JP2023133396A - ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物 - Google Patents

ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒトガンマデルタＴ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物の提供。【解決手段】本開示は、一般に、ガンマ－デルタ（ＧＤ）Ｔ細胞を活性化するための方法および組成物に関する。そのような方法および組成物は、がんを処置するために使用することができる。第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターであって、前記第１のコードされた遺伝子エレメントが、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、前記第２のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む、ウイルスベクター。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１６日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｖｉａ Ｈｕｍａｎ Ｇａｍｍａ－Ｄｅｌｔａ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ」というタイトルの米国仮特許出願第６２／５２１，２７４号、および２０１８年２月２１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｖｉａ Ｈｕｍａｎ Ｇａｍｍａ－Ｄｅｌｔａ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ」というタイトルの米国仮特許出願第６２／６３３，４６１号に対する優先権を主張し、これらの仮出願は参照することによりそれぞれ本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、一般に、遺伝子療法および免疫療法の分野に関し、具体的には、ガンマデルタ（「ＧＤ」）Ｔ細胞の増加した活性化およびエフェクター細胞機能に関連する、遺伝子療法および免疫療法の分野に関する。
ヒトＴ細胞は、Ｔ細胞受容体の構造に基づいて区別される。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを含む主な集団は、アルファ鎖およびベータ鎖から構成される受容体を発現する。より小さなサブセットは、ガンマ鎖およびデルタ鎖から作られたＴ細胞受容体を発現する。ガンマデルタ（「ＧＤ」）Ｔ細胞は循環リンパ球の３～１０％を構成し、Ｖδ２＋サブセットは血液中のＧＤ Ｔ細胞の７５％を構成する。Ｖδ２＋細胞は非ペプチドエピトープを認識し、主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）またはヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）による抗原提示を必要としない。Ｖδ２＋ Ｔ細胞の大部分はまたＶγ９鎖を発現し、メバロン酸および非メバロン酸ステロール／イソプレノイド合成経路における中間体である５炭素ピロリン酸化合物への曝露により刺激される。イソペンテニルピロリン酸（５炭素）への応答は健常なヒトにおいてほぼ普遍的である。
ＧＤ Ｔ細胞の別のサブセットであるＶδ１＋は、血液中を循環するＴ細胞のはるかに小さいパーセンテージを構成するが、Ｖδ＋１細胞は上皮粘膜および皮膚において最も一般的に見られる。小細胞集団は他のＶδ鎖を発現し、アレルギー、移植またはウイルス性および細菌性疾患の間の特定の応答と関連付けられ得る。
一般に、ＧＤ Ｔ細胞は、腫瘍細胞および病原体感染細胞の殺滅などのいくつもの機能を有する。それらの特有のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）を通じた刺激は２つの糖タンパク質鎖、γおよびδから構成され、これらの糖タンパク質鎖は、ＣＤ３複合体タンパク質と相互作用して機能的なＴＣＲを生成し、細胞傷害性、サイトカイン分泌および他のエフェクター機能のための能力を向上させる。ＧＤ Ｔ細胞のＴＣＲは特有の特異性を有し、細胞自体が高いクローン頻度で起こるため、腫瘍および病原体に対する迅速な先天性様の応答を可能とする。
ビスホスホネート薬物、およびメバロン酸経路におけるイソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）の下流のファルネシル二リン酸合成酵素（「ＦＤＰＳ」）の他のインヒビター（例えば、図１を参照）は、がん、具体的には骨転移を伴うがんなどの様々な疾患を処置するために使用されてきた。ビスホスホネート薬物としては、例えば、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ａｃｔｏｎｅｌ（登録商標）（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ）、Ａｒｅｄｉａ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＦｏｓａｍａｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）などの商標名が挙げられる。
ある特定のビスホスホネートはまた、ＧＤ Ｔ細胞の刺激について研究されてきた。この理由は、骨髄細胞または腫瘍細胞におけるＦＤＰＳの阻害は、ＩＰＰのファルネシル二リン酸への変換を遮断してＩＰＰの蓄積を引き起こすのと同時に、通常ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の活性化を抑制するＦＤＰＳの下流の生成物であるゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）のレベルを低減させるためであり得る。ＧＧＰＰの低減はカスパーゼ依存性インフラマソーム経路のインヒビターを除去し、インターロイキン－１ベータおよびインターロイキン－１８などのサイトカインの分泌を可能とし、インターロイキン－１８はガンマデルタＴ細胞活性化のために特に重要である。
したがって、ＦＤＰＳが遮断されたときに、増加したＩＰＰおよび減少したＧＧＰＰは骨髄細胞または腫瘍細胞を改変し、改変された細胞は、ＧＤ Ｔ細胞、具体的にはＶδ２＋サブセットを活性化するための増加した能力を得る。活性化されたＶδ２＋細胞は急速に増殖し、多数のサイトカインおよびケモカインを発現し、腫瘍細胞または病原体感染細胞を細胞傷害性により破壊するように機能することができる。ＧＤ Ｔ細胞エフェクター活性としては、マクロファージおよび抗原提示細胞を活性化するＩＦＮ－ガンマの分泌、他の自然および獲得免疫機構を活性化する他のサイトカインおよびケモカインの中でもＴＮＦ－アルファの分泌、標的細胞を攻撃および破壊するグランザイムＢの活性化およびＦａｓ＋標的細胞における細胞アポトーシスを誘発するＦａｓＬの細胞表面発現が挙げられる。
伝統的ながん処置に伴う重大な問題は、患者が化学療法処置に対して非感受性となることである。化学療法抵抗性の腫瘍細胞は特に、処置が非常に難しくなる。化学療法抵抗性の患者を処置する代替的な療法として、または化学療法および／もしくは放射線療法の代わりの一次療法として、本出願は、腫瘍部位において遺伝子を発現するための組換えレンチウイルスの使用を提案し、ＧＤ Ｔ細胞活性に影響するタンパク質の操作は、腫瘍成長を減速させ、がんを認識して殺滅する患者自身の自然免疫応答を活性化し得る。
本開示の一態様では、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターが開示される。第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターはまた、第３のコードされた遺伝子エレメントを含み、第３のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターはまた、第４のコードされた遺伝子エレメントを含み、第４のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、少なくとも１つの酵素は、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンチル二リン酸（disphosphate）デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）である。実施形態では、第１のコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
実施形態では、マイクロＲＮＡは、
Figure 2023133396000001
 と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。
実施形態では、マイクロＲＮＡは、
Figure 2023133396000002
 を含む。
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より高い同一性パーセントを有する配列を含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％より高い同一性パーセントを有する配列を含む。
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；または
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）を含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、または配列番号７６を含む。
実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮ３Ａ２、またはＢＴＮ３Ａ１またはこれらのバリアントを含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を含む。実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、ＴＮＦ－α、またはインターフェロン－γを含む。実施形態では、ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、Ｃケモカイン、またはＸＣケモカインを含む。さらなる実施形態では、ＣＣケモカインはＲＡＮＴＥＳを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書に詳述されるようなレンチウイルスベクター；標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされたときに、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞により産生され、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染して標的細胞内でメバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素を阻害することができる。
別の態様では、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および本明細書に詳述されるようなレンチウイルスベクターを含む。実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。
別の態様では、ガンマデルタ（ＧＤ）Ｔ細胞を活性化する方法が開示される。方法は、ＧＤ Ｔ細胞の存在下で、標的細胞をレンチウイルス粒子に感染させるか、または感染させたことを含み、レンチウイルス粒子は、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、少なくとも１つの酵素が標的細胞中で阻害されたときに、標的細胞はＧＤ Ｔ細胞を活性化する。実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。実施形態では、方法は、標的細胞およびＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物と接触させるか、または接触させたことをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。実施形態では、少なくとも１つの酵素は、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）である。
別の態様では、被験体においてがんを処置する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与するか、または投与したことを含み、レンチウイルス粒子は、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、少なくとも１つの酵素がＧＤ Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害されたときに、標的細胞はＧＤ Ｔ細胞を活性化し、それによりがんを処置する。実施形態では、方法は、標的細胞およびＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物と接触させるか、または接触させたことをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３（配列番号１７）またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）（配列番号５４）を含む。さらなる実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、またはＩＬ－３６を含む。
別の態様では、ウイルスベクターが開示される。ウイルスベクターは、メバロン酸経路の第１の標的を標的としてメバロン酸経路の第１の生成物を増加させることができる第１のスモールＲＮＡ、およびメバロン酸経路の第２の標的を標的としてメバロン酸経路の第２の生成物を減少させることができる第２のスモールＲＮＡを含む。実施形態では、第１の標的はメバロン酸経路の第１の酵素であり、第２の標的はメバロン酸経路の第２の酵素である。実施形態では、第１の酵素および第２の酵素の少なくとも１つは、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）を含む。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を含む。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を含む。
別の態様では、被験体においてがんを処置する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与するか、または投与したことを含み、レンチウイルス粒子は、本明細書中に記載するようなウイルスベクターを含む。実施形態では、方法は、被験体に治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を投与するか、または投与したことをさらに含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターであって、前記第１のコードされた遺伝子エレメントが、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、前記第２のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む、ウイルスベクター。
（項目２）
第３のコードされた遺伝子エレメントをさらに含み、前記第３のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目３）
第４のコードされた遺伝子エレメントをさらに含み、前記第４のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む、項目２に記載のウイルスベクター。
（項目４）
前記少なくとも１つの酵素が、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）である、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目５）
前記第１のコードされた遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目６）
前記マイクロＲＮＡが、
ａ） ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号６８）；または
ｂ） ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号６９）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、項目５に記載のウイルスベクター。
（項目７）
前記マイクロＲＮＡが、
ａ） ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号６８）；または
ｂ） ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号６９）
を含む、項目６に記載のウイルスベクター。
（項目８）
前記ｓｈＲＮＡが、
ａ） ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ｂ） ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ｃ） ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；
ｄ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）；
ｅ） ＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号６４）；
ｆ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧ（配列番号６５）；
ｇ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６６）；または
ｈ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６７）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、項目５に記載のウイルスベクター。
（項目９）
前記ｓｈＲＮＡが、
ａ） ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ｂ） ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ｃ） ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；
ｄ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）；
ｅ） ＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号６４）；
ｆ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧ（配列番号６５）；
ｇ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６６）；または
ｈ） ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号６７）
を含む、項目８に記載のウイルスベクター。
（項目１０）
前記ブチロフィリンファミリーメンバーが、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮ３Ａ２、またはＢＴＮ３Ａ１を含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目１１）
前記ブチロフィリンファミリーメンバーが、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目１２）
前記サイトカインが、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、ＴＮＦ－α、またはインターフェロン－γを含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目１３）
前記ケモカインが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、Ｃケモカイン、またはＸＣケモカインを含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目１４）
前記ＣＣケモカインが、ＲＡＮＴＥＳを含む、項目１３に記載のウイルスベクター。
（項目１５）
レンチウイルスベクターである、項目１のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（項目１６）
レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系であって、
項目１５に記載のレンチウイルスベクター；
標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するための少なくとも１つのエンベローププラスミド；および
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミド
を含み、
前記レンチウイルスベクター、前記少なくとも１つのエンベローププラスミド、および前記少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされたときに、前記レンチウイルス粒子が前記パッケージング細胞により産生され、前記レンチウイルス粒子が、前記標的細胞に感染することができ、前記標的細胞内でメバロン酸経路に関与する前記少なくとも１つの酵素を阻害することができる、
レンチウイルスベクター系。
（項目１７）
標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子であって、前記標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および項目１５に記載のレンチウイルスベクターを含む、レンチウイルス粒子。
（項目１８）
前記標的細胞が、がん細胞である、項目１７に記載のレンチウイルス粒子。
（項目１９）
ガンマデルタ（ＧＤ）Ｔ細胞を活性化する方法であって、
前記ＧＤ Ｔ細胞の存在下で、標的細胞をレンチウイルス粒子に感染させるか、または感染させたことを含み、
前記レンチウイルス粒子が、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、
前記第１のコードされた遺伝子エレメントが、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、前記第２のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、
前記少なくとも１つの酵素が前記標的細胞中で阻害されたときに、前記標的細胞が前記ＧＤ Ｔ細胞を活性化する、
方法。
（項目２０）
前記標的細胞が、がん細胞である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記標的細胞および前記ＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物と接触させるか、または接触させたことをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記アミノビスホスホネート薬物が、ゾレドロン酸である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記少なくとも１つの酵素が、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）である、項目１９または項目２１に記載の方法。
（項目２４）
被験体においてがんを処置する方法であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与するか、または投与したことを含み、前記レンチウイルス粒子が、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、前記第１のコードされた遺伝子エレメントが、メバロン酸経路に関与する少なくとも１つの酵素の産生を阻害することができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含み、前記第２のコードされた遺伝子エレメントが、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、前記少なくとも１つの酵素がＧＤ Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害されたときに、前記標的細胞が前記ＧＤ Ｔ細胞を活性化し、それにより前記がんを処置する、方法。
（項目２５）
前記被験体に治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を投与するか、または投与したことをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アミノビスホスホネート薬物が、ゾレドロン酸である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記少なくとも１つの酵素が、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）である、項目２４または項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ブチロフィリンファミリーメンバーが、ＢＴＮ３Ａ３またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
メバロン酸経路の第１の標的を標的としてメバロン酸経路の第１の生成物を増加させることができる第１のスモールＲＮＡ；および
メバロン酸経路の第２の標的を標的としてメバロン酸経路の第２の生成物を減少させることができる第２のスモールＲＮＡ
を含む、ウイルスベクター。
（項目３０）
前記第１の標的がメバロン酸経路の第１の酵素であり、前記第２の標的がメバロン酸経路の第２の酵素である、項目２９に記載のウイルスベクター。
（項目３１）
前記第１の酵素および前記第２の酵素の少なくとも１つが、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１（ＧＧＰＳ１）、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１（ＩＤＩ１）、またはファルネシルトランスフェラーゼ（Ｆ－Ｔａｓｅ）を含む、項目３０に記載のウイルスベクター。
（項目３２）
前記メバロン酸経路の前記第１の生成物が、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を含む、項目２９に記載のウイルスベクター。
（項目３３）
前記メバロン酸経路の前記第２の生成物が、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を含む、項目２９に記載のウイルスベクター。
（項目３４）
被験体においてがんを処置する方法であって、前記方法が、前記被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与するか、または投与したことを含み、前記レンチウイルス粒子が、項目２９に記載のウイルスベクターを含む、方法。
（項目３５）
前記被験体に治療有効量のアミノビスホスホネート薬物を投与するか、または投与したことをさらに含む、項目３４に記載の方法。
図１は、ステロイドおよびイソプレノイドの生合成のためのメバロン酸経路における主なステップの概要を示す。
図２は、例示的な環状化形態の３ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
図３は、例示的な環状化形態の４ベクターレンチウイルスベクター系を示す。
図４は、ＢＴＮ３Ａ３ならびに／またはＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８と組み合わせてＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ標的化配列を発現するレンチウイルスベクターの様々な線形マップを示す。
図５は、本明細書中に記載するように、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）を発現するレンチウイルスを用いたＰＣ３前立腺癌細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図６は、本明細書中に記載するように、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびｓｈＲＮＡ ＃４の両方を発現するレンチウイルスを用いたＨｅｐＧ２細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図７は、本明細書中に記載するように、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびｓｈＲＮＡ ＃４の両方を発現するレンチウイルスを用いたＰＣ３前立腺癌細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図８は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２を発現するレンチウイルスを用いたＨｅｐＧ２細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図９は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２を発現するレンチウイルスを用いたＰＣ３細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図１０は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－１５を発現するレンチウイルスを用いたＰＣ３細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図１１は、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを用いたＰＣ３細胞およびＨｅｐＧ２細胞におけるＢＴＮ３Ａ３の細胞外発現を実証するデータを示す。
図１２は、本明細書中に記載するように、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅｐＧ２細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図１３は、本明細書中に記載するように、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３細胞を注射されたマウスにおける腫瘍の遅延した成長を実証するデータを示す。
図１４は、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを注射された後にＰＢＭＣおよび／またはゾレドロン酸で処置されたマウスの生存期間を実証するデータを示す。
図１５は、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを注射された後にＰＢＭＣおよび／またはゾレドロン酸で処置されたマウスの腫瘍体積を実証するデータを示す。
図１６は、ＰＢＭＣで処置されたおよび処置されなかったＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ ＰＣ３異種移植腫瘍の肉眼的外見を示す。
図１７は、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、またはＩＤＩ１を標的とする合成ｓｈＲＮＡ配列を有するＨ１プロモーターを含有するレンチウイルスベクター、およびＦＤＰＳ標的化配列を有する合成マイクロＲＮＡを有する伸長因子１アルファプロモーターを含有するレンチウイルスベクターを示す。
図１８は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ ＃１（配列番号１）またはｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸ありまたはなしで処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＤＰＳタンパク質発現の低減を実証するデータを示す。
図１９Ａは、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－Ａ（配列番号６４）、ｓｈＦＤＰＳ－Ｒ（配列番号６５）、ｓｈＦＤＰＳ－ＴＴ（配列番号６６）、およびｓｈＦＤＰＳ－Ｌ（配列番号６７）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３細胞におけるＦＤＰＳ ＲＮＡ（図１９Ａ）の低減を実証するデータを示す。 図１９Ｂは、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－Ａ（配列番号６４）、ｓｈＦＤＰＳ－Ｒ（配列番号６５）、ｓｈＦＤＰＳ－ＴＴ（配列番号６６）、およびｓｈＦＤＰＳ－Ｌ（配列番号６７）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３細胞におけるタンパク質発現（図１９Ｂ）の低減を実証するデータを示す。
図２０は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ－４（配列番号４）、ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ－１（配列番号６８）およびｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ－３（配列番号６９）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＤＰＳタンパク質発現の低減を示す。
図２１は、本明細書中に記載するように、ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸ありまたはなしで処理されたＴＨＰ－１細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図２２は、本明細書中に記載するように、ｓｈＧＧＰＳ１ ＃１（配列番号７０）、ｓｈＧＧＰＳ１ ＃２（配列番号７１）、およびｓｈＧＧＰＳ１ ＃３（配列番号７３）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅＬａ細胞におけるＧＧＰＳ１タンパク質発現の低減を示す。
図２３は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号４）またはｓｈＧＧＰＳ１配列＃１（配列番号７０）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸ありまたはなしで処理されたＰＣ３細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図２４は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号４）またはｓｈＧＧＰＳ１配列＃１（配列番号７０）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸ありまたはなしで処理されたＨｅｐＧ２細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図２５は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号４）および／またはｓｈＧＧＰＳ１配列＃１（配列番号７０）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸ありまたはなしで処理されたＴＨＰ－１細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図２６は、本明細書中に記載するように、ｓｈＩＤＩ１（配列番号７６）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３細胞におけるＩＤＩ１タンパク質発現の低減を示す。
図２７は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号１）またはｓｈＩＤＩ１配列＃１（配列番号７６）を発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図２８は、本明細書中に記載するように、ゾレドロン酸、ＦＴＩ２７７、またはザラゴジン酸で処理されたＴＨＰ－１細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するデータを示す。
図２９は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸、ＦＴＩ２７７、またはザラゴジン酸で処理されたＰＣ３細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
図３０は、本明細書中に記載するように、ｓｈＦＤＰＳ配列＃４（配列番号４）を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸、ＦＴＩ２７７、またはザラゴジン酸で処理されたＨｅｐＧ２細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳデータを示す。
開示の概要
本開示は、遺伝子療法用構築物およびその構築物の細胞への送達に関し、送達は、例えば図１に示すように、イソペンテニルリン酸（ＩＰＰ）をファルネシル二リン酸（ＦＤＰ）およびメバロン酸経路の他の下流の生成物に変換するために必要なファルネシル二リン酸合成酵素（「ＦＤＰＳ」）またはメバロン酸経路の他の酵素の抑制をもたらす。実施形態では、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、またはスクアレン合成酵素のうちの１つまたは複数を標的とし、それによりこれらの酵素の発現レベルを低減させるマイクロＲＮＡまたは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有する１つまたは複数のウイルスベクターが提供される。ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。ＦＤＰＳおよびメバロン酸経路の他の酵素の発現をモジュレートすることの帰結は、ＧＤ Ｔ細胞増殖および分化の刺激因子であるＩＰＰの蓄積を増加させることである。ＧＧＰＳ１およびメバロン酸経路の他の酵素の発現をモジュレートすることの帰結は、ＧＧＰＰレベルを減少させ、インターロイキン－１ベータおよびインターロイキン－１８などのサイトカインの分泌を可能とすることである。したがって、本明細書中に提供する構築物は、ＧＤ Ｔ細胞を活性化するために使用され、がんおよび感染性疾患を処置するために使用される。
定義および解釈
本明細書中で別様に定義しない限り、本開示との関連で使用する科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上別様に要求されない限り、単数の語は複数を包含し、複数の語は単数を包含する。一般に、本明細書中に記載する細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用する学術用語およびそれらの技術は周知であり、当該技術分野において一般に使用されている。本開示の方法および技術は、別段の記載がなければ、当該技術分野において周知の、本明細書全体で引用し議論する様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載される従来の方法にしたがって一般に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ， Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００３年）を参照。あらゆる酵素反応または精製技術は、当該技術分野において一般に遂行されるように、または本明細書中に記載するように、製造業者の仕様にしたがって行われる。本明細書中に記載する分析化学、合成有機化学、医薬品化学、および製薬化学との関連で使用する学術用語、ならびに実験の手順および技術は、当該技術分野において周知であり一般に使用されるものである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は交換可能に使用し、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数形も包含すること、およびそれぞれの意味の範囲内に包含されることを意図する。また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、挙げた項目の１つまたは複数のあらゆる全ての可能な組み合わせ、ならびに、選択肢（「または」）として解釈する場合には組み合わせないことを指し、およびこれらを包含する。
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量といった、範囲などの数値による全ての指定は、０．１の増分で（＋）または（－）に変動する近似値である。必ずしも明示的には述べないが、数値による全ての指定には「約」という用語が先行することを理解するべきである。「約」という用語は、「Ｘ＋０．１」または「Ｘ－０．１」などの「Ｘ」の小さな増分に加えて、「Ｘ」という正確な値も包含する。必ずしも明示的には述べないが、本明細書中に記載する試薬は単に例示的なものであり、そのようなものの同等物が当該技術分野で公知であることも理解するべきである。
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、また、それが使用される文脈に応じてある程度変動する。使用されている文脈を考慮すると当業者に明確でない用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
本明細書中で使用する場合、「投与」または「投与する」という用語は、処置を必要とする被験体に対して活性剤を、治療的に有用な形態かつ治療有効量でその個体の体内に導入できる形態で与えることを示す。
本明細書中で使用する場合、「ブチロフィリン３Ａ」という用語は、本明細書中で「ＢＴＮ３Ａ」とも称され得る。さらに、「ブチロフィリン３Ａ１」は、本明細書中で「ＢＴＮ３Ａ１」とも称され得、配列番号５３のＢＴＮ３Ａ１部分を含み得る。ブチロフィリン３Ａ３は、本明細書中で「ＢＴＮ３Ａ３」（配列番号１７）とも称され得る。ＢＴＮ３Ａ３のバリアントとしては、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）が挙げられるがこれに限定されず、配列番号５４または配列番号５５または配列番号５９のＢＴＮ３Ａ３部分を含み得る。「Ｒ３８１Ｈ」への言及は、アミノ酸位置３８１においてヒスチジン（Ｈ）アミノ酸により置換されたアルギニン（Ｒ）アミノ酸への言及である。アミノ酸置換を定義するためのこの慣習は、本明細書中で他の位置および他のアミノ酸について使用され得る。
本明細書中で使用する場合、「ＣＡ１９－９」という用語は、炭水化物抗原１９－９を指す。本明細書中で使用する場合、「ＣＣケモカイン」という用語は、アミノ末端の近くに２つの隣接するシステインを有することにより特徴付けられるケモカインタンパク質のクラスを指す。「ＣＸＣケモカイン」という用語は、アミノ末端の近くに１アミノ酸だけ離れた２つのシステインを有することにより特徴付けられるケモカインタンパク質のクラスを指す。「ＣＸ３Ｃケモカイン」という用語は、アミノ末端の近くに３アミノ酸だけ離れた２つのシステインを有することにより特徴付けられるケモカインタンパク質のクラスを指す。「ＸＣケモカイン」という用語は、アミノ末端の近くのアミノ酸に隣接する１つのシステインを有することにより特徴付けられるケモカインタンパク質のクラスを指す。
本明細書中で使用する場合、「ＣＤ」という用語は、分化抗原群タンパク質（cluster
of differentiation protein）を指す。そのようなタンパク質の例としては、ＣＤ４およびＣＤ８が挙げられるがこれらに限定されない。例えばＣＤ４＋への言及は、ＣＤ４タンパク質の発現が陽性であることを指し示す。
本明細書中で使用する場合、「ＣＥＡ」という用語は、癌胎児性抗原を指す。
本明細書中で使用する場合、「ビスホスホネート」および「ビスホスホネート薬物」という用語は、様々な実施形態の治療剤を指し、アミノビスホスホネート、ジホスホネート、重ホスホン酸（biphosphonic acids）、およびジホスホン酸（diphosphonic acid）
のいずれかの他に、これらの薬学的に許容される塩および誘導体を包含する。ビスホスホネートを指す際の特定の命名法の使用は、具体的に指し示されなければ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
本明細書中で使用する場合、「共投与」または「併用投与」または「併用」または「併用療法」などの用語は、本明細書中で利用されるような、治療ベクターまたはレンチウイルス粒子およびビスホスホネート薬物またはこれらの任意の組み合わせの、それを必要とする単一の被験体（例えば、患者）への投与を指し、薬剤が必ずしも同じ投与経路によりおよび／または同時に投与されない処置レジメンを含むことが意図される。
本明細書中で使用する場合、「固定の組み合わせ」という用語は、単一の実体もしくは投与量または組み合わせた実体もしくは投与量の形態で、例えば、１つの錠剤または１つのカプセルまたは組み合わせた錠剤もしくはカプセルまたは組み合わせた液体形態で、基本的に組み合わせて患者に、例えば基本的に同時に投与される、各々の組成物、製剤または薬物形態のいずれかを含む、２つまたはそれより多くの活性成分または活性成分（active ingredient or component）、例えば、治療ベクターまたはレンチウイルス粒子お
よびビスホスホネート薬物またはこれらの任意の組み合わせを指す。
本明細書中で使用する場合、「非固定の組み合わせ」という用語は、特定の時間的制限なく同時に、並行してまたは逐次的に、のいずれかで別々の実体として患者に組み合わせて投与され、そのような投与が患者において治療有効レベルの活性成分を提供する、各々の組成物、製剤または薬物形態のいずれかを含む、２つまたはそれより多くの活性成分または活性成分、例えば、治療ベクターまたはレンチウイルス粒子およびビスホスホネート薬物またはこれらの任意の組み合わせを指す。非固定の組み合わせは、互いに独立して、または例えば同時にもしくは異なる時点において異なる固定の組み合わせを使用することにより投与され得る。活性成分は、例えば、併用の可能性に関する表示による指示（label instruction）と共にまたはそれなしで、互いに独立して販売され得る別々の医薬剤形または医薬製剤として投与され得る。そのような指示は、例えば、リーフレットなどのパッケージ用品中、または例えば医師および医療スタッフに提供される他の情報中に提供され得る。非固定の組み合わせ、各々の組成物、製剤または薬物形態のいずれかを含むその各々の活性成分または活性成分、またはこれらの部分は、同時にまたは時系列的にずらして、例えば、異なる時点において投与の任意の部分について等しいもしくは異なる時間間隔で投与され得る。そのような時間間隔は、処置される疾患に対する効果が、組み合わせて処置されるときに、活性成分のいずれか１つのみの使用により得られるよりも効果的であるように選択され得る。
本明細書中で使用する場合、「組み合わせ」、「組み合わせて」および「併用療法」という用語は、一般に、上記の「固定の組み合わせ」および「非固定の組み合わせ」の定義および実施形態のいずれかまたは両方を指すことができる。
本明細書中で使用する場合、「含む」という移行語は、組成物および方法を定義するために使用する場合、組成物および方法が、記載した要素を含むが、他のものを除外しないことを意味する。本明細書中で使用する場合、「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、追加の要素が組成物または方法の基本的で新規の特徴に実質的に影響しない場合にのみ、組成物および方法がそれらの追加の要素を含むことを意味する。本明細書中で使用する場合、「からなる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、組成物および方法が、組成物および実体的な方法ステップのために極微量な他の成分の要素以上を除外することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。例えば、方法および組成物は、追加のステップおよび成分を含み得るか（含む）、あるいは重要でないステップおよび組成物を含むか（から本質的になる）、あるいは記載した方法ステップまたは組成物のみを意図する（からなる）ことが意図される。
本明細書中で使用する場合、「発現」、「発現される」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシング、または転写後修飾もしくは翻訳後修飾というその他の形態を包含し得る。
本明細書中で使用する場合、「ファルネシル二リン酸合成酵素」という用語は、本明細書中でＦＤＰＳとも称され得、また、本明細書中でファルネシルピロリン酸合成酵素またはＦＰＰＳとも称され得る。
本明細書中で使用する場合、「ガンマデルタＴ細胞」という用語は、本明細書中でγδ
Ｔ細胞、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞、Ｖガンマ９Ｖデルタ２ Ｔ細胞、Ｖγ２Ｖδ２ Ｔ細胞、Ｖガンマ２Ｖデルタ２ Ｔ細胞とも称され得、またはさらにＧＤ Ｔ細胞とも称され得る。「ガンマデルタＴ細胞活性化」という用語は、活性化されているガンマデルタＴ細胞の代表的な、そのようなＴ細胞と関連する任意の測定可能な生物学的現象を指す。そのような生物学的現象の非限定的な例としては、サイトカイン産生の増加、細胞表面タンパク質の質的または量的な組成の変化、Ｔ細胞増殖の増加、および／または、標的細胞を殺傷するもしくは別のエフェクター細胞が標的細胞を殺傷するのを援助するなどのＴ細胞エフェクター機能の増加が挙げられる。
本明細書中で使用する場合、「Ｆ－Ｔａｓｅ」という用語は、ファルネシルトランスフェラーゼを指す。
本明細書中で使用する場合、「ＧＧＰＰ」という用語は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を指し、本明細書中でゲラニルゲラニル二リン酸とも称され得る。
本明細書中で使用する場合、「ＧＧＤＰＳ」、「ＧＧＰＰＳ」、「ＧＧＤＰＳ１」、「ＧＧＰＳ１」および「ＧＧＰＰＳ１」という用語は、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素１を指し、本明細書中でゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素またはゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素とも称され得る。
本明細書中で使用する場合、「ＨＥＲ－２」という用語は、ヒト上皮成長因子受容体２を指す。
本明細書中で使用する場合、「インターロイキン２」などのサイトカインは、「ＩＬ－２」、「ＩＬ２」などとも称され得る。ＩＬ－２はまた、配列番号５６への言及を含み得る。関連する方式で、「インターロイキン１５」はまた、配列番号５７への言及を含み得る。関連する方式で、「インターロイキン１８」はまた、配列番号５８への言及を含み得る。関連する方式で、「インターロイキン２３」はまた、配列番号６０への言及を含み得る。関連する方式で、「インターロイキン３６」はまた、配列番号６１～６３のいずれかへの言及を含み得る。一般に、接頭語「ＩＬ」は、インターロイキンを指す。
本明細書中で使用する場合、「ＩＤＩ１」という用語は、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ１を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＩＦＮ」という用語は、インターフェロンを指し、ＩＦＮ－ガンマおよびＩＦＮ－γという用語は、インターフェロン－ガンマを指す。
本明細書中で使用する場合、「個体」、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、任意の個体哺乳動物被験体、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および／またはヒトを指す。
本明細書中で使用する場合、「ＩＰＰ」という用語は、イソペンテニルピロリン酸を指す。
本明細書中で使用する場合、「Ｍ２－ＰＫ」という用語は、ピルビン酸キナーゼアイソエンザイムＭ２型を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＭＨＣ」という用語は、主要組織適合複合体を指す。
本明細書中で使用する場合、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡを指し、本明細書中で「ｍｉＲ」とも称され得る。
本明細書中で使用する場合、「ＮＫ細胞」または「ＮＫ受容体ファミリー」という用語は、それぞれ「ナチュラルキラー細胞」または「ナチュラルキラー細胞受容体ファミリー」を指す。
本明細書中で使用する場合、「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用できる任意の細胞株を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＰＢＭＣ」という用語は、末梢血単核細胞を指す。
本明細書中で使用する場合、「相同性」という用語は、同一であるか、または保存的置換を構成するアミノ酸、核酸、またはこれらのアナログの数のパーセンテージを指す。相同性は、ＧＡＰ（Deveraux et al.,1984， Nucleic Acids Research 12, 387-395）などの配列比較プログラムを使用して決定することができる。この方法では、本明細書中に引用される配列と類似のまたは実質的に異なる長さの配列が、アラインメントへのギャップの挿入により比較されてよく、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰにより使用される比較アルゴリズムにより決定される。
本明細書中で使用する場合、「配列同一性」という用語は、本明細書中で使用する類似の表現（pharasings）として、所与の配列と「５０％同一の配列」および所与の配列と「少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する」という非限定的な文脈においても見ることができ、比較のウインドウにわたり１ヌクレオチド毎または１アミノ酸毎に配列が同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウインドウにわたり２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列中で起こっている位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）により割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出され得る。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピュータによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）によりまたは検査および選択された様々な方法のいずれかにより生成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたり最も高い相同性パーセンテージをもたらす）により実行され得る。例えばAltschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389, 1997により開示されるようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムもまた参照され得る。
本明細書中で使用する場合、２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈における、「配列同一性」という用語と交換可能に使用され得る「同一性パーセント」という用語は、以下に記載する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能なその他のアルゴリズム）の１つを使用して、または目視検査によって測定されるとおりの、最大の一致のために比較およびアラインされたときの、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する２つまたはそれより多くの配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の一領域にわたり（例えば、機能ドメインにわたり）存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較のために、通常は１つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列の役目を持つ。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を指定し、必要であれば配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または目視検査（一般には後述のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）によって実行することができる。
配列同一性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムとしては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公開されている。
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。また、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１～１７頁、（１９８９年））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティーとして１２、およびギャップペナルティーとして４を使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４～４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定することができる。
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示中に提供される核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いて行うことができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁（１９９７年）に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合うように、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症を起こすことなくヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液との接触に使用するために好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを指す、およびそれらを包含する。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ
６６巻：１～１９頁（１９７７年）を参照）。
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより親化合物または活性成分が改変された、化合物または他の活性成分の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱物塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；アルカリ金属、アルカリ性金属（alkaline metal）、アンモニウム、
およびモノ、ジ、トリ、またはテトラ－Ｃ１～Ｃ３０－アルキル置換アンモニウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。様々な実施形態の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された、化合物または活性成分の従来の非毒性の塩が挙げられる。好適な有機酸は、例えば、カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、コハク酸、フマル酸またはメタンスルホン酸（methansulfonic acid）である。本明細書中の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物または活性成分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態または遊離塩基形態のこれらの化合物を、水中または有機溶媒中、またはその２つの混合物中の化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p.1418およびJournal of Pharmaceutical Science, 66, 2(1977)（これらのそ
れぞれは参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）に見出される。
本明細書中で使用する場合、「ＰＳＡ」という用語は、前立腺特異的抗原を指す。
本明細書中で使用する場合、「ＲＡＮＴＥＳ」という用語は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５と同義であり、これはＣＣＬ５とも同義である。
本明細書中で使用する場合、「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）」という用語は、「配列ＩＤ番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ Ｎｏ．）」という用語と同義である。
本明細書中で使用する場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に約２００ヌクレオチドまたはそれ未満の長さの、サイレンシング機能または干渉機能を持つノンコーディングＲＮＡをいう。その実施形態では、スモールＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１５０ヌクレオチドまたはそれ未満、約１２５ヌクレオチドまたはそれ未満、約１００ヌクレオチドまたはそれ未満、あるいは約７５ヌクレオチドまたはそれ未満の長さである。そのようなＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。実施形態では、「スモールＲＮＡ」は、一般に、標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊を生じさせる経路を通じて、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害することまたはノックダウンすることができる。
本明細書中で使用する場合、「ＴＣＲ」という用語は、Ｔ細胞受容体を指し、「ＴＣＲｓ」という用語は、その複数形を指す。
本明細書中で使用する場合、「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態に罹患した患者に見られる症状、進行、または合併症の発症を処置し、または防止するために好適な組成物中および好適な剤形中の本開示の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態の状況またはその重篤度、および処置される被験体の年齢、体重などに応じて変化する。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態などのいくつかの要因、ならびに当業者によって理解されるその他の要因のいずれかに応じて変化し得る。
本明細書中で使用する場合、「治療ベクター」という用語は、例えば本明細書の図２および図３に記載するようなレンチウイルスベクター、およびレンチウイルスプラスミドへの言及を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ＴＮＦ」という用語は、腫瘍壊死因子を指し、ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－αへの言及は、腫瘍壊死因子アルファを指す。
本明細書中で使用する場合、「処置」および「処置する」という用語は、疾患状態の意図した標的化およびそれとの戦い、すなわち、疾患状態を改善させまたは予防することを指す。具体的な処置は、したがって、標的とされる疾患状態ならびに医薬療法および治療アプローチの現在または将来の状況に依存する。処置は、関連毒性を有し得る。
本明細書中で使用する場合、「処置」または「処置すること」という用語は、一般に、処置されている被験体の自然経過を変えようとする介入を指し、予防のため、または臨床病理の経過の間に行われ得る。望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の抑制、減少、または阻害、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善の惹起が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「ＶＳＶＧ」または「ＶＳＶ－Ｇ」という用語は、水胞性口内炎ウイルスＧエンベロープ糖タンパク質を指す。
本開示の態様の説明
本開示の一態様では、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターが開示される。第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、第３のコードされた遺伝子エレメントを含み、第３のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、第４のコードされた遺伝子エレメントを含み、第４のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含む。実施形態では、酵素は、ファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）またはこれらの機能的バリアントである。実施形態では、第１のコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；または
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはより高い同一性パーセントを有する配列を含む。
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ（配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３）；または
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号４）を含む。
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号６８または配列番号６９と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
実施形態では、酵素は、ＧＧＰＳ１またはその機能的バリアントである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号７０、配列番号７１、または配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
実施形態では、酵素は、ＩＤＩ１またはその機能的バリアントである。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号７６と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
実施形態では、酵素は、Ｆ－Ｔａｓｅ、またはスクアレン合成酵素、またはこれらの機能的バリアントである。
実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮ３Ａ３、またはＢＴＮ３Ａ１を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を含む。実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ブチロフィリン様分子を含む。実施形態では、ブチロフィリン様分子は、ＢＴＮＬ３またはＢＴＮＬ８を含む。実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、ＴＮＦ－α、またはインターフェロン－γを含む。
実施形態では、ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、Ｃケモカイン、またはＸＣケモカインを含む。さらなる実施形態では、ＣＣケモカインは、ＲＡＮＴＥＳを含む。実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。さらなる実施形態では、Ｃケモカインは、ＸＣＬ１（リンホタクチン）を含む。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書に詳述されるようなレンチウイルスベクター；標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子、またはこれらの機能的バリアントを発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞中にトランスフェクトされたときに、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞により産生され、レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染して、標的細胞内でメバロン酸経路に関与する酵素を阻害することができる。
実施形態では、レンチウイルス粒子は、メバロン酸経路の第１の生成物のレベルの増加を引き起こすことができる。実施形態では、第１の生成物は、ＩＰＰを含む。実施形態では、レンチウイルス粒子は、メバロン酸経路の第２の生成物のレベルの減少を引き起こすことができる。実施形態では、第２の生成物は、ＧＧＰＰを含む。実施形態では、レンチウイルスの生成物は、第１の生成物を増加させ、第２の生成物を減少させる。
実施形態では、レンチウイルス粒子は、メバロン酸経路の第１の標的を標的化することができるスモールＲＮＡをコードする。実施形態では、レンチウイルス粒子は、メバロン酸経路の第２の標的を標的化することができるスモールＲＮＡをさらにコードする。実施形態では、第１の標的および第２の標的の少なくとも１つは酵素である。実施形態では、第１の標的および第２の標的の少なくとも１つは、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、またはスクアレン合成酵素である。
実施形態では、スモールＲＮＡによる第１の標的の標的化は、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度の増加を引き起こす。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、第１の生成物の対照に対して最大１０％増加し、第１の生成物の対照は、第１の標的がスモールＲＮＡにより標的とされない場合の第１の生成物の存在、レベル、または濃度を意味し得る。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第１の生成物の対照に対して最大１０％から最大２０％増加する。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第１の生成物の対照に対して最大２０％から最大３０％増加する。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第１の生成物の対照に対して最大３０％から最大４０％増加する。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第１の生成物の対照に対して最大４０％から最大５０％増加する。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第１の生成物の対照に対して５０％より大きく増加する。実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物は、ＩＰＰを含む。
実施形態では、スモールＲＮＡによる第２の標的の標的化は、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度の減少を引き起こす。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、第２の生成物の対照の最大１０％減少し、第２の生成物の対照は、第２の標的がスモールＲＮＡにより標的とされない場合の第２の生成物の存在、レベル、または濃度を意味し得る。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第２の生成物の対照の最大１０％から最大２０％減少する。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第２の生成物の対照の最大２０％から最大３０％減少する。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第２の生成物の対照の最大３０％から最大４０％減少する。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第２の生成物の対照の最大４０％から最大５０％減少する。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度は、本明細書中に記載するような第２の生成物の対照の５０％より大きく減少する。実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物は、ＧＧＰＰを含む。
実施形態では、メバロン酸経路の第１の生成物の存在、レベル、または濃度の増加は、ガンマデルタ（ＧＤ）Ｔ細胞活性化の増加を引き起こす。実施形態では、ＧＤ Ｔ細胞活性化は、第１の活性化の対照に対して最大１０％増加し、第１の活性化の対照は、第１の標的がスモールＲＮＡにより標的とされない場合のＧＤ Ｔ細胞活性化のレベルを意味し得る。実施形態では、第１の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第１の活性化の対照に対して最大１０％から最大２０％増加する。実施形態では、第１の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第１の活性化の対照に対して最大２０％から最大３０％増加する。実施形態では、第１の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第１の活性化の対照に対して最大３０％から最大４０％増加する。実施形態では、第１の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第１の活性化の対照に対して最大４０％から最大５０％増加する。実施形態では、第１の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第１の活性化の対照に対して５０％またはそれより大きく増加する。
実施形態では、メバロン酸経路の第２の生成物の存在、レベル、または濃度の減少は、ガンマデルタ（ＧＤ）Ｔ細胞活性化の増加を引き起こす。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、第２の活性化の対照に対して最大１０％増加し、第２の活性化の対照は、第２の標的がスモールＲＮＡにより標的とされない場合のＧＤ Ｔ細胞活性化のレベルを意味し得る。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第２の活性化の対照に対して最大１０％から最大２０％増加する。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第２の活性化の対照に対して最大２０％から最大３０％増加する。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第２の活性化の対照に対して最大３０％から最大４０％増加する。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ
Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第２の活性化の対照に対して最大４０％から最大５０％増加する。実施形態では、第２の生成物のモジュレーションにより引き起こされるＧＤ Ｔ細胞活性化は、本明細書中に記載するような第２の活性化の対照に対して５０％またはそれより大きく増加する。
別の態様では、標的細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、標的細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および本明細書に詳述されるようなレンチウイルスベクターを含む。実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。
別の態様では、ガンマデルタ（ＧＤ）Ｔ細胞を活性化する方法が開示される。方法は、ＧＤ Ｔ細胞の存在下で、標的細胞をレンチウイルス粒子に感染させることを含み、レンチウイルス粒子は、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、酵素が標的細胞中で阻害されたときに、標的細胞はＧＤ Ｔ細胞を活性化する。実施形態では、酵素は、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、および／またはスクアレン合成酵素、またはこれらの機能的バリアントの少なくとも１つを含む。
実施形態では、標的細胞は、がん細胞である。実施形態では、方法は、標的細胞およびＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物と接触させることをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。
別の態様では、被験体においてがんを処置する方法が開示される。方法は、被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与することを含み、レンチウイルス粒子は、第１および第２のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する酵素の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバー、サイトカイン、またはケモカインのうちの１つを含み、酵素がＧＤ Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害されたときに、標的細胞はＧＤ Ｔ細胞を活性化し、それによりがんを処置する。実施形態では、酵素は、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの少なくとも１つを含む。
実施形態では、方法は、標的細胞およびＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物と接触させることをさらに含む。実施形態では、方法は、被験体に治療有効量のレンチウイルス粒子を投与することを含み、レンチウイルス粒子は、第１、第２および第３のコードされた遺伝子エレメントを含むウイルスベクターを含み、第１のコードされた遺伝子エレメントは、メバロン酸経路に関与する１つまたは複数の酵素の産生を阻害することができる１つまたは複数のスモールＲＮＡを含み、第２のコードされた遺伝子エレメントは、ブチロフィリンファミリーメンバーを含み、第３の遺伝子エレメントは、サイトカインまたはケモカインをコードし、酵素がＧＤ Ｔ細胞の存在下でがん細胞において阻害されたときに、標的細胞はＧＤ Ｔ細胞を活性化し、ブチロフィリンは、ＧＤ Ｔ細胞を活性化する効率を増加させ、サイトカインは、ＧＤ Ｔ細胞の活性化および増殖を増加させ、ケモカインは、腫瘍部位におけるＧＤ Ｔ細胞の存在を増加させ、それによりがんを処置する。実施形態では、方法は、標的細胞およびＧＤ Ｔ細胞をある量のアミノビスホスホネート薬物に曝露することをさらに含む。実施形態では、アミノビスホスホネート薬物は、ゾレドロン酸である。
実施形態では、ブチロフィリンファミリーメンバーは、ＢＴＮ３Ａ３（配列番号１７）またはＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）（配列番号５４）を含む。実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、またはＩＬ－３６を含むが、Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化することが公知である他のサイトカインも含み得る。実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ５遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５、またはＧＤ Ｔ細胞受容体により認識されることが公知であり、ＧＤ Ｔ細胞を腫瘍成長の部位に誘引できることが公知である他のケモカインを含み得る。
がん
本明細書中に提供する組成物および方法は、がんを処置するために使用される。細胞、組織、または標的は、がん細胞であり得、がん性組織であり得、がん性組織を有し得、あるいは疾患または状態を発症していると診断されたまたはそのリスクがある被験体または患者であり得る。ある特定の態様では、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、グリア細胞、間質細胞、または粘膜細胞であり得る。がん細胞集団は、脳細胞、神経細胞、血液細胞、子宮内膜細胞、髄膜細胞、食道細胞、肺細胞、心臓血管細胞、肝細胞、リンパ細胞、乳房細胞、骨細胞、結合組織細胞、脂肪細胞、網膜細胞、甲状腺細胞、腺細胞、副腎細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、結腸細胞、前立腺細胞、子宮細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、脾臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、または横紋筋細胞を含み得るが、これらに限定されず、前記のいずれかからのがん細胞集団も挙げることができ、癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、混合型または前記の混合物の１つまたは複数と関連付けられ得る。なおさらなる態様では、がんとしては、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、未分化大細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、血管肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、慢性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道扁平上皮癌、ユーイング肉腫、線維肉腫、神経膠腫、膠芽腫、ガストリノーマ、胃癌、胚芽腫、肝細胞癌、カポジ肉腫、ホジキンリンパ腫、喉頭扁平上皮癌、喉頭癌、白血病、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黒色腫、マントル細胞リンパ腫、髄芽腫、中皮腫、粘液線維肉腫、骨髄性白血病、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、高リスク骨髄異形成症候群、鼻咽腔癌、神経芽腫、神経線維腫、高悪性度非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、食道癌、骨肉腫、膵臓癌、褐色細胞腫、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、シュワン細胞腫（ｓｃｈｗａｎｏｍｍａ）、小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、精巣腫瘍、甲状腺癌、尿路上皮癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提供する組成物および方法は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）、小児悪性疾患、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって惹起または助長される子宮頸部およびその他の腫瘍、黒色腫、バレット食道（前悪性症候群）、副腎がん、および皮膚がん、ならびに自己免疫疾患、腫瘍性皮膚疾患を処置するためにも使用される。
感染性疾患
本明細書中に開示する組成物および方法は、感染性疾患を処置するために使用することができる。「感染性疾患」という用語は、感染性因子により引き起こされる任意の疾患を含む。「感染性因子」としては、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマ、および寄生虫が挙げられるがこれらに限定されない任意の外因性の病原体が挙げられる。本開示中で提供される組成物を用いて処置され得る感染性因子としては、動物において病理発生を引き起こす任意の当該技術分野で認識される感染性生物が挙げられ、これには、グラム陰性またはグラム陽性の球菌または桿菌である細菌、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルス、例えば、以下に限定されないが、パピローマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスなどのＤＮＡウイルス、ならびにアレナウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス（picomavirus）、パラミクソウイルス、レオウイルス、レトロウ
イルス、およびラブドウイルスなどのＲＮＡウイルスなどの生物が含まれる。本開示の組成物および方法を用いて処置され得る真菌の例としては、カビとして成長するか、または酵母様の真菌が挙げられ、例えば、白癬、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコックス症、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、およびカンジダ症などの疾患を引き起こす真菌が挙げられる。本明細書中で提供される組成物および方法は、寄生虫感染症を処置するために利用することができ、寄生虫感染症としては、体条虫（somatic tapeworm）、住血吸虫、組織回虫（tissue roundworm）、アメーバ、ならびにPlasmodium、Trypanosoma、Leishmania、およびToxoplasma種により引き起こされる感染症が挙げられるがこれらに限定されない。
ＧＤ Ｔ細胞の活性化方法
個体においてＧＤ Ｔ細胞を活性化するための組成物および方法の他に、腫瘍および感染性疾患を処置する方法が本明細書中に提供される。例えば、実施形態では、本明細書中に提供する組成物および方法は、全ての公知のがんを処置するための方法において使用することができ、その理由は、活性化されたＧＤ Ｔ細胞は、腫瘍の免疫サーベイランスのための天然の機構を含むためである（例えば、Pauza et al. Frontiers in Immunol. 5: 687 (2014)を参照）。同様に、実施形態では、本明細書中に提供する組成物方法および方法は、感染性疾患を処置するために使用することができ、感染性疾患としては、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトレトロウイルス、マイコバクテリア、プラスモジウムおよび様々な他のウイルス、真菌および細菌の感染症が挙げられるがこれらに限定されない。（例えば、Pauza and Cairo, 2015 Cell Immunol. 296(1)を参照）。
一般に、ＦＤＰＳの発現を減少させるため、および他の実施形態では、ケモカインまたはサイトカインの発現を増加させるために、開示する構築物を用いて標的細胞集団をトランスフェクトまたは形質導入するために、ベクター系は個体に投与される。投与およびトランスフェクション／形質導入は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができ、後者の概要では、トランスフェクトされた細胞は後に、被験体内に投与して戻される。
被験体の細胞への開示するベクターの投与および開示する構築物のトランスフェクションまたは形質導入は、ＦＤＰＳの発現の減少、サイトカインまたはケモカインの発現の増加、ＩＰＰの蓄積および多くの場合、遺伝子が改変された腫瘍細胞の成長速度の低減をもたらす。これらの特徴の全てが一緒に働いて、ＧＤ Ｔ細胞を活性化し、それを腫瘍または感染の部位に共局在させる。
開示する方法はまた、腫瘍細胞および／または感染細胞を認識して破壊するＮＫ細胞の能力を増加させることができる。ＧＤ Ｔ細胞とＮＫ細胞との間のクロストークは、免疫応答および炎症応答を調節する重要な態様である。さらに、ＧＤ Ｔ細胞は、樹状細胞の成熟を誘発し、Ｂ細胞およびマクロファージを動員し、インターフェロン－γおよびＴＮＦ－αの分泌などの様々な細胞溶解活性に参加することができる。
実施形態では、本明細書中に提供する開示する組成物および方法は、腫瘍の部位においてＧＤ Ｔ細胞を活性化するための遺伝子療法の形態を含む。一態様では、本明細書中に提供する組成物および方法は、がん細胞を殺滅しまたは感染性疾患を処置することができる細胞溶解活性のために必要とされる特定のサイトカインの産生を促進することによりＧＤ Ｔ細胞を活性化し、その増殖、分化、および機能的能力をサポートする。
実施形態では、遺伝子療法用配列（例えば、ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ、ＦＤＰＳ ｍｉＲＮＡ、ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ、ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ、Ｆ－ＴａｓｅスモールＲＮＡ、またはスクアレン合成酵素スモールＲＮＡ）は、治療ベクターにより担持され、治療ベクターとしては、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されず、他のウイルスベクターもまた好適であり得る。遺伝子療法用構築物はまた、プラスミド形態が挙げられるがこれに限定されないＤＮＡまたはＲＮＡの形態で送達され得る。実施形態では、開示する遺伝子療法用構築物はまた、タンパク質－核酸複合体または脂質核酸複合体およびこれらの製剤の混合物の形態で送達され得る。例えば、タンパク質－核酸複合体は、リジンおよびアルギニンなどの陽イオン性ペプチドとの複合体において目的の核酸を含み得る。脂質－核酸複合体は、脂質エマルション、ミセル、リポソーム、ならびに／またはＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、およびＤＭＲＩＥなどの中性および陽イオン性脂質の混合物を含み得る。
実施形態では、治療ベクターは、単一の構築物または少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つの異なる構築物を含み得る。１つより多くの構築物がベクター中に存在する場合、構築物は同一であってもよく、またはそれらは異なっていてもよい。例えば、構築物は、プロモーター、組込みエレメントの存在もしくは非存在、および／または配列に関して異なり得る。
実施形態では、治療ベクターは、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの少なくとも１つの発現をノックダウンさせることができるスモールＲＮＡをコードする少なくとも１つの構築物を含む。実施形態では、治療ベクターはまた、ＴＮＦ－α、インターフェロン－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、またはＲＡＮＴＥＳが挙げられるがこれらに限定されない特定のサイトカイン（複数可）および／またはケモカイン（複数可）をコードする。実施形態では、単一の構築物は、ＦＤＰＳおよびＴＮＦ－α、インターフェロン－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、またはＲＡＮＴＥＳが挙げられるがこれらに限定されない特定のサイトカインまたはケモカインの発現をノックダウンさせることができる両方のスモールＲＮＡをコードし得る。
実施形態では、ウイルスベクターは、宿主染色体中に組み込まれる核酸構築物を導入し得る。あるいは、一過性の送達ベクターを使用して、染色体への組込みを防止し、遺伝子療法用構築物の寿命を制限することができる。
実施形態では、開示する構築物およびベクターは、ＦＤＰＳ、ゲラニルピロリン酸合成酵素（「ＧＰＰＳ」）、ファルネシルトランスフェラーゼ（「Ｆ－Ｔａｓｅ」）、ＩＤＩ１、および／またはスクアレン合成酵素遺伝子の発現を低減させまたはノックダウンさせることができる短鎖ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）、マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）、またはｓｉＲＮＡを含む。ステロイドおよびイソプレノイドの合成を制御するこれらの遺伝子を下方調節することにより、イソペンテニルピロリン酸（「ＩＰＰ」）レベルが上昇し、および／またはＧＧＰＰレベルが減少する。ＩＰＰの上昇および蓄積は、ＧＤ
Ｔ細胞活性化を増加させるための機構である。さらに、これらのピロリン酸合成酵素遺伝子の下方調節は、インフラマソーム機能の重要な負の調節因子を除去し、次いでそれが、ＧＤ Ｔ細胞活性化およびエフェクター細胞機能のために重要なサイトカインの発現の増加をもたらす。がん細胞表面上のＢＴＮ３Ａ３およびＩＰＰのより高い細胞質レベルは、Ｖガンマ９Ｖデルタ２ Ｔ細胞（本明細書中でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞とも称される）を強力に刺激する。
実施形態では、開示する構築物は、インターロイキン－２および／またはインターロイキン－１５を産生させてＧＤ Ｔ細胞増殖を維持させることができる特定のプロモーターにより調節される。しかしながら、本明細書中に記載するように、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、およびＩＬ－３６などの他のサイトカインもまた、選択し、使用することができる。加えて、開示する構築物は、ＧＤ Ｔ細胞分化および全てのエフェクター細胞機能の獲得のために必要とされるインターロイキン－１ベータおよび／またはインターロイキン－１８および／またはインターフェロン－ガンマを産生することができる特定のプロモーターにより調節され得る。望ましいエフェクター細胞機能としては、腫瘍および／または感染細胞の直接的な細胞傷害性細胞殺滅、有益なサイトカインおよび／またはケモカインの分泌、がん性のまたは細胞（cancerous or cell）を認識するために必要とされるＮＫ受
容体の発現の増加、ならびにＧＤ Ｔ細胞をがん性細胞または感染細胞標的と共局在させるために標的化抗体に結合するために必要とされるＦｃ受容体の発現の増加のための能力が挙げられる。
実施形態では、開示する方法は、ＧＤ Ｔ細胞を活性化して、がん性細胞、腫瘍、または感染細胞を攻撃して破壊するＮＫ細胞の能力を増加させる間接的な効果をもたらす。ＮＫ細胞の活性化はＧＤ Ｔ細胞を必要とし、ＧＤ Ｔ細胞は、刺激されて、増殖および分化し、ＮＫ細胞上の４－１ＢＢ共刺激受容体に結合するために必要とされる４－１ＢＢＬ共刺激リガンドを発現する。この形態のクロストークは、ＮＫ細胞を活性化するための重要な機構として公知であり、本明細書中で開示する方法および組成物の作用を通じて達成される。
別の態様では、ＧＤ Ｔ細胞とＮＫ細胞との間のクロストークは、疾患組織に蓄積する炎症性樹状細胞を除去するための重要な機構である。単独では、ＧＤ Ｔ細胞およびＮＫ細胞のいずれも、樹状細胞を破壊することができないが、上述のクロストーク相互作用が起こると、ＮＫ細胞は変化して、炎症性樹状細胞に対して細胞傷害性となる。この免疫調節機構は、ＧＤ Ｔ細胞の強い活性化および増殖に依存する。
実施形態では、ＧＤ Ｔ細胞の活性化のための開示する方法は、病的炎症応答を抑制するステップをさらに含み、病的炎症応答としては、アテローム性動脈硬化症に繋がる細胞増殖、腫瘍成長を刺激する慢性免疫活性化、乾癬および表皮における他の提示などの自己免疫疾患、中枢神経系の炎症性疾患、ならびに関節炎および調節されない免疫応答の他の疾患を挙げることができる。
実施形態では、治療ベクターは、ガンマデルタＴ細胞の相乗的な活性化を達成するために、ビスホスホネート薬物と並行して投与される。相乗効果は、ビスホスホネート薬物の交互の、改変されたまたは低下した用量を可能とすることができ、急性炎症応答および慢性疾患などのビスホスホネートへの有害反応を減少させ得る。
実施形態では、治療ベクターは、ビスホスホネート薬物と組み合わせて投与される。様々な実施形態では、そのような組み合わせは、ガンマデルタＴ細胞の相乗的な、正のまたは向上した活性化を達成する。そのような正の活性化は、ビスホスホネートの交互の、改変されたまたは低下した用量を可能とすることができ、急性炎症応答および慢性疾患などのビスホスホネートへの有害反応を減少させ得る。ビスホスホネートとの治療ベクターの組み合わせは、併用のためまたは組み合わせ製品についての指示と共にまたはそれなしで一緒にまたは別々に存在し得る。治療ベクターおよび／またはビスホスホネートは、完全に別々に投与されてもよく、完全に別個の医薬剤形中に製剤化されてもよい。治療ベクターおよび／またはビスホスホネートは、併用の可能性に関する表示による指示と共にまたはそれなしで、互いに独立して販売され得る。そのような指示はまた、例えば、リーフレットなどのパッケージ用品中、または例えば医師および医療スタッフに提供される他の情報（例えば、口頭伝達、書面などでの伝達）中に提供され得る。そのようなラベルまたは他の指示は、１つの投薬単位形態での固定の組み合わせ、または、治療ベクターが、ある時間間隔内でビスホスホネート薬物とは独立して、同時に、もしくは別々に投与され得る併用投与のための部分のキットとしての非固定の組み合わせのいずれかを指すことができる。様々な実施形態では、組み合わせは、協調的効果もしくは共同効果、または処置の毒性もしくは合併症の減少を呈する。一実施形態では、組み合わせの効果は相乗的である。相乗効果は、一緒に使用された活性成分が、化合物を別々に使用することに起因する効果の和より大きい場合に達成される。相乗効果は、活性成分が、（１）一緒に製剤化され、組み合わせての単位投与量製剤において同時に投与もしくは送達された場合；（２）別々の製剤として交互にまたは並行して送達された場合；または（３）いくつかの他のレジメンによる場合に得られ得る。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば、別々のシリンジでの異なる注射により、逐次的に投与または送達される場合に得られ得る。一般に、交互療法の間に、効果的な投与量の各活性成分が逐次的に、すなわち連続的に投与される一方、併用療法では、本明細書に詳述されるように潜在的なタイミングの変動にさらされるとはいえ、効果的な投与量の２つまたはそれより多くの活性成分は一緒に投与される。
本明細書における組み合わせは、同じまたは異なる製造者により製造および／または製剤化され得る。活性成分は、（ｉ）医師への組み合わせ製品の出荷前（例えば、本開示の化合物および他の治療剤を含むキットの場合）；（ｉｉ）投与の直前に治療医により（または医師の指導の下で）；（ｉｉｉ）例えば、本明細書に開示する活性成分の逐次的な投与の間に実際の患者において、併用療法にまとめることができる。
実施形態では、治療有効量の各組み合わせは、同時にまたは逐次的かつ任意の順序で投与されてよく、成分は一緒にまたは別々に投与されてよい。例えば、本開示による増殖性疾患を処置する方法は、（ｉ）レンチウイルス粒子の部分を形成する治療ベクターなどの第１の薬剤の投与および／または（ｉｉ）遊離もしくは薬学的に許容される塩の形態のビスホスホネート薬物などの第２の薬剤の投与を含み得る。薬剤（ｉ）、および／または（ｉｉ）の投与は、同時にまたは逐次的な任意の順序で、治療有効量で、好ましくは、協調的な、共同効果のある、および／または相乗効果のある量で、例えば、本明細書中に記載する量に対応する毎日のまたは間欠的な投与量で為され得る。組み合わせは、療法の経過の間の異なる時点において別々にまたは分割されたもしくは単一の薬物形態で並行して投与され得る。さらには、「投与する」という用語はまた、組み合わせパートナーにそれ自体ｉｎ ｖｉｖｏで変換する組み合わせパートナーのプロドラッグを使用することを包含する。本開示は、したがって、同時のまたは交互の処置の全てのそのようなレジメンを包含するものとして理解されるべきであり、「投与する」という用語はそれにしたがって解釈されるべきである。
実施形態では、薬剤（ｉ）および（ｉｉ）は、鼻腔内投与、頬側投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）投与、肺投与、腟内投与、局所投与、局部投与、乱切後の局部投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースもしくはゼラチンなどの半固体媒体中で、または頬側もしくは鼻噴霧製剤を介してなど、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。例えば、治療ベクターおよび／またはビスホスホネート薬物は、静脈内に投与され得る。さらに、薬剤（ｉ）および（ｉｉ）は、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、液体分散剤、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。例えば、ビスホスホネート薬物は、錠剤に製剤化されて、経口投与され得る。
本開示による併用療法は、それ以外にまたは加えて、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的介入、またはこれらの組み合わせと組み合わせて特にがん療法のために投与することができる。長期療法は、上記するような他の処置戦略の文脈においてアジュバント療法と同じく可能である。他の可能な処置は、腫瘍退縮後に患者の状態を維持するための療法、またはさらには、例えばリスクがある患者における化学的予防療法である。
ＧＤ Ｔ細胞活性化用の構築物
ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、および／またはこれらの機能的バリアントの阻害は、ＩＰＰの蓄積および／またはＧＧＰＰレベルの減少をもたらすことがあり、これは、Ｖデルタ２＋ ＧＤ Ｔ細胞の活性化ならびにインターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、およびＩＬ－１８の発現をもたらし、これらもまたＧＤ Ｔ細胞の活性化において重要である。ファルネシルトランスフェラーゼおよび／またはスクアレン合成酵素の阻害は、タンパク質のプレニル化の減少をもたらす。開示する構築物は、腫瘍細胞または感染細胞のような特定の標的細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができ、そこでそれらは、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの翻訳を阻害するＲＮＡ配列（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）を発現できる他に、細胞傷害性サイトカインまたはケモカインをコードし発現することができる。
ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの発現を減少させるため、サイトカインの発現を増加させるため、ならびにＲＡＮＴＥＳなどのケモカインの発現を増加させるための構築物が本明細書中に開示される。例えば、実施形態では、構築物は、インターフェロン－ガンマ、ＩＬ－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６、またはＴＮＦ－αをコードし得る。
上記に列記したもののようなサイトカインおよびケモカインの発現は、腫瘍細胞または病原性生物に感染した細胞の局在化した細胞傷害性破壊をもたらす。したがって、腫瘍細胞によるそのような構築物の発現は、腫瘍細胞がそれら自体の破壊を補助し、レンチウイルスベクターにより遺伝子改変されていない他の腫瘍細胞を破壊することができる免疫機構を活性化することをもたらし得る。ＧＤ Ｔ細胞を活性化する遺伝子改変された細胞の能力は、ＧＤ Ｔ細胞受容体、ブチロフィリン認識、および一般的なガンマ鎖サイトカインについてのＧＤ Ｔ細胞受容体の活性化を伴う。腫瘍細胞の殺滅は、腫瘍細胞を正常細胞から区別して細胞殺滅プロセスの選択性を提供するＮＫ受容体ファミリーのメンバーとして一般に記載されるＧＤ Ｔ細胞表面受容体のファミリーに依拠する。結果として、少数の遺伝子改変された腫瘍細胞は、充分な数のＧＤ Ｔ細胞を活性化して、同じまたは遠位の腫瘍中の遺伝子改変および非遺伝子改変細胞の両方の殺滅を含む腫瘍の大規模な破壊を達成することができる。したがって、腫瘍細胞または感染細胞によるそのような構築物の発現は、望ましくない細胞がそれ自体の破壊を補助することをもたらす。
同様に、開示する構築物が腫瘍細胞または感染細胞において発現される場合、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの発現の減少は、ＧＤ Ｔ細胞の活性化および細胞感染の部位の腫瘍部位への動員をもたらし得る。ＲＡＮＴＥＳの発現の増加は、意図する組織位置にＧＤ Ｔ細胞をさらに誘引する。ＧＤ Ｔ細胞は広範な上皮起源の腫瘍の他に多くの白血病およびリンパ腫を殺滅することができ、高レベルの抗腫瘍性サイトカイン、ＩＦＮγの産生がさらに可能であるので、腫瘍の部位へのＧＤ Ｔ細胞の動員は、抗腫瘍免疫を誘導する特に効果的な手段であり得る。
ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの発現の減少は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または当該技術分野において公知の他の手段を介して達成することができる。例えば、開示する構築物および方法において配列番号１、２、３、または４、またはこれらのバリアントによるｓｈＲＮＡを使用することができるが、この例は限定的なものではない。開示する構築物および方法において配列番号６４～６７、７０～７２、７６、またはこれらのバリアントによるｓｈＲＮＡを使用することができるが、この例は限定的なものではない。開示する構築物および方法において配列番号６８または６９、またはこれらのバリアントによるｍｉＲＮＡを使用することができるが、この例は限定的なものではない。ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、ＩＤＩ１、Ｆ－Ｔａｓｅ、スクアレン合成酵素、および／またはこれらの機能的バリアントの発現を減少させるためのＲＮＡのコーディング領域、ならびにサイトカインおよびケモカインのコーディング領域は、同じ構築物中または異なる構築物上にあってよい。
組換えポリペプチドまたはスモールＲＮＡなどの遺伝子調節分子を産生するための古典的なアプローチは、安定発現構築物を使用することである。これらの構築物は、形質導入された発現プラスミド（または少なくともその一部分）の宿主細胞のゲノムへの染色体組込み、短い持続時間のプラスミドトランスフェクション、または限られた半減期を有する非組込み性ウイルスベクターにも基づく。遺伝子組込みの部位は一般にランダムであり、任意の特定の部位に組み込まれる遺伝子の数および比は多くの場合に予測できない。同様に、非組込み性のプラスミドまたはウイルスベクターもまた核内ＤＮＡを生成するが、これらの種は通常、ＤＮＡ複製および連続的な維持のために必要とされる配列を欠いている。したがって、染色体組込みに依拠する構築物は、治療間隔を超えたものであり得る組換え遺伝子の永久的な維持をもたらす。
遺伝子発現のための安定発現構築物の代替としては、一過性発現構築物がある。後者の遺伝子発現構築物の発現は非組込み性プラスミドに基づき、それゆえ、発現は、典型的に、細胞が分裂するか、またはプラスミドベクターが内因性ヌクレアーゼにより破壊されると失われる。
開示する構築物は、好ましくは、一過的に発現されるエピソーム構築物である。エピソーム構築物は、被験体のゲノムに永久的な変更を加えず、標的細胞の染色体中に組み込まれないように、時間と共に分解または希釈される。エピソーム複製のプロセスは、典型的に、宿主細胞の複製機構およびウイルストランス作用因子の両方を組み込む。
染色体組込みの回避は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達に対するある特定の障壁を低減させる。しかしながら、組込み欠陥性構築物であっても、バックグラウンド頻度の組込みを有し得、あらゆるＤＮＡ分子は、宿主配列と組換えを起こすための希少な相同性を有し得るが、これらの組込み率は例外的に希少であり、一般に臨床的に有意でない。
したがって、実施形態では、開示するベクターは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２週の期間にわたり活動的遺伝子および／またはスモールＲＮＡの送達をサポートする。実施形態では、開示するベクターは、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはより長い期間にわたり活動的遺伝子および／またはスモールＲＮＡの送達をサポートする。例えば、１ヶ月および１週、または３ヶ月および２週といった、これらの期間の任意の組み合わせもまた本発明の方法において使用することができる。
しかしながら、実施形態では、構築物は、レトロウイルスインテグラーゼ遺伝子に依存する組込みエレメントを含み、それにより、構築物は被験体の染色体中に組み込まれる。レトロ転位および転位は、可動性遺伝子エレメントが染色体に組み込まれるかまたは挿入される機構の追加の例である。プラスミドは、組換えにより染色体中に組み込まれてよく、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥＮなどの遺伝子編集技術は、ガイドＲＮＡ配列を利用し、遺伝子欠失または遺伝子変換機構により染色体遺伝子座を変化させる。
構築物は、ＧＤ Ｔ細胞の維持に関与するサイトカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、またはＩＬ－３６）を発現するための特定のプロモーターを含み得る。例えば、開示する構築物中に組み込まれ得るプロモーターとしては、ＴＡＴＡボックスプロモーター、ＣｐＧボックスプロモーター、ＣＣＡＡＴボックスプロモーター、ＴＴＧＡＣＡボックスプロモーター、ＢＲＥボックスプロモーター、ＩＮＲボックスプロモーター、ＡＴベースのプロモーター、ＣＧベースのプロモーター、ＡＴＣＧ小型プロモーター、ＡＴＣＧ均衡プロモーター、ＡＴＣＧ中型プロモーター、ＡＴＣＧレスプロモーター、ＡＴレスプロモーター、ＣＧレスプロモーター、ＡＴスパイクプロモーター、およびＣＧスパイクプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, Eukaryotic genomes may exhibit up to 10 generic classes of gene promoters, BMC GENOMICS 13: 512 (2012)を参照。
治療ベクター
構築物は、以下に限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどの公知のトランスフェクションベクターおよび／または形質導入ベクター、タンパク質および／または脂質複合体、リポソーム、ミセル、細菌によって産生された小胞、真核生物によって産生された小胞、エキソソームなどを介して送達され得る。
ウイルスベクターは、本開示の方法のために有用な細胞種（すなわち、腫瘍細胞または骨髄性細胞またはリンパ球）に優先的に標的化され得る。ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ－宿主細胞受容体の特異的相互作用およびウイルスの遺伝子発現機構によって標的細胞中に遺伝子を形質導入するために使用され得る。結果として、ウイルスベクターは、全胚、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ ｓｉｔｕの組織標的、および培養細胞株などの多くの異なる細胞種中に遺伝子を導入するためのビヒクルとして使用されている。細胞中に外来遺伝子を導入し、発現させる能力は、遺伝子発現の研究および細胞系列の解明、ならびに遺伝子療法などの治療的介入の可能性の提供、人工多能性幹細胞の体細胞再プログラミング、および様々な種類の免疫療法において有用である。パポーバウイルス科（例えば、ウシパピローマウイルスまたはＢＰＶ）、またはヘルペスウイルス科（例えば、エプスタインバーウイルスまたはＥＢＶ）、またはヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）、またはワクシニアなどのポックスベクターのようなウイルス由来のウイルス構成成分は、本開示のベクターにおいて使用され得る。
本開示はレンチウイルスベクターに特に限定されるものではないが、レンチウイルスベクターは、本開示の組成物および方法にとって好ましい種類のベクターである。レンチウイルスは、有意な量のウイルス核酸を宿主細胞中に送達できるウイルスの属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染し／それに形質導入する独特の能力を有するものとして特徴付けられ、形質導入後にレンチウイルスはその核酸を宿主細胞の染色体中に組み込む。
感染性レンチウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖという毒性タンパク質をコードする３つの主要遺伝子、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの調節遺伝子を有する。特定の血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の調節、合成、および／またはプロセシング、ならびにその他の複製機能に関与するタンパク質をコードする追加のアクセサリー遺伝子が存在し得る。
さらには、レンチウイルスは、末端反復配列（ＬＴＲ）領域を含有し、これは約６００ｎｔの長さであり得る。ＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域に分けられ得る。ＬＴＲは、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体中へのレトロウイルスＤＮＡの組込みを媒介し得る。あるいは、インテグラーゼの機能なしに、ＬＴＲは、ウイルス核酸を環状化するために使用され得る。
レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質としては、逆転写酵素およびインテグラーゼが挙げられる。逆転写酵素は、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、相補的ＤＮＡコピーの合成のための鋳型としてウイルスＲＮＡゲノムを使用する。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型の破壊のためにＲＮａｓｅＨ活性も有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されたウイルスｃＤＮＡおよび宿主ＤＮＡの両方に結合する。インテグラーゼは、宿主ＤＮＡ中にウイルスゲノムを挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。Ｔａｔは、転写の際に開始および伸長を増進するトランス活性化因子として働く。ｒｅｖ応答エレメントは転写後に働き、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細胞質への輸送を調節する。
ウイルスベクターは、一般に糖タンパク質を含み、様々な糖タンパク質は、特異的親和性を提供し得る。例えば、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶＧ）ペプチドは、骨髄細胞中へのトランスフェクションを増加させ得る。あるいは、ウイルスベクターは、その殻ペプチドに取り付けられた、抗体などの標的化部分も有し得る。標的化抗体は、例えば、ＨＥＲ－２、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｍ２－ＰＫ、およびＣＡ１９－９のような腫瘍で過剰発現される抗原に特異的であり得る。
ウイルスベクターの他の特異性もまた当該技術分野において公知であり、細胞の特定の集団を標的とするために使用することができる。例えば、ポックスウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターはマクロファージ、樹状細胞および上皮細胞を標的とし、麻疹ウイルスベクターはＢ細胞を標的とすることができ、狂犬病ウイルスベクターは神経細胞を標的とすることができる。
レンチウイルスベクター系
レンチウイルスのビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。プロモーターに作動可能に連結された、逆転写および組込みに必要なレンチウイルスのｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも１つのベクターがある。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。プロモーターに作動可能に連結された、ウイルスカプシドを形成するために必要なレンチウイルスのｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターもある。一実施形態では、このｇａｇの核酸配列は、ｐｏｌの核酸配列の少なくとも一部とは別のベクター上にある。別の実施形態では、ｇａｇの核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌの核酸配列とは別のベクター上にある。
野生型復帰変異体を得る機会をさらに最小化するための粒子の作製に使用される多数の改変を、ベクターに対して行うことができる。これらとしては、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔの欠失、およびマトリックス（ＭＡ）の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖのベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と称される、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結されたエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。実施形態では、ｅｎｖの核酸配列は、レンチウイルスのエンベロープタンパク質をコードする。
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来のものではなく、異なるウイルスに由来する。生じる粒子は、シュードタイプ化粒子と称される。エンベロープの適切な選択により、実質的にあらゆる細胞に「感染」することができる。例えば、エンドサイトーシス区画を標的化するエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができ、これらは、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ－Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）、およびオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）などのものである。好ましく使用され得るその他のエンベロープとしては、ＭＬＶ－Ｅ、ＭＬＶ－Ａ、およびＧＡＬＶなどのモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。これら後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。その他のエンベロープタンパク質は、所望の宿主細胞に応じて選択され得る。例えば、ドーパミン受容体などの特定の受容体の標的化は、脳への送達のために使用され得る。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスのエンベロープを使用して標的化され得る。例えば、転写後修飾によってＧＰとなるエボラのＧＰ、およびＧＰ２糖タンパク質である。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープを有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
本明細書中に詳述するように、レンチウイルスベクター系は、通常、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、もしくはｒｅｖ遺伝子、またはそれらの機能的バリアントのうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子、またはそれらの機能的バリアントのそれぞれが個々のプラスミド上に提供されてもよいし、あるいは１つまたは複数の遺伝子が一緒に同一のプラスミド上に提供されてもよい。一実施形態では、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｒｅｖ遺伝子は、同一のプラスミド上に提供される（例えば、図２）。別の実施形態では、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は第１のプラスミド上に提供され、ｒｅｖ遺伝子は第２のプラスミド上に提供される（例えば、図３）。したがって、３ベクター系および４ベクター系の両方が、本明細書中の実施例セクションおよびその他の箇所に記載するようなレンチウイルスを製造するために使用され得る。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞株である。治療ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株中にトランスフェクトされた時に、レンチウイルス粒子が最終的に生産される。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクター系が開示される。系は、本明細書中に記載するようなレンチウイルスベクター；細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド；ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子、またはこれらの機能的バリアントを発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされたときに、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株により産生され、レンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することまたはＨＩＶ ＲＮＡ配列を標的化することができる。
別の態様では、および図２に詳述されるように、本明細書中で治療ベクターと称されるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含み得る：ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号５～６）、プサイ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号７）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号８）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号９）、Ｈ１プロモーター（配列番号１０）、ｓｈＦＤＰＳ（配列番号１、２、３、４）、ＣＭＶ（配列番号１９）、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）－Ｔ２Ａ－ＩＬ－２（まとめて配列番号５５）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号１１）、および３’デルタＬＴＲ（配列番号１２）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化（sequence variation）が、本明細書中で言
及する配列を改変するために使用され得る。
別の態様では、および本明細書に詳述されるように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＭＶ（ＣＡＧ）エンハンサー（配列番号２１）；ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号１３）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２２）；ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１４）；ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）；ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）；ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号８）；ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号１８）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を発現するための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第２の別のプラスミドを含むように改変され得る。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
別の態様では、本明細書中に詳述するように、エンベローププラスミドは、左から右に以下のエレメントを含むように設計されている：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号１９）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）（配列番号２０）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化が、本明細書中で言及する配列を改変するために使用され得る。
別の態様では、レンチウイルスのパッケージングのために使用されるプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であり得る。例えば、以下のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミド中の類似のエレメントの代わりとなり得る：伸長因子－１（ＥＦ－１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターの代わりとなり得る。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡの代わりとなり得る。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）由来の膜糖タンパク質で置換することができる。
なお、レンチウイルスパッケージング系は市販のものを入手でき（例えば、Ｌｅｎｔｉ－ｖｐａｋ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、また本明細書中に記載するように設計することもできる。さらに、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または改変して、レンチウイルス粒子の生産効率などのいくつもの関連因子を向上させることは当業者の技術的範囲内である。
用量および剤形
本開示のベクターは、目的の遺伝子または配列の短期、中期、または長期の発現、ならびに本開示のベクターのエピソームの維持を可能とする。したがって、投薬レジメンは、処置されている状態および投与方法に基づいて変化し得る。
一実施形態では、形質導入ベクターは、必要とする被験体に様々な用量で投与され得る。具体的には、被験体は、約１０６以上の感染用量（１標的細胞への形質導入に平均で１用量が必要）を投与され得る。より具体的には、被験体は、約１０７以上、約１０８以上、約１０９以上、または約１０１０以上の感染用量、あるいはこれらの値の間の任意の数の用量を投与され得る。形質導入ベクターの投薬の上限は、各疾患適応症について決定され、各個々の製品および製品ロットの毒性／安全性プロファイルに依存する。
さらに、本開示のベクターは、１日に１回または２回、あるいは任意のその他の好適な期間で定期的に投与され得る。例えば、ベクターは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎、９カ月毎、１年に１回、１８カ月毎、２年毎、３０カ月毎、または３年毎に、必要とする被験体に投与され得る。
一実施形態では、本開示のベクターは、医薬組成物として投与される。実施形態では、本開示のベクターを含む医薬組成物は、多様な剤形に製剤化され得、これらの剤形としては、臨床適用のための経鼻、経肺、経口、局所、または非経口の剤形が挙げられるが、これらに限定されない。各剤形は、様々な可溶化剤、崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤、またはその他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ベクターを含む医薬組成物は、注射、ガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）、注入、または皮内曝露用にも製剤化され得る。例えば、注射製剤は、好適なｐＨおよび張度の水性または非水性の溶液中に本開示のベクターを含み得る。
本開示のベクターは、腫瘍部位中へのまたは感染部位における直接の注射を介して被験体に投与され得る。実施形態では、ベクターは、全身投与され得る。実施形態では、ベクターは、腫瘍または感染の部位のすぐ周囲の組織へのガイドされたカニューレ挿入を介して投与され得る。
本開示のベクター組成物は、例えば、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内）投与、経肺投与、腟内投与、局所投与、局部投与、乱切後の局部投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、アガロースまたはゼラチンなどの半固体媒体中で、あるいは口腔内または経鼻噴霧製剤を介してなど、任意の薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。
さらに、本開示のベクター組成物は、例えば、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル剤、液体分散物、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、液剤、乳剤、および懸濁剤などの任意の薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さらに、組成物は、制御放出製剤、徐放製剤、即時放出性製剤、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、組成物は、経皮送達システムであり得る。
実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経口投与用の固体剤形として製剤化され得、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、または丸剤であり得る。実施形態では、固体剤形は、例えば、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含み得る。加えて、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または調節放出形態であり得る。調節放出剤形としては、制御放出または持続放出、腸管での放出などが挙げられる。調節放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。
さらなる実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、舌下剤形または口腔内剤形として製剤化され得る。そのような剤形は、舌下に投与される舌下錠または舌下溶液組成物、および頬と歯茎との間に置かれる口腔錠を含む。
実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。そのような本発明の剤形としては、経鼻送達用の溶液組成物、懸濁物組成物、およびゲル組成物が挙げられる。
実施形態では、ベクターを含む医薬組成物は、懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤などの経口投与用の液体剤形として製剤化され得る。実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、保湿剤、甘味剤、芳香剤、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、小児患者への投与のために好適となるように製剤化され得る。
実施形態では、医薬組成物は、滅菌水性液剤、懸濁剤、乳剤、非水性液剤、または坐剤などの非経口投与用剤形として製剤化され得る。実施形態では、液剤または懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルを含み得る。
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および様式、排泄速度、ならびに疾患の重篤度に応じて変化し得る。
実施形態では、がんの処置は、針を使用した腫瘍中への本開示のベクター構築物のガイド下の直接注射、または血管内カニューレ挿入によって達成される。実施形態では、本開示のベクターは、静脈もしくは動脈へのカニューレ挿入または注射、皮内送達、筋肉内送達、または疾患部位近くの排液臓器（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｏｒｇａｎ）中への注射によって、脳脊髄液、血液、またはリンパ循環中に投与される。
以下の実施例は、本発明の実例を挙げるために与えたものである。しかしながら、本発明は、これらの実施例に記載する特定の条件または詳細に限定されないことを理解するべきである。本明細書中で参照する全ての出版物は、参照することにより具体的に組み込まれる。
（実施例１：レンチウイルスベクター系の開発）
図２および３に要約するように、レンチウイルスベクター系を開発した（環状形態を示す）。治療ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクション後に、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）中でレンチウイルス粒子を生産した。２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞のトランスフェクションにより、機能的なウイルス粒子が生産された。このトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いた。最初に、血清を含まない培養培地中にプラスミドおよびＤＮＡを３：１の比（ＤＮＡに対するＰＥＩの質量比）で別々に加えた。２～３日後、細胞培地を回収し、高速遠心分離および／または濾過とその後の陰イオン交換クロマトグラフィーによってレンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ ｐ２４レベルの測定（ｐ２４タンパク質はレンチウイルス粒子中に組み込まれる）、定量ＰＣＲによる細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数の測定、または細胞の感染および光の使用（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）によって達成した。
上記の通り、３ベクター系（すなわち、２ベクターのレンチウイルスパッケージング系）をレンチウイルス粒子の生産用に設計した。３ベクター系の概略図を図２に示す。図２に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含む。図２の中央に見られるベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書中に記載する治療ベクターである。
より具体的に図２に関して、ヘルパープラスＲｅｖプラスミドは、ＣＭＶ（ＣＡＧ）エンハンサー（配列番号２１）、ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号１３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２２）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号８）、ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号１８）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）を含む。
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号１９）、ベータグロビンイントロン（配列番号２４）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号２０）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２５）を含む。
ヘルパー（プラスＲｅｖ）プラスミドおよびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４－３ ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）由来のＤＮＡ断片の初期ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の同じ部位に挿入するために使用され得るＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーを設計した。フォワードプライマーは（５’－ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ－３’）（配列番号２６）であり、リバースプライマーは（５’－ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ－３’）（配列番号２７）であった。
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼの断片の配列は以下の通りであった：
Figure 2023133396000003
Figure 2023133396000004
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位と共にＲｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡの配列を含有するＤＮＡ断片は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
Figure 2023133396000005
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターをＣＡＧエンハンサー／プロモータープラスニワトリベータアクチンイントロン配列で置換した。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位と共にＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
Figure 2023133396000006
ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドの構築：
水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）配列は、隣接ＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＥｃｏＲＩ制限部位においてＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用するシークエンシングによって正しい配向であることを決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
Figure 2023133396000007
本明細書中に記載する方法および材料を使用して、４ベクター系（すなわち、３ベクターレンチウイルスパッケージング系）も設計し、生産した。４ベクター系の概略図を図３に示す。図３に関して簡潔に述べれば、一番上のベクターはヘルパープラスミドであり、これはこの場合、Ｒｅｖを含まない。上から２つ目のベクターは別個のＲｅｖプラスミドである。下から２つ目のベクターはエンベローププラスミドである。一番下のベクターは、先に記載された治療ベクターである。
一部図３に関して、ヘルパープラスミドは、ＣＭＶ（ＣＡＧ）エンハンサー（配列番号２１）、ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号１３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号２２）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号８）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）を含む。
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号３３）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）を含む。
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号１９）、ベータグロビンイントロン（配列番号２４）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号２０）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）を含む。
ヘルパープラスミド、Ｒｅｖプラスミド、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。この配列は、隣接ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。次いで、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列をヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
Figure 2023133396000008
Figure 2023133396000009
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ配列は、隣接ＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって単一のＤＮＡ断片として合成された。次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターで置換されたＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位において、ＤＮＡ断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
Figure 2023133396000010
Figure 2023133396000011
２－ベクターパッケージング系および３－ベクターパッケージング系のためのプラスミドは、類似のエレメントを用いて改変することができ、また、イントロン配列は、ベクター機能を失うことなく取り除くことが可能であった。例えば、以下のエレメントは、２－ベクターパッケージング系および３－ベクターパッケージング系中の類似のエレメントの代わりとなり得た：
プロモーター：伸長因子－１（ＥＦ－１）（配列番号３４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号３５）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号３６）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号１９）またはニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号１３）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号３７）およびｂＧＨポリＡ（配列番号３８）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号２３）の代わりとなり得る。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶの株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ Ｇａｇ（配列番号１４）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号１５）、およびＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号１６）を、本明細書中に概説したように、ヘルパー／ヘルパープラスＲｅｖプラスミド中に含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
エンベロープ：ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号３９）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号４０）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号４１）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号４２）、Ａ型インフルエンザ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号４３）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号４４）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号４５）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号４６）由来の膜糖タンパク質と置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書中の配列部分として特定される。さらに、これらの配列を、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
要約すると、部分的に、３ベクター系と４ベクター系とを以下の通りに比較および対比することができる。３ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および３．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、Ｈ１、ｓｈＦＤＰＳ、ＣＭＶ、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）Ｔ２Ａ ＩＬ－２、ＷＰＲＥ、および３’δ ＬＴＲ。４ベクターレンチウイルスベクター系は以下を含有する：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および４．治療ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、プサイパッケージングシグナル、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、Ｈ１、ｓｈＦＤＰＳ、ＣＭＶ、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）Ｔ２Ａ ＩＬ－２、ＷＰＲＥ、および３’δ ＬＴＲ。上記エレメントと対応する配列は、本明細書中の配列表の部分として特定される。
（実施例２）
ＦＤＰＳを阻害するレンチウイルスベクターの開発
この実施例の目的は、本明細書中でＬＶ－ｓｈＦＤＰＳとも称されるＦＤＰＳ阻害レンチウイルスベクターを開発することであった。
阻害性ＲＮＡの設計：ホモサピエンスファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００２００４．３）を使用して、ヒト細胞においてＦＤＰＳレベルをノックダウンするための潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催するＧＰＰ Ｗｅｂ Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）またはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ｉＴ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムによって潜在的なＲＮＡ干渉配列を同定した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１（配列番号１０）、Ｕ６（配列番号４７）または７ＳＫ（配列番号４８）などのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側において、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞への形質導入を行い、特定のｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルの低下のために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込むことで、ＥＦ１アルファまたはＣＭＶ ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能とした。マイクロＲＮＡ骨格はｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇから選択した。ＲＮＡ配列を合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用せずに細胞内に直接導入した。
レンチウイルスベクターの構築：ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡのため、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温へと冷却しながらアニーリングさせた。３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターをオリゴに混合し（３：１の比）、アニーリングおよびライゲートさせた。ライゲーション反応は、室温で３０分間、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショック後に形質転換を達成した。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物抵抗性コロニー（アンピシリン抵抗性プラスミドの存在を指し示す）を回収し、ＬＢ培地中で増殖させた。オリゴ配列の挿入を確認するために、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＤＮＡミニプレップキットを用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡの発現を調節するために使用されるプロモーター用の特異的プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。以下の標的配列を使用して、ＦＤＰＳをノックダウンするための例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した：ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴ（ＦＤＰＳ標的配列＃１；配列番号４９）；
ＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃１；配列番号１）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴ
（ＦＤＰＳ標的配列＃２；配列番号５０）；
ＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴ（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃２；配列番号２）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴ
（ＦＤＰＳ標的配列＃３；配列番号５１）；
ＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃３；配列番号３）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴ
（ＦＤＰＳ標的配列＃４；配列番号５２）；および
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃４；配列番号４）。
前記のいずれも限定することなく、図２～４に詳述するように治療ベクター（本明細書中でレンチウイルスプラスミドとも称される）を構築することができる。引き続き図４を参照すると、
ベクター１は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ１配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター２は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ３配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター３は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター４は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ１配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター５は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ３配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター６は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター７は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＡＦＰ配列；ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）配列、ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター８は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＩＬ－２配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター９は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＩＬ－１５配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター１０は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＩＬ－１８配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
ベクター１１は、左から右に、５’ＬＴＲ配列；プサイ配列；ＲＲＥ配列；Ｈ１配列；ｓｈＦＤＰＳ配列；ＣＭＶ配列；ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）配列；Ｔ２Ａ配列；ＩＬ－２配列；ＷＰＲＥ配列；および３’ＬＴＲ配列を含む。
（実施例３）
ＰＣ３前立腺癌細胞におけるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）の発現
この実施例は、図５に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）によるＰＣ３細胞におけるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）またはＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）の発現が、ＧＤ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶベクター、ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）、またはＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）のいずれかを形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ－２と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで０．３７％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で２６．７％、ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）で０．４４％であった。ゾレドロン酸ありの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで８．９１％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で３５．２％、ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（ＷＴ）で８．７６％であった。
（実施例４）
ｓｈＲＮＡ ＃４によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞におけるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）の発現およびＦＤＰＳのノックダウン
この実施例は、図６に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４によるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）の発現およびＦＤＰＳ細胞のノックダウンが、ＧＤ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＨｅｐＧ２細胞にＬＶベクター、ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）、またはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ－２と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２
Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで０．６％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で９．５％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）と組み合わせて１３．２％であった。ゾレドロン酸ありの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで７．２％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で１７．８％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）と組み合わせて３０．１％であった。
（実施例５）
ｓｈＲＮＡ ＃４によるＰＣ３前立腺癌細胞におけるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）の発現およびＦＤＰＳのノックダウン
この実施例は、図７に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４によるＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）の発現およびＦＤＰＳ細胞のノックダウンが、ＧＤ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶベクター、ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）、またはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞およびＩＬ－２と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２
Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで０．１％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で２１．１％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）と組み合わせて１８．２％であった。ゾレドロン酸ありの場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで１３．６％、ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）で２５．５％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）と組み合わせて３９．６％であった。
（実施例６）
ｓｈＲＮＡ ＃４によるＨｅｐＧ２肝臓癌細胞におけるＩＬ－２の発現およびＦＤＰＳのノックダウン
この実施例は、図８に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＩＬ－２およびＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４によるＩＬ－２の発現およびＦＤＰＳ細胞のノックダウンが、ＧＤ
Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＨｅｐＧ２細胞にＬＶ－ｓｈＦＤＰＳまたはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２を形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞、およびＩＬ－２ありまたはなしで共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸のみを用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２
Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで７．５％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２で２０．１％であった。ゾレドロン酸およびＩＬ－２を用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで２７．８％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２で２４．７％であった。
（実施例７）
ｓｈＲＮＡ ＃４によるＰＣ３癌細胞におけるＩＬ－２の発現およびＦＤＰＳのノックダウン
この実施例は、図９に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＩＬ－２およびＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４によるＩＬ－２の発現およびＦＤＰＳ細胞のノックダウンが、ＧＤ
Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶ－ｓｈＦＤＰＳまたはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２を形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞、およびＩＬ－２ありまたはなしで共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸のみを用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで２４．６％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２で４６．８％であった。ゾレドロン酸およびＩＬ－２を用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで４８．６％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－２で４１％であった。
（実施例８）
ｓｈＲＮＡ ＃４によるＰＣ３癌細胞におけるＩＬ－１５の発現およびＦＤＰＳのノックダウン
この実施例は、図１０に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＩＬ－１５およびＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４によるＩＬ－１５の発現およびＦＤＰＳ細胞のノックダウンが、ＧＤ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶベクター、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ、またはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－１５を形質導入した。形質導入の３日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞、およびＩＬ－２ありまたはなしで共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸およびＩＬ－２で１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で選択した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸のみを用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで１０％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで１３％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－１５で１４．６％であった。ゾレドロン酸およびＩＬ－２を用いた場合、ＴＮＦ－αを発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のパーセントは、ＬＶベクターで１４．５％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳで２１．７％、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＩＬ－１５で２１％であった。
（実施例９）
ＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）およびＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）によるＰＣ３癌細胞およびＨｅｐＧ２癌細胞におけるＢＴＮ３Ａ３の発現
この実施例は、図１１に示すように、レンチウイルス（ＬＶ）発現ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）が単独でおよびｓｈＦＤＰＳと共に、ＰＣ３癌細胞およびＨｅｐＧ２癌細胞中でＢＴＮ３Ａ３発現を増加させることを説明する。
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、ＰＣ３前立腺癌細胞またはＨｅｐＧ２肝臓癌細胞にＬＶベクターまたはＬＶ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を３日間形質導入した。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＢＴＮ３Ａ３（ＣＤ２７７）抗体を使用してＢＴＮ３Ａ３を染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。ＰＣ３細胞およびＨｅｐＧ２細胞においてそれぞれ６から２１および３から１０への平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加があった。図１１Ｃに示すように、ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞にＬＶベクターまたはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－ＢＴＮ３Ａ３（Ｒ３８１Ｈ）を３日間形質導入した。４から１８への平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加があった。
（実施例１０）
Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入細胞およびゾレドロン酸による細胞傷害性Ｖγ２Ｖδ２細胞の刺激
この実施例は、図１２に示すように、細胞傷害性Ｖγ２Ｖδ２細胞の活性化が、ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルス（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ）およびゾレドロン酸での処理により増加することを説明する。
ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞にＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ、Ｌｖ－ＦＤＰＳ－ＩＬ－１５（ｓｈＲＮＡＦＤＰＳおよびヒトサイトカインインターロイキン１５の両方を発現する）またはＬｖ対照を形質導入し、７２時間培養した。（１）Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを形質導入された細胞、（２）Ｌｖ－ＦＤＰＳ－ＩＬ－１５を形質導入された細胞、および（３）Ｌｖ対照を形質導入されたＨｅｐＧ２細胞にゾレドロン酸（１μＭ）を加えた。処理した細胞を２４時間培養した。Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入細胞、Ｌｖ－ＦＤＰＳ－ＩＬ－１５形質導入細胞、およびＬｖ対照形質導入細胞を、Ｖγ９Ｖδ２細胞を富化したＰＢＭＣおよびタンパク質輸送インヒビター（ＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）と４時間共培養した。４時間の刺激後、細胞を回収し、Ｖδ２フィコエリトリン（ＰＥ）およびＴＮＦαアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識し、フローサイトメトリーによって標識された細胞を分析した。
１μＭのゾレドロン酸の存在下での応答性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（細胞内サイトカイン染色により測定されるＴＮＦ－αを発現する）の頻度は、Ｌｖ対照におけるよりもＬｖ－ＦＤＰＳにおいて高く、Ｌｖ－ＦＤＰＳ－ＩＬ－１５によりさらに増加することを結果は示した。１００単位／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の添加は、Ｌｖ対照と比較してＬｖ－ＦＤＰＳを形質導入されたＨｅｐＧ２によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を増加させたが、ＩＬ－２はＩＬ－１５の代わりとなり、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化についてＬｖ－ＦＤＰＳで処理されたＨｅｐＧ２とＬｖ－ＦＤＰＳ－ＩＬ－１５で処理されたＨｅｐＧ２との間の差異を低減させた。
（実施例１１）
マウスにおけるＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ対Ｌｖ対照形質導入ＰＣ３腫瘍の成長曲線
この実施例は、図１３に示すように、マウスにおけるヒト前立腺がん（ＰＣ３）細胞の腫瘍成長速度がＬｖ－ｓｈＦＤＰＳでの処置後に遅くなることを説明する。
ＮＳＧ（商標）マウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＬｖ－ｓｈＦＤＰＳまたはＬｖ対照のうちの１つを形質導入した３百万個のＰＣ３細胞を皮下注射した。腫瘍をモニターし、週に２回測定した。キャリパーを用いて各腫瘍の垂直直径を測定することにより腫瘍サイズを決定した。以下の式：ｄ２×（Ｄ／２）（式中、ｄ＝最短の直径、Ｄ＝最長の直径）を用いて腫瘍体積（ｍｍ３）を算出した。
Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳでの処理および／または形質導入をされた異種移植ＰＣ３腫瘍は、Ｌｖ対照での処理および／または形質導入をされた異種移植ＰＣ３腫瘍の成長と比較してより遅い成長を示した。例えば、Ｌｖ対照異種移植ＰＣ３腫瘍が３００ｍｍ３まで成長するには２１日を要したが、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植ＰＣ３腫瘍が３００ｍｍ３まで成長するには３０日を要した。
（実施例１２）
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞および／またはゾレドロン酸ありまたはなしで処理したときのＬｖ－ＦＤＰＳまたはＬｖ対照形質導入ＰＣ３腫瘍を異種移植したマウスの腫瘍成長および生存期間
この実施例は、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳを形質導入された後にＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞で処理された異種移植ＰＣ３腫瘍の処理は、ゾレドロン酸処理ありまたはなしで、腫瘍成長を遅くし、生存期間を増加させることを説明する。
ＮＳＧ（商標）マウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ（図１４および図１５においてＦＤＰＳノックダウンまたは「ＦＤＰＳ ＫＤ」とも称する）またはＬｖ対照（図１４および図１５において「Ｌｖ」または「対照」とも称する）のうちの１つを形質導入した３百万個のＰＣ３細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍をモニターし、腫瘍サイズが約３００ｍｍ３に達するまで測定した。キャリパーを用いて各腫瘍の垂直直径を測定することにより腫瘍サイズを決定した。以下の式：ｄ２×（Ｄ／２）（式中、ｄ＝最短の直径、Ｄ＝最長の直径）を用いて腫瘍体積（ｍｍ３）を算出した。
結果として生じた腫瘍が３００ｍｍ３のサイズに達したときに、マウスを無作為化し、８つの群にグループ化した：Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスの４つの群およびＬｖ対照形質導入マウスの４つの群。Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスおよびＬｖ対照形質導入マウスのそれぞれからの１つの群を４週にわたり週に１回のＰＢＭＣの腹腔内注射で処置した。Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスおよびＬｖ対照形質導入マウスのそれぞれからの１つの群を１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸で処置した。Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスおよびＬｖ対照形質導入マウスのそれぞれからの１つの群をＰＢＭＣとゾレドロン酸と組み合わせて処置した。Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスおよびＬｖ対照形質導入マウスのそれぞれからの１つの群を４週にわたり週に１回のＰＢＳの腹腔内注射で処置した（対照）。マウスの生存期間を、９５日より短い期間または腫瘍サイズが２０００ｍｍ３に達したときに観察した。試験の終わりに腫瘍を切除して観察した。
図１４に示すように、カプラン・マイヤー生存曲線は、Ｌｖ対照ＰＣ３異種移植（スクランブル）マウスと比較してＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ ＰＣ３異種移植マウスにより達成された有意な生存上の利点を示した。ＰＢＭＣ（その多くがＶγ９Ｖδ２細胞であった）で処置したＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植マウスの生存率は、ＰＢＭＣで処置しなかったＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植マウスの生存率より高かった。ＰＢＭＣでのＬｖ対照ＰＣ３異種移植マウスの処置は生存期間に実質的に影響しなかった。
図１５に示すように、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植ＰＣ３腫瘍の肉眼的観察は、Ｌｖ対照異種移植ＰＣ３腫瘍の腫瘍体積と比較してより小さい腫瘍体積を示した。ＰＢＭＣ（その多くがＶγ９Ｖδ２細胞であった）で処置したＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植ＰＣ３腫瘍の腫瘍体積は、ＰＢＭＣで処置しなかったＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ ＰＣ３腫瘍の腫瘍体積と比較して大きく減少した。ＰＢＭＣで処置したまたは処置しなかったＬｖ対照異種移植マウスの間で有意差は観察されず、腫瘍が２０００ｍｍ３のサイズに達したときにこれらの群の構成個体（constituent）を屠殺した。１００μｇ／ｋｇのゾレドロン酸でのＬｖ－
ｓｈＦＤＰＳ形質導入マウスおよびＬｖ対照形質導入マウスの処置は、腫瘍サイズおよび生存期間のいずれに対しても明らかな効果を示さなかった。
図１６に示すように、Ｌｖ－ｓｈＦＤＰＳ異種移植ＰＣ３腫瘍の外観の肉眼的観察は、ＰＢＭＣで処置した腫瘍の体積は、ＰＢＭＣで処置しなかったＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ ＰＣ３腫瘍の腫瘍体積と比較して大きく減少することを示した。ＰＢＭＣで処置した一部のＬｖ－ｓｈＦＤＰＳ ＰＣ３腫瘍は測定不可能な腫瘍を示した。
（実施例１３）
ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、およびＩＤＩ１を阻害するレンチウイルスベクターの開発
この実施例は、図１７に示すように、ＦＤＰＳ、ＧＧＰＳ１、およびＩＤＩ１を阻害するレンチウイルスベクターの開発を説明する。
ｓｈＲＮＡ配列のクローニング：Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ｉＴ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）のＢｒｏａｄ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからのｓｈＲＮＡ設計プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ｓｅｑ／ｓｅａｒｃｈ）を用いて潜在的なＲＮＡ干渉配列を同定した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する短鎖ヘアピンオリゴヌクレオチド配列またはＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するマイクロＲＮＡ配列はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより合成された。７０℃でインキュベートした後、室温で１時間冷却することによりオリゴヌクレオチド配列をアニールさせた。並行して、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩまたはＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩを３７℃で１時間用いてレンチウイルスベクターを消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動により精製し、ＤＮＡゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してゲルから抽出した。それぞれについてＤＮＡ濃度を決定し、５０ｎｇのベクターを２マイクロリットルのアニールしたオリゴに加えた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間ライゲーション反応を行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を２５マイクロリットルのＳｔｂＩ３コンピテント細菌細胞に加えた。４２℃での熱ショックステップを用いて形質転換を行った。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を画線し、選択したコロニーをＬＢ培地中で増やした。オリゴ配列の挿入を確認するために、ＤＮＡミニプレップキット（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、回収した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中へのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、Ｈ１またはＥＦ－１プライマーを使用してＤＮＡシークエンシングによって検証した。正しいｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、ｍＲＮＡをノックダウンする能力を試験するためにレンチウイルス粒子をパッケージングした。細胞にレンチウイルス粒子を形質導入し、３日後に回収した。タンパク質およびｍＲＮＡの両方を分析した。
ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列の同定。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００２００４．３）を使用して、ヒト細胞においてＦＤＰＳレベルを低減させるための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索した。上記で議論したようなＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃１～４に加えて、ＦＤＰＳをノックダウンするための以下の例示的なｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ配列を決定した：
ＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃４Ａ；配列番号６４）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧ
（ＦＰＤＳ ｓｈＲＮＡ配列＃４Ｒ；配列番号６５）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃４ＴＴ；配列番号６６）；
ＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴ
（ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列＃４Ｌ；配列番号６７）；
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ
（ＦＤＰＳ ｍｉＲ３０配列＃１；配列番号６８）；
ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴ
（ＦＤＰＳ ｍｉＲ３０配列＃３；配列番号６９）。
ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ配列の同定。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＳ１）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００１０３７２７７．１）を使用して、ヒト細胞においてＧＧＰＳ１を低減させるための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索した。以下の標的配列を使用して、ＧＧＰＳ１をノックダウンするための例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した：
ＧＣＴＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＣＴＡＴＡＡ
（ＧＧＰＳ１標的配列＃１；配列番号７３）；
ＧＣＴＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＣＴＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴ
（ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ配列＃１；配列番号７０）；
ＧＴＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＡ
（ＧＧＰＳ１標的配列＃２；配列番号７４）；
ＧＴＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＴＴ
（ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ配列＃２；配列番号７１）；
ＣＣＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＡ
（ＧＧＰＳ１標的配列＃３；配列番号７５）；および
ＣＣＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＣＣＴＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＴ
（ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ配列＃３；配列番号７２）。
ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ配列の同定：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓイソペンテニル二リン酸デルタ－イソメラーゼ１（ＩＤＩ１）ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００４５０８．３）を使用して、ヒト細胞においてＩＤＩ１レベルを低減させるための潜在的なｓｈＲＮＡ候補を検索した。以下の標的配列を使用して、ＩＤＩ１をノックダウンするための例示的なｓｈＲＮＡ配列を決定した：
ＧＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡ
（ＩＤＩ１標的配列；配列番号７７）；および
ＧＣＣＡＧＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴ
（ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ配列；配列番号７６）。
（実施例１４）
ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞におけるＦＤＰＳ ＲＮＡおよびタンパク質の発現
この実施例は、ＨｅｐＧ２細胞におけるｓｈＦＤＰＳによるＦＤＰＳ ＲＮＡおよびタンパク質の発現の低減を説明する。
図１８は、ＦＤＰＳタンパク質発現がｓｈＦＤＰＳにより低減することを示す。ＨｅｐＧ２細胞を、ｓｈＣｏｎまたは２つの異なるＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ配列、ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃１（配列番号１）もしくはＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４）のいずれかを含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。４８時間後、１μＭのゾレドロン酸（Ｚｏｌ）ありまたはなしで細胞を処理した。７２時間後、細胞を溶解し、抗ＦＤＰＳおよびタンパク質ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を使用してイムノブロットを行った。イムノブロットバンドのデンシトメトリーを定量し、ＬＶ－ｓｈ対照を１（１００％）に設定した。ＦＤＰＳタンパク質発現の６２％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ
＃１（配列番号１））、４８％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃１＋Ｚｏｌ（配列番号１））、４４％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４））、および３２％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃４＋Ｚｏｌ（配列番号４））の低減があった。
（実施例１５）
ｓｈＦＤＰＳヘアピンループのバリエーションを発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３前立腺癌細胞におけるＦＤＰＳタンパク質の発現
この実施例は、ｓｈＦＤＰＳヘアピンループのバリエーション；Ａ（アンチセンス－ループ－センス）、Ｒ（センス－反転ループ－アンチセンス）、ＴＴ（センス－ＴＴ－アンチセンス）、およびＬ（センス－アンチセンス）がＰＣ３細胞におけるＦＤＰＳタンパク質発現の低減に効果的であることを説明する。
ＰＣ３細胞を、非標的化配列（ｓｈＣｏｎ）またはｓｈＦＤＰＳの異なるバリエーション、すなわち、ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４）、ｓｈＦＤＰＳ－Ａ（配列番号６４）、ｓｈＦＤＰＳ－Ｒ（配列番号６５）、ｓｈＦＤＰＳ－ＴＴ（配列番号６６）、もしくはｓｈＦＤＰＳ－Ｌ（配列番号６７）を含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。７２時間後、細胞を溶解し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用してＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットを使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用してＰＣＲ反応を行った後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ ｑＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により試料を分析した。
ＴａｑＭａｎ ＦＤＰＳプローブおよびＦＤＰＳプライマーを使用して定量ＰＣＲによりＦＤＰＳ ｃＤＮＡの発現を決定した。図１９Ａについて、ＦＤＰＳフォワードプライマー（５’－ＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧ－３’）（配列番号７９）およびリバースプライマー（５’－ＣＣＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡＴ－３’）（配列番号８０）を使用して、Ｆａｍ標識ＴａｑＭａｎプローブ（５’－ＴＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣ－３’）（配列番号７８）を用いてＦＤＰＳの発現を検出した。試料をアクチンの発現に対して正規化した。アクチンは、アクチンフォワードプライマー（５’－ＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＴ－３’）（配列番号８２）およびリバースプライマー（５’－ＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴ－３’）（配列番号８３）を使用してＦａｍ標識ＴａｑＭａｎプローブ（５’－ＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣ－３’）（配列番号８１）を用いて検出した。ｓｈＣｏｎ試料の相対的なＦＤＰＳ ＲＮＡ発現を１００％に設定している。図１９Ａに示すように、ＦＤＰＳ発現の９５％（ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４））、７５％（ｓｈＦＤＰＳ－Ａ（配列番号６４））、９５％（ｓｈＦＤＰＳ－Ｒ（配列番号６５））、９０％（ｓｈＦＤＰＳ－ＴＴ（配列番号６６））および７２％（ＦＤＰＳ－Ｌ（配列番号６７））の減少があった。
タンパク質発現に対するｓｈＦＤＰＳバリエーションの効果を調べるために、ＰＣ３細胞を、ｓｈ対照またはｓｈＦＤＰＳ ＃４のバリエーションのいずれかを含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。７２時間後、細胞を溶解し、抗ＦＤＰＳおよびタンパク質ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を使用してイムノブロットを行った。イムノブロットバンドのデンシトメトリーを定量し、ＬＶ－ｓｈ対照を１（１００％）に設定した。図１９Ｂに示すように、ＦＤＰＳタンパク質発現の８７％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４））、１３％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－Ａ（配列番号６４））、８８％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ－Ｒ（配列番号６５））、８１％（ＬＶ－ＦＤＰＳ－ＴＴ（配列番号６６））、および３７％（ＬＶ－ＦＤＰＳ－Ｌ（配列番号６７））の低減があった。
（実施例１６）
ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞におけるＦＤＰＳタンパク質の発現
この実施例は、ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入された細胞におけるＦＤＰＳタンパク質の発現の減少を説明する。
ＦＤＰＳタンパク質の発現を測定するために、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞を、ｓｈ対照、ｓｈＦＤＰＳ ＃３（配列番号３）、ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８）、またはｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃３（配列番号６９）のいずれかを含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。７２時間後、ＮＰ－４０溶解緩衝液を用いて細胞を溶解し、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質を測定した。５０マイクログラムのタンパク質試料を４～１２％のビス－トリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを５％のブロッティンググレードブロッカーにおいて遮断した。抗ＦＤＰＳ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびタンパク質ローディングコントロールとして抗アクチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用してイムノブロットを行った。抗体を、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を使用してＬｉｃｏｒ ｃ－ＤｉＧｉｔ Ｂｌｏｔスキャナーを用いて検出した。イムノブロットバンドのデンシトメトリーを、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて定量し、ＬＶ対照を１（１００％）に設定した。図２０に示すように、ＦＤＰＳタンパク質の発現のそれぞれ８５％（ＬＶ－ｓｈＦＤＰＳ ＃４（配列番号４））、５９％（ＬＶ－ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８））、および５３％（ＬＶ－ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃３（配列番号６９））の低減があった。
（実施例１７）
ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ＃１を発現するレンチウイルスを形質導入されたＴＨＰ－１単球性白血病癌細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２１に示すように、ＬＶ発現ｍｉＲ３０－ＦＤＰＳ ｍｉＲＮＡ ＃１（配列番号６８）およびゾレドロン酸ありまたはなしでの処理によるＴＨＰ－１単球性白血病癌細胞における７日間のＦＤＰＳのノックダウンが、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＴＨＰ－１細胞（２×１０５細胞）にＬＶ対照またはＬＶ－ｍｉＲ３０ ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８）を７日間形質導入した。１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＴＨＰ－１細胞を５ｍＬの丸底チューブ中で４時間２×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照は２．４４％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激し、ＬＶ－ｍｉＲ３０ ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８）は２８．４％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照は２３．８％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激し、ＬＶ－ｍｉＲ３０ ＦＤＰＳ ＃１（配列番号６８）は６１．４％を刺激した。
（実施例１８）
ｓｈＧＧＰＳ１を発現するレンチウイルスを形質導入されたＨｅＬａ子宮頸癌細胞におけるＧＧＰＳ１タンパク質の発現
ＨｅＬａ細胞を、ｓｈ対照または３つの異なるＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ配列、すなわち、ＬＶ－ｓｈＧＧＰＳ１ ＃１（配列番号７０）、ＬＶ－ｓｈＧＧＰＳ１ ＃２（配列番号７１）、もしくはＬＶ－ｓｈＧＧＰＳ１ ＃３（配列番号７３）のいずれかを含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。７２時間後、細胞を溶解し、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商品番号ｓｃ－２７１６８０）の抗ＧＧＰＳ１抗体およびタンパク質ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を使用してイムノブロットを行った。イムノブロットバンドのデンシトメトリーを定量し、ＬＶ－ｓｈ対照を１（１００％）に設定した。図２２に示すように、ＦＤＰＳタンパク質の発現のそれぞれ５４％（ＬＶ－ｓｈＧＧＰＳ１ ＃１（配列番号７０））、６９％（ＬＶ－ ｓｈＧＧＰＳ１ ＃２（配列番号７１））、および５１％（ＬＶ－ ｓｈＧＧＰＳ１ ＃３（配列番号７２））の低減があった。
（実施例１９）
ｓｈＦＤＰＳまたはｓｈＧＧＰＳ１を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸で処理されたＰＣ３前立腺癌細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２３に示すように、ＬＶ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号１）を形質導入されたＰＣ３細胞におけるＦＤＰＳまたはＧＧＰＳ１の３日間のノックダウンおよびゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞中のＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶ対照またはＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＬＶ－ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照は２．７８％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は０．７７％を刺激し、ＬＶ－ＧＧＰＳ１ ＃１ ｓｈＲＮＡ（配列番号７０）は１．２３％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照は５．７１％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は１１．４％を刺激し、ＬＶ－ＧＧＰＳ１ ＃１ ｓｈＲＮＡ（配列番号７０）は１０％を刺激した。
（実施例２０）
ｓｈＦＤＰＳまたはｓｈＧＧＰＳ１を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸で処理されたＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞によるＶδ２＋ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２４に示すように、ＬＶ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）を形質導入されたＨｅｐＧ２細胞におけるＦＤＰＳまたはＧＧＰＳ１の３日間のノックダウンおよびゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＨｅｐＧ２細胞にＬＶ対照またはＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＬＶ－ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照は０．３６％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は０．９％を刺激し、ＬＶ－ＧＧＰＳ１ ＃１（配列番号７０）ｓｈＲＮＡは０．５８％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照は６．８８％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は２１．１％を刺激し、ＬＶ－ＧＧＰＳ１ ＃１ ｓｈＲＮＡ（配列番号７０）は１２％を刺激した。
（実施例２１）
ｓｈＦＤＰＳまたはｓｈＧＧＰＳ１を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸で処理されたＴＨＰ－１細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２５に示すように、Ｌｖ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）および／またはＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）を形質導入されたＴＨＰ－１細胞におけるＦＤＰＳまたはＧＧＰＳ１の３日間のノックダウンおよびゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＴＨＰ－１細胞にＬＶ対照またはＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＬｖ－ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＴＨＰ－１細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照は１．３３％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、Ｌｖ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は２．４９％を刺激し、Ｌｖ－ＧＧＰＳ１ ＃１ ｓｈＲＮＡ（配列番号７０）は１．２２％を刺激し、および両方の組み合わせは１．９１％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、Ｌｖ対照は５．７４％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、Ｌｖ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は１０．８％を刺激し、Ｌｖ－ＧＧＰＳ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７０）は４．５％を刺激し、両方の組み合わせは１１．５％を刺激した。
（実施例２２）
ｓｈＩＤＩ１を発現するレンチウイルスを形質導入されたＰＣ３前立腺癌細胞におけるＩＤＩ１タンパク質の発現
この実施例は、ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ配列をコードするレンチウイルスベクターを用いた形質導入の、イムノブロット解析により決定されるＩＤＩ１発現に対する効果を説明する。
ＰＣ３細胞を、ｓｈ対照またはＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ配列（配列番号７６）のいずれかを含有するレンチウイルスベクターに５ＭＯＩで感染させた。７２時間後、細胞を溶解し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（商品番号ＰＡ５－４４２０７）からの抗ＩＤＩ１抗体およびタンパク質ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を使用してイムノブロットを行った。イムノブロットバンドのデンシトメトリーを定量し、Ｌｖ－ｓｈ対照を１（１００％）に設定した。図２６に示すように、ＩＤＩ１タンパク質の発現の８８％の低減があった。
（実施例２３）
ｓｈＦＤＰＳまたはｓｈＩＤＩ１を発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸で処理されたＰＣ３前立腺癌細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２７に示すように、Ｌｖ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７６）を形質導入されたＰＣ３細胞におけるＦＤＰＳまたはＩＤＩ１の３日間のノックダウンおよびゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬｖ対照またはＬｖ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）またはＬＶ－ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７６）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ゾレドロン酸なしの場合、ＬＶ対照は３．８２％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は２．２８％を刺激し、ＬＶ－ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７６）は１．９２％を刺激した。ゾレドロン酸処理ありの場合、ＬＶ対照は８．６６％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）は３６．９％を刺激し、ＬＶ－ＩＤＩ１ ｓｈＲＮＡ ＃１（配列番号７６）は１２．９％を刺激した。
（実施例２４）
ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）、ＦＴＩ２７７（ＦＴＩ）、またはザラゴジン酸（ＺＡ）で処理されたＴＨＰ－１急性単球性白血病細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２８に示すように、ゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞中でのＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＺＡは、ステロール合成に関与する経路におけるスクアレン合成酵素の小分子インヒビターである。ＴＨＰ－１細胞を、ＦＤＰＳインヒビターＺｏｌ（１０μＭ）、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビターＦＴＩ（１０μＭ）、またはＺＡ（５０μＭ）のいずれかで２４時間処理した。ＴＨＰ－１細胞（２．５×１０５）を丸底の９６ウェルプレート中で５時間２．５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。非処理細胞は３．０８％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ゾレドロン酸処理は４０．１％を刺激し、ＦＴＩ２７７処理は１１．７％を刺激し、ザラゴジン酸は２．１３％を刺激した。
（実施例２５）
ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）、ＦＴＩ２７７（ＦＴＩ）、またはザラゴジン酸（ＺＡ）で処理されたＰＣ３前立腺癌細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図２９に示すように、ＬＶ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４を形質導入されたＰＣ３細胞のゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＰＣ３細胞にＬＶ対照またはＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸、１μＭのＦＴＩ２７７、または５μＭのザラゴジン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＰＣ３細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２
Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ＬＶ対照形質導入細胞では、非処理細胞は１．７３％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ゾレドロン酸処理は２．８７％を刺激し、ＦＴＩ２７７は１．６４％を刺激し、ザラゴジン酸は１．５７％を刺激した。ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）形質導入細胞では、非処理細胞は１．７７％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ゾレドロン酸は５０．３％を刺激し、ＦＴＩ２７７は２．４４％を刺激し、ザラゴジン酸は２．６６％を刺激した。
（実施例２６）
ｓｈＦＤＰＳを発現するレンチウイルスを形質導入され、ゾレドロン酸（Ｚｏｌ）、ＦＴＩ２７７（ＦＴＩ）、またはザラゴジン酸（ＺＡ）で処理されたＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞によるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化
この実施例は、図３０に示すように、ＬＶ発現ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４を形質導入されたＨｅｐＧ２細胞のゾレドロン酸での処理がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞におけるＴＮＦ－α発現を刺激することを説明する。
ＨｅｐＧ２細胞にＬＶ対照またはＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）を３日間形質導入した。形質導入の２日後、１μＭのゾレドロン酸、１μＭのＦＴＩ２７７、または５μＭのザラゴジン酸ありまたはなしで細胞を処理した。２４時間後、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞を丸底の９６ウェルプレート中で４時間５×１０５個のＰＢＭＣ細胞と共培養した。ＰＢＭＣ細胞をゾレドロン酸＋ＩＬ－２で少なくとも１１日間事前刺激してＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増やした。フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗ＴＣＲ－Ｖδ２抗体および抗ＴＮＦ－α抗体を使用してＶγ９Ｖδ２およびＴＮＦ－αを染色した後、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。生細胞をゲーティングし、Ｖδ２＋およびＴＮＦ－α＋細胞をドットブロット上で同定した。活性化された細胞傷害性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞はフローサイトグラムの右上の象限に現れた。ＬＶ対照形質導入細胞では、非処理細胞は１．８２％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ゾレドロン酸処理は３．０２％を刺激し、ＦＴＩ２７７は１．７２％を刺激し、ザラゴジン酸は１．６３％を刺激した。ＬＶ－ＦＤＰＳ ｓｈＲＮＡ ＃４（配列番号４）形質導入細胞では、非処理細胞は１．８６％のＴＮＦ－α発現Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を刺激した一方、ゾレドロン酸は５０．８％を刺激し、ＦＴＩ２７７は２．６９％を刺激し、ザラゴジン酸は２．８２％を刺激した。
本開示のある特定の好ましい実施形態を上記に記載し、具体的に例示したが、いかなる発明もそのような実施形態に限定されることは意図されない。
配列
以下の配列が本明細書中で参照され、本開示に組み込まれる。
Figure 2023133396000012
Figure 2023133396000013
Figure 2023133396000014
Figure 2023133396000015
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Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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