 갖는다. CD3 복합체 단백질과 상호작용하여 기능성 TCR을 생성시키는 2개의 당단백질 사슬, γ 및 δ로 구성된 그들 고유의 T 세포 수용체 ("TCR")를 통한 자극은 세포의 세포독성, 사이토카인 분비 및 다른 이펙터 기능에 대한 능력을 개선시킨다. GD T 세포의 TCR은 고유한 특이성을 가지며 세포 그 자체는 높은 클론 빈도로 발생되어서, 종양 및 병원체에 대한 신속한 선천성-유사 반응을 가능하게 한다.
비스포스포네이트 약제, 및 메발로네이트 경로 (예를 들어, 도 1 참조)에서 이소펜테닐 파이로포스페이트 ("IPP") 하류에 있는, 파르네실 디포스페이트 신타제 ("FDPS")의 다른 억제제는 암, 특히 골전이가 관여된 것들을 포함해서 다양한 질환을 치료하는데 사용되어 왔다. 비스포스포네이트 약제는 예를 들어, 상표명 예컨대 Zometa® (Novartis), Actonel® (Procter & Gamble), Aredia® (Novartis) 및 Fosamax® (Merck)를 포함한다.
일정 비스포스포네이트가 또한 GD T 세포의 자극을 위해 조사되어왔다. 이것은 골수 또는 종양 세포에서 FDPS의 억제가 IPP의 파르네실 디포스페이트로의 전환을 차단하여 IPP가 축적되게 하는 동시에, 정상적으로는 NLRP3 인플라마솜 경로의 활성화를 억제하는 FDPS의 하류 생성물인 제라닐제라닐 파이로포스페이트 ("GGPP")의 수준을 감소시키기 때문일 수 있다. GGPP의 감소는 캐스파제-의존적 인플라마솜 경로의 억제제를 제거시키고, 인터류킨-1 베타 및 인터류킨-18을 포함한 사이토카인의 분비를 가능하게 하는데, 후자의 사이토카인이 감마 델타 T 세포 활성화에 특히 중요하다.
따라서, FDPS가 차단될 때, 증가된 IPP 및 감소된 GGPP는 골수 또는 종양 세포를 변형시키고, 변형된 세포는 GD T 세포, 특별히 Vδ2+ 서브세트를 활성화시키기 위한 증가된 능력을 얻게 된다. 활성화된 Vδ2+ 세포는 신속하게 증식되어 다수의 사이토카인 및 케모카인을 발현시키고, 종양 세포 또는 병원체-감염된 세포를 세포독성적으로 파괴시키는 기능을 할 수 있다. GD T 세포 이펙터 활성은 마크로파지 및 항원-제시 세포를 활성화시키는 IFN-감마의 분비, 다른 선천성 및 획득성 면역 기전을 활성화시키는 케모카인 및 다른 사이토카인 중에도 TNF-알파의 분비, 표적 세포를 공격 및 파괴하는 그랜자임 B의 활성화, 및 Fas+ 표적 세포에서 세포 아폽토시스를 촉발시키는 FasL의 세포 표면 발현을 포함한다.
전통적인 암 치료의 중대한 문제는 환자가 화학요법 치료에 둔감해진다는 것이다. 화학-내성 종양 세포는 특히 치료가 매우 어려워진다. 화학-내성 환자를 치료하기 위한 대체 요법으로서, 또는 화학요법 및/또는 방사선 요법 대신의 1차 요법으로서, 본 출원은 GD T 세포 활성에 영향을 미치는 단백질의 조작이 종양 성장을 둔화시킬 수도 있고 환자 자신의 선천성 면역 반응을 활성화시켜 암을 인식해 사멸시킬 수도 있게, 종양 부위에서 유전자를 발현시키기 위한 재조합 렌티바이러스의 사용을 제안한다.
본 개시 내용의 일 양상에서, 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터가 개시된다. 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 또한 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하고, 여기서 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 또한 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하고, 여기서 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 적어도 하나의 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜틸-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)이다. 실시형태에서, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 microRNA 또는 shRNA를 포함한다.
실시형태에서, microRNA는 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00001
실시형태에서, microRNA는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00002
실시형태에서, shRNA는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00003
Figure pct00004
실시형태에서, shRNA는 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, 또는 SEQ ID NO: 76의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, shRNA는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00005
실시형태에서, shRNA는 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, 또는 SEQ ID NO: 76을 포함한다.
실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3, BTN3A2, 또는 BTN3A1 또는 이의 변이체를 포함한다. 실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 (R381H)를 포함한다. 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, TNF-α, 또는 인터페론-γ를 포함한다. 실시형태에서, 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, CX3C 케모카인, C 케모카인, 또는 XC 케모카인을 포함한다. 추가 실시형태에서, CC 케모카인은 RANTES를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
다른 양상에서, 렌티바이러스 입자를 발현시키기 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시된다. 시스템은 본 명세서에 상술되는 렌티바이러스 벡터; 표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 엔벨로프 단백질의 발현을 위한 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드; 및 gag, pol 및 rev 유전자의 발현을 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 벡터, 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포를 형질감염시킬 때, 렌티바이러스 입자는 패키징 세포에 의해 생산되고, 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있고, 표적 세포 내에서 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소를 억제시킬 수 있다.
다른 양상에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자가 개시된다. 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시키기 위해 최적화된 엔벨로프 단백질, 및 본 명세서에 상술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다.
다른 양상에서, 감마 델타 (GD) T 세포를 활성화시키는 방법이 개시된다. 이 방법은 GD T 세포의 존재 하에서, 표적 세포를 렌티바이러스 입자로 감염시키거나, 또는 감염되게 하는 단계를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하며, 적어도 하나의 효소가 표적 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시킨다. 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 실시형태에서, 방법은 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양과 접촉시키거나, 또는 접촉되게 하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산이다. 실시형태에서, 적어도 하나의 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)이다.
다른 양상에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 대상체에게 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계로서, 여기서 렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 효소가 GD T 세포의 존재 하에서 암 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시키고, 그리하여 암을 치료하는 것인 단계를 포함한다. 실시형태에서, 방법은 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양과 접촉시키거나, 또는 접촉되게 하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산이다. 실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 (SEQ ID NO: 17) 또는 BTN3A3 (R381H) (SEQ ID NO: 54)을 포함한다. 추가 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 IL-36을 포함한다.
다른 양상에서, 바이러스 벡터가 개시된다. 바이러스 벡터는 메발로네이트 경로의 제1 표적을 표적화하고 메발로네이트 경로의 제1 생성물을 증가시킬 수 있는 제1 소형 RNA, 및 메발로네이트 경로의 제2 표적을 표적화하고 메발로네이트 경로의 제2 생성물을 감소시킬 수 있는 제2 소형 RNA를 포함한다. 실시형태에서, 제1 표적은 메발로네이트 경로의 제1 효소이고, 제2 표적은 메발로네이트 경로의 제2 효소이다. 실시형태에서, 제1 효소 및 제2 효소 중 적어도 하나는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)를 포함한다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물은 이소펜테닐 파이로포스페이트 (IPP)를 포함한다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제2 생성물은 제라닐제라닐 파이로포스페이트 (GGPP)를 포함한다.
다른 양상에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 대상체에게 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 입자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 방법은 대상체에게 아미노비스포스포네이트 약제의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계를 더 포함한다.
도 1 은 스테로이드 및 이소프레노이드의 생합성을 위한 메발로네이트 경로의 주요 단계의 개요를 도시한다.
도 2 는 원형 형태의 예시적인 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 3 은 원형 형태의 예시적인 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템을 도시한다.
도 4 는 BTN3A3 및/또는 IL-2, IL-15, 및 IL-18과 조합하여 FDPS shRNA 표적화 서열을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 다양한 선형 맵을 도시한다.
도 5 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (WT)을 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 PC3 전립선 암종 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 6 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (R381H) 및 shRNA #4 둘 모두를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 HepG2 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 7 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (R381H) 및 shRNA #4 둘 모두를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 PC3 전립선 암종 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 8 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS-IL-2를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 HepG2 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 9 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS-IL-2를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 PC3 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 10 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS-IL-15를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 PC3 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 11 은 BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (R381H) 및 shFDPS를 발현하는 렌티바이러스가 존재하는 PC3 및 HepG2 세포에서 BTN3A3의 세포외 발현을 입증하는 데이타를 도시한다.
도 12 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, Lv-shFDPS를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 HepG2 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 13 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, Lv-shFDPS를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 세포를 주사한 마우스에서 종양의 지연 성장을 입증하는 데이타를 도시한다.
도 14 는 Lv-shFDPS를 발현하는 렌티바이러스를 주사하고, 후속하여 PBMC 및/또는 졸레드론산을 처리한 마우스의 생존을 입증한 데이타를 도시한다.
도 15 는 Lv-shFDPS를 발현하는 렌티바이러스를 주사하고, 후속하여 PBMC 및/또는 졸레드론산을 처리한 마우스의 종양 부피를 입증하는 데이타를 도시한다.
도 16 은 PBMC로 처리 및 미처리된 Lv-shFDPS PC3 이종이식 종양의 전체 외관을 도시한다.
도 17 은 FDPS, GGPS1, 또는 IDI1을 표적화하는 합성 shRNA 서열과 H1 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터, 및 FDPS 표적화 서열을 갖는 합성 microRNA와 연장 인자 1 알파 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 도시한다.
도 18 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS #1 (SEQ ID NO: 1) 또는 shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리 또는 미처리된 HepG2 세포 중에서 FDPS 단백질 발현의 감소를 입증하는 데이타를 도시한다.
도 19A 및 19B 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS-A (SEQ ID NO: 64), shFDPS-R (SEQ ID NO: 65), shFDPS-TT (SEQ ID NO: 66), 및 shFDPS-L (SEQ ID NO: 67)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 세포 중에서 FDPS RNA (도 19A) 및 단백질 발현 (도 19B)의 감소를 입증하는 데이타를 도시한다.
도 20 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS-4 (SEQ ID NO: 4), miR30-FDPS-1 (SEQ ID NO: 68) 및 miR30-FDPS-3 (SEQ ID NO: 69)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 HepG2 세포 중에서 FDPS 단백질 발현의 감소를 도시한다.
도 21 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, miR30-FDPS #1 (SEQ ID NO: 68)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리 또는 미처리된 THP-1 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 22 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shGGPS1 #1 (SEQ ID NO: 70), shGGPS1 #2 (SEQ ID NO: 71), 및 shGGPS1 #3 (SEQ ID NO: 73)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 HeLa 세포 중에서 GGPS1 단백질 발현의 감소를 도시한다.
도 23 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 shGGPS1 서열 #1 (SEQ ID NO: 70)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리 또는 미처리된 PC3 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 24 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 shGGPS1 서열 #1 (SEQ ID NO: 70)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리 또는 미처리된 HepG2 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 25 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 4) 및/또는 shGGPS1 서열 #1 (SEQ ID NO: 70)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리 또는 미처리된 THP-1 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 26 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shIDI1 (SEQ ID NO: 76)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 세포 중에서 IDI1 단백질 발현의 감소를 도시한다.
도 27 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 1) 또는 shIDI1 서열 #1 (SEQ ID NO: 76)을 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 28 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 졸레드론산, FTI277, 또는 자라고즈산으로 처리된 THP-1 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 데이타를 도시한다.
도 29 는 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 4)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산, FTI277, 또는 자라고즈산으로 처리된 PC3 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
도 30 은 본 명세서에 기술된 바와 같이, shFDPS 서열 #4 (SEQ ID NO: 4)를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산, FTI277, 또는 자라고즈산이 처리된 HepG2 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화를 입증하는 FACS 데이타를 도시한다.
개시 내용의 개요
본 개시 내용은 예를 들어 도 1에 도시된 바와 같이, 이소펜테닐 포스페이트 (IPP)를 파르네실 디포스페이트 (FDP) 및 메발로네이트 경로의 다른 하류 생성물로 전환시키는데 필요한, 파르네실 디포스페이트 신타제 ("FDPS") 또는 메발로네이트 경로의 다른 효소의 억제를 일으키는, 유전자 요법 구성체 및 이의 세포로의 전달에 관한 것이다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 또는 스쿠알렌 신타제 중 하나 이상을 표적화하고, 그리하여 이들 효소의 발현 정도를 감소시키는, microRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 제공한다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 및 AAV 벡터를 포함한다. FDPS 및 메발로네이트 경로의 다른 효소의 발현 조절 결과는 GD T 세포 증식 및 분화의 자극인자인 IPP의 축적을 증가시키는 것이다. GGPS1 및 메발로네이트 경로의 다른 효소의 발현 조절의 결과는 GGPP 수준을 감소시키는 것이고, 이것은 인터류킨-1 베타 및 인터류킨-18을 포함하는 사이토카인의 분비를 가능하게 한다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 구성체는 GD T 세포를 활성화시키는데 사용되고, 암 및 감염성 질환을 치료하는데 사용된다.
정의 및 해석
본 명세서에서 달리 정의하지 않으면, 본 개시 내용과 관련되어 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술되는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기술들과 연관된 명명법은 당분야에 충분히 공지되어 있고 통용되는 것들이다. 본 개시 내용의 방법 및 기술은 일반적으로 당분야에 충분히 공지된 통상의 방법에 따라서 그리고 달리 표시하지 않으면 본 명세서 전반에서 인용되고 논의되는 다양한 일반 및 보다 특수한 참조 문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)]; [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)]; [Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)]; 및 [Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]. 임의의 효소 반응 또는 정제 기술은 당분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제조사의 명세서에 따라서 수행된다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학의 실험실 절차 및 기술, 및 그와 관련되어 사용되는 명명법은 당분야에서 충분히 공지되고 통용되는 것들이다.
구체적인 내용 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "한", "하나" 및 "그"는 상호교환적으로 사용되고 또한 복수 형태를 포함하고자 하고, 문맥에서 달리 명확하게 표시하지 않으면, 각 의미 내에 속한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 가능한 조합을 비롯하여 대안으로서 해석될 때 조합의 부족 ("또는")을 의미하고 포괄한다.
범위를 포함하여 모든 수치 표시, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 0.1의 증분만큼 (+) 또는 (-)인 가변적인 어림치이다. 항상 분명하게 명시되지 않더라도, 모든 수치 표시는 용어 "약"이 선행되는 것으로 이해해야 한다. 용어 "약"은 또한 정확한 값 "X"와 그에 더하여 "X"의 소량의 증분 예컨대 "X + 0.1" 또는 "X - 0.1"을 포함한다. 항상 분명하게 명시되지 않더라도, 본 명세서에 기술된 시약은 단지 예시이고 그의 등가물은 당분야에 공지되어 있다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 당업자가 이해하게 될 것이고 이것이 사용되는 문맥에 따라서 어느 정도까지는 가변적일 것이다. 이것이 사용되는 문맥을 고려하여 당업자에게 분명하지 않은 이 용어의 용도가 존재한다면, "약"은 특정 용어의 10%를 더하거나 또는 뺀 것을 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "∼의 투여" 또는 "투여하는"은 치료적으로 유용한 형태 및 치료적 유효량으로 개체의 신체에 유입시킬 수 있는 형태로 치료를 필요로 하는 대상체에게 활성제를 제공하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "부티로필린 3A"는 본 명세서에서 "BTN3A"라고 할 수 있다. 또한, "부티로필린 3A1"은 본 명세서에서 "BTN3A1"이라고 할 수 있고, SEQ ID NO: 53의 BTN3A1의 일부분을 포함할 수 있다. 부티로필린 3A3은 본 명세서에서 "BTN3A3" (SEQ ID NO: 17)이라고 할 수 있다. BTN3A3의 변이체는 제한없이 BTN3A3 (R381H)를 포함하고, SEQ ID NO: 54 또는 SEQ ID NO: 55 또는 SEQ ID NO: 59의 BTN3A3 일부분을 포함할 수 있다. "R381H"에 대한 언급은 아르기닌 (R) 아미노산이 아미노산 위치 381에서 히스티딘 (H) 아미노산으로 치환된 것을 의미한다. 아미노산 치환을 정의하는 이러한 협약은 본 명세서의 다른 위치 및 다른 아미노산에 대해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CA19-9"는 탄수화물 항원 19-9를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "CC 케모카인"은 그들 아미노산 말단 근처에 2개의 인접하는 시스테인을 갖는 것을 특징으로 하는 케모카인 단백질의 클래스를 의미한다. 용어 "CXC 케모카인"은 그들 아미노산 말단 근처에서 하나의 아미노산에 의해 이격된 2개 시스테인을 갖는 것을 특징으로 하는 케모카인 단백질의 클래스를 의미한다. 용어 "CX3C 케모카인"은 그들 아미노 말단 근처에 3개 아미노산에 의해 이격된 2개 시스테인을 갖는 것을 특징으로 하는 케모카인 단백질의 클래스를 의미한다. 용어 "XC 케모카인"은 그들 아미노 말단 근처 아미노산에 인접하는 하나의 시스테인을 갖는 것을 특징으로 하는 케모카인 단백질의 클래스를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CD"는 분화 단백질의 클러스터를 의미한다. 이러한 단백질의 예는 제한없이 CD4 및 CD8을 포함한다. 예를 들어, CD4+에 대한 언급은 CD4 단백질이 양성적으로 발현된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CEA"는 암배 항원을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비스포스포네이트" 및 "비스포스포네이트 약제"는 다양한 실시형태의 치료제를 의미하고, 임의의 아미노비스포스포네이트, 디포스포네이트, 비포스폰산 및 디포스폰산을 비롯하여, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 유도체를 포괄한다. 비스포스포네이트를 언급하는 특별한 명명법의 사용은 달리 특별히 표시하지 않으면, 본 발명의 범주를 한정하는 것을 의미하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "병용 투여" 또는 "조합 사용" 또는 "병용 요법" 또는 본 명세서에서 이용되는 유사 용어는 이를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어, 환자)에게 치료적 벡터 또는 렌티바이러스 입자 및 비스포스포네이트 약제 또는 이들의 임의 조합의 투여를 의미하고, 작용제가 반드시 동일한 투여 경로 및/또는 동일한 시점에 투여될 필요가 없는 치료 용법을 포함하고자 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "고정 병용물"은 단일 독립체 또는 용량 또는 조합된 독립체 또는 용량의 형태로, 예를 들어, 하나의 정제 또는 하나의 캡슐로 또는 조합된 정제 또는 캡슐 또는 조합된 액상 형태로, 환자에게 본질적으로 병용하여, 예를 들어 본질적으로 동시에 투여되는, 임의의 그들 개별 조성물, 제제 또는 약제 형태, 예를 들어 치료적 벡터 또는 렌티바이러스 입자 및 비스포스포네이트 약제 또는 이들의 임의 조합을 포함한, 둘 이상의 활성 원료 또는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비-고정 병용물"은 특별한 시간 제한없이 동시에, 동시발생적으로 또는 순차적으로, 개별 독립체로서 환자에게 병용하여 투여되는, 임의의 그들 개별 조성물, 제제 또는 약제 형태, 예를 들어 치료적 벡터 또는 렌티바이러스 입자 및 비스포스포네이트 약제 또는 임의의 이들 조합을 포함한, 둘 이상의 활성 원료 또는 성분을 의미하고, 이러한 투여는 환자 내에 활성 성분의 치료적 유효 수준을 제공한다. 비-고정 병용물은 서로 독립적으로, 또는 상이한 고정 병용물의 사용에 의해서, 예를 들어 동시에 또는 상이한 시점에 투약될 수 있다. 활성 성분은 예를 들어 조합 사용의 가능성에 관한 라벨 지시서가 있거나 또는 없이, 서로 독립적으로 판매될 수 있는 개별 약학 제형 또는 약학 제제로서 투여될 수 있다. 이러한 지시서는 패키지 비품, 예를 들어 리플렛 등으로, 또는 예를 들어 의사 및 의료진에게 제공되는 다른 정보로 제공될 수 있다. 임의의 그들 개별 조성물, 제제 또는 약제 형태, 또는 이의 일부를 포함하여, 비-고정 병용물, 이의 개별 활성 원료 또는 성분은 동시에 또는 연대기순으로 시차를 두고, 예를 들어 투여의 임의 부분의 경우 상이한 시점에, 그리고 동일하거나 또는 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 이러한 시간 간격은 병용 치료시, 치료되는 질환에 대한 효과가 활성 성분 중 오직 어느 하나의 사용으로 수득되는 것에 비해 더 효과적이도록 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "병용물", "병용하여" 및 "병용 요법"은 일반적으로 상기 기술된 "고정 병용물" 및 "비-고정 병용물" 정의 및 실시형태 중 어느 하나 또는 둘 모두를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 연결 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 구성요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지는 않는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용시, "조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "∼로 본질적으로 이루어지는"은 조성물 및 방법이 추가의 구성요소를 포함하지만, 그 추가의 구성요소가 조성물 또는 방법의 신규 및 기초 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않아야만 한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용시, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, "∼로 이루어지는"은 조성물 및 방법이 조성물에 대한 다른 성분의 미량 원소 초과 및 실질적인 방법 단계들을 배제한다는 것을 의미한다. 이들 연결 용어 각각에 의해 정의되는 실시형태는 본 개시 내용의 범주 내이다. 예를 들어, 방법 및 조성물은 추가의 단계들 및 성분들을 포함할 수 있거나 (포함하는) 또는 대안적으로 유의하지 않은 단계 및 조성물을 포함할 수 있거나 (본질적으로 이루어지는) 또는 대안적으로 오직 명시된 방법 단계 또는 조성물만을 의도할 수 있다 (이루어지는)는 것을 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현", "발현된" 또는 "코딩하다"는 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 발현은 진핵생물 세포 중에서 mRNA의 스플라이싱 또는 전사후 변형 또는 번역후 변형의 다른 형태를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "파르네실 디포스페이트 신타제"는 또한 본 명세서에서 FDPS로서 언급될 수 있고, 또한 본 명세서에서 파르네실 파이로포스페이트 신타제 또는 FPPS로서 언급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감마 델타 T 세포"는 또한 본 명세서에서 γδ T 세포, Vγ9Vδ2 T 세포, V감마9V델타2 T 세포, Vγ2Vδ2 T 세포, V감마2V델타2 T 세포 또는 추가로 GD T 세포라고 할 수 있다. 용어 "감마 델타 T 세포 활성화"는 활성화된 이러한 T 세포를 의미하는 감마 델타 T 세포와 연관된 임의의 측정가능한 생물학적 현상을 의미하는 것이다. 이러한 생물학적 현상의 비제한적인 예는 사이토카인 생산의 증가, 세포 표면 단백질의 정량적 또는 정성적 조성의 변화, T 세포 증식의 증가, 및/또는 표적 세포의 사멸 또는 표적 세포 사멸을 위해 다른 이펙터 세포 보조와 같은 T 세포 이펙터 기능의 증가를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "F-Tase"는 파르네실 트랜스퍼라제를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "GGPP"는 제라닐제라닐 파이로포스페이트를 의미하고, 또한 본 명세서에서 제라닐제라닐 디포스페이트로서 언급될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "GGDPS", "GGPPS", "GGDPS1", "GGPS1" 및 "GGPPS1"은 제라닐제라닐 디포스페이트 신타제 1을 의미하고, 또한 본 명세서에서 제라닐제라닐 파이로포스페이트 신타제 또는 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제로서 언급될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "HER-2"는 인간 상피 성장 인자 수용체 2를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 사이토카인 예컨대 "인터류킨 2"는 또한 "IL-2", "IL2" 등으로 언급될 수 있다. IL-2는 또한 SEQ ID NO: 56에 대한 참조를 포함할 수 있다. 관련 방식으로, "인터류킨 15"는 또한 SEQ ID NO: 57에 대한 참조를 포함할 수 있다. 관련 방식으로, "인터류킨 18"은 또한 SEQ ID NO: 58에 대한 참조를 포함할 수 있다. 관련 방식으로, "인터류킨 23"은 또한 SEQ ID NO: 60에 대한 참조를 포함할 수 있다. 관련 방식으로, "인터류킨 36"은 또한 임의의 SEQ ID NO: 61-63 중 어느 하나에 대한 참조를 포함할 수 있다. 일반적으로, 접두사 "IL"은 인터류킨을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IDI1"은 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IFN"은 인터페론을 의미하고, 용어 IFN-감마 및 IFN-γ는 인터페론-감마를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 개별 포유동물 대상체, 예를 들어 소, 개, 고양이, 말, 및/또는 인간을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "IPP"는 이소펜테닐 파이로포스페이트를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "M2-PK"는 피루베이트 키나제 동종효소 M2형을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "MHC"는 주요 조직적합성 복합체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "miRNA"는 microRNA를 의미하고, 또한 본 명세서에서 "miR"이라고도 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "NK 세포" 또는 "NK 수용체 패밀리"는 각각 "자연 살해 세포" 또는 "자연 살해 세포 수용체 패밀리"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "패키징 세포주"는 렌티바이러스 입자를 발현시키는데 사용될 수 있는 임의의 세포주를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동성"은 동일하거나 또는 보존성 치환을 구성하는 아미노산, 핵산 또는 이의 유사체의 개수의 백분율을 의미한다. 상동성은 서열 비교 프로그램 예컨대 GAP을 사용해 결정할 수 있다 (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). 이러한 방식으로 본 명세서에서 인용되는 것과 유사하거나 또는 실질적으로 상이한 길이의 서열은 정렬에 갭의 삽입을 통해 비교될 수 있고, 이러한 갭은 예를 들어, GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은, 또한 본 명세서에서 사용시, 유사한 표현으로서, 소정 서열과 "50%가 동일한 서열", 및 "적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 가지는"의 비제한적인 문맥으로 표시될 수 있고, 서열이 비교창 상에서 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기반 또는 아미노산 대 아미노산 기반으로 동일한 정도를 의미한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교창 상에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 양쪽 서열 중에 존재하는 위치의 개수를 결정하는 단계, 일치되는 위치의 개수를 비교 창 내 위치의 총 개수 (즉, 창 크기)로 나누는 단계, 및 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA)의 컴퓨터 구현에 의해서 또는 선택된 임의의 다양한 방법으로 생성시킨 검사 및 최선의 정렬 (즉, 비교창 상에서 최고의 상동성 백분율을 생성)에 의해 수행될 수 있다. 또한 예를 들어 [Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997]에 개시된 바와 같은 BLAST 패밀리 프로그램을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성 백분율"은 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서, 용어 "서열 동일성"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 하기 기술된 서열 비교 알고리즘 중 하나 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용가능한 다른 알고리즘)를 사용하거나 또는 육안 검사를 통해서 측정시, 최대 대응도에 대해 비교 및 정렬했을 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 용도에 따라서, "동일성 백분율"은 예를 들어, 기능성 도메인 상에서 비교되는 서열의 영역 상에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로, 비교하려는 2개 서열의 전체 길이 상에 존재한다. 서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 좌표는, 필요하다면 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 그 다음으로 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 백분율을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 육안 검사 (일반적으로 [Ausubel et al., 상동] 참조)를 통해 수행할 수 있다.
서열 동일성 백분율을 결정하는데 적합한 알고리즘은 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술된 BLAST 알고리즘을 포함한다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보 센터 웹사이트를 통해서 공공으로 입수가능하다.
2개 뉴클레오티드 서열 간 동일성 백분율은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램을 사용해 결정할 수 있다. 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (version 2.0)에 도입된 E. Meyers 및 W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))의 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 도입된 Needleman 및 Wunsch, (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
본 개시 내용의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공용 데이타베이스에 대해 검색을 수행하기 위한 "문의 서열"로서 더욱 사용할 수 있다. 이러한 검색은 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (version 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 개시 내용에서 제공하는 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해서 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12를 사용해 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 개시 내용의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해서 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3을 사용해 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해서, 갭 BLAST는 [Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때, 개별 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"은 타당한 의학 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합당한 이득/위험 비율에 비례하는 다른 문제 또는 합병증없이 인간 및 동물의 조직, 장기 및/또는 체액과 접촉하는데 사용이 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 의미하고, 포함한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 산부가 염 또는 염기 부가 염 (예를 들어, [Berge et al. J Pharm Sci 66:1-19) (1977)] 참조)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물 또는 다른 활성 원료의 유도체를 의미하고, 여기서 부모 화합물 또는 활성 원료는 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시켜 변형된다. 약학적으로 허용가능한 염의 비제한적인 예는 제한없이 염기성 잔기 예컨대 아민의 미네랄 또는 유기산 염; 산성 잔기 예컨대 카르복실산의 알칼리 또는 유기 염; 알칼리 (alkali) 금속, 알칼리성 (alkaline) 금속, 암모늄, 및 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-C1-C30-알킬-치환된 암모늄 등을 포함한다. 다양한 실시형태의 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 화합물 또는 활성 원료의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 적합한 유기산은 예를 들어 카르복실산 또는 술폰산, 예컨대 아세트산, 숙신산, 푸마르산 또는 메탄술폰산이다. 본 명세서에서 약학적으로 허용가능한 염은 통상의 화학 방법을 통해서 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 부모 화합물 또는 활성 원료로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산의 화학양론적 양과 반응시켜 제조될 수 있고, 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418] 및 [Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에서 확인하며, 이들 각각은 그 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PSA"는 전립선-특이적 항원을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "RANTES"는 CCL5와 동의어이기도 한 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5와 동의어이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO"는 용어 "서열 ID No"와 동의어이다.
본 명세서에서 사용시, "소형 RNA"는 일반적으로 약 200개 뉴클레오티드 또는 그 이하의 길이이고 침묵화 또는 간섭 기능을 보유하는 넌코딩 RNA를 의미한다. 실시형태에서, 소형 RNA는 약 175개 이하의 뉴클레오티드, 약 150개 이하의 뉴클레오티드, 약 125개 이하의 뉴클레오티드, 약 100개 이하의 뉴클레오티드, 또는 약 75개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 이러한 RNA는 microRNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 포함한다. 실시형태에서, "소형 RNA"는 일반적으로 표적 유전자 mRNA의 억제 또는 파괴를 일으키는 경로를 통해서, 표적 유전자의 유전자 발현을 억제할 수 있거나 또는 넉-다운시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TCR"은 T 세포 수용체를 의미하고, 용어 "TCRs"는 이의 복수형을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 소정 질병, 손상, 질환 또는 병태를 앓는 환자에서 확인된 합병증의 증상, 진행 또는 개시를 치료하거나 또는 예방하기 위한, 적합한 조성물, 및 적합한 제형 중 본 개시 내용의 활성제의 충분한 분량을 의미한다. 치료적 유효량은 치료하려는 환자 병태의 상태 또는 이의 중증도, 및 치료하려는 대상체의 연령, 체중 등에 따라서 가변적일 것이다. 치료적 유효량은 예를 들어, 투여 경로, 대상체의 병태를 비롯하여, 당업자가 이해하는 다른 인자들을 포함하여, 임의의 많은 인자들에 따라서, 가변적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 벡터"는 제한없이, 예를 들어 본 명세서의 도 2 및 3에 언급된 바와 같은 렌티바이러스 플라스미드, 및 렌티바이러스 벡터에 대한 참조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TNF"는 종양 괴사 인자를 의미하고, TNF-알파 또는 TNF-α에 대한 참조는 종양 괴사 인자-알파를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 및 "치료하는"은 질환 상태의 표적화 및 이와의 전투, 즉, 질환 상태를 개선시키거나 또는 예방시키고자 하는 것을 의미한다. 따라서 특정한 치료는 치료하려는 질환 상태 및 의학 요법 및 치료적 접근법의 현행 또는 향후 상태에 따라 좌우될 것이다. 치료는 연관된 독성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 일반적으로 치료되는 대상체의 자연 경과를 변경시키고자 시도하는 중재를 의미하고, 예방적으로 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 제한없이, 질환 발병 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 저해, 축소 또는 억제, 질환 상태의 개선 또는 일시적 호전, 및 관해 또는 개선된 예후의 야기를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "VSVG" 또는 "VSV-G"는 수포성 구내염 바이러스 G 엔벨로프 당단백질을 의미한다.
개시 내용의 양상의 설명
개시 내용의 양상에서, 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터가 개시된다. 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여되는 효소의 생산을 억제할 수 있는 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하고, 여기서 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하고, 여기서 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함한다. 실시형태에서, 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS) 또는 이의 기능적 변이체이다. 실시형태에서, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 microRNA 또는 shRNA를 포함한다. 실시형태에서, shRNA는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다:
Figure pct00006
실시형태에서, shRNA는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00007
실시형태에서, shRNA는 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, 또는 SEQ ID NO: 67과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, miRNA는 SEQ ID NO: 68 또는 SEQ ID NO: 69와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 효소는 GGPS1 또는 이의 기능적 변이체이다. 실시형태에서, shRNA는 SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 효소는 IDI1 또는 이의 기능적 변이체이다. 실시형태에서, shRNA는 SEQ ID NO: 76과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 효소는 F-Tase, 또는 스쿠알렌 신타제, 또는 이의 기능적 변이체이다.
실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3, BTN3A3, 또는 BTN3A1을 포함한다. 실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 (R381H)를 포함한다. 실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 부티로필린-유사 분자를 포함한다. 실시형태에서, 부티로필린-유사 분자는 BTNL3 또는 BTNL8을 포함한다. 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, TNF-α 또는 인터페론-γ를 포함한다.
실시형태에서, 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, CX3C 케모카인, C 케모카인, 또는 XC 케모카인을 포함한다. 추가 실시형태에서, CC 케모카인은 RANTES를 포함한다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 추가 실시형태에서, C 케모카인은 XCL1 (림포탁틴)을 포함한다.
다른 양상에서, 렌티바이러스 입자의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시된다. 시스템은 본 명세서에 상술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터; 표적 세포의 감염에 최적화된 엔벨로프 단백질의 발현을 위한 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드; 및 gag, pol, 및 rev 유전자, 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 벡터, 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드, 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드로 패키징 세포를 형질감염시킬 때, 렌티바이러스 입자가 패키징 세포에 의해 생성되고, 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있고 표적 세포 내 메발로네이트 경로에 관여되는 효소를 억제할 수 있다.
실시형태에서, 렌티바이러스 입자는 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 증가된 수준을 야기시킬 수 있다. 실시형태에서, 제1 생성물은 IPP를 포함한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 입자는 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 감소된 수준을 야기시킬 수 있다. 실시형태에서, 제2 생성물은 GGPP를 포함한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 생성물은 제1 생성물을 증가시키고 제2 생성물을 감소시킨다.
실시형태에서, 렌티바이러스 입자는 메발로네이트 경로의 제1 표적을 표적화할 수 있는 소형 RNA를 코딩한다. 실시형태에서, 렌티바이러스 입자는 메발로네이트 경로의 제2 표적을 표적화할 수 있는 소형 RNA를 더 코딩한다. 실시형태에서, 제1 표적 및 제2 표적 중 적어도 하나는 효소이다. 실시형태에서, 제1 표적 및 제2 표적 중 적어도 하나는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 또는 스쿠알렌 신타제이다.
실시형태에서, 소형 RNA에 의한 제1 표적의 표적화는 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도의 증가를 야기시킨다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 10% 까지 증가되고, 여기서 제1 생성물 대조군은 제1 표적이 소형 RNA에 의해 표적화되지 않을 때 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도를 의미할 수 있다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 10% 내지 20% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 20% 내지 30% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 30% 내지 40% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 40% 내지 50% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제1 생성물 대조군에 비해 50% 초과까지 증가된다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물은 IPP를 포함한다.
실시형태에서, 소형 RNA에 의한 제2 표적의 표적화는 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도의 감소를 야기시킨다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 생성물 대조군의 10% 까지 감소되고, 여기서 제2 생성물 대조군은 제2 표적이 소형 RNA에 의해 표적화되지 않을 때의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도를 의미할 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 생성물 대조군의 10% 내지 20% 까지 감소된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 생성물 대조군의 20% 내지 30% 까지 감소된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 생성물 대조군의 30% 내지 40% 까지 감소된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 생성물 대조군의 40% 내지 50% 까지 감소된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도는 제2 대조군 생성물의 50% 초과까지 감소된다. 실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제2 생성물은 GGPP를 포함한다.
실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물의 존재, 수준 또는 농도의 증가는 감마 델타 (GD) T 세포 활성화의 증가를 야기시킨다. 실시형태에서, GD T 세포 활성화는 제1 활성화 대조군에 비해서 10% 까지 증가되고, 여기서 제1 활성화 대조군은 제1 표적이 소형 RNA에 의해 표적화되지 않을 때 GD T 세포 활성화의 수준을 의미할 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 생성물의 조절에 의해 야기되는 GD T 세포 활성화는 제1 활성화 대조군에 비해서 10% 내지 20% 까지 증가된다. 실시형태에서, GD T 세포 활성화는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 활성화 대조군에 비해서 20% 내지 30% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제1 활성화 대조군에 비해 30% 내지 40% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제1 활성화 대조군에 비해 40% 내지 50% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제1 활성화 대조군에 비해 50% 이상까지 증가된다.
실시형태에서, 메발로네이트 경로의 제2 생성물의 존재, 수준 또는 농도의 감소는 감마 델타 (GD) T 세포 활성화의 증가를 야기시킨다. 실시형태에서, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 10% 까지 증가되고, 여기서 제2 활성화 대조군은 제2 표적이 소형 RNA에 의해 표적화되지 않을 때 GD T 세포 활성화의 수준을 의미할 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 10% 내지 20% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 20% 내지 30% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 30% 내지 40% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 40% 내지 50% 까지 증가된다. 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제2 생성물의 조절에 의해 야기된 GD T 세포 활성화는 제2 활성화 대조군에 비해 50% 이상까지 증가된다.
다른 양상에서, 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자가 개시된다. 렌티바이러스 입자는 표적 세포의 감염에 최적화된 엔벨로프 단백질, 및 본 명세서에 상술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다.
다른 양상에서, 감마 델타 (GD) T 세포를 활성화시키는 방법이 개시된다. 방법은 GD T 세포의 존재 하에서, 표적 세포를 렌티바이러스 입자로 감염시키는 단계를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고, 여기서 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여되는 효소의 생산을 억제할 수 있는 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하고, 효소가 표적 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시킨다. 실시형태에서, 효소는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 및/또는 스쿠알렌 신타제, 또는 이의 기능적 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 실시형태에서, 방법은 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산이다.
다른 양상에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 대상체에게 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계로서, 여기서 렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 효소의 생산을 억제할 수 있는 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하고, 효소가 GD T 세포의 존재 하에서 암 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시키고, 그리하여 암을 치료하는 것인 단계를 포함한다. 실시형태에서, 효소는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체 중 적어도 하나를 포함한다.
실시형태에서, 방법은 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 방법은 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하는 단계로서, 여기서 렌티바이러스 입자는 제1, 제2 및 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 효소 또는 효소들의 생산을 억제할 수 있는 소형 RNA 또는 RNA들을 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원을 포함하고, 제3 유전자 엘리먼트는 사이토카인 또는 케모카인을 코딩하며, 효소가 GD T 세포의 존재 하에 암 세포 중에서 억제될 때 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시키고, 부티로필린은 GD T 세포를 활성화시키는 효율을 증가시키고, 사이토카인은 GD T 세포 활성화 및 증식을 증가시키고, 케모카인은 종양 부위에서 GD T 세포의 존재를 증가시키며, 그리하여 암을 치료하는 것인 단계를 포함한다. 실시형태에서, 방법은 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양에 노출시키는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산이다.
실시형태에서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 (SEQ ID NO: 17) 또는 BTN3A3 (R381H) (SEQ ID NO: 54)를 포함한다. 실시형태에서, 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, 또는 IL-36을 포함하지만 또한 면역 세포, 예컨대 T 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 다른 사이토카인을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 케모카인은 CCL5 유전자에 의해 코딩되는 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5, 또는 GD T 세포 수용체에 의해 인식되는 것으로 공지되고 종양 성장 부위로 GD T 세포를 유인할 수 있는 것으로 공지된 다른 케모카인을 포함할 수 있다.
암
본 명세서에 제공되는 조성물 및 방법은 암을 치료하는데 사용된다. 세포, 조직 또는 표적은 암 세포, 암성 조직일 수 있거나, 암성 조직을 품고있거나, 또는 질환 또는 병태가 발생될 위험성이 있거나 또는 그로 진단받은 대상체 또는 환자일 수 있다. 일정 양상에서, 세포는 상피, 내피, 중피, 신경교, 기질, 또는 점막 세포일 수 있다. 암 세포 개체군은 제한없이 뇌, 뉴런, 혈액, 내막, 뇌막, 식도, 폐, 심혈관, 간, 림프, 유방, 뼈, 결합 조직, 지방, 망막, 갑상선, 선상, 부신, 췌장, 위, 장, 신장, 방광, 결장, 전립선, 자궁, 난소, 자궁경부, 고환, 비장, 피부, 평활근, 심근 또는 횡문근을 포함할 수 있고, 또한 전술한 어느 하나 유래의 암 세포 개체군을 포함할 수 있으며, 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종, 혼합형 또는 전술한 것의 혼합 중 하나 이상과 연관될 수 있다. 여전히 추가 양상에서 암은 제한없이 성상세포종, 급성 골수성 백혈병, 역형성 대세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병, 혈관육종, B-세포 림프종, 버킷 림프종, 유방 암종, 방광 암종, 두경부의 암종, 자궁경부 암종, 만성 림프아구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 직결장 암종, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 유잉 육종, 섬유육종, 신경교종, 교아세포종, 가스트린종, 위암종, 간아세포종, 간세포 암종, 카포시 육종, 호지킨 림프종, 후도 편평 세포 암종, 후두 암종, 백혈병, 평활근육종, 지방종, 지방육종, 흑색종, 맨틀 세포 림프종, 수아세포종, 중피종, 점액섬유육종, 골수성 백혈병, 점막-관련 림프 조직 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 고위험 골수이형성 증후군, 비인두 암종, 신경아세포종, 신경섬유종, 고등급 비-호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 난소 암종, 식도 암종, 골육종, 췌장 암종, 크롬친화성세포종, 전립선 암종, 신장 세포 암종, 망막아세포종, 횡문근육종, 타액선 종양, 신경초종, 소세포 폐암, 두경부의 편평 세포 암종, 고환 종양, 갑상선 암종, 요로상피세포 암종, 및 빌름스 종양을 포함한다.
본 명세서에서 제공하는 조성물 및 방법은 또한 NSCLC (비-소세포 폐암), 소아 악성종, 인간 파필로마 바이러스 (HPV)에 의해 야기되거나 또는 촉진되는 자궁경부 및 다른 종양, 흑색종, 바렛 식도 (전-악성 증후군), 부신 및 피부 암 및 자가 면역, 신생물성 피부 질환을 치료하는데 사용된다.
감염성 질환
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "감염성 질환"은 감염원에 의해 야기되는 임의 질환을 포함한다. "감염원"은 제한없이, 박테리아, 진균, 바이러스, 마이코플라즈마, 및 기생충을 포함하는 임의의 외인성 병원체를 포함한다. 본 개시 내용에 제공되는 조성물로 치료될 수 있는 감염원은 그람-음성 또는 그람-양성 구균 또는 간균인 박테리아와 같은 유기체, 제한없이 DNA 바이러스 예컨대 파필로마 바이러스, 파보바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 백시니아 바이러스, 및 RNA 바이러스 예컨대 아레나바이러스, 코로나바이러스, 리노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 피코마바이러스, 파라믹소바이러스, 레오바이러스, 레트로바이러스 및 라브도바이러스를 포함한 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하여, 동물에서 발병을 일으키는 임의의 당분야에서 인식되는 감염성 유기체를 포함한다. 개시 내용의 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 진균의 예는 예를 들어, 백선증, 히스토플라스마증, 분아균증, 아스퍼질러스증, 크립토코커스증, 스포로트리쿰증, 콕시디오이데스진균증, 파라콕시디오이데스진균증, 및 칸디다증과 같은 질환을 야기시키는 진균을 포함하여, 곰팡이처럼 성장하거나 또는 효모유사한 진균을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법은 제한없이, 체강 조충, 주혈 흡충, 조직 회충, 아메바, 및 플라스모듐 (Plasmodium), 트리파노소마 (Trypanosoma), 리슈마니아 (Leishmania), 및 톡소플라스마 (Toxoplasma) 종에 의해 야기된 감염을 포함하는 기생충 감염을 치료하는데 이용될 수 있다.
GD T 세포 활성화의 방법
본 명세서는 개체에서 GD T 세포를 활성화시키기 위한 조성물 및 방법을 비롯하여, 종양 및 감염성 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 명세서에서 제공하는 조성물 및 방법은 활성화된 GD T 세포가 종양의 면역 감시를 위한 자연 기전을 포함하기 때문에 모든 알려진 암을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, [Pauza et al. Frontiers in Immunol. 5:687 (2014)] 참조). 유사하게, 실시형태에서, 본 명세서에서 제공하는 조성물 및 방법은 제한없이 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 레트로바이러스, 마이코박테리아, 플라스모디아 및 다양한 다른 바이러스, 진균 및 박테리아 감염을 포함한, 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Pauza and Cairo, 2015 Cell Immunol. 296(1)] 참조).
일반적으로, 벡터 시스템은 FDPS의 발현을 감소시키기 위해, 그리고 다른 실시형태에서, 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 증가시키기 위해, 개시된 구성체로 표적 세포 개체군을 형질감염 또는 형질도입시키도록 개체에게 투여된다. 투여 및 형질감염/형질도입은 생체내 또는 생체외에서 일어날 수 있으며, 형질감염된 세포가 이후에 후자의 시나리오로 대상체에게 다시 투여된다.
대상체의 세포에 개시된 벡터의 투여 및 개시된 구성체의 형질감염 또는 형질도입은 그 결과로 FDPS의 감소된 발현, 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현, IPP의 축적, 및 많은 경우에, 유전자 변형된 종양 세포에 대한 감소된 성장 속도를 일으킨다. 모든 이들 특성은 함께 작용하여 GD T 세포를 활성화시키고 종양 또는 감염 부위에 공동-국재시킨다.
개시된 방법은 또한 종양 세포 및/또는 감염 세포를 인식하여 파괴하는 NK 세포의 능력을 증가시킬 수 있다. GD T 세포 및 NK 세포 간 크로스토크는 면역 및 염증 반응을 조절하는 중요한 측면이다. 뿐만 아니라, GD T 세포는 수지상 세포 성숙화를 촉발시킬 수 있고, B 세포 및 마크로파지를 동원할 수 있으며, 다양한 세포용해 활성, 예컨대 인터페론-γ 및 TNF-α의 분비에 참여할 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 개시된 조성물 및 방법은 종양 부위에서 GD T 세포를 활성화시키기 위한 유전자 요법의 형태를 포함한다. 일 양상에서, 본 명세서에서 제공하는 조성물 및 방법은 GD T 세포를 활성화시키고, 암 세포를 사멸시킬 수 있거나 또는 감염성 질환을 치료할 수 있는 세포용해 활성에 필요한 특별한 사이토카인의 생산을 촉진함으로써 그들 증식, 분화 및 기능적 능력을 지원한다.
실시형태에서, 유전자 요법 서열 (예를 들어, FDPS shRNA, FDPS miRNA, GGPS1 shRNA, IDI1 shRNA, F-Tase 소형 RNA, 또는 스쿠알렌 신타제 소형 RNA)은 제한없이 바이러스 벡터 예컨대 렌티바이러스 또는 아데노-연합 바이러스를 포함한, 치료적 벡터에 의해 수행되지만, 다른 바이러스 벡터도 역시 적합할 수 잇다. 유전자 요법 구성체는 또한 제한없이 플라스미드 형태를 포함하여, DNA 또는 RNA의 형태로도 전달될 수 있다. 실시형태에서, 개시된 유전자 요법 구성체는 또한 단백질-핵산 복합체의 형태 또는 지질 핵산 복합체의 형태 및 이들 제제의 혼합 형태로 전달될 수도 있다. 예를 들어, 단백질-핵산 복합체는 관심 핵산을 양이온성 펩티드 예컨대 리신 및 아르기닌과의 복합체로 포함할 수 있다. 지질-핵산 복합체는 지질 에멀션, 미셀, 리포솜, 및/또는 중성 및 양이온성 지질 예컨대 DOTMA, DOSPA, DOTAP, 및 DMRIE의 혼합물을 포함할 수 있다.
실시형태에서, 치료적 벡터는 단일 구성체 또는 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 또는 적어도 5종의 상이한 구성체를 포함할 수 있다. 하나 초과의 구성체가 벡터로 존재할 때, 그 구성체는 동일할 수 있거나, 또는 그들은 상이해도 된다. 예를 들어, 구성체는 그들 프로모터, 통합 엘리먼트의 존재 또는 부재, 및/또는 그들 서열 관점에서 다양할 수 있다.
실시형태에서, 치료적 벡터는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체 중 적어도 하나의 발현을 넉다운시킬 수 있는 소형 RNA를 코딩하는 적어도 하나의 구성체를 포함하게 될 것이다. 실시형태에서, 치료적 벡터는 또한 제한없이 TNF-α, 인터페론-γ, IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, 또는 RANTES를 포함하여, 특별한 사이토카인(들) 및/또는 케모카인(들)을 코딩하게 될 것이다. 실시형태에서, 단독 구성체는 제한없이 TNF-α, 인터페론-γ, IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, 또는 RANTES를 포함하여 특별한 사이토카인 또는 케모카인 및 FDPS의 발현을 넉다운시킬 수 있는 양 소형 RNA를 코딩할 수 있다.
실시형태에서, 바이러스 벡터는 숙주 염색체에 통합되는 핵산 구성체를 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 일시적 전달 벡터를 사용하여 염색체 통합을 방지하고 유전자 요법 구성체의 수명을 제한할 수도 있다.
실시형태에서, 개시된 구성체 및 벡터는 FDPS, 제라닐 파이로포스페이트 신타제 ("GPPS"), 파르네실 트랜스퍼라제 ("F-Tase"), IDI1, 및/또는 스쿠알렌 신타제 유전자의 발현을 감소시킬 수 있거나 또는 넉다운시킬 수 있는 짧은 헤어핀 RNA ("shRNA"), micro RNA ("miRNA"), 또는 siRNA를 포함한다. 스테로이드 및 이소프레노이드 합성을 제어하는, 이들 유전자를 하향 조절시킴으로써, 이소펜테닐 파이로포스페이트 ("IPP") 수준은 상승되고/되거나 GGPP 수준은 감소된다. IPP의 상승 및 축적은 GD T 세포 활성화를 증가시키기 위한 기전이다. 또한, 이들 파이로포스페이트 신타제 유전자의 하향 조절은 인플라마솜 기능의 중요한 음성 조절인자를 제거하여 결국 결과적으로 GD T 세포 활성화 및 이펙터 세포 기능에 중요한 사이토카인의 발현을 증가시키게 된다. 암 세포 표면 상에서 BTN3A3 및 IPP의 보다 높은 세포질 수준은 잠재적으로 V감마9V델타2 T 세포 (본 명세서에서 Vγ9Vδ2 T 세포라고도 함)를 자극시킨다.
실시형태에서, 개시된 구성체는 GD T 세포 증식을 지속시키는 인터류킨-2 및/또는 인터류킨-15를 생성시킬 수 있는 특별한 프로모터에 의해 조절된다. 그러나, 본 명세서에서 언급한 바와 같이, IL-18, IL-23, 및 IL-36을 포함하는 다른 사이토카인이 역시 선택될 수 있고 사용될 수 있다. 또한, 개시된 구성체는 GD T 세포 분화 및 모든 이펙터 세포 기능의 획득에 필요한 인터류킨-1 베타 및/또는 인터류킨-18 및/또는 인터페론-감마를 생산할 수 있는 특별한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 바람직한 이펙터 세포 기능은 종양 및/또는 감염 세포의 세포독성적 세포 사멸을 유도하는 능력, 유리한 사이토카인 및/또는 케모카인의 분비, 암성 또는 세포를 인식하는데 필요한 NK 수용체의 증가된 발현, 및 GD T 세포를 암성 또는 감염된 세포 표적과 공동-국재시키기 위해 표적화 항체가 결합하는데 필요한 Fc 수용체의 증가된 발현을 포함한다.
실시형태에서, 개시된 방법은 GD T 세포를 활성화시켜서, 그 결과로 암성 세포, 종양 또는 감염 세포를 공격하여 파괴하는 NK 세포의 능력을 증가시키는 간접 효과를 일으킨다. NK 세포의 활성화는 증식 및 분화되고, NK 세포 상의 4-1BB 공자극성 수용체를 관여시키는데 요구되는 4-1BBL 공자극성 리간드를 발현하도록 자극되는 GD T 세포를 필요로 한다. 이러한 크로스토크 형태는 NK 세포의 활성화를 위한 중요한 기전으로서 알려져 있고, 개시된 방법 및 조성물의 작용을 통해 여기서 획득된다.
다른 양상에서, GD T 세포 및 NK 세포 간 크로스토크는 질환 조직 내에 축적되는 염증성 수지상 세포를 제거하기 위한 중요한 기전이다. 단독으로, GD T 세포나 NK 세포가 수지상 세포를 파괴할 수 없지만, 상기 언급된 크로스토크 상호작용이 발생되면, NK 세포는 변하여 염증성 수지상 세포에 대해 세포독성이 된다. 이러한 면역-조절 기전은 GD T 세포의 강력한 활성화 및 증식에 의존한다.
실시형태에서, GD T 세포의 활성화를 위해 개시된 방법은 아테롬성 동맥경화증을 초래하는 세포 증식을 포함할 수 있는 병적 염증 반응, 종양 성장을 자극하는 만성 면역 활성화, 건선 및 상피의 다른 외양을 포함하는 자가면역 질환, 중추 신경계의 염증성 질환, 및 관절염 및 다른 미조절된 면역 반응의 질환을 저해하는 단계를 더 포함한다.
실시형태에서, 치료적 벡터는 감마 델타 T 세포의 상승적 활성화를 획득하도록 비스포스포네이트 약제와 동시발생적으로 투여된다. 상승작용은 비스포스포네이트 약제의 교대, 변형 또는 감소 용량을 허용할 수 있고, 급성 염증 반응 및 만성 질환을 포함한 비스포스포네이트에 대한 부작용을 감소시킬 수도 있다.
실시형태에서, 치료적 벡터는 비스포스포네이트 약제와 병용하여 투여된다. 다양한 실시형태에서, 이러한 병용은 감마 델타 T 세포의 상승적이거나, 양성적이거나 또는 강화된 활성화를 획득한다. 이러한 양성적 활성화는 비스포스포네이트의 교대, 변형 또는 감소된 용량을 허용할 수 있고 급성 염증 반응 및 만성 질환을 포함하여 비스포스포네이트에 대한 부작용을 감소시킬 수도 있다. 치료적 벡터와 비스포스포네이트의 병용물은 조합 사용 또는 병용 제품에 대한 지시서가 있거나 또는 없이, 함께이거나 또는 개별적으로 존재할 수 있다. 치료적 벡터 및/또는 비스포스포네이트는 완전히 개별적으로 투여될 수 있고 완전히 별개의 약학 제형으로 제제화될 수 있다. 치료적 벡터 및/또는 비스포스포네이트는 조합 사용의 가능성에 관한 라벨 지시서가 있거나 또는 없이, 서로 독립적으로 판매될 수 있다. 이러한 지시서는 또한 패키지 비품, 예를 들어 리플렛 등으로 또는 예를 들어 의사 및 의료진에게 제공되는 다른 정보로 제공될 수 있다 (예를 들어, 구두 연락, 서면 연락 등). 이러한 라벨 또는 기타 지시서는 시간 간격 내에서 개별적으로 또는 동시에, 비스포스포네이트 약제와 독립적으로 치료적 벡터가 투여될 수도 있는 병용 투여를 위한 부분의 키트로서 비고정 병용물, 또는 하나의 단위 제형 중 고정 병용물을 의미할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 병용물은 협동 또는 공동 효과를 나타내거나, 또는 치료의 독성 또는 합병증을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 병용물의 효과는 상승적이다. 상승 효과는 함께 사용되는 활성 원료들이 개별적으로 화합물을 사용하여 얻는 효과의 총합에 비해 더 클 때 획득된다. 상승 효과는 활성 성분이 (1) 병용된, 단위 용량 제제로 동시에 공동-제제화 및 투여 또는 전달되거나; (2) 개별 제제로서 교대로 또는 동시에 전달되거나; 또는 (3) 일부 다른 용법에 의한 경우에 얻어질 수 있다. 교대 요법으로 전달될 때, 상승 효과는 화합물이 순차적으로, 예를 들어 개별 시린지로 상이한 주사를 통해서 투여되거나 또는 전달될 때 얻어질 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안, 각 활성 원료의 유효 용량은 순차적으로, 즉 연속으로 투여되는 반면, 병용 요법에서, 둘 이상의 활성 원료의 유효 용량은 본 명세서에서 상술되는 바와 같이 시기에 잠재적인 변동이 있더라도, 함께 투여된다.
본 명세서에서 병용물은 동일하거나 또는 상이한 제조사에 의해 제조 및/또는 제제화될 수 있다. 활성 원료는 (i) 의사에게 병용 생성물의 방출 전 (예를 들어, 본 개시의 화합물 및 다른 치료제를 포함하는 키트의 경우); 및 (ii) 투여 직전에 의사가 처리하여 (또는 의사의 안내 하에); (iii) 실제 환자에서, 예를 들어 본 명세서에 개시된 활성 원료의 순차적 투여 동안, 병용 요법에서 함께 할 수 있다.
실시형태에서, 각각의 병용물의 치료적 유효량은 동시에 또는 순차적으로, 그리고 임의 순서로 투여될 수 있고, 성분들은 함께 또는 개별로 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시 내용에 따라서 증식성 질환을 치료하는 방법은 (i) 렌티바이러스 입자의 일부를 형성하는 제1 작용제 예컨대 치료적 벡터의 투여 단계 및/또는 (ii) 제2 작용제 예컨대 유리형 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태의 비스포스포테이트 약제의 투여 단계를 포함할 수 있다. 작용제 (i), 및/또는 (ii)의 투여는 치료적 유효량으로, 바람직하게, 협동, 공동 유효량, 및/또는 상승적 유효량으로, 예를 들어 본 명세서에 기술된 양에 상응하는 1일 또는 간헐적 용량으로, 동시에 또는 임의 순서로 순차적일 수 있다. 병용물은 분배 또는 단일 약제 형태로 동시발생적으로 또는 요법의 과정 동안 상이한 시점에 개별적으로 투여될 수 있다. 뿐만 아니라, 용어 "투여하는"은 또한 생체내에서 그와 같은 병용 파트너로 전환되는 병용 파트너의 프로드러그의 사용을 포괄한다. 그러므로 본 개시 내용은 모든 이러한 동시 또는 교대 치료의 용법을 포용하는 것으로서 이해하며, 용어 "투여하는"은 그에 부응하여 해석된다.
실시형태에서, 작용제 (i) 및 (ii)는 임의의 약학적으로 허용가능한 방법을 사용하여, 예컨대 구강, 설하, 경구, 직장, 안구, 비경구 (정맥내, 피부내, 근육내, 피하, 복강내), 폐, 질내, 국부 투여, 국소 투여, 방혈 후 국소 투여, 점막 투여에 의해서, 아가로스 또는 젤라틴과 같은 반고체 매질 중 에어로졸을 통해서, 또는 구강 또는 코 스프레이 제제를 통해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료적 벡터 및/또는 비스포스포네이트 약제는 정맥내로 투여될 수 있다. 또한, 작용제 (i) 및 (ii)는 임의의 약학적으로 허용가능한 제형, 예컨대 고형 제형, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 액상 분산액, 겔, 에어로졸, 폐 에어로졸, 코 에어로졸, 연고, 크림, 반고체 제형, 액제, 에멀션, 및 현탁액으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 비스포스포네이트 약제는 정제로 제제화되어 경구로 투여될 수 있다.
본 개시 내용에 따른 병용 요법은 그 외에 또는 추가로, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 외과적 중재술, 또는 이들의 조합과 병용하여 특히 암 요법을 위해 투여될 수 있다. 장기간 요법은 상기 기술된 바와 같이, 다른 치료 전략의 상황에서 보조 요법으로서 동일하게 가능하다. 다른 가능한 치료는 종양 퇴행 이후에 환자의 상태를 유지하기 위한 요법이거나, 또는 심지어 예를 들어 위험성이 있는 환자에서의 화학-예방 요법이다.
GD T 세포 활성화를 위한 구성체
FDPS, GGPS1, IDI1, 및/또는 이의 기능적 변이체의 억제는 IPP 축적 및/또는 감소된 GGPP 수준을 일으킬 수 있고, 그 결과로 V델타2+ GD T 세포의 활성화, 및 GD T 세포의 활성화에서도 중요한 인터페론-감마, TNF-알파, 및 IL-18의 발현을 일으킨다. 파르네실 트랜스퍼라제 및/또는 스쿠알렌 신타제의 억제는 단백질의 감소된 프레닐화를 일으킨다. 개시된 구성체는 종양 세포 또는 감염 세포와 같은 특별한 표적 세포를 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있고, 여기서 그들은 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체의 번역을 억제할 RNA 서열 (즉, siRNA, shRNA 또는 microRNA)을 발현할 수 있을 뿐만 아니라, 세포독성 사이토카인 또는 케모카인을 코딩하고 발현할 수 있다.
본 명세서에서는 FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체의 발현을 감소시키고, 사이토카인의 발현을 증가시키며, RANTES를 포함한 케모카인의 발현을 증가시키는 구성체가 개시된다. 예를 들어, 실시형태에서, 구성체는 인터페론-감마, IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, 또는 TNF-α를 코딩할 수도 있다.
상기 열거된 것과 같은 사이토카인 및 케모카인의 발현은 종양 세포 또는 병원성 유기체가 감염된 세포의 국재적 세포독성 파괴를 일으키게 될 것이다. 따라서, 종양 세포에 의한 이러한 구성체의 발현은 그들 자신의 파괴를 보조하고, 렌티바이러스에 의해 유전자 변형되지 않은 다른 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 기전을 활성화시키는 종양 세포를 생성시킬 수 있다. GD T 세포를 활성화시키는 유전자 변형된 세포의 능력은 GD T 세포 수용체, 부티로필린 인식, 및 공통 감마 사슬 사이토카인에 대한 GD T 세포 수용체의 활성화를 포함한다. 종양 세포의 사멸은 종양 세포를 정상 세포와 구별하고 세포 사멸 과정에서 선택성을 제공하는 NK 수용체 패밀리의 구성원으로서 일반적으로 설명되는 GD T 세포 표면 수용체의 패밀리에 의존한다. 결과적으로, 적은 수의 유전자 변형 종양 세포가, 동일하거나 또는 멀리 있는 종양에서 유전자 변형 및 비변형 세포 둘 모두의 사멸을 포함하여 종양의 광범위한 파괴를 획득하도록 충분한 수의 GD T 세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 종양 세포 또는 감염 세포에 의한 이러한 구성체의 발현은 그 자신의 파괴를 보조하는 원치않는 세포를 생성시키게 될 것이다.
마찬가지로, 개시된 구성체가 종양 세포 또는 감염 세포에서 발현되면, FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체의 발현 감소가 GD T 세포의 활성화 및 GD T 세포의 종양 부위 또는 세포 감염 부위로의 동원을 일으킬 수도 있다. RANTES 발현의 증가는 의도하는 조직 위치로 GD T 세포를 더욱 유인하게 될 것이다. GD T 세포는 광범위한 범위의 상피 기원 종양을 비롯하여 많은 백혈병 및 림프종을 사멸시킬 수 있고, 높은 수준의 항-종양 사이토카인, IFNγ를 생산할 수 있기 때문에, 종양 부위로 GD T 세포의 동원은 항-종양 면역성을 유도하는 특히 효과적인 수단일 수 있다.
FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체의 감소된 발현은 shRNA, microRNA, siRNA, 또는 당분야에 공지된 다른 수단을 통해 획득할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 또는 4, 또는 이의 변이체에 따른 shRNA가 개시된 구성체 및 방법에서 사용될 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. SEQ ID NO: 64-67, 70-72, 76, 또는 이의 변이체에 따른 shRNA가 개시된 구성체 및 방법에서 사용될 수 있지만, 이 예에 제한되지는 않는다. SEQ ID NO: 68 또는 69, 또는 이의 변이체에 따른 miRNA가 개시된 구성체 및 방법에서 사용될 수 있지만, 이 예에 제한되지는 않는다. FDPS, GGPS1, IDI1, F-Tase, 스쿠알렌 신타제, 및/또는 이의 기능적 변이체의 발현을 감소시키는 RNA에 대한 코딩 영역, 및 사이토카인 및 케모카인의 코딩 영역은 동일 구성체 또는 상이한 구성체에 존재할 수도 있다.
소형 RNA를 포함한 유전자 조절 분자 또는 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 고전적인 접근법은 안정한 발현 구성체의 사용이다. 이들 구성체는 형질도입된 발현 플라스미드 (또는 이의 적어도 일부)의 숙주 세포 게놈으로의 염색체 통합, 단기간의 플라스미드 형질감염, 또는 역시 제한된 반감기를 갖는 비통합 바이러스 벡터를 기반으로 한다. 유전자 통합 부위는 일반적으로 무작위적이고, 임의의 특정 부위에 통합되는 유전자의 개수 및 비율은 종종 예측불가능하고, 유사하게, 비통합 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 또한 핵 DNA를 생성시키지만 이들 종은 일반적으로 DNA 복제 및 계속적인 유지에 필요한 서열이 결여된다. 따라서, 염색체 통합에 의존하는 구성체는 치료 간격을 초과할 수 있는 재조합 유전자의 영구적 유지를 일으킨다.
유전자 발현을 위한 안정한 발현 구성체의 대안은 일시적 발현 구성체이다. 후자의 유전자 발현 구성체의 발현은 비통합 플라스미드를 기반으로 하며, 그리하여 전형적으로 발현은 세포가 분열을 겪으면서 상실되거나 또는 플라스미드 벡터는 내생성 뉴클레아제에 의해 파괴된다.
개시된 구성체는 바람직하게 일시적으로 발현되는 에피솜 구성체이다. 에피솜 구성체는 그들이 대상체의 게놈에 영구적인 변화를 만들지 않거나, 또는 그들이 표적 세포의 염색체에 유입되지 않도록 시간 경과에 따라 분해되거나 또는 희석된다. 전형적으로 에피솜 복제 과정은 숙주 세포 복제 기구 및 바이러스 트랜스-작용 인자 둘 모두를 포함한다.
염색체 통합을 피하는 것은 생체내 유전자 전달에 대한 일정 장벽을 감소시킨다. 그러나, 통합-결핍 구성체가 배경치의 통합 빈도를 가질 수 있고, 임의의 DNA 분자가 숙주 세포와 재조합되는 희귀 상동성이 발현될 수 있지만, 이들 통합 속도는 유난히 드믈고 일반적으로 임상적으로 유의하지 않다.
따라서, 실시형태에서, 개시된 벡터는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 11주, 또는 약 12주의 기간 동안 활성 유전자 및/또는 소형 RNA 전달을 지원한다. 실시형태에서, 개시된 벡터는 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 이상의 기간 동안 활성 유전자 및/또는 소형 RNA 전달을 지원한다. 이들 시간 기간의 임의 조합, 예를 들어 1개월 및 1주, 또는 3개월 및 2주가 본 발명의 방법에서 또한 사용될 수 있다.
그러나, 실시형태에서, 구성체는 이 구성체가 대상체의 염색체에 통합되도록, 레트로바이러스 인테그라제 유전자에 의존하는 통합 엘리먼트를 포함한다. 역전위 및 전위는 이동식 유전자 엘리먼트가 염색체에 통합되거나 또는 삽입되는 기전의 추가 예이다. 플라스미드는 재조합에 의해 염색체에 통합될 수 있고, CRISPR 및 TALEN를 포함하는 유전자 편집 기술은 가이드 RNA 서열을 이용하고, 유전자 결실 또는 유전자 전환 기전을 통해 염색체 유전자좌를 변경시킨다.
구성체는 GD T 세포의 유지에 관여되는 사이토카인 (즉, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, 또는 IL-36)을 발현시키기 위한 특별한 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 구성체에 도입될 수 있는 프로모터는 제한없이 TATA-박스 프로모터, CpG-박스 프로모터, CCAAT-박스 프로모터, TTGACA-박스 프로모터, BRE-박스 프로모터, INR-박스 프로모터, AT-기반 프로모터, CG-기반 프로모터, ATCG-콤팩트 프로모터, ATCG-밸런스드 프로모터, ATCG-미들 프로모터, ATCG-less 프로모터, AT-less 프로모터, CG-less 프로모터, AT-스파이크 프로모터, 및 CG-스파이크 프로모터를 포함한다. 예를 들어, [Gagniuc Ionescu-Tirgoviste, Eukaryotic genomes may exhibit up to 10 generic classes of gene promoters, BMC GENOMICS 13:512 (2012)]을 참조한다.
치료적 벡터
구성체는 제한없이 렌티바이러스 벡터, 아데노-연합 바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스 벡터, 단백질 및/또는 지질 복합체, 리포솜, 미셀, 박테리아 생산 소포체, 진핵생물 세포 생산 소포체, 엑소솜 등을 포함하여, 기지의 형질감염 및/또는 형질도입 벡터를 통해서 전달될 수 있다.
바이러스 벡터는 개시된 방법에 유용한 세포 유형 (즉, 종양 세포 또는 골수성 세포, 또는 림프구)을 우선적으로 표적화할 수 있다. 바이러스 벡터는 특이적 바이러스 엔벨로프-숙주 세포 수용체 상호작용 및 유전자 발현을 위한 바이러스 기전 덕분에 표적 세포로 유전자를 형질도입시키는데 사용될 수 있다. 그 결과로, 바이러스 벡터는 전체 배아, 수정란, 단리된 조직 샘플, 제자리 조직 표적, 및 배양된 세포주를 포함한 많은 상이한 세포 유형으로의 유전자의 전달을 위한 비히클로서 사용되어 왔다. 세포 내에 외래 유전자를 도입시켜 발현시키는 능력은 유전자 발현의 연구, 및 세포 계통의 해석을 비롯하여, 치료 중재술 예컨대 유전자 요법, 유도 다능성 줄기 세포의 체세포 재프로그래밍, 및 다양한 유형의 면역요법에 대한 잠재성 제공에 유용하다. 파포바바이러스과 (예를 들어, 소 파필로마바이러스 또는 BPV) 또는 헤르페스바이러스과 (예를 들어, 엡슈타인 바 바이러스 또는 EBV) 또는 헤파드나바이러스과 (예를 들어, B형 간염 바이러스 또는 HBV) 또는 백시니아 바이러스 포함 폭스 벡터와 같은 바이러스 유래의 바이러스 성분들이 개시된 벡터에서 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 개시된 조성물 및 방법에 바람직한 벡터의 유형이지만, 본 개시는 렌티바이러스 벡터에 특별히 제한되지 않는다. 렌티바이러스는 숙주 세포로 유의한 양의 바이러스 핵산을 전달할 수 있는 바이러스속이다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염/형질도입시키는 고유 능력을 갖는 것을 특징으로 하고, 형질도입 이후에, 렌티바이러스는 숙주 세포의 염색체로 그들 핵산을 통합시킨다.
감염성 렌티바이러스는 병독성 단백질을 코딩하는 3개의 주요 유전자 gag, pol, 및 env, 및 tat 및 rev를 포함한 2개의 조절 유전자를 갖는다. 특별한 혈청형 및 바이러스에 의존하여, 바이러스 핵산의 조절, 합성 및/또는 프로세싱 및 다른 복제 기능에 관여하는 단백질을 코딩하는 추가의 보조 유전자가 존재할 수도 있다.
게다가, 렌티바이러스는 대략 600 nt 길이일 수 있는 긴 말단 반복부 (LTR) 영역을 함유한다. LTR은 U3, R, 및 U5 영역으로 분할될 수 있다. LTR은 인테그라제의 작용을 통해서 숙주 염색체로의 레트로바이러스 DNA의 통합을 매개할 수 있다. 대안적으로, 인테그라제 기능없이, LTR은 바이러스 핵산을 원형화시키는데 사용될 수 있다.
렌티바이러스 복제의 초기 단계에 관여되는 바이러스 단백질은 역전사효소 및 인테그라제를 포함한다. 역전사효소는 바이러스가 코딩하는 RNA-의존적 DNA 중합효소이다. 이 효소는 상보성 DNA 카피의 합성을 위한 주형으로서 바이러스 RNA 게놈을 사용한다. 또한 역전사효소는 RNA-주형의 파괴를 위해 RNaseH 활성을 갖는다. 인테그라제는 역전사효소에 의해 생성된 바이러스 cDNA 및 숙주 DNA 둘 모두에 결합된다. 인테그라제는 바이러스 게놈이 숙주 DNA에 삽입되기 전에 LTR을 프로세싱한다. Tat는 개시 및 연장을 증강시키도록 전사 동안 트랜스-활성인자로서 작용한다. rev 반응성 엘리먼트는 전사후에 작용하여, mRNA 스플라이싱 및 세포질로의 수송을 조절한다.
일반적으로, 바이러스 벡터는 당단백질을 포함하고 다양한 당단백질은 특이적 친화성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 G (VSVG) 펩티드는 골수성 세포로의 형질감염을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터는 또한 그들 쉘 펩티드에 부착되는 표적화 모이어티, 예컨대 항체를 가질 수 있다. 표적화 항체는 예를 들어 HER-2, PSA, CEA, M2-PK, 및 CA19-9와 같은 종양 상에서 과발현되는 항원에 특이적일 수 있다.
다른 바이러스 벡터 특이성이 또한 당분야에 공지되어 있으며 특정 세포 개체군을 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폭스바이러스 및 헤르페스바이러스 벡터는 마크로파지, 수지상 세포 및 상피 세포를 표적으로 하고, 홍역 바이러스 벡터는 B 세포를 표적으로 할 수 있으며, 공수병 바이러스 벡터는 신경 세포를 표적으로 할 수 있다.
렌티바이러스 벡터 시스템
렌티바이러스 비리온 (입자)은 비리온 (바이러스 입자)을 생산하는데 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터 시스템에 의해 발현된다. 프로모터에 작동적으로 연결된, 역전사 및 통합에 필요한 렌티바이러스 pol 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 적어도 하나의 벡터가 존재한다. 다른 실시형태에서, pol 단백질은 다수의 벡터에 의해 발현된다. 또한 프로모터에 작동적으로 연결된, 바이러스 캡시드의 형성에 필요한 렌티바이러스 gag 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터도 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 gag 핵산 서열은 pol 핵산 서열의 적어도 일부와 별개의 벡터에 존재한다. 다른 실시형태에서, gag 핵산은 pol 단백질을 코딩하는 모든 pol 핵산 서열과는 별개의 벡터에 존재한다.
야생형 복귀돌연변이체를 얻게 될 기회를 더욱 최소화시킨 입자를 생성시키는데 사용되는, 수많은 변형이 벡터에 가해질 수 있다. 이들은 제한없이 LTR의 U3 영역의 결실, tat 결실 및 매트릭스 (MA) 결실을 포함한다.
gag, pol 및 env 벡터(들)는 렌티바이러스 패키징 서열이라고 하는, 렌티바이러스 RNA를 포장하는 렌티바이러스 게놈 유래 뉴클레오티드를 함유하지 않는다.
입자를 형성하는 벡터(들)는 바람직하게 엔벨로프 단백질을 발현하는 렌티바이러스 게놈 유래 핵산 서열을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 프로모터에 작동적으로 연결된 엔벨로프 단백질 코딩 핵산 서열을 함유하는 별개의 벡터가 사용된다. 이러한 env 벡터는 또한 렌티바이러스 패키징 서열을 함유하지 않는다. 실시형태에서, env 핵산 서열은 렌티바이러스 엔벨로프 단백질을 코딩한다.
다른 실시형태에서, 엔벨로프 단백질은 렌티바이러스 유래가 아니라 상이한 바이러스 유래이다. 최종 입자는 위형화된 입자라고 한다. 엔벨로프의 적절한 선택에 의해서, 실제로 임의 세포를 "감염"시킬 수 있다. 예를 들어 인플루엔자 바이러스, VSV-G, 알파 바이러스 (셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스), 아레나바이러스 (림프구성 맥락수막염 바이러스), 플라비바이러스 (진드기-매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스, GB 바이러스), 라브도바이러스 (수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스), 파라믹소바이러스 (유행성이하선염 또는 홍역) 및 오르쏘믹소바이러스 (인플루엔자 바이러스)의 것과 같이, 세포내이입 구획을 표적화하는 엔벨로프 단백질을 코딩하는 env 유전자를 사용할 수 있다. 바람직하게 사용할 수 있는 다른 엔벨로프는 몰로니 백혈병 바이러스 유래의 것 예컨대 MLV-E, MLV-A 및 GALV를 포함한다. 이들 후자의 엔벨로프는 숙주 세포가 원발성 세포인 경우에 특히 바람직하다. 다른 엔벨로프 단백질은 바람직한 숙주 세포에 따라서 선택될 수 있다. 예를 들어, 특이적 수용체 예컨대 도파민 수용체의 표적화는 뇌 전달에 사용될 수 있다. 다른 표적은 혈관 내피일 수 있다. 이들 세포는 필로바이러스 엔벨로프를 사용해 표적화할 수 있다. 예를 들어, 에볼라의 GP는 전사후 변형에 의해 GP, 및 GP2 당단백질이 된다. 다른 실시형태에서, 위형 엔벨로프 (예를 들어, FIV 또는 SHIV [미국 특허 제5,654,195호])를 갖는 상이한 렌티바이러스 캡시드를 사용할 수 있다. SHIV 위형 벡터는 동물 모델 예컨대 원숭이에서 쉽게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상술하는 바와 같이, 전형적으로, 렌티바이러스 벡터 시스템은 gag, pol, 또는 rev 유전자, 또는 이의 기능적 변이체 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함한다. gag, pol 및 rev 유전자, 또는 이의 기능적 변이체 각각은 개별 플라스미드 상에 제공될 수 있거나, 또는 하나 이상의 유전자는 동일한 플라스미드 상에 함께 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, gag, pol, 및 rev 유전자는 동일한 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 2). 다른 실시형태에서, gag 및 pol 유전자는 제1 플라스미드 상에 제공되고, rev 유전자는 제2 플라스미드 상에 제공된다 (예를 들어, 도 3). 따라서, 3-벡터 및 4-벡터 시스템 둘 모두는 실시예 섹션 및 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 렌티바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 치료적 벡터, 엔벨로프 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주를 형질감염시킨다. 패키징 세포주의 비제한적인 예는 293T/17 HEK 세포주이다. 치료적 벡터, 엔벨로프 플라스미드, 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주를 형질감염시킬 때, 최종적으로 렌티바이러스 입자가 생산된다.
다른 양상에서, 렌티바이러스 입자의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 시스템이 개시된다. 시스템은 본 명세서에 기술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터; 세포의 감염에 최적화된 엔벨로프 단백질의 발현을 위한 엔벨로프 플라스미드; 및 gag, pol, 및 rev 유전자, 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하고, 여기서 렌티바이러스 벡터, 엔벨로프 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포주를 형질감염시킬 때, 렌티바이러스 입자는 패키징 세포주에 의해 생산되고, 렌티바이러스 입자는 케모카인 수용체 CCR5의 생산을 억제할 수 있거나 또는 HIV RNA 서열을 표적화할 수 있다.
다른 양상에서, 그리고 도 2에 상술된 바와 같이, 본 명세서에서 치료적 벡터라고도 하는 렌티바이러스 벡터는 하기의 엘리먼트들을 포함할 수 있다: 하이브리드 5' 긴 말단 반복부 (RSV/5' LTR) (SEQ ID NO: 5-6), Psi 서열 (RNA 패키징 부위) (SEQ ID NO: 7), RRE (Rev-반응 엘리먼트) (SEQ ID NO: 8), cPPT (폴리푸린 트랙) (SEQ ID NO: 9), H1 프로모터 (SEQ ID NO: 10), shFDPS (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4), CMV (SEQ ID NO: 19), BTN3A3 (R381H) - T2A - IL-2 (집합적으로, SEQ ID NO: 55), 우드척 전사후 조절 엘리먼트 (WPRE) (SEQ ID NO: 11), 및 3' 델타 LTR (SEQ ID NO: 12). 다른 양상에서, 치환, 결실, 첨가 또는 돌연변이에 의한 서열 변이를 사용하여 본 명세서의 서열 기준들을 변형시킬 수 있다.
다른 양상에서, 그리고 본 명세서에 상술된 바와 같이, 헬퍼 플라스미드는 다음의 엘리먼트들을 포함하도록 디자인되었다: CMV (CAG) 인핸서 (SEQ ID NO: 21); 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터 (SEQ ID NO: 13); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 22); HIV gag (SEQ ID NO: 14); HIV Pol (SEQ ID NO: 15); HIV Int (SEQ ID NO: 16); HIV RRE (SEQ ID NO: 8); HIV Rev (SEQ ID NO: 18); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23). 다른 양상에서, 헬퍼 플라스미드는 gag 및 pol 유전자의 발현을 위한 제1 헬퍼 플라스미드, 및 rev 유전자의 발현을 위한 제2 및 개별 플라스미드를 포함하도록 변형될 수 있다. 다른 양상에서, 치환, 결실, 첨가 또는 돌연변이에 의한 서열 변이를 사용하여 본 명세서의 서열 기준들을 변형시킬 수 있다.
다른 양상에서, 그리고 본 명세서에 상술한 바와 같이, 엔벨로프 플라스미드는 하기 엘리먼트들을 좌측에서 우측으로 포함하도록 디자인되었다: RNA 중합효소 II 프로모터 (CMV) (SEQ ID NO: 19) 및 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질 (VSV-G) (SEQ ID NO: 20). 다른 양상에서, 치환, 결실, 첨가 또는 돌연변이에 의한, 서열 변이를 사용하여 본 명세서의 서열 기준들을 변형시킬 수 있다.
다른 양상에서, 렌티바이러스 패키징에 사용되는 플라스미드는 유사한 엘리먼트로 변형될 수 있고 인트론 서열은 잠재적으로 벡터 기능의 손실없이 제거될 수 있다. 예를 들어, 하기의 엘리먼트들이 패키징 시스템을 포함하는 플라스미드의 유사 엘리먼트를 대체할 수 있다: 연장 인자-1 (EF-1), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 및 유비퀴틴 C (UbC) 프로모터는 CMV 또는 CAG 프로모터를 대체할 수 있다. SV40 폴리 A 및 bGH 폴리 A는 토끼 베타 글로빈 폴리 A를 대체할 수 있다. 헬퍼 플라스미드의 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 분기군으로부터 구축될 수 있다. VSV-G 당단백질은 고양이 내인성 바이러스 (RD114), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 공수병 (FUG), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV), 로스 리버 알파바이러스 (RRV), 쥐과 백혈병 바이러스 10A1 (MLV), 또는 에볼라 바이러스 (EboV) 유래의 막 당단백질로 대체될 수 있다.
특히, 렌티바이러스 패키징 시스템은 상업적으로 획득할 수 있고 (예를 들어, OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD)의 Lenti-vpak 패키징 키트), 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 디자인될 수 있다. 게다가, 렌티바이러스 입자의 생산 효율을 포함하여, 임의 수의 관련 인자들을 개선시키도록 렌티바이러스 패키징 시스템의 양상들을 대체하거나 또는 변형시키는 것은 당업자의 기술 내에 있다.
용량 및 제형
개시된 벡터는 관심 유전자 또는 서열의 단기간, 중기간 또는 장기간 발현 및 개시된 벡터의 에피솜 유지를 가능하게 한다. 따라서, 투약 용법은 치료하려는 병태 및 투여 방법을 기반으로 가변적일 수도 있다.
일 실시형태에서, 형질도입 벡터는 가변적인 용량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특히, 대상체는 약 ≥ 106 감염 용량 (1 표적 세포를 형질도입시키는데 평균 1 용량이 필요)이 투여될 수 있다. 보다 특히, 대상체는 약 ≥ 107, 약 ≥ 108, 약 ≥ 109, 또는 약 ≥1010 감염 용량, 또는 이들 값 사이의 임의수의 용량이 투여될 수 있다. 형질도입 벡터 용량의 상한치는 각 질환의 징후에 대해 결정될 것이고 각 개별 생성물 또는 생성물 로트에 대한 독성/안전성 프로파일에 따라 좌우될 것이다.
추가적으로, 본 개시 내용의 벡터는 주기적으로, 예컨대 1일 1회 또는 2회, 또는 임의의 다른 적합한 기간으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 1개월에 1회, 2개월마다, 3개월마다, 6개월, 9개월마다 1회, 1년마다, 18개월마다, 2년마다, 13개월마다, 또는 3년마다 1회로 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 개시된 벡터는 약학 조성물로서 투여된다. 실시형태에서, 개시된 벡터를 포함하는 약학 조성물은 제한없이, 임상 용도를 위한, 코, 폐, 경구, 국소, 또는 비경구 제형을 포함하여, 광범위하게 다양한 제형으로 제제화될 수 있다. 각각의 제형은 다양한 가용화제, 붕해제, 계면활성제, 충전제, 증점제, 결합제, 희석제 예컨대 습윤제 또는 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 벡터를 포함하는 약학 조성물은 또한 주사, 통기, 주입 또는 피내 노출을 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는 적합한 pH 및 등장성으로 수성 또는 비수성 용액 중에 개시된 벡터를 포함할 수 있다.
개시된 벡터는 종양 부위 또는 감염 부위에 직접 주사를 통해서 대상체에게 투여될 수 있다. 실시형태에서, 벡터는 전신으로 투여될 수 있다. 실시형태에서, 벡터는 종양 또는 감염 부위의 바로 주변 조직에 유도 캐뉼라 삽입을 통해서 투여될 수 있다.
개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 방법, 예컨대 비내, 구강, 설하, 경구, 직장, 안구, 비경구 (정맥내, 피내, 근육내, 피하, 복강내), 폐, 질내, 국부 투여, 국소 투여, 방혈 후 국소 투여, 점막 투여를 사용하거나, 반고체 매질 예컨대 아가로스 또는 젤라틴 중 에어로졸을 통해 또는 구강 또는 코 스프레이 제제를 통해 투여될 수 있다.
또한, 개시된 벡터 조성물은 임의의 약학적으로 허용가능한 제형, 예컨대 고체 제형, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 액체 분산액, 겔, 에어로졸, 폐 에어로졸, 코 에어로졸, 연고, 크림, 반고체 제형, 용액제, 에멀션 및 현탁액으로 제제화될 수 있다. 또한, 조성물은 제어 방출 제제, 지속 방출 제제, 즉시 방출 제제, 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 또한, 조성물은 경피 전달 시스템일 수 있다.
실시형태에서, 벡터를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여를 위한 고체 제형으로 제제화될 수 있고, 고체 제형은 분말, 과립, 캡슐, 정제 또는 알약일 수 있다. 실시형태에서, 고체 제형은 하나 이상의 부형제 예컨대 칼슘 카보네이트, 전분, 수크로스, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 젤라틴을 포함할 수 있다. 또한, 고체 제형은 부형제 이외에도, 윤활제 예컨대 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 경구 제형은 즉시 방출, 또는 변형 방출 형태일 수 있다. 변형 방출 제형은 제어 또는 연장 방출, 장 방출 등을 포함한다. 변형 방출 제형에 사용되는 부형제는 당업자에게 통상적으로 공지되어 있다.
추가 실시형태에서, 벡터를 포함하는 약학 조성물은 설하 또는 구강 제형으로서 제제화될 수 있다. 이러한 제형은 볼과 잇몸 사이에 위치되는 구강 정제 및 혀 아래에 투여되는 설하 정제 또는 용액 조성물을 포함한다.
실시형태에서, 벡터를 포함하는 약학 조성물은 코 제형으로서 제제화될 수 있다. 본 발명의 이러한 제형은 코 전달을 위한 용액, 현탁액 및 겔 조성물을 포함한다.
실시형태에서, 벡터를 포함하는 약학 조성물은 경구 투여를 위한 액상 제형, 예컨대 현탁액, 에멀션 또는 시럽으로 제제화될 수 있다. 실시형태에서, 액상 제형은 통용되는 단순 희석제 예컨대 물 및 액상 파라핀 이외에도, 다양한 부형제 예컨대 보습제, 감미제, 방향제 또는 보존제를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 벡터를 포함하는 조성물은 소아 환자에게 투여에 적합하도록 제제화될 수 있다.
실시형태에서, 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제형, 예컨대 멸균 수성 용액, 현탁액, 에멀션, 비수성 용액 또는 좌제로 제제화될 수 있다. 실시형태에서, 용액 또는 현탁액은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브유 또는 주사용 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트를 포함할 수 있다.
약학 조성물의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여 시간 및 방식, 배출 속도, 및 질환의 중증도에 따라서 가변적일 수 있다.
실시형태에서, 암의 치료는 바늘, 또는 혈관내 캐뉼라 삽입을 사용하여, 종양으로 개시된 벡터 구성체의 유도 직접 주사를 통해 수행된다. 실시형태에서, 개시된 벡터는 뇌척수액, 혈액 또는 림프 순환계로 정맥 또는 동맥 캐뉼라 삽입 또는 주사, 피내 전달, 근육내 전달 또는 질환 부위 근처 배액 장기로의 주사로 투여된다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 기술된 특별한 상태 또는 상세 설명에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 참조된 모든 출판물은 특별히 참조로 편입된다.
실시예
실시예 1 - 렌티바이러스 벡터 시스템의 개발.
렌티바이러스 벡터 시스템은 도 2 및 3 (원형 형태로 도시)에 요약된 대로 개발되었다. 렌티바이러스 입자는 치료적 벡터, 엔벨로프 플라스미드, 및 헬퍼 플라스미드에 의한 형질감염 이후에 293T/17 HEK 세포 (American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구매)에서 생산되었다. 기능적 바이러스 입자를 생산한, 293T/17 HEK 세포의 형질감염은 플라스미드 DNA 흡수의 효율을 증가시키기 위해 시약 폴리(에틸렌이민) (PEI)을 이용하였다. 플라스미드 및 DNA는 초기에 3:1의 비율 (PEI 대 DNA의 질량비)로 혈청없는 배양 배지 중에서 개별적으로 첨가되었다. 2일 내지 3일 후에, 세포 배지를 채취하였고 렌티바이러스 입자는 고속 원심분리 및/또는 여과후 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 렌티바이러스 입자의 농도는 형질도입 유닛/mL (TU/mL)으로 표시될 수 있다. TU의 결정은 배양액에서 HIV p24 수준을 측정 (p24 단백질이 렌티바이러스 입자로 도입됨)하거나, 정량적 PCR에 의해 세포 당 바이러스 DNA 카피수를 측정하거나, 또는 세포를 감염시키고 빛을 사용하여 (벡터가 루시퍼라제 또는 형광성 단백질 마커를 코딩하는 경우) 수행되었다.
상기에 언급된 바와 같이, 3-벡터 시스템 (즉, 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템)이 렌티바이러스 입자의 생산을 위해 디자인되었다. 3-벡터 시스템의 개략도는 도 2에 도시되어 있다. 간략하게, 도 2를 참조하면, 맨위의 벡터는 헬퍼 플라스미드이고, 이 경우에, Rev를 포함한다. 도 2의 중간에 도시된 벡터는 엔벨로프 플라스미드이다. 맨 아래 벡터는 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료적 벡터이다.
더 특별하게 도 2를 참조하면, 헬퍼 플러스 Rev 플라스미드는 CMV (CAG) 인핸서 (SEQ ID NO: 21); 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터 (SEQ ID NO: 13); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 22); HIV gag (SEQ ID NO: 14); HIV Pol (SEQ ID NO: 15); HIV Int (SEQ ID NO: 16); HIV RRE (SEQ ID NO: 8); HIV Rev (SEQ ID NO: 18); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23)를 포함한다.
엔벨로프 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 19); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 24); VSV-G (SEQ ID NO: 20); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 25)를 포함한다.
헬퍼 (플러스 Rev) 및 엔벨로프 플라스미드를 포함한 2-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템의 합성.
재료 및 방법:
헬퍼 플라스미드의 구축: 헬퍼 플라스미드는 Gag, Pol, 및 인테그라제 유전자를 함유하는 pNL4-3 HIV 플라스미드 (NIH Aids Reagent Program)로부터 DNA 단편의 초기 PCR 증폭을 통해서 구축하였다. 프라이머는 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)의 동일 부위에 삽입시키는데 사용할 수 있는 EcoRI 및 NotI 제한효소 부위를 갖는 단편을 증폭하도록 디자인되었다. 전방향 프라이머는 (5'-TAAGCAGAATTCATGAATTTGCCAGGAAGAT-3') (SEQ ID NO: 26)이었고 역방향 프라이머는 (5'-CCATACAATGAATGGACACTAGGCGGCCGCACGAAT-3') (SEQ ID NO: 27)이었다.
Gag, Pol, 인테그라제 단편의 서열은 하기와 같다:
Figure pct00008
Figure pct00009
다음으로, Rev, RRE, 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하고 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위가 측접된 DNA 단편은 Eurofins Genomics를 통해서 합성하였다. 이어서, DNA 단편은 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위에서 플라스미드로 삽입되었다. DNA 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00010
마지막으로, pCDNA3.1의 CMV 프로모터는 닭 베타 액틴 인트론 서열이 더해진 CAG 인핸서/프로모터로 대체되었다. CAG 인핸서/프로모터/인트론 서열을 함유하고 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위가 측접된 DNA 단편은 Eurofins Genomics를 통해서 합성하였다. 다음으로 DNA 단편은 MluI 및 EcoRI 제한효소 부위에서 플라스미드로 삽입되었다. DNA 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00011
VSV-G 엔벨로프 플라스미드의 구축:
수포성 구내염 인디아나 바이러스 당단백질 (VSV-G) 서열은 EcoRI 제한효소 부위를 측접시켜서 Eurofins Genomics를 통해 합성하였다. 그 다음으로 DNA 단편은 EcoRI 제한효소 부위에서 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)로 삽입시켰고 올바른 배향은 CMV 특이적 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 통해 결정하였다. DNA 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00012
4-벡터 시스템 (즉, 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템)을 또한 디자인하여 본 명세서에 기술된 방법 및 재료를 사용해 생산하였다. 4-벡터 시스템의 개략도는 도 3에 도시되어 있다. 간략하게, 도 3을 참조하면, 맨위 벡터는 헬퍼 플라스미드로서, 이 경우에, Rev는 포함하지 않는다. 위에서 2번째 벡터는 별개의 Rev 플라스미드이다. 아래에서 2번째 벡터는 엔벨로프 플라스미드이다. 맨 아래 벡터는 이전에 기술된 치료적 벡터이다.
부분적으로, 도 3을 참조하면, 헬퍼 플라스미드는 CMV (CAG) 인핸서 (SEQ ID NO: 21); 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터 (SEQ ID NO: 13); 닭 베타 액틴 인트론 (SEQ ID NO: 22); HIV gag (SEQ ID NO: 14); HIV Pol (SEQ ID NO: 15); HIV Int (SEQ ID NO: 16); HIV RRE (SEQ ID NO: 8); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23)를 포함한다.
Rev 플라스미드는 RSV 프로모터 및 HIV Rev (SEQ ID NO: 33); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23)를 포함한다.
엔벨로프 플라스미드는 CMV 프로모터 (SEQ ID NO: 19); 베타 글로빈 인트론 (SEQ ID NO: 24); VSV-G (SEQ ID NO: 20); 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23)를 포함한다.
헬퍼, Rev, 및 엔벨로프 플라스미드를 포함하는 3-벡터 렌티바이러스 패키징 시스템의 합성.
재료 및 방법:
Rev 부재의 헬퍼 플라스미드의 구축:
Rev 부재의 헬퍼 플라스미드는 RRE 및 토끼 베타 글로빈 폴리 A 서열을 함유하는 DNA 단편을 삽입하여 구축하였다. 이러한 서열은 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위를 측접시켜 Eurofins Genomics를 통해서 합성하였다. 그 다음으로 RRE/토끼 폴리 A 베타 글로빈 서열은 XbaI 및 XmaI 제한효소 부위에서 헬퍼 플라스미드로 삽입되었다. DNA 서열은 하기와 같다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Rev 플라스미드의 구축:
RSV 프로모터 및 HIV Rev 서열은 MfeI 및 XbaI 제한효소 부위를 측접시켜서 Eurofins Genomics를 통해 단일 DNA 단편으로서 합성하였다. 다음으로 DNA 단편은 CMV 프로모터가 RSV 프로모터로 교체된 pCDNA3.1 플라스미드 (Invitrogen)로 MfeI 및 XbaI 제한효소 부위에서 삽입시켰다. DNA 서열은 다음과 같았다:
Figure pct00015
Figure pct00016
2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템을 위한 플라스미드는 유사한 엘리먼트로 변형시킬 수 있었고 인트론 서열은 벡터 기능의 손실없이 잠재적으로 제거시킬 수 있었다. 예를 들어, 하기의 엘리먼트가 2-벡터 및 3-벡터 패키징 시스템의 유사한 엘리먼트를 대체할 수 있었다:
프로모터: 연장 인자-1 (EF-1) (SEQ ID NO: 34), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) (SEQ ID NO: 35), 및 유비퀴틴 C (UbC) (SEQ ID NO: 36)는 CMV (SEQ ID NO: 19) 또는 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터 (SEQ ID NO: 13)를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더욱 가변적일 수 있다.
폴리 A 서열: SV40 폴리 A (SEQ ID NO: 37) 및 bGH 폴리 A (SEQ ID NO: 38)는 토끼 베타 글로빈 폴리 A (SEQ ID NO: 23)를 대체할 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더욱 가변적일 수 있다.
HIV Gag, Pol, 및 인테그라제 서열: 헬퍼 플라스미드의 HIV 서열은 상이한 HIV 균주 또는 분기군으로부터 구축할 수 있다. 예를 들어, Bal 균주 유래의 HIV Gag (SEQ ID NO: 14); HIV Pol (SEQ ID NO: 15); 및 HIV Int (SEQ ID NO: 16)는 본 명세서에 약술된 바와 같은 헬퍼/헬퍼 플러스 Rev 플라스미드에 함유된 gag, pol 및 int 서열과 상호교환될 수 있다. 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더욱 가변적일 수 있다.
엔벨로프: VSV-G 당단백질은 고양이 내인성 바이러스 (RD114) (SEQ ID NO: 39), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV) (SEQ ID NO: 40), 공수병 (FUG) (SEQ ID NO: 41), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV) (SEQ ID NO: 42), 인플루엔자 A 조류 흑사병 바이러스 (FPV) (SEQ ID NO: 43), 로스 리버 알파바이러스 (RRV) (SEQ ID NO: 44), 쥐과 백혈병 바이러스 10A1 (MLV) (SEQ ID NO: 45), 또는 에볼라 바이러스 (EboV) (SEQ ID NO: 46) 유래의 막 당단백질로 대체될 수 있다. 이들 엔벨로프의 서열은 본 명세서의 서열 부분에서 확인한다. 더 나아가서, 이들 서열은 또한 첨가, 치환, 결실 또는 돌연변이에 의해 더욱 가변적일 수 있다.
요약하면, 3-벡터 대 4-벡터 시스템은 다음과 같이, 부분적으로, 비교할 수 있고 대조할 수 있다. 3-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 인테그라제, 및 Rev/Tat; 2. 엔벨로프 플라스미드: VSV-G/FUG 엔벨로프; 및 3. 치료적 벡터: RSV, 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, H1, shFDPS, CMV, BTN3A3 (R381H) T2A IL-2, WPRE, 및 3'δ LTR을 함유한다. 4-벡터 렌티바이러스 벡터 시스템은 1. 헬퍼 플라스미드: HIV Gag, Pol, 및 인테그라제; 2. Rev 플라스미드: Rev; 3. 엔벨로프 플라스미드: VSV-G/FUG 엔벨로프; 및 4. 치료적 벡터: RSV, 5'LTR, Psi 패키징 신호, RRE, cPPT, H1, shFDPS, CMV, BTN3A3 (R381H) T2A IL-2, WPRE, 및 3'δ LTR을 함유한다. 상기 엘리먼트와 서열 대응도는 본 명세서의 서열 목록 부분에서 확인한다.
실시예 2 - FDPS를 억제하는 렌티바이러스 벡터의 개발.
이 실시예의 목적은 LV-shFDPS라고도 본 명세서에서 언급되는 FDPS-억제 렌티바이러스 벡터를 개발하는 것이었다.
억제성 RNA 디자인: 호모 사피언스 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS) (NM_002004.3) mRNA의 서열은 인간 세포에서 FDPS 수준을 넉다운시키기 위한 잠재적 siRNA 또는 shRNA 후보를 검색하는데 사용하였다. 잠재적 RNA 간섭 서열은 Broad Institute (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/)가 관리하는 GPP 웹 포탈의 siRNA 또는 shRNA 디자인 프로그램 또는 Thermo Scientific (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)의 BLOCK-iT RNAi Designer를 통해 확인하였다. 개별 선택된 shRNA 서열은 shRNA 발현을 조절하기 위해서 RNA 중합효소 III 프로모터 예컨대 H1 (SEQ ID NO: 10), U6 (SEQ ID NO: 47), 또는 7SK (SEQ ID NO: 48)의 바로 3'에서 렌티바이러스 벡터로 삽입되었다. 이들 렌티바이러스 shRNA 구성체는 세포를 형질도입시키고 특별한 mRNA 수준의 변화를 측정하는데 사용되었다. mRNA 수준 감소에 가장 강력한 shRNA는 개별적으로 microRNA 골격 내에 내포시켜서 EF-1알파 또는 CMV RNA 중합효소 II 프로모터에 의한 발현을 가능하게 하였다. microRNA 골격은 mirbase.org에서 선택하였다. RNA 서열은 또한 합성 siRNA 올리고뉴클레오티드로서 합성하였고 렌티바이러스 벡터를 사용하지 않고 세포에 직접 도입시켰다.
렌티바이러스 벡터 구축: FDPS shRNA의 경우에, BamHI 및 EcoRI 제한효소 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열은 Eurofins Genomics를 통해서 합성하였다. 중복 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 혼합하였고 70℃에서 실온으로 냉각 동안 어닐링시켰다. 렌티바이러스 벡터는 제한 효소 BamHI 및 EcoRI를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 분해시켰다. 분해된 렌티바이러스 벡터는 아가로스 겔 전기영동을 통해서 정제하였고 Thermo Scientific의 DNA 겔 추출 키트를 사용해 겔로부터 추출하였다. DNA 농도를 결정하였고, 벡터와 올리고 (3:1 비율)를 혼합하였고, 어닐링 및 결찰되게 하였다. 결찰 반응은 T4 DNA 리가제를 사용하여 30분 동안 실온에서 수행하였다. 2.5 마이크로리터의 결찰 믹스를 25 마이크로리터의 STBL3 컴피턴트 박테리아 세포에 첨가하였다. 형질전환은 42℃에서 열-충격 후에 획득하였다. 박테리아 세포는 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 스프레딩하였고 약제-내성 콜로니 (암피실린-내성 플라스미드의 존재를 의미)는 LB 액체 배지에서 회수하여 확장시켰다. 올리고 서열의 삽입을 검토하기 위해서, 플라스미드 DNA는 Thermo Scientific DNA 미니 프렙 키트를 사용하여 회수된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 렌티바이러스 벡터에 shRNA 서열의 삽입은 shRNA 발현을 조절하기 위해 사용된 프로모터에 특이적인 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. 하기 표적 서열을 사용하여, FDPS를 넉다운시키기 위한 예시적인 shRNA 서열을 결정하였다:
Figure pct00017
임의의 전술한 내용을 제한하지 않고, 치료적 벡터 (본 명세서에서 또한 렌티바이러스 플라스미드라고 함)는 도 2-4에 상술된 바와 같이 구축될 수 있다. 계속하여 도 4 를 참조한다:
벡터 1은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; CMV 서열; BTN3A1 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 2는 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; CMV 서열; BTN3A3 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 3은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; CMV 서열; BTN3A3 (R381H) 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 4는 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; BTN3A1 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 5는 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; BTN3A3 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 6은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; BTN3A3 (R381H) 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 7은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; AFP 서열; BTN3A3 (R381H) 서열, WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 8은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; IL-2 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 9는 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; IL-15 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 10은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; IL-18 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
벡터 11은 좌측에서 우측으로, 5' LTR 서열; Psi 서열; RRE 서열; H1 서열; shFDPS 서열; CMV 서열; BTN3A3 (R381H) 서열; T2A 서열; IL-2 서열; WPRE 서열; 및 3' LTR 서열을 포함한다.
실시예 3 - PC3 전립선 암종 세포에서 BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (WT)의 발현
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (WT)에 의한 PC3 세포 중 BTN3A3 (R381H) 또는 BTN3A3 (WT)의 발현이 도 5에 도시된 바와 같이 GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극한다는 것을 예시한다.
PC3 세포를 LV-벡터, LV-BTN3A3 (R381H), 또는 LV-BTN3A3 (WT)로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2와 공배양되었다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포를 유세포측정을 통해서 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 윗쪽 우측 사분면에서 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 0.37%, BTN3A3 (R381H)의 경우 26.7%, 그리고 LV-BTN3A3 (WT)의 경우 0.44%였다. 졸레드론산 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 8.91%, BTN3A3 (R381H)의 경우 35.2%, 및 LV-BTN3A3 (WT)의 경우 8.76%였다.
실시예 4 - HepG2 간 암종 세포에서 shRNA #4에 의한 FDPS의 넉다운 및 BTN3A3 (R381H)의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 BTN3A3 (R381H) 및 FDPS shRNA #4에 의한 BTN3A3 (R381H)의 발현 및 FDPS 넉다운 세포가 도 6에 도시된 바와 같이, GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극한다는 것을 예시한다.
HepG2 세포를 LV-벡터, LV-BTN3A3 (R381H), 또는 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 HepG2 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2와 공배양하였다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포를 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 0.6%, BTN3A3 (R381H)의 경우 9.5%, 및 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)의 조합 경우 13.2%였다. 졸레드론산 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 7.2%, BTN3A3 (R381H)의 경우 17.8%, 및 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)의 조합 경우 30.1%였다.
실시예 5 - PC3 전립선 암종 세포에서 shRNA #4에 의한 FDPS의 넉다운 및 BTN3A3 (R381H)의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 BTN3A3 (R381H) 및 FDPS shRNA #4에 의한 BTN3A3 (R381H)의 발현 및 FDPS 넉다운 세포가 도 7에 도시된 바와 같이, GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포는 LV-벡터, LV-BTN3A3 (R381H), 또는 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2와 공배양하였다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 0.1%, BTN3A3 (R381H)의 경우 21.1%, 및 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)의 조합 경우 18.2%였다. 졸레드론산 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 13.6%, BTN3A3 (R381H)의 경우 25.5%, 및 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)의 조합 경우 39.6%였다.
실시예 6 - HepG2 간 암종 세포에서 shRNA #4에 의한 FDPS의 넉다운 및 IL-2의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 IL-2 및 FDPS shRNA #4에 의한 IL-2의 발현 및 FDPS 넉다운 세포가 도 8에 도시된 바와 같이, GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
HepG2 세포는 LV-shFDPS 또는 LV-shFDPS-IL-2로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 HepG2 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2 존재 또는 부재로 공배양하였다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포를 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 윗쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 단독 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-shFDPS의 경우 7.5%이고, LV-shFDPS-IL-2의 경우 20.1%였다. 졸레드론산 및 IL-2 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-shFDPS의 경우 27.8%였고 LV-shFDPS-IL-2의 경우 24.7%였다.
실시예 7 - PC3 암종 세포에서 shRNA #4에 의한 FDPS의 넉다운 및 IL-2의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 IL-2 및 FDPS shRNA #4에 의한 IL-2의 발현 및 FDPS 넉다운 세포가 도 9에 도시된 바와 같이 GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포를 LV-shFDPS 또는 LV-shFDPS-IL-2로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2의 존재 또는 부재로 공배양하였다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포를 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 단독 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-shFDPS의 경우 24.6%였고, LV-shFDPS-IL-2의 경우 46.8%였다. 졸레드론산 및 IL-2 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-shFDPS의 경우 48.6%였고 LV-shFDPS-IL-2의 경우 41%였다.
실시예 8 - PC3 암종 세포에서 shRNA #4에 의한 FDPS의 넉다운 및 IL-15의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 IL-15 및 FDPS shRNA #4에 의한 IL-15의 발현 및 FDPS 넉다운 세포가 도 10에 도시된 바와 같이 GD T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포를 LV-벡터, LV-shFDPS, 또는 LV-shFDPS-IL-15로 형질도입시켰다. 형질도입 후 3일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포 및 IL-2 존재 또는 부재로 공배양하였다. PBMC 세포는 졸레드론산 및 IL-2으로 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 선택하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 단독 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 10%였고, LV-shFDPS의 경우 13%였고, LV-shFDPS-IL-15의 경우 14.6%였다. 졸레드론산 및 IL-2 존재 하에서, TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포의 백분율은 LV-벡터의 경우 14.5%였고, LV-shFDPS의 경우 21.7%였고, LV-shFDPS-IL-15의 경우 21%였다.
실시예 9 - PC3 및 HepG2 암종 세포에서 LV-BTN3A3 (R381H) 및 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)에 의한 BTN3A3의 발현.
이 실시예는 렌티바이러스 (LV)-발현 BTN3A3 (R381H) 단독 및 shFDPS 존재가 도 11에 도시된 바와 같이 PC3 및 HepG2 암종 세포에서 BTN3A3 발현을 증가시킨다는 것을 예시한다.
PC3 전립선 또는 HepG2 간 암종 세포를 도 11A 및 11B에 도시된 바와 같이, 3일 동안 LV-벡터 또는 LV-BTN3A3 (R381H)으로 형질도입시켰다. 형광단-접합된 항 BTN3A3 (CD277) 항체를 사용하여 BTN3A3에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 각각 PC3 및 HepG2 세포에서 6에서 21 및 3에서 10으로 평균 형광 강도 (MFI)의 증가가 존재하였다. HepG2 간 암종 세포는 도 11C에 도시된 바와 같이, 3일 동안 LV-벡터 또는 LV-shFDPS-BTN3A3 (R381H)으로 형질도입시켰다. 평균 형광 강도 (MFI)가 4에서 18로 증가되었다.
실시예 10 - Lv-shFDPS 형질도입된 세포 및 졸레드론산에 의한 세포독성 Vγ2Vδ2 세포의 자극.
이 실시예는 세포독성 Vγ2Vδ2 세포의 활성화가 도 12에 도시된 바와 같이 shFDPS (LV-shFDPS) 발현 렌티바이러스 및 졸레드론산의 처리에 의해 증가된다는 것을 예시한다.
HepG2 간 암종 세포는 Lv-shFDPS, Lv-FDPS-IL-15 (shRNAFDPS 및 인간 사이토카인 인터류킨 15 둘 모두를 발현) 또는 Lv-대조군으로 형질도입시켰고 72시간 동안 배양시켰다. 졸레드론산 (1 μM)을 (1) Lv-shFDPS 형질도입 세포, (2) Lv-FDPS-IL-15 형질도입 세포, 및 (3) Lv-대조군 형질도입 HepG2 세포에 첨가하였다. 처리된 세포는 24시간 동안 배양하였다. Lv-shFDPS 형질도입된 세포, Lv-FDPS-IL-15 형질도입된 세포, 및 Lv-대조군 형질도입된 세포는 4시간 동안 단백질 수송 억제제 (BD GolgiStop)를 더하여 Vγ9Vδ2 세포로 농축된 PBMC와 공배양하였다. 4시간의 자극 후에, 세포를 수집하였고 Vδ2 파이코에리쓰린 (PE) 및 TNFα알로파이코시아닌 (APC)으로 표지시켰으며, 표지된 세포는 유세포측정으로 분석하였다.
결과는 1 μM 졸레드론산의 존재 하에서, 반응하는 Vγ9Vδ2 T 세포 (세포내 사이토카인 염색으로 측정된 TNF-α 발현)의 빈도가 Lv-대조군에 비해서 Lv-FDPS에서 더 높았고, Lv-FDPS-IL-15에 의해 더욱 증가되었다는 것을 보여주었다. 100 유닛/mL의 인터류킨-2 (IL-2)의 첨가는 Lv-대조군에 비해 Lv-FDPS가 형질도입된 HepG2 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 증가시켰지만, IL-2가 IL-15를 대체하고, Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화를 위한 Lv-FDPS 및 Lv-FDPS-IL-15 처리된 HepG2 간의 편차는 감소되었다.
실시예 11 - 마우스에서 Lv-대조군 형질도입 대비 Lv-shFDPS 형질도입된 PC3 종양의 성장 그래프.
이 실시예는 마우스에서 인간 전립선암 (PC3) 세포 종양 성장 속도가 도 13에 도시된 바와 같이 Lv-shFDPS의 처리 후에 둔화된다는 것을 예시한다.
NSG™ 마우스는 Lv-shFDPS 또는 Lv-대조군 중 하나가 형질도입된 3백만개 PC3 세포 및 Matrigel®을 피하 주사하였다. 종양은 1주에 2회 모니터링하고 측정하였다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용해 각 종양의 수직 직경을 측정하여 결정하였다. 종양 부피 (㎣)는 다음의 식으로 계산하였다: d2 x (D/2) [여기서 d = 최단 직경이고, D = 최장 직경임].
Lv-shFDPS로 처리 및/또는 형질도입된 이종이식 PC3 종양은 Lv-대조군 처리 및/또는 형질도입된 이종이식 PC3 종양의 성장에 비해서 더 느린 성장을 보였다. 예를 들어, Lv-대조군 이종이식 PC3 종양은 300 ㎣ 까지 성장하는데 21일이 걸렸지만, Lv-shFDPS 이종이식 PC3 종양은 300 ㎣ 까지 성장하는데 30일이 걸렸다.
실시예 12 - Vγ9Vδ2 T 세포 및/또는 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리시 Lv-FDPS 또는 Lv-대조군 형질도입된 PC3 종양이 이종이식된 마우스의 종양 성장 및 생존.
이 실시예는 Lv-shFDPS가 형질도입된 이종이식 PC3 종양의 처리 및 후속하여 Vγ9Vδ2 T 세포의 처리가 졸레드론산 처리 존재 또는 부재 하에서, 종양 성장을 둔화시키고 생존을 증가시킨다는 것을 예시한다.
NSG™ 마우스는 Lv-shFDPS (FDPS 넉다운 또는 "FDPS KD"로서 도 14 및 15에 언급) 또는 Lv-대조군 ("Lv" 또는 "대조군"으로 도 14 및 15에 언급) 중 하나가 형질도입된 3백만개 PC3 세포 및 Matrigel®을 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양은 종양 크기가 약 300 ㎣에 도달할 때까지 모니터링하고 측정되었다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 각 종양의 수직 직경을 측정하여 결정되었다. 종양 부피 (㎣)는 다음의 식으로 계산하였다: d2 x (D/2) [d = 최단 직경이고, D = 최장 직경임].
초래된 종양이 300 ㎣의 크기에 도달했을 때, 마우스를 임의 추출하여 8개 그룹: Lv-shFDPS-형질도입된 마우스의 4개 그룹 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스의 4개 그룹으로 분류하였다. Lv-shFDPS-형질도입된 마우스 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스 각각으로부터 1개 그룹을 4주 동안 1주 당 1회 PBMC의 복강내 주사로 처리하였다. Lv-shFDPS-형질도입된 마우스 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스 각각으로부터 1개 그룹은 100 μg/kg의 졸레드론산으로 처리하였다. Lv-shFDPS-형질도입된 마우스 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스 각각으로부터의 1개 그룹은 PBMC 및 졸레드론산의 병용물로 처리하였다. Lv-shFDPS-형질도입된 마우스 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스 각각으로부터 1개 그룹은 4주 동안 1주 당 1회 PBS의 복강내 주사로 처리하였다 (대조군). 마우스 생존은 95일 또는 종양 크기가 2000 ㎣ 에 도달했을 때 중 더 짧은 동안 관찰하였다. 종양은 연구 종료시에 절제하고 관찰하였다.
도 14에 도시된 바와 같이, 카플란 메이어 생존 그래프는 Lv-대조군 PC3 이종이식 (스크램블) 마우스와 비교하여 Lv-shFDPS PC3 이종이식 마우스에 의해 획득된 유의한 생존 장점을 보여주었다. PBMC (이들 중 많은 것이 Vγ9Vδ2 세포였음)가 처리된 Lv-shFDPS 이종이식 마우스의 생존률은 PBMC 미처리된 Lv-shFDPS 이종이식 마우스의 생존률에 비해 더 컸다. Lv-대조군 PC3 이종이식 마우스의 PBMC 처리는 실질적으로 생존에 영향을 미치지 않았다.
도 15에 도시된 바와 같이, Lv-shFDPS 이종이식 PC3 종양의 전체 관찰은 Lv-대조군 이종이식 PC3 종양의 것과 비교하여 더 작은 종양 부피를 보여주었다. PBMC (이들 중 많은 것이 Vγ9Vδ2 세포였음) 처리된 Lv-shFDPS 이종이식 PC3 종양의 종양 부피는 PBMC 미처리된 Lv-shFDPS PC3 종양의 종양 부피와 비교하여 많이 감소되었다. PBMC 처리 또는 미처리된 Lv-대조군 이종이식 마우스 간에 유의한 편차는 관찰되지 않았고, 이들 그룹의 구성원들은 종양이 2000 ㎣의 크기에 도달했을 때 희생시켰다. 100 μg/kg의 졸레드론산으로의 Lv-shFDPS-형질도입된 마우스 및 Lv-대조군-형질도입된 마우스의 처리는 종양 크기 또는 생존에 분명한 효과를 보이지 않았다.
도 16에 도시된 바와 같이, Lv-shFDPS 이종이식 PC3 종양의 외관의 전체 관찰은 PBMC 처리된 종양의 부피가 PBMC 미처리된 Lv-shFDPS PC3 종양의 것과 비교하여 많이 감소되었다는 것을 보여주었다. PBMC로 처리된 일부 Lv-shFDPS PC3 종양은 측정불가한 종양을 보였다.
실시예 13 - FDPS , GGPS1 , 및 IDI1을 억제하는 렌티바이러스 벡터의 개발
이 실시예는 도 17에 도시된 바와 같이, FDPS, GGPS1, 및 IDI1을 억제하는 렌티바이러스 벡터의 개발을 예시한다.
shRNA 서열의 클로닝: 잠재적 RNA 간섭 서열은 Broad institute의 shRNA 디자인 프로그램 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/seq/search) 또는 Thermo Scientific의 BLOCK-iT RNAi Designer (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)를 사용해 확인하였다. BamHI 및 EcoRI 제한효소 부위를 함유하는 짧은-헤어핀 올리고뉴클레오티드 서열 또는 BsrGI 및 EcoRI 제한효소 부위를 함유하는 microRNA 서열은 Eurofins Genomics를 통해서 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 70℃에서 인큐베이션한 다음 실온으로 1시간 동안 냉각시킴으로써 어닐링시켰다. 동시에, 렌티바이러스는 제한 효소 BamHI 및 EcoRI 또는 BsrGI 및 EcoRI으로 1시간 동안 37℃에서 분해하였다. 분해된 렌티바이러스 벡터는 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제하고 DNA 겔 추출 키트 (Thermo Scientific)를 사용해 겔로부터 추출하였다. DNA 농도를 각각에 대해 결정하였고 50 ng의 벡터를 2 마이크로리터의 어닐링된 올리고에 첨가하였다. 결찰 반응은 T4 DNA 리가제를 사용하여 30분 동안 실온에서 수행하였다. 2.5 마이크로리터의 결찰 믹스를 25 마이크로리터의 StbI3 컴피턴트 박테리아 세포에 첨가하였다. 형질전환은 42℃에서 열-충격 단계를 통해 수행하였다. 박테리아 세포를 암피실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 스트리킹하였고 선택된 콜로니는 LB 액체 배지에서 확장시켰다. 올리고 서열의 삽입을 검토하기 위해서 플라스미드 DNA는 DNA 미니 프렙 키트 (Thermo Scientific)를 사용해 회수된 박테리아 배양물로부터 추출하였다. 렌티바이러스 벡터에 shRNA 서열의 삽입은 H1 또는 EF-1 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱으로 검증하였다. 올바른 shRNA 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터는 mRNA를 넉다운시키는 그들 능력을 시험하기 위해 렌티바이러스 입자를 패키징하는데 사용하였다. 세포를 렌티바이러스 입자로 형질도입시켰고 3일 후에 채취하였고 단백질 및 mRNA 둘 모두를 분석하였다.
FDPS shRNA 서열의 확인. 호모 사피엔스 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS) (NM_002004.3) mRNA의 서열을 사용하여 인간 세포에서 FDPS 수준을 감소시키기 위한 잠재적인 shRNA 후보를 검색하였다. 상기 기술된 바와 같은, FDPS shRNA 서열 #1-4 이외에도, 하기의 예시적인 shRNA 및 microRNA 서열들이 FDPS를 넉다운시키는 것으로 결정되었다:
Figure pct00018
GGPS1 shRNA 서열의 확인. 호모 사피엔스 제라닐제라닐 파이로포스페이트 신타제 (GGPS1) (NM_001037277.1) mRNA의 서열을 사용하여 인간 세포에서 GGPS1를 감소시키기 위한 잠재적인 shRNA 후보를 검색하였다. 하기의 표적 서열을 사용하여, 예시적인 shRNA 서열들이 GGPS1을 넉다운시키는 것으로 결정되었다:
Figure pct00019
IDI1 shRNA 서열의 확인. 호모 사피엔스 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제 1 (IDI1) (NM_004508.3) mRNA의 서열을 사용하여 인간 세포에서 IDI1 수준을 감소시키기 위한 잠재적인 shRNA 후보를 검색하였다. 하기의 표적 서열을 사용하여, 예시적인 shRNA 서열이 IDI1을 넉다운시키는 것으로 결정되었다:
Figure pct00020
실시예 14 - shFDPS 발현 렌티바이러스가 형질도입된 HepG2 간세포 암종 세포에서 FDPS RNA 및 단백질 발현.
이 실시예는 HepG2 세포에서 shFDPS에 의한 FDPS RNA 및 단백질 발현의 감소를 예시한다.
도 18은 FDPS 단백질 발현이 shFDPS에 의해 감소된 것을 보여준다. HepG2 세포는 shCon 또는 2종의 상이한 FDPS shRNA 서열, LV-shFDPS #1 (SEQ ID NO: 1) 또는 LV-shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 48시간 후에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 (Zol) 존재 또는 부재로 처리하였다. 72시간 후에, 세포를 용해시켰고 면역블록은 항-FDPS 및 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴 항체를 사용하여 수행하였다. 면역블롯 밴드의 밀도측정을 정량하였고 LV-sh대조군은 1 (100%)로 설정하였다. 62% (LV-shFDPS #1 (SEQ ID NO: 1)), 48% (LV-shFDPS #1+Zol (SEQ ID NO: 1)), 44% (LV-shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)), 및 32% (LV-shFDPS #4+Zol (SEQ ID NO: 4))의 FDPS 단백질 발현 감소가 존재하였다.
실시예 15 - shFDPS 헤어핀-루프 변이 발현 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 전립선 암종 세포에서 FDPS 단백질 발현.
이 실시예는 shFDPS 헤어핀-루프 변이; A (안티센스-루프-센스), R (센스-역 루프-안티센스), TT (센스-TT-안티센스), 및 L (센스-안티센스)이 PC3 세포에서 FDPS 단백질 발현을 감소시키는데 효과적이라는 것을 예시한다.
PC3 세포는 비-표적화 서열 (shCon) 또는 shFDPS의 상이한 변이, 즉, shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4), shFDPS-A (SEQ ID NO: 64), shFDPS-R (SEQ ID NO: 65), shFDPS-TT (SEQ ID NO: 66), 또는 shFDPS-L (SEQ ID NO: 67)을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 72시간 후에, 세포를 용해시켰고 RNA는 RNeasy 미니 키트를 사용해 추출하였다. cDNA는 SuperScript VILO cDNA 합성 키트를 사용해 RNA로부터 합성하였다. PCR 반응은 TaqMan Fast Advanced 마스터 믹스를 사용해 수행하였고 샘플은 Applied Biosystems QuantStudio3 qPCR 기계 (Thermo Scientific)를 사용한 정량적 PCR (qPCR)을 통해 분석하였다.
FDPS cDNA의 발현은 TaqMan FDPS 프로브 및 FDPS 프라이머를 사용한 정량적 PCR을 통해 결정하였다. 도 19A의 경우, FDPS 발현은 Fam-표지된 프로브 (5'-TAGCATCTCCTATCTCTGGGTGCCC-3') (SEQ ID NO: 78)와, FDPS 전방향 프라이머 (5'-GTGCTGACTGAGGATGAGATG-3') (SEQ IF NO: 79) 및 역방향 프라이머 (5'-CCGGTTATACTTGCCTCCAAT-3') (SEQ ID NO: 80)를 사용해 검출하였다. 샘플은 액틴 발현에 대해 정규화시켰다. 액틴은 Fam-표지된 TaqMan 프로브 (5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3') (SEQ ID NO: 81)와 액틴 전방향 프라이머 (5'-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3') (SEQ ID NO: 82) 및 역방향 프라이머 (5'-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3') (SEQ ID NO: 83)를 사용하여 검출하였다. shCon 샘플의 상대 FDPS RNA 발현도를 100%로 설정한다. 도 19A에 도시된 바와 같이 95% (shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)), 75% (shFDPS-A (SEQ ID NO: 64)), 95% (shFDPS-R (SEQ ID NO: 65)), 90% (shFDPS-TT (SEQ ID NO: 66)) 및 72% (FDPS-L (SEQ ID NO: 67))의 FDPS 발현 감소가 존재하였다.
단백질 발현에 대한 shFDPS 변이의 효과를 조사하기 위해서, PC3 세포는 sh대조군 또는 shFDPS #4의 변이를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 72시간 후에, 세포를 용해시켰고 면역블롯은 항-FDPS 및 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴 항체를 사용해 수행하였다. 면역블롯 밴드의 밀도측정을 정량하였고 LV-sh대조군은 1 (100%)로 설정하였다. 도 19B에 도시된 바와 같이, 87% (LV-shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)), 13% (LV-shFDPS-A (SEQ ID NO: 64)), 88% (LV-shFDPS-R (SEQ ID NO: 65)), 81% (LV-FDPS-TT (SEQ ID NO: 66)), 및 37% (LV-FDPS-L (SEQ ID NO: 67))의 FDPS 단백질 발현 감소가 존재하였다.
실시예 16 - miR30-FDPS 발현 렌티바이러스가 형질도입된 HepG2 간세포 암종 세포에서 FDPS 단백질 발현.
이 실시예는 miR30-FDPS 발현 렌티바이러스가 형질도입된 세포에서 FDPS 단백질 발현의 감소를 예시한다.
FDPS 단백질 발현을 측정하기 위해서, HepG2 인간 간세포 암종 세포는 sh대조군, shFDPS #3 (SEQ ID NO: 3), miR30-FDPS #1 (SEQ ID NO: 68), 또는 miR30-FDPS #3 (SEQ ID NO: 69)을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 72시간 후에, 세포는 NP-40 용해 완충액으로 용해시켰고 단백질은 Bio-Rad 단백질 어세이 시약으로 측정하였다. 50 마이크로그램의 단백질 샘플을 4-12% Bis-Tris 겔 (Thermo Scientific)에서 전기영동시키고 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯은 5% 블롯팅 등급 차단제로 차단시켰다. 면역블롯은 항-FDPS 항체 (Bethyl Laboratories) 및 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴 항체 (Millipore Sigma)를 사용하여 수행하였다. 항체를 HRP-접합된 2차 항체 (Thermo Scientific)와 결합시켰고 Immobilon 웨스턴 ECL 시약 (Millipore Sigma)을 사용하여 Licor c-DiGit 블롯 스캐너로 검출하였다. 면역블롯 밴드의 밀도측정은 NIH 이미지 소프트웨어로 정량하였고, LV-대조군은 1 (100%)로 설정하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 각각 85% (LV-shFDPS #4 (SEQ ID NO: 4)), 59% (LV-miR30-FDPS #1 (SEQ ID NO: 68)), 및 53% (LV-miR30-FDPS #3 (SEQ ID NO: 69))의 FDPS 단백질 발현 감소가 존재하였다.
실시예 17 - miR30-FDPS #1 발현 렌티바이러스가 형질도입된 THP-1 단핵구 백혈병 암종 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 LV-발현 miR30-FDPS miRNA #1 (SEQ ID NO: 68)에 의한 THP-1 단핵구 백혈병 암종 세포 중에서 7일간 FDPS의 넉다운 및 졸레드론산 존재 또는 부재의 처리가 도 21에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
THP-1 세포 (2x105 세포)는 LV-대조군 또는 LV-miR30 FDPS #1 (SEQ ID NO: 68)로 7일 동안 형질도입시켰다. 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 THP-1 세포는 5 mL의 둥근 바닥 튜브 중에서 4시간 동안 2x105 PBMC 세포와 공배양하였다. PBMC 세포는 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 적어도 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, LV-대조군은 2.44%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시켰고 LV-miR30 FDPS #1 (SEQ ID NO: 68)은 28.4%를 자극시켰다. 졸레드론산 처리 존재 시에, LV-대조군은 23.8%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시켰고 LV-miR30 FDPS #1 (SEQ ID NO: 68)은 61.4%를 자극시켰다.
실시예 18 - shGGPS1 발현 렌티바이러스가 형질도입된 HeLa 자궁경부 암종 세포에서 GGPS1 단백질 발현.
HeLa 세포는 sh대조군 또는 3종의 상이한 GGPS1 shRNA 서열, 즉 LV-shGGPS1 #1 (SEQ ID NO: 70), LV-shGGPS1 #2 (SEQ ID NO: 71), 또는 LV-shGGPS1 #3 (SEQ ID NO: 73)을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 72시간 후에, 세포를 용해시켰고 면역블롯은 Santa Cruz Biotechnology의 항-GGPS1 항체 (카탈로그 번호 sc-271680) 및 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴을 사용하여 수행하였다. 면역블록 밴드의 밀도측정을 정량하였고, LV-sh대조군은 1 (100%)로 설정하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 각각 54% (LV-shGGPS1 #1(SEQ ID NO: 70)), 69% (LV- shGGPS1 #2 (SEQ ID NO: 71)), 및 51% (LV- shGGPS1 #3(SEQ ID NO: 72))의 FDPS 단백질 발현 감소가 존재하였다.
실시예 19 - shFDPS 또는 shGGPS1 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산이 처리된 PC3 전립선 암종 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 LV-발현 FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 1)이 형질도입된 PC3 세포에서 3일 동안 FDPS 또는 GGPS1의 넉다운 및 졸레드론산 처리가 도 23에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포는 LV-대조군 또는 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 LV-GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)로 3일 동안 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포와 공배양시켰다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더해 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, LV-대조군은 2.78%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해서 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 0.77%를 자극시켰고 LV-GGPS1 #1 shRNA (SEQ ID NO: 70)는 1.23%를 자극시켰다. 졸레드론산 처리 존재 하에서, LV-대조군은 5.71%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 11.4%를 자극시켰고 LV-GGPS1 #1 shRNA (SEQ ID NO: 70)는 10%를 자극시켰다.
실시예 20 - shFDPS 또는 shGGPS1 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산이 처리된 HepG2 간세포 암종 세포에 의한 Vδ2+ T 세포의 활성화.
이 실시예는 LV-발현 FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)이 형질도입된 HepG2 세포 중에서 3일간 FDPS 또는 GGPS1의 넉다운 및 졸레드론산 처리가 도 24에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
HepG2 세포는 LV-대조군 또는 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 LV-GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)로 3일 동안 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 HepG2 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에 5x105 PBMC 세포와 공배양시켰다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, LV-대조군은 0.36%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해서 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 0.9%를 자극시켰고 LV-GGPS1 #1 (SEQ ID NO: 70) shRNA는 0.58%를 자극시켰다. 졸레드론산 처리 존재 하에서, LV-대조군은 6.88%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해서, LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 21.1%를 자극시켰고 LV-GGPS1 #1 shRNA (SEQ ID NO: 70)는 12%를 자극시켰다.
실시예 21 - shFDPS 또는 shGGPS1 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산이 처리된 THP-1 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이러한 실시예는 Lv-발현 FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 및/또는 GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)가 형질도입된 THP-1 세포에서 3일간 FDPS 또는 GGPS1의 넉다운 및 졸레드론산 처리가 도 25에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
THP-1 세포는 LV-대조군 또는 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 Lv-GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)로 3일 동안 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 THP-1 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포와 공배양시켰다. PBMC 세포는 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 적어도 11일 동안 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅시켰고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, LV-대조군은 1.33%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해 Lv-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 2.49%를 자극시켰고, Lv-GGPS1 #1 shRNA (SEQ ID NO: 70)는 1.22%를 자극시켰으며, 양쪽 조합은 1.91%를 자극시켰다. 졸레드론산 처리 존재 하에서, Lv-대조군은 5.74%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해서, Lv-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 10.8%를 자극시켰고, Lv-GGPS1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 70)은 4.5%를 자극시켰고, 양쪽 조합은 11.5%를 자극시켰다.
실시예 22 - shIDI1 발현 렌티바이러스가 형질도입된 PC3 전립선 암종 세포에서 IDI1 단백질 발현.
이 실시예는 면역블롯 분석으로 결정된, IDI1 발현에 대한 IDI1 shRNA 서열 코딩 렌티바이러스 벡터로의 형질도입 효과를 예시한다.
PC3 세포는 sh대조군 또는 IDI1 shRNA 서열 (SEQ ID NO: 76)을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 5 MOI로 감염시켰다. 72시간 후에, 세포를 용해시켰고 면역블롯은 Thermo Fisher (Cat. No. PA5-44207)의 항-IDI1 항체 및 단백질 로딩 대조군으로서 항-액틴 항체를 사용하여 수행하였다. 면역블롯 밴드의 밀도측정을 정량하였고, Lv-sh대조군은 1 (100%)로 설정하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 88%의 IDI1 단백질 발현 감소가 존재하였다.
실시예 23 - shFDPS 또는 shIDI1 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산으로 처리된 PC3 전립선 암종 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 Lv-발현 FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 IDI1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 76)이 형질도입된 PC3 세포에서 3일 동안 FDPS 또는 IDI1의 넉다운 및 졸레드론산 처리가 도 27에 도시된 바와 같이, Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포는 Lv-대조군 또는 Lv-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 또는 LV-IDI1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 76)로 3일 동안 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산 존재 또는 부재로 처리하였다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포와 공배양시켰다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 졸레드론산 부재 하에서, LV-대조군은 3.82%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 2.28%를 자극시켰고 LV-IDI1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 76)은 1.92%를 자극시켰다. 졸레드론산 처리 존재 하에서, LV-대조군은 8.66%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)는 36.9%를 자극시켰고 LV-IDI1 shRNA #1 (SEQ ID NO: 76)은 12.9%를 자극시켰다.
실시예 24 - 졸레드론산 (Zol), FTI277 (FTI), 또는 자라고즈산 (ZA)으로 처리된 THP-1 급성 단핵구 백혈병 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 도 28에 도시된 바와 같이, 졸레드론산 처리가 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
ZA는 스테롤 합성이 수행되는 경로에서의 스쿠알렌 신타제의 소형 분자 억제제이다. THP-1 세포는 FDPS 억제제 Zol (10 μM), 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 FTI (10 μM), 또는 ZA (50 μM)로 24시간 동안 처리되었다. THP-1 세포 (2.5x105)는 5시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 2.5x105 PBMC 세포와 공배양시켰다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. 미처리 세포는 3.08%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, 졸레드론산 처리는 40.1%를 자극시켰고, FTI277 처리는 11.7%를 자극시켰으며, 자라고즈산은 2.13%를 자극시켰다.
실시예 25 - shFDPS 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산 (Zol), FTI277 (FTI), 또는 자라고즈산 (ZA)이 처리된 PC3 전립선 암종 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 LV-발현 FDPS shRNA #4가 형질도입된 PC3 세포의 졸레드론산 처리가 도 29에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
PC3 세포는 3일 동안 LV-대조군 또는 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)로 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산, 1 μM의 FTI277, 또는 5 μM의 자라고즈산 존재 또는 부재로 처리되었다. 24시간 후에, 형질도입된 PC3 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC 세포와 공배양되었다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포는 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. LV-대조군 형질도입된 세포에서, 미처리 세포는 1.73%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해서, 졸레드론산 처리는 2.87%를 자극시켰고, FTI277은 1.64%를 자극시켰으며, 자라고즈산은 1.57%를 자극시켰다. LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 형질도입된 세포에서, 미처리 세포는 1.77%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, 졸레드론산은 50.3%를 자극시켰고, FTI277은 2.44%를 자극시켰으며 자라고즈산은 2.66%를 자극시켰다.
실시예 26 - shFDPS 발현 렌티바이러스가 형질도입되고 졸레드론산 (Zol), FTI277 (FTI), 또는 자라고즈산 (ZA)이 처리된 HepG2 간세포 암종 세포에 의한 Vγ9Vδ2 T 세포의 활성화.
이 실시예는 LV-발현 FDPS shRNA #4가 형질도입된 HepG2 세포의 졸레드론산 처리가 도 30에 도시된 바와 같이 Vγ9Vδ2 T 세포에서 TNF-α 발현을 자극시킨다는 것을 예시한다.
HepG2 세포는 3일 동안 LV-대조군 또는 LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4)로 형질도입시켰다. 형질도입 후 2일에, 세포는 1 μM의 졸레드론산, 1 μM의 FTI277, 또는 5 μM의 자라고즈산 존재 또는 부재로 처리되었다. 24시간 후에, 형질도입된 HepG2 세포는 4시간 동안 둥근 바닥 96웰 플레이트 중에서 5x105 PBMC와 공배양시켰다. PBMC 세포는 적어도 11일 동안 IL-2를 더하여 졸레드론산으로 사전-자극시켜서 Vγ9Vδ2 T 세포를 확장시켰다. 형광단-접합된 항 TCR-Vδ2 및 항-TNF-α 항체를 사용하여 Vγ9Vδ2 및 TNF-α에 대해 염색 후, 세포는 유세포측정을 통해 분석하였다. 생존 세포를 게이팅하였고, Vδ2+ 및 TNF-α+ 세포는 도트 블롯 상에서 확인하였다. 활성화된 세포독성 Vγ9Vδ2 T 세포는 유세포측정 그래프의 위쪽 우측 사분면에 나타났다. LV-대조군 형질도입된 세포에서, 미처리 세포는 1.82%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, 졸레드론산 처리는 3.02%를 자극시켰고, FTI277은 1.72%를 자극시켰으며, 자라고즈산은 1.63%를 자극시켰다. LV-FDPS shRNA #4 (SEQ ID NO: 4) 형질도입된 세포에서, 미처리 세포는 1.86%의 TNF-α 발현 Vγ9Vδ2 T 세포를 자극시킨데 반해, 졸레드론산은 50.8%를 자극시켰고, FTI277은 2.69%를 자극시켰으며 자라고즈산은 2.82%를 자극시켰다.
본 개시 내용의 바람직한 일정 실시형태들이 기술되었고 상기에 특별히 예시되었지만, 이러한 실시형태에 임의 발명을 제한하려는 것이 아니다.
서열
하기의 서열들이 본 명세서에서 언급되며, 그리하여 본 개시 내용에 편입된다:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
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Figure pct00038
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Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
<110> American Gene Technologies International Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE ACTIVATION OF TUMOR CYTOTOXICITY VIA HUMAN GAMMA-DELTA T-CELLS <130> 70612.01716 <140> WO PCT/US2018/037924 <141> 2018-06-15 <150> US 62/521,274 <151> 2017-06-16 <150> US 62/633,461 <151> 2018-02-21 <160> 83 <170> NOTEPAD <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #1 <400> 1 gtcctggagt acaatgccat tctcgagaat ggcattgtac tccaggactt ttt 53 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #2 <400> 2 gcaggatttc gttcagcact tctcgagaag tgctgaacga aatcctgctt ttt 53 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #3 <400> 3 gccatgtaca tggcaggaat tctcgagaat tcctgccatg tacatggctt ttt 53 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #4 <400> 4 gcagaaggag gctgagaaag tctcgagact ttctcagcct ccttctgctt ttt 53 <210> 5 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rous Sarcoma virus (RSV) promoter <400> 5 gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 60 cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 120 tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 180 gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacg 228 <210> 6 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 Long terminal repeat (LTR) <400> 6 ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac 60 tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt 120 gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 180 180 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psi Packaging signal <400> 7 tacgccaaaa attttgacta gcggaggcta gaaggagaga g 41 <210> 8 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rev response element (RRE) <400> 8 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcc 233 <210> 9 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Central polypurine tract (cPPT) <400> 9 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttta 118 <210> 10 <211> 217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polymerase III shRNA promoters-H1 promoter <400> 10 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accactt 217 <210> 11 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long WPRE sequence <400> 11 aatcaacctc tgattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct 590 <210> 12 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 delta LTR <400> 12 tggaagggct aattcactcc caacgaagat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta 240 gttcatgtca 250 <210> 13 <211> 290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-Chicken beta actin (CAG) promoter-Transcription <400> 13 gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc 60 ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 120 gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 180 ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 240 cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 290 <210> 14 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-HIV Gag-Viral capsid <400> 14 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60 ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120 ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180 ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240 acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300 ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360 gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420 caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480 gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540 ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600 ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660 gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720 agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780 atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840 agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900 tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960 ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020 gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080 agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140 ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200 atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260 caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320 cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380 gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440 aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500 taa 1503 <210> 15 <211> 1872 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-HIV Pol-Protease and reverse transcriptase <400> 15 atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa atgatagggg gaattggagg ttttatcaaa 60 gtaggacagt atgatcagat actcatagaa atctgcggac ataaagctat aggtacagta 120 ttagtaggac ctacacctgt caacataatt ggaagaaatc tgttgactca gattggctgc 180 actttaaatt ttcccattag tcctattgag actgtaccag taaaattaaa gccaggaatg 240 gatggcccaa aagttaaaca atggccattg acagaagaaa aaataaaagc attagtagaa 300 atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa atttcaaaaa ttgggcctga aaatccatac 360 aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa gacagtacta aatggagaaa attagtagat 420 ttcagagaac ttaataagag aactcaagat ttctgggaag ttcaattagg aataccacat 480 cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta acagtactgg atgtgggcga tgcatatttt 540 tcagttccct tagataaaga cttcaggaag tatactgcat ttaccatacc tagtataaac 600 aatgagacac cagggattag atatcagtac aatgtgcttc cacagggatg gaaaggatca 660 ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa atcttagagc cttttagaaa acaaaatcca 720 gacatagtca tctatcaata catggatgat ttgtatgtag gatctgactt agaaataggg 780 cagcatagaa caaaaataga ggaactgaga caacatctgt tgaggtgggg atttaccaca 840 ccagacaaaa aacatcagaa agaacctcca ttcctttgga tgggttatga actccatcct 900 gataaatgga cagtacagcc tatagtgctg ccagaaaagg acagctggac tgtcaatgac 960 atacagaaat tagtgggaaa attgaattgg gcaagtcaga tttatgcagg gattaaagta 1020 aggcaattat gtaaacttct taggggaacc aaagcactaa cagaagtagt accactaaca 1080 gaagaagcag agctagaact ggcagaaaac agggagattc taaaagaacc ggtacatgga 1140 gtgtattatg acccatcaaa agacttaata gcagaaatac agaagcaggg gcaaggccaa 1200 tggacatatc aaatttatca agagccattt aaaaatctga aaacaggaaa atatgcaaga 1260 atgaagggtg cccacactaa tgatgtgaaa caattaacag aggcagtaca aaaaatagcc 1320 acagaaagca tagtaatatg gggaaagact cctaaattta aattacccat acaaaaggaa 1380 acatgggaag catggtggac agagtattgg caagccacct ggattcctga gtgggagttt 1440 gtcaataccc ctcccttagt gaagttatgg taccagttag agaaagaacc cataatagga 1500 gcagaaactt tctatgtaga tggggcagcc aatagggaaa ctaaattagg aaaagcagga 1560 tatgtaactg acagaggaag acaaaaagtt gtccccctaa cggacacaac aaatcagaag 1620 actgagttac aagcaattca tctagctttg caggattcgg gattagaagt aaacatagtg 1680 acagactcac aatatgcatt gggaatcatt caagcacaac cagataagag tgaatcagag 1740 ttagtcagtc aaataataga gcagttaata aaaaaggaaa aagtctacct ggcatgggta 1800 ccagcacaca aaggaattgg aggaaatgaa caagtagatg ggttggtcag tgctggaatc 1860 aggaaagtac ta 1872 <210> 16 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper Rev-HIV Integrase-Integration of viral RNA <400> 16 tttttagatg gaatagataa ggcccaagaa gaacatgaga aatatcacag taattggaga 60 gcaatggcta gtgattttaa cctaccacct gtagtagcaa aagaaatagt agccagctgt 120 gataaatgtc agctaaaagg ggaagccatg catggacaag tagactgtag cccaggaata 180 tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct tggtagcagt tcatgtagcc 240 agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag ggcaagaaac agcatacttc 300 ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac atacagacaa tggcagcaat 360 ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg ggatcaagca ggaatttggc 420 attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta tgaataaaga attaaagaaa 480 attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga cagcagtaca aatggcagta 540 ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 600 gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 720 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780 ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840 gtggcaagta gacaggatga ggattaa 867 <210> 17 <211> 1755 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lenti-BTN3A3(BTN3A3) <400> 17 atgaaaatgg caagttccct ggctttcctt ctgctcaact ttcatgtctc cctcttcttg 60 gtccagctgc tcactccttg ctcagctcag ttttctgtgc ttggaccctc tgggcccatc 120 ctggccatgg tgggtgaaga cgctgatctg ccctgtcacc tgttcccgac catgagtgca 180 gagaccatgg agctgaggtg ggtgagttcc agcctaaggc aggtggtgaa cgtgtatgca 240 gatggaaagg aagtggaaga caggcagagt gcaccgtatc gagggagaac ttcgattctg 300 cgggatggca tcactgcagg gaaggctgct ctccgaatac acaacgtcac agcctctgac 360 agtggaaagt acttgtgtta tttccaagat ggtgacttct acgaaaaagc cctggtggag 420 ctgaaggttg cagcattggg ttctgatctt cacattgaag tgaagggtta tgaggatgga 480 gggatccatc tggagtgcag gtccactggc tggtaccccc aaccccaaat aaagtggagc 540 gacgccaagg gagagaacat cccggctgtg gaagcacctg tggttgcaga tggagtgggc 600 ctgtatgcag tagcagcatc tgtgatcatg agaggcagct ctggtggggg tgtatcctgc 660 atcatcagaa attccctcct cggcctggaa aagacagcca gcatatccat cgcagacccc 720 ttcttcagga gcgcccagcc ctggatcgcg gccctggcag ggaccctgcc tatctcgttg 780 ctgcttctcg caggagccag ttacttcttg tggagacaac agaaggaaaa aattgctctg 840 tccagggaga cagaaagaga gcgagagatg aaagaaatgg gatacgctgc aacagagcaa 900 gaaataagcc taagagagaa gctccaggag gaactcaagt ggaggaaaat ccagtacatg 960 gctcgtggag agaagtcttt ggcctatcat gaatggaaaa tggccctctt caaacctgcg 1020 gatgtgattc tggatccaga cacggcaaac gccatcctcc ttgtttctga ggaccagagg 1080 agtgtgcagc gtgctgaaga gccgcgggat ctgccagaca accctgagag atttgaatgg 1140 cgttactgtg tccttggctg tgaaaacttc acatcaggga gacattactg ggaggtggaa 1200 gtgggggaca gaaaagagtg gcatattggg gtatgtagta agaacgtgga gaggaaaaaa 1260 ggttgggtca aaatgacacc ggagaacgga tactggacta tgggcctgac tgatgggaat 1320 aagtatcggg ctctcactga gcccagaacc aacctgaaac ttcctgagcc tcctaggaaa 1380 gtggggatct tcctggacta tgagactgga gagatctcgt tctataatgc cacagatgga 1440 tctcatatct acacctttcc gcacgcctct ttctctgagc ctctatatcc tgttttcaga 1500 attttgacct tggagcccac tgccctgacc atttgcccaa taccaaaaga agtagagagt 1560 tcccccgatc ctgacctagt gcctgatcat tccctggaga caccactgac cccgggctta 1620 gctaatgaaa gtggggagcc tcaggctgaa gtaacatctc tgcttctccc tgcccaccct 1680 ggagctgagg tctccccttc tgcaacaacc aatcagaacc ataagctaca ggcacgcact 1740 gaagcacttt actga 1755 <210> 18 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-HIV Rev-Nuclear export and stabilize viral mRNA <400> 18 atggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gaactcctca aggcagtcag actcatcaag 60 tttctctatc aaagcaaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 120 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatcctt 180 agcacttatc tgggacgatc tgcggagcct gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga 240 cttactcttg attgtaacga ggattgtgga acttctggga cgcagggggt gggaagccct 300 caaatattgg tggaatctcc tacaatattg gagtcaggag ctaaagaata g 351 <210> 19 <211> 577 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope-CMV promoter-Transcription <400> 19 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420 gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480 gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 540 gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagc 577 <210> 20 <211> 1519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope-VSV-G-Glycoprotein envelope-cell entry <400> 20 atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60 gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120 ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180 atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240 gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300 ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360 ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420 gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480 gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540 acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600 gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660 ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720 aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780 tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840 acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900 caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960 cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020 tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080 ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140 gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200 tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260 ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320 tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380 tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440 gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500 tatacagaca tagagatga 1519 <210> 21 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-CMV early (CAG) enhancer-EnhanceTranscription <400> 21 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tc 352 <210> 22 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-Chicken beta actin intron-Enhance gene expression <400> 22 ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag 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ttctggcgtg tgaccggcgg 960 960 <210> 23 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helper/Rev-Rabbit beta globin poly A-RNA stability <400> 23 agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 60 ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 120 ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 180 ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag 240 gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga aaagccttga 300 cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa 360 aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca 420 tagctgtccc tcttctctta tgaagatc 448 <210> 24 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Envelope-Beta globin intron-Enhance gene expression <400> 24 gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 60 ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 120 ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct 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ttttgtgtta tttttttctt taacatccct 360 aaaattttcc ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt 420 catagctgtc cctcttctct tatggagatc 450 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 taagcagaat tcatgaattt gccaggaaga t 31 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 ccatacaatg aatggacact aggcggccgc acgaat 36 <210> 28 <211> 2745 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gag, Pol, Integrase fragment <400> 28 gaattcatga atttgccagg aagatggaaa ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 60 atcaaagtaa gacagtatga tcagatactc atagaaatct gcggacataa agctataggt 120 acagtattag taggacctac acctgtcaac ataattggaa gaaatctgtt gactcagatt 180 ggctgcactt taaattttcc cattagtcct attgagactg taccagtaaa attaaagcca 240 ggaatggatg gcccaaaagt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 300 gtagaaattt gtacagaaat ggaaaaggaa ggaaaaattt caaaaattgg gcctgaaaat 360 ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca gtactaaatg gagaaaatta 420 gtagatttca 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cactaatgat gtgaaacaat taacagaggc agtacaaaaa 1320 atagccacag aaagcatagt aatatgggga aagactccta aatttaaatt acccatacaa 1380 aaggaaacat gggaagcatg gtggacagag tattggcaag ccacctggat tcctgagtgg 1440 gagtttgtca atacccctcc cttagtgaag ttatggtacc agttagagaa agaacccata 1500 ataggagcag aaactttcta tgtagatggg gcagccaata gggaaactaa attaggaaaa 1560 gcaggatatg taactgacag aggaagacaa aaagttgtcc ccctaacgga cacaacaaat 1620 cagaagactg agttacaagc aattcatcta gctttgcagg attcgggatt agaagtaaac 1680 atagtgacag actcacaata tgcattggga atcattcaag cacaaccaga taagagtgaa 1740 tcagagttag tcagtcaaat aatagagcag ttaataaaaa aggaaaaagt ctacctggca 1800 tgggtaccag cacacaaagg aattggagga aatgaacaag tagataaatt ggtcagtgct 1860 ggaatcagga aagtactatt tttagatgga atagataagg cccaagaaga acatgagaaa 1920 tatcacagta attggagagc aatggctagt gattttaacc taccacctgt agtagcaaaa 1980 gaaatagtag ccagctgtga taaatgtcag ctaaaagggg aagccatgca tggacaagta 2040 gactgtagcc caggaatatg gcagctagat tgtacacatt tagaaggaaa agttatcttg 2100 gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag taattccagc agagacaggg 2160 caagaaacag catacttcct cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa aacagtacat 2220 acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg ccgcctgttg gtgggcgggg 2280 atcaagcagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc aaggagtaat agaatctatg 2340 aataaagaat taaagaaaat tataggacag gtaagagatc aggctgaaca tcttaagaca 2400 gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac 2460 agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa 2520 aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag agatccagtt 2580 tggaaaggac cagcaaagct cctctggaaa ggtgaagggg cagtagtaat acaagataat 2640 agtgacataa aagtagtgcc aagaagaaaa gcaaagatca tcagggatta tggaaaacag 2700 atggcaggtg atgattgtgt ggcaagtaga caggatgagg attaa 2745 <210> 29 <211> 1586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Fragment containing Rev, RRE and rabbit beta globin poly A <400> 29 tctagaatgg caggaagaag cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc 60 atcaagcttc tctatcaaag caacccacct cccaatcccg 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ttccacacaa ccaaaaagga aactggaaaa atgttccttc taattaccat 120 tattgcccgt caagctcaga tttaaattgg cataatgact taataggcac agccttacaa 180 gtcaaaatgc ccaagagtca caaggctatt caagcagacg gttggatgtg tcatgcttcc 240 aaatgggtca ctacttgtga tttccgctgg tatggaccga agtatataac acattccatc 300 cgatccttca ctccatctgt agaacaatgc aaggaaagca ttgaacaaac gaaacaagga 360 acttggctga atccaggctt ccctcctcaa agttgtggat atgcaactgt gacggatgcc 420 gaagcagtga ttgtccaggt gactcctcac catgtgctgg ttgatgaata cacaggagaa 480 tgggttgatt cacagttcat caacggaaaa tgcagcaatt acatatgccc cactgtccat 540 aactctacaa cctggcattc tgactataag gtcaaagggc tatgtgattc taacctcatt 600 tccatggaca tcaccttctt ctcagaggac ggagagctat catccctggg aaaggagggc 660 acagggttca gaagtaacta ctttgcttat gaaactggag gcaaggcctg caaaatgcaa 720 tactgcaagc attggggagt cagactccca tcaggtgtct ggttcgagat ggctgataag 780 gatctctttg ctgcagccag attccctgaa tgcccagaag ggtcaagtat ctctgctcca 840 tctcagacct cagtggatgt aagtctaatt caggacgttg agaggatctt ggattattcc 900 ctctgccaag aaacctggag 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tggagacaac agaaggaaaa aattgctctg 840 tccagggaga cagaaagaga gcgagagatg aaagaaatgg gatacgctgc aacagagcaa 900 gaaataagcc taagagagaa gctccaggag gaactcaagt ggaggaaaat ccagtacatg 960 gctcgtggag agaagtcttt ggcctatcat gaatggaaaa tggccctctt caaacctgcg 1020 gatgtgattc tggatccaga cacggcaaac gccatcctcc ttgtttctga ggaccagagg 1080 agtgtgcagc gtgctgaaga gccgcgggat ctgccagaca accctgagag atttgaatgg 1140 cactactgtg tccttggctg tgaaaacttc acatcaggga gacattactg ggaggtggaa 1200 gtgggggaca gaaaagagtg gcatattggg gtatgtagta agaacgtgga gaggaaaaaa 1260 ggttgggtca aaatgacacc ggagaacgga tactggacta tgggcctgac tgatgggaat 1320 aagtatcggg ctctcactga gcccagaacc aacctgaaac ttcctgagcc tcctaggaaa 1380 gtggggatct tcctggacta tgagactgga gagatctcgt tctataatgc cacagatgga 1440 tctcatatct acacctttcc gcacgcctct ttctctgagc ctctatatcc tgttttcaga 1500 attttgacct tggagcccac tgccctgacc atttgcccaa taccaaaaga agtagagagt 1560 tcccccgatc ctgacctagt gcctgatcat tccctggaga caccactgac cccgggctta 1620 gctaatgaaa gtggggagcc tcaggctgaa gtaacatctc tgcttctccc tgcccaccct 1680 ggagctgagg tctccccttc tgcaacaacc aatcagaacc ataagctaca ggcacgcact 1740 gaagcacttt accgtagacg aaagcgcgga agcggagagg gcagaggaag tctgctaaca 1800 tgcggtgacg tcgaggagaa tcctggacct atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt 1860 gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt gcacctactt caagttctac aaagaaaaca 1920 cagctacaac tggagcattt actgctggat ttacagatga ttttgaatgg aattaataat 1980 tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc 2040 acagaactga aacatcttca gtgtctagaa gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta 2100 aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta agacccaggg acttaatcag caatatcaac 2160 gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag 2220 acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca 2280 acactgactt ga 2292 <210> 56 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-2 (IL-2, or IL2) <400> 56 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60 gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420 tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462 <210> 57 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-15(IL15, or IL-15) <400> 57 atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60 ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120 gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180 gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240 cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300 gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360 agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420 gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480 acttcttga 489 <210> 58 <211> 757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-18(IL-18, or IL18) <400> 58 ctggacagtc agcaaggaat tgtctcccag tgcattttgc cctcctggct gccaactctg 60 gctgctaaag cggctgccac ctgctgcagt ctacacagct tcgggaagag gaaaggaacc 120 tcagaccttc cagatcgctt cctctcgcaa caaactattt gtcgcaggaa taaagatggc 180 tgctgaacca gtagaagaca attgcatcaa ctttgtggca atgaaattta ttgacaatac 240 gctttacttt atagctgaag atgatgaaaa cctggaatca gattactttg gcaagcttga 300 atctaaatta tcagtcataa gaaatttgaa tgaccaagtt ctcttcattg accaaggaaa 360 tcggcctcta tttgaagata tgactgattc tgactgtaga gataatgcac cccggaccat 420 atttattata agtatgtata aagatagcca gcctagaggt atggctgtaa ctatctctgt 480 gaagtgtgag aaaatttcaa ctctctcctg tgagaacaaa attatttcct ttaaggaaat 540 gaatcctcct gataacatca aggatacaaa aagtgacatc atattctttc agagaagtgt 600 cccaggacat gataataaga tgcaatttga atcttcatca tacgaaggat actttctagc 660 ttgtgaaaaa gagagagacc tttttaaact cattttgaaa aaagaggatg aattggggga 720 tagatctata atgttcactg ttcaaaacga agactag 757 <210> 59 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lenti-AFP tumor-specific promoter (BTN3A3) [LTSP-AFP BTN3A3] <400> 59 cgatagtttg aggagaatat ttgttatatt tgcaaaataa aataagtttg caagtttttt 60 ttttctgccc caaagagctc tgtgtccttg aacataaaat acaaataacc gctatgctgt 120 taattattgg caaatgtccc attttcaacc taaggaaata ccataaagta acagatatac 180 caacaaaagg ttactagtta acaggcattg cctgaaaaga gtataaaaga atttcagcat 240 gattttccat attgtgcttc caccactgcc aataacacg 279 <210> 60 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-23(IL-23, or IL23) alpha subunit p19 <400> 60 agagccagcc agatttgaga agaaggcaaa aagatgctgg ggagcagagc tgtaatgctg 60 ctgttgctac tgccctggac agctcagggc agagctgtgc ctgggggcag cagccctgcc 120 tggactcagt gccagcagct ttcacagaag ctctgcacac tggcctggag tgcacatcca 180 ctagtgggac acatggatct aagagaagag ggagatgaag agactacaaa tgatgttccc 240 catatccagt gtggagatgg ctgtgacccc caaggactca gggacaacag tcagttctgc 300 ttgcaaagga tccaccaggg tctgattttt tatgagaagc tgctaggatc ggatattttc 360 acaggggagc cttctctgct ccctgatagc cctgtgggcc agcttcatgc ctccctactg 420 ggcctcagcc aactcctgca gcctgagggt caccactggg agactcagca gattccaagc 480 ctcagtccca gccagccatg gcagcgtctc cttctccgct tcaagatcct tcgcagcctc 540 caggcctttg tggccgtagc cgcccgggtc tttgcccatg gagcagcaac cctgagtccc 600 taaaggcagc agctcaag 618 <210> 61 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-36A(IL-36A, or IL36A) alpha <400> 61 aaaacccaag tgcagtagaa gccattgttc ataatggtag ggatacaggg tccttcgtaa 60 cagattatca gtgtggccta tgctggaaag tctggtgacc tctgattttt tttgcttcca 120 ggtctttggc cttggcactc tttgtcatat tagagttcct gggtctaggc ctgggcagga 180 ttcataggtg cagctgcttc tgctggaggt agactgcatc caacaaagta agggtgctgg 240 gtgagttctg ggagtataga ttctgactgg ggtcactgct gggctggccg ccagtctttc 300 atctgaccca gggttaaact gtggcttggg actgactcag gtcctctctt ggggtcggtc 360 tgcacataaa aggactccta tccttggcag ttctgaaaca acaccaccac aatggaaaaa 420 gcattgaaaa ttgacacacc tcagcagggg agcattcagg atatcaatca tcgggtgtgg 480 gttcttcagg accagacgct catagcagtc ccgaggaagg accgtatgtc tccagtcact 540 attgccttaa tctcatgccg acatgtggag acccttgaga aagacagagg gaaccccatc 600 tacctgggcc tgaatggact caatctctgc ctgatgtgtg ctaaagtcgg ggaccagccc 660 acactgcagc tgaaggaaaa ggatataatg gatttgtaca accaacccga gcctgtgaag 720 tcctttctct tctaccacag ccagagtggc aggaactcca ccttcgagtc tgtggctttc 780 cctggctggt tcatcgctgt cagctctgaa ggaggctgtc ctctcatcct tacccaagaa 840 ctggggaaag ccaacactac tgactttggg ttaactatgc tgttttaa 888 <210> 62 <211> 1186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-36B(IL-36B, or IL36B) beta <400> 62 cacgggttcc tccccactct gtctttctca cctctccttc acttttccta gcctcctcac 60 caccatctga tctatcttgt tctcttcaca aaaggctctg aagacatcat gaacccacaa 120 cgggaggcag cacccaaatc ctatgctatt cgtgattctc gacagatggt gtgggtcctg 180 agtggaaatt ctttaatagc agctcctctt agccgcagca ttaagcctgt cactcttcat 240 ttaatagcct gtagagacac agaattcagt gacaaggaaa agggtaatat ggtttacctg 300 ggaatcaagg gaaaagatct ctgtctcttc tgtgcagaaa ttcagggcaa gcctactttg 360 cagcttaagc ttcagggctc ccaagataac atagggaagg acacttgctg gaaactagtt 420 ggaattcaca catgcataaa cctggatgtg agagagagct gcttcatggg aacccttgac 480 caatggggaa taggagtggg tagaaagaag tggaagagtt cctttcaaca tcaccatctc 540 aggaagaagg acaaagattt ctcatccatg cggaccaaca taggaatgcc aggaaggatg 600 tagaaataag gggaggaaga ttcccatctc tacaatcttt gagtgggttt gctatcaatg 660 aaatgctaca aatggaataa gttgcagaaa tttttctctt ttcttgggtt ctggagagtt 720 tgtaaaacaa ggacactatg tatttttaaa gagttggtaa atcttacctg taaagctaga 780 gaaggtcgga gtctttttag gagtagattt ggactacata acctgtaaat gtgttttgtc 840 cagtccttag agtgtttttt aaaaaattgt aaagtcaagg ttttcatgaa aaatgggaag 900 atcagacaac attgctcctg aattcccaca gagcagcaag ctactagagc tcaatctgtt 960 atttcttttc ctgatgtaca ggggttaagt cctatggaag aaacagcaga attattcaaa 1020 attatttaca taatgtgcaa ttattcacta gagcatgagg agtgaaacgc tctgtttagt 1080 atgtataact taaaaggaac acatacaatt aaaagtaatt gaaagacatt tcttcttaaa 1140 aattctataa tcttacactg gtaaaataaa ctagtttttc ccatgt 1186 <210> 63 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytokine IL-36G (IL-36G, or IL-36G) gamma <400> 63 gaagctgctg gagccacgat tcagtcccct ggactgtaga taaagaccct ttcttgccag 60 gtgctgagac aaccacacta tgagaggcac tccaggagac gctgatggtg gaggaagggc 120 cgtctatcaa tcaatcactg ttgctgttat cacatgcaag tatccagagg ctcttgagca 180 aggcagaggg gatcccattt atttgggaat ccagaatcca gaaatgtgtt tgtattgtga 240 gaaggttgga gaacagccca cattgcagct aaaagagcag aagatcatgg atctgtatgg 300 ccaacccgag cccgtgaaac ccttcctttt ctaccgtgcc aagactggta ggacctccac 360 ccttgagtct gtggccttcc cggactggtt cattgcctcc tccaagagag accagcccat 420 cattctgact tcagaacttg ggaagtcata caacactgcc tttgaattaa atataaatga 480 ctgaactcag cctagaggtg gcagcttggt ctttgtctta aagtttctgg ttcccaatgt 540 gttttcgtct acattttctt agtgtcattt tcacgctggt gctgagacag gggcaaggct 600 gctgttatca tctcatttta taatgaagaa gaagcaatta cttcatagca actgaagaac 660 aggatgtggc ctcagaagca ggagagctgg gtggtataag gctgtcctct caagctggtg 720 ctgtgtaggc cacaaggcat ctgcatgagt gactttaaga ctcaaagacc aaacactgag 780 ctttcttcta ggggtgggta tgaagatgct tcagagctca tgcgcgttac ccacgatggc 840 atgactagca cagagctgat ctctgtttct gttttgcttt attccctctt gggatgatat 900 catccagtct ttatatgttg ccaatatacc tcattgtgtg taatagaacc ttcttagcat 960 taagaccttg taaacaaaaa taattcttgt gttaagttaa atcatttttg tcctaattgt 1020 aatgtgtaat cttaaagtta aataaacttt gtgtatttat ataataataa agctaaaact 1080 gatataaaat aaagaaagag taaactg 1107 <210> 64 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #4A <400> 64 actttctcag cctccttctg cctcgaggca gaaggaggct gagaaagttt ttt 53 <210> 65 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #4R <400> 65 gcagaaggag gctgagaaag tgagctcact ttctcagcct ccttctg 47 <210> 66 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS shRNA sequence #4TT <400> 66 gcagaaggag gctgagaaag tttactttct cagcctcctt ctgcttttt 49 <210> 67 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS sequence #4L <400> 67 gcagaaggag gctgagaaag tactttctca gcctccttct gcttttt 47 <210> 68 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS miR30 sequence #1 <400> 68 aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgaca ctttctcagc ctccttctgc gtgaagccac 60 agatggcaga aggaggctga gaaagtgctg cctactgcct cggacttcaa ggggct 116 <210> 69 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS miR30 sequence #3 <400> 69 aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgaca ctttctcagc ctccttctgc gtgaagccac 60 agatggcaga agggctgaga aagtgctgcc tactgcctcg gacttcaagg ggct 114 <210> 70 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 shRNA sequence #1 <400> 70 gcttgaagct aaagcctata actcgagtta taggctttag cttcaagctt ttt 53 <210> 71 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 shRNA sequence #2 <400> 71 gtacattatc ttgaggatgt actcgagtac atcctcaaga taatgtactt ttt 53 <210> 72 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 shRNA sequence 3 <400> 72 cctgagctag tagccttagt actcgagtac taaggctact agctcaggtt ttt 53 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 target sequence #1 <400> 73 gcttgaagct aaagcctata a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 target sequence #2 <400> 74 gtacattatc ttgaggatgt a 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GGPS1 target sequence #3 <400> 75 cctgagctag tagccttagt a 21 <210> 76 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDI1 shRNA sequence <400> 76 gccagtggtg aaattaagat actcgagtat cttaatttca ccactggctt ttt 53 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDI1 target sequence <400> 77 gccagtggtg aaattaagat a 21 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fam-labeled TaqMan probe <400> 78 tagcatctcc tatctctggg tgccc 25 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS forward primer <400> 79 gtgctgactg aggatgagat g 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDPS reverse primer <400> 80 ccggttatac ttgcctccaa t 21 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fam-labeled TaqMan probe <400> 81 agcgggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin forward primer <400> 82 ggacctgact gactacctca t 21 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin reverse primer <400> 83 cgtagcacag cttctcctta at 22

Claims (35)

  1. 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터로서, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여되는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 더 포함하고, 제3의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 더 포함하고, 제4의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)인 바이러스 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 microRNA 또는 shRNA를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, microRNA는 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터:
    Figure pct00049
  7. 제6항에 있어서, microRNA는 하기 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터:
    Figure pct00050
  8. 제5항에 있어서, shRNA는 하기 서열과 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터:
    Figure pct00051
  9. 제8항에 있어서, shRNA는 하기 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터:
    Figure pct00052

    Figure pct00053
  10. 제1항에 있어서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3, BTN3A2, 또는 BTN3A1을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 (R381H)를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 사이토카인은 IL-1, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-33, IL-36, TNF-α, 또는 인터페론-γ를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 케모카인은 CC 케모카인, CXC 케모카인, CX3C 케모카인, C 케모카인, 또는 XC 케모카인을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  14. 제13항에 있어서, CC 케모카인은 RANTES를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 바이러스 벡터.
  16. 렌티바이러스 입자의 발현을 위한 렌티바이러스 벡터 시스템으로서,
    제15항에 따른 렌티바이러스 벡터;
    표적 세포의 감염에 최적화된 엔벨로프 단백질의 발현을 위한 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드; 및
    gag, pol, 및 rev 유전자의 발현을 위한 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드를 포함하고,
    렌티바이러스 벡터, 적어도 하나의 엔벨로프 플라스미드 및 적어도 하나의 헬퍼 플라스미드가 패키징 세포를 형질감염시킬 때, 렌티바이러스 입자가 패키징 세포에 의해 생산되고, 렌티바이러스 입자는 표적 세포를 감염시킬 수 있고, 표적 세포 내에서 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소를 억제시킬 수 있는 것인 렌티바이러스 벡터 시스템.
  17. 표적 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스 입자로서, 렌티바이러스 입자는 표적 세포의 감염에 최적화된 엔벨로프 단백질, 및 제15항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인 렌티바이러스 입자.
  18. 제17항에 있어서, 표적 세포는 암 세포인 렌티바이러스 입자.
  19. 감마 델타 (GD) T 세포를 활성화시키는 방법으로서,
    GD T 세포의 존재 하에서, 표적 세포를 렌티바이러스 입자로 감염시키거나 또는 감염되게 하는 단계를 포함하고,
    렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고,
    제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고, 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하며,
    적어도 하나의 효소가 표적 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시키는 것인 활성화 방법.
  20. 제19항에 있어서, 표적 세포는 암 세포인 활성화 방법.
  21. 제19항에 있어서, 표적 세포 및 GD T 세포를 아미노비스포스포네이트 약제의 양과 접촉시키거나 또는 접촉되게 하는 단계를 더 포함하는 것인 활성화 방법.
  22. 제21항에 있어서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산인 활성화 방법.
  23. 제19항 또는 제21항에 있어서, 적어도 하나의 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)인 활성화 방법.
  24. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계로서,
    렌티바이러스 입자는 제1 및 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고, 제1의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 메발로네이트 경로에 관여하는 적어도 하나의 효소의 생산을 억제할 수 있는 적어도 하나의 소형 RNA를 포함하고 제2의 코딩되는 유전자 엘리먼트는 부티로필린 패밀리 구성원, 사이토카인, 또는 케모카인 중 하나를 포함하며, 적어도 하나의 효소가 GD T 세포의 존재 하에서 암 세포 중에서 억제될 때, 표적 세포는 GD T 세포를 활성화시키고, 그리하여 암을 치료하는 것인 단계를 포함하는, 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대상체에게 아미노비스포스포네이트 약제의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 아미노비스포스포네이트 약제는 졸레드론산인 치료 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 적어도 하나의 효소는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)인 치료 방법.
  28. 제24항에 있어서, 부티로필린 패밀리 구성원은 BTN3A3 또는 BTN3A3 (R381H)를 포함하는 것인 치료 방법.
  29. 메발로네이트 경로의 제1 표적을 표적화하고 메발로네이트 경로의 제1 생성물을 증가시킬 수 있는 제1 소형 RNA; 및
    메발로네이트 경로의 제2 표적을 표적화하고 메발로네이트 경로의 제2 생성물을 감소시킬 수 있는 제2 소형 RNA
    를 포함하는 바이러스 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 제1 표적은 메발로네이트 경로의 제1 효소이고, 제2 표적은 메발로네이트 경로의 제2 효소인 바이러스 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 제1 효소 및 제2 효소 중 적어도 하나는 파르네실 디포스페이트 신타제 (FDPS), 제라닐제라닐-디포스페이트 신타제 1 (GGPS1), 이소펜테닐-디포스페이트 델타 이소머라제 1 (IDI1), 또는 파르네실 트랜스퍼라제 (F-Tase)를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  32. 제29항에 있어서, 메발로네이트 경로의 제1 생성물은 이소펜테닐 파이로포스페이트 (IPP)를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  33. 제29항에 있어서, 메발로네이트 경로의 제2 생성물은 제라닐제라닐 파이로포스페이트 (GGPP)를 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  34. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 방법은 대상체에게 렌티바이러스 입자의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계를 포함하고, 렌티바이러스 입자는 제29항의 바이러스 벡터를 포함하는 것인 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서, 대상체에게 아미노비스포스포네이트 약제의 치료적 유효량을 투여하거나, 또는 투여되게 하는 단계를 더 포함하는 것인 치료 방법.
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