CN117295505A - 嗜乳脂蛋白亚家族3成员a1（btn3a1，cd277）的调节 - Google Patents

嗜乳脂蛋白亚家族3成员a1（btn3a1，cd277）的调节 Download PDF

Info

Publication number
CN117295505A
CN117295505A CN202280020423.2A CN202280020423A CN117295505A CN 117295505 A CN117295505 A CN 117295505A CN 202280020423 A CN202280020423 A CN 202280020423A CN 117295505 A CN117295505 A CN 117295505A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
btn3a1
btn3a
expression
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280020423.2A
Other languages
English (en)
Inventor
亚历山大·马尔松
穆拉德·马梅多夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
J David Gladstone Institutes
Original Assignee
University of California
J David Gladstone Institutes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California, J David Gladstone Institutes filed Critical University of California
Publication of CN117295505A publication Critical patent/CN117295505A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464429—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

本文中描述了BTN3A的正调节子和负调节子，以及用于鉴定可受益于T细胞治疗和/或多种化学治疗的对象的方法。所述对象可例如患有免疫障碍、癌症、以及其他疾病和病症。

Description

嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1(BTN3A1，CD277)的调节
优先权申请
本申请要求于2021年2月8日提交的美国临时申请序列No.63/147,050的优先权权益，其内容明确地通过引用整体并入本文。
通过引用作为文本文件提供的序列表并入
序列表作为文本文件“2213184.txt”提供于此，其创建于2022年2月3日，并且大小为475,136字节。该文本文件的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
可用作抗癌治疗剂的细胞治疗剂的一些实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、自然杀伤T(natural killer T，NKT)细胞、γδT细胞、树突细胞和CAR T细胞。使用患者来源免疫细胞也可以是有效的癌症治疗，其几乎没有副作用或没有副作用。NK细胞具有细胞杀伤效力，但也可能具有负作用(Bolourian&Mojtahedi，Immunotherapy 9(3)：281-288(2017))。树突细胞是属于疫苗概念的治疗剂，因为它们不具有直接杀伤细胞的功能，但是它们能够在患者体内将抗原特异性递送至T细胞，使得以高效率将癌细胞特异性赋予T细胞。另外，CD4+T细胞通过抗原特异性发挥辅助其他细胞的作用，并且已知CD8+T细胞具有最好的抗原特异性和细胞杀伤作用。γδT细胞可用作自体和同种异体治疗二者，不引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)。
然而，迄今为止已使用或开发的大多数细胞治疗剂对大多数癌症的临床作用有限。例如，癌细胞自身分泌抑制人体内免疫应答的物质，或不呈递适应性免疫识别这样的癌细胞所需的抗原，从而阻止合适的免疫应答发生。
发明概述
本文中描述了调节嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1(BTN3A1，CD277)表达和功能的组合物和方法。这样的组合物和方法可调节T细胞应答。T细胞可在体内或离体调节。使用本文中所述方法离体调节的T细胞可施用于可受益于这样的施用的对象。本文中还描述了用于评价测试剂和鉴定可用于调节T细胞的药剂的方法。
BTN3A1可在特定情况下抑制α-βT细胞活性，包括在癌症相关的情况下(Payne etal.，Science，2020)。因此，沉默或抑制BTN3A1或者沉默或抑制BTN3A1正调节子的组合物和方法；或增强BTN3A1负调节子活性的组合物和方法可在多种癌症和感染病应用中降低BTN3A1水平，以实现更强的α-βCD4或CD8 T细胞应答。
然而，BTN3A1也可激活称为Vgamm9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞的人γ-δT细胞亚群，其例如可参与抗肿瘤免疫监测。这样的Vγ9Vδ2 T细胞可识别靶细胞中的磷酸抗原(phosphoantigen)积聚和正在进行肿瘤转化(eoplastic transformation)的细胞上表达的分子。这样的Vγ9Vδ2 T细胞还可识别病原体来源磷酸抗原的存在并靶向感染的细胞。因此，上调或增强BTN3A1或者上调或增强BTN3A1正调节子的组合物和方法；或者沉默或抑制BTN3A1负调节子的活性的组合物和方法可在多种癌症和感染病应用中上调BTN3A1水平以实现更强的Vγ9Vδ2 T细胞应答。
本文中所述的实验揭示了多层调节框架的存在，其调节γδT细胞与BTN3A1之间的相互作用。例如，如本文中所示，BTN3A1丰度和/或可及性受IRF1、IRF8、IRF9、NLRC5、SPI1、SPIB、ZNF217、RUNX1、AMPK或其组合的转录调节。此外如本文中所示，在唾液酸化机制(CMAS)破坏之后、在内质网分选受体1(RER1)的滞留(retention)破坏之后、以及在铁-硫簇形成(FAM96B)破坏之后，还观察到BTN3A表面丰度提高。然而，CtBP1(其转录和运输调节取决于细胞NAD+/NADH比的代谢传感器)负调节BTN3A丰度。敲除PPAT(嘌呤生物合成)、GALE(半乳糖分解代谢)、NDUFA2(OXPHOS)和TIMMDC1(OXPHOS)导致BTN3A1/2转录上调。此外如本文中所示，AMPK是正在经历能量危机的细胞中BTN3A1表达的调节子。因此，本文中所示的实验结果阐明了关键的γδT细胞-癌细胞相互作用的应激调节机制。
本文中描述了用于鉴定和/或治疗可受益于T细胞治疗的候选者的方法。例如，如本文中所示，如果样品显示出本文中所述的任何BTN3A正调节子的表达水平提高(相对于参考值或阴性对照)，则从中获得样品的对象是用于T细胞治疗的良好候选者。然而，如果样品显示出本文中所述的任何BTN3A负调节子的表达水平提高(相对于参考值或阴性对照)，则从中获得样品的对象可能不是用于T细胞治疗的良好候选者。
附图简述
图1A-1E示出了Vγ9Vδ2 T细胞与Daudi细胞全基因组敲除文库共培养，揭示了哪些遗传敲除导致Daudi癌细胞杀伤逃逸和哪些导致经由T细胞的Daudi癌细胞杀伤增强。图1A是与Daudi-Cas9细胞的全基因组敲除(knockout，KO)文库共培养的Vγ9Vδ2 T细胞的筛选示意图(ZOL＝唑来膦酸盐(zoledronate)，其增强磷酸抗原)。Vγ9Vδ2 T细胞杀伤一些Daudi细胞敲除突变体，其通过将gRNA丰度与输入群体中的gRNA丰度进行比较来检测。图1B是甲羟戊酸途径的示意图。磷酸抗原由交叉阴影线背景表示，并且示出了唑来膦酸盐(ZOL)对磷酸抗原增强的作用的基因座。图1C分别图解示出了增强杀伤或逃逸杀伤的Daudi-Cas9KO细胞中从负富集(左)到正富集(右)的所有18,010个基因的排序。左边(圆形符号)标识的基因增强癌细胞杀伤，而右边(方形符号；右框)标识的那些帮助癌细胞逃逸杀伤。x轴上的垂直线表示左框中所列OXPHOS复合物I至V亚基的排序位置(rank position)。OXPHOS系统包含五个多亚基蛋白质复合物，其中NADH-泛醌氧化还原酶(复合物1，CI)是进入电子传递链(electron transport chain，ETC)的主要电子进入点，其对线粒体ATP合成至关重要。方框仅示出了显著命中物的子集。所有非显著基因点均以菱形符号显示。除ICAM1和SLC37A3的#FDR＜0.1之外，错误发现率(false-discovery rate，FDR)＜0.05。图1D示出了甲羟戊酸途径中具有特定遗传KO的细胞的富集或耗竭及其统计学显著性(倍数变化[fold change，FC])的示意图。仅针对显著命中物(FDR＜0.05)显示指示log2(倍数变化)的交叉影线。如所示出的，癌细胞内某些甲羟戊酸途径酶(HMGCS1、MVD、FDPS、GGPS1)的敲除显著增强了T细胞介导的对这些癌细胞的杀伤。然而，敲除一些甲羟戊酸途径酶(ACAT2、HMGCR、SQLE)，其中两个位于FDPS磷酸抗原合成的上游，并未增强癌细胞杀伤。图1E图示性地示出了针对所选显著命中物的单独单指导RNA(sgRNA)的富集或耗竭，在显示所有sgRNA分布的梯度上叠加。如所示出的，一些基因(例如，FDPS、PPAT、NDUFA3、NDUFA2、NDUFB7、NDUFA6)被敲除的细胞频繁地被T细胞杀伤，因此仅在少数细胞中检出这些基因的sgRNA。然而，敲除另一些基因(BTN3A1、ACAT2、BTN2A1、IRF1)的细胞未被T细胞如此频繁地杀伤，因此在大量细胞中检出了这些基因的sgRNA。对于图1B至1E，n＝3个PBMC供体；通过MAGeCK算法计算富集和统计学。
图2A至2L示出了BTN3A表面表达的调节与T细胞杀伤的增强和逃逸的重叠。图2A是示出了针对BTN3A(CD277)表面表达的全基因组敲除(KO)筛选的示意图。产生Daudi-Cas9敲除突变体细胞文库，并针对BTN3A(CD277)的表达进行筛选。对顶部和底部25％BTN3A+细胞进行分选，以用于下游下一代测序(next generation sequencing，NGS)分析。图2B是示出了筛选一致性的示意图。如所示出的，敲除一些基因(例如，内质网分选受体1，RER1)可提高BTN3A表面表达，并且也可提高癌细胞杀伤——这样的基因是BTN3A(未突变时)的负调节子。然而，另一些基因(例如，干扰素调节因子1(Interferon regulatory factor 1，IRF1)、IRF8、IRF9、NLRC5、SPIB、SPI1、TIMMDC1)的缺失可降低BTN3A表面表达，并且还降低癌细胞杀伤——这样的基因是BTN3A(未突变时)的正调节子。图2C图示性地示出了所有18,010个基因在表达低水平的BTN3A(BTN3A低)的Daudi-Cas9 KO细胞相对于表达高水平的BTN3A(BTN3A高)的Daudi-Cas9细胞中按照其负到正细胞富集的排序。突出显示了一致命中物(BTN3A筛选FDR＜0.01，共培养筛选FDR＜0.05)和非一致命中物(BTN3A筛选FDR＜0.01)。图下方示出了KEGG基因集的分布(KEGG基因参见genome.jp/kegg/genes.html)。图2D图示性地示出了在分成BTN3A表面表达的正调节子(圆圈)和负调节子(三角形)的一致命中物中的筛选效应量(LFC)的相关性。图2E是示出了在两个筛选中KO细胞中哪个嘌呤生物合成途径基因被耗竭的示意图。基因名称的交叉阴影线背景指示log2(倍数变化)，但仅针对显著命中物(FDR＜0.05)。图2F示出了与AAVS1对照相比，单基因KO的子集的表面BTN3A荧光的代表性直方图。图2G图示性地示出了y轴上标识的每个基因缺失的两个不同KO在转导之后13天的表面BTN3A中位荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)，BTN3A1除外，其中示出了一个KO的数据。将结果相对于AAVS1对照中的BTN3A MFI归一化，并进行log2转换。除BTN3A1(一个KO)之外，每个基因缺失分析了两个不同的KO。示出了来自三个独立实验的合并数据。AAVS1 n＝36，BTN3A1 n＝9，n＝18所有其他缺失。图2H图示性地示出了具有y轴上所列不同遗传KO的细胞，在转导之后13天时G115 Vγ9Vδ2克隆的TCR四聚体染色荧光(MFI)。示出了一个实验的代表性数据。AAVS1 n＝12，BTN3A1 n＝3，n＝6所有其他缺失。图2I图示性地示出了对于具有不同类型的基因KO的细胞，相对于ACTB转录物归一化的BTN3A1转录物的qPCR数据。来自两个独立实验的合并数据。n＝5至6，AAVS1 n＝12。图2J图示性地示出了对于具有不同类型的基因KO的细胞，相对于ACTB转录物归一化的BTN3A2转录物的qPCR数据。来自两个独立实验的合并数据。n＝5至6，AAVS1 n＝12。单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验用于图2G至2J。平均值±SD。p＜0.0001(***)，p＜0.001(***)，p＜0.01(**)，p＜0.05(*)。图2K图示性地示出了用不同量的唑来膦酸盐处理72小时的活Daudi-Cas9细胞上的BTN3A表达。来自三个独立实验之一的代表性数据。n＝3/ZOL剂。平均值±SD。图2L图示性地示出了细胞系中的BTN2A1水平，其各自具有沿x轴标识的敲除基因。通过qPCR来测量BTN2A1水平。基因的类型通过交叉影线指示，如右边的图例所示。
图3A至3M示出了BTN3A的转录和代谢调节。图3A是氧化磷酸化/电子转运连接的磷酸化途径(OXPHOS)的示意图，其中标识了相关的抑制剂和基因敲除。图3B图示性地示出了在RPMI(+谷氨酰胺，+胎牛血清，+青霉素/链霉素，-葡萄糖，-丙酮酸盐)中在不同葡萄糖浓度下培养3天的Daudi-Cas9敲除细胞中的表面BTN3A中位荧光强度(MFI)。将荧光数据相对于无葡萄糖(0g/L)培养的细胞的荧光数据归一化。n＝4/条件，数据合并自两个独立的实验。单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验。图3C图示性地示出了在完全RPMI中用以下的OXPHOS抑制剂培养72小时的野生型(wildtype，WT)Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3A MFI：复合物I(鱼藤酮，圆圈)、复合物V(寡霉素A，三角形Δ)和线粒体膜电位(羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙，FCCP，倒置三角形)。n＝4/条件，合并两个独立实验。单因素ANOVA与Dunnett多重比较检验。图3D图示性地示出了在完全RPMI中，与对照(正方形)相比，用复合物III的OXPHOS抑制剂(抗霉素A，圆圈)培养72小时的野生型(WT)Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3AMFI。n＝3/条件，来自两个实验之一的代表性数据。双尾未配对Student’s t检验。图3E图示性地示出了在完全RPMI中用糖酵解阻断2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)或等量的DMSO(载剂)培养72小时的WT Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3A MFI。n＝3/条件。来自三个独立实验之一的代表性数据。图3F图示性地示出了在完全RPMI中，用AICAR(N1-(β-D-呋喃核糖基)-5-氨基咪唑-4-甲酰胺)、AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)的变构激活剂或等量的DMSO(载剂)培养72小时的WT Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3AMFI。n＝3/条件。来自三个独立实验之一的代表性数据。图3G图示性地示出了在完全RPMI中，用化合物991或等量的DMSO(载剂)培养72小时的WT Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3AMFI。n＝3/条件。来自两个独立实验之一的代表性数据。双尾未配对Student’s t检验。图3H图示性地示出了用80μM化合物991(DMSO)、DMSO(载剂)、0.5mM AICAR(水性)或空白(nothing)处理72小时的WT Daudi-Cas9细胞的Vγ9Vδ2 G115克隆四聚体的荧光(MFI)。n＝4/条件。来自两个独立实验之一的代表性数据。双尾未配对Student’s t检验。图3I图示性地示出了在用化合物991处理的Daudi-Cas9细胞中通过qPCR检测的BTN2A1、BTN3A1和BTN3A2转录物的表达水平，其相对于ACTB转录物内部归一化并相对于经DMSO(赋形剂)处理的细胞归一化。n＝4/条件。来自三个独立实验之一的代表。双尾未配对Student’s t检验。图3J图示性地示出了在用递增量的化合物C和AMPK激活剂AICAR共处理的WT Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3AMFI。与经DMSO处理的对照相比，n＝3/条件。来自两个独立实验之一的代表性数据。图3K图示性地示出了在用指定的OXPHOS/糖酵解抑制剂(寡霉素、FCCP、2-DG、鱼藤酮)之一和递增量的化合物C共处理的WT Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3A MFI。n＝3/条件。来自三个独立实验之一的代表性数据。平均值±SD。p＜0.0001(***)，p＜0.001(***)，p＜0.01(**)，p＜0.05(*)。图3L图示性地示出了在PPAT KO细胞中或在AAVSI KO细胞中用沿X轴标识的化合物处理72小时的Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3A MFI。作为对照，将等分试样的KO细胞也用等量的DMSO(载剂)进行处理。图3M图示性地示出了用AMPK激动剂A-769662或等量的DMSO(载剂)处理72小时的Daudi-Cas9细胞中的表面BTN3A MFI。
图4A至4F示出了本文中所述的共培养筛选和BTN3A筛选与患者存活相关，尤其是在涉及Vγ9Vδ2 T细胞浸润的癌症中。图4A图示性地示出了表现出高表达水平或低表达水平的共培养筛选基因特征(命中物)的低级别胶质瘤(low-grade glioma，LGG)患者(n＝529)的存活。图4B图示性地示出了表达高水平的T细胞受体γ变体9(T Cell ReceptorGamma Variable 9，TRGV9)/T细胞受体γ变体(TRDV2)(即，TRGV9/TRDV2-高)或低水平的TRGV9/TRDV2(TRGV9/TRDV2-低)同时表现出高表达或低表达的共培养筛选基因特征(命中物)的LGG患者的存活。图4C图示性地示出了表现出高表达水平或低表达水平的共培养筛选基因特征(命中物)的膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)患者(n＝433)的存活。图4D图示性地示出了按高表达和低表达的共培养筛选基因特征(命中物)分开的TRGV9/TRDV2-高或TRGV9/TRDV2-低BLCA患者的存活。对于图4A至4D，使用了对数秩检验(Kaplan-Meier存活分析)。对于图4A和4C，沃尔德检验(Wald test)(Cox回归)，用Benjamini-Hochberg多重比较校正进行调整(padj)。图4E图示性地示出了按高表达和低表达的BTN3A表达筛选基因特征(命中物)分开的总LGG患者的存活。使用对数秩检验(Kaplan-Meier存活分析)和沃尔德检验(Cox回归)，用Benjamini-Hochberg多重比较校正进行调整(padj)。图4F图示性地示出了按高表达和低表达的BTN3A表达筛选基因特征(命中物)分开的TRGV9/TRDV2-高/低LGG患者的存活。使用对数秩检验(Kaplan-Meier存活分析)和沃尔德检验(Cox回归)，用Benjamini-Hochberg多重比较校正进行调整(padj)。
发明详述
本文中描述了用于鉴定和治疗可受益于T细胞治疗的对象的方法。本文中还描述了用于检测和调节BTN3A表达和/或活性的方法和组合物，其可用于调节T细胞应答。
本文中描述了可涉及从对象获得样品并将样品中的基因表达水平与一个或更多个参考值进行比较的方法，其中比较了以下基因的表达水平：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。所述方法还可包括将从中获得样品的对象分类为患有癌症(即，癌症患者)或不患有癌症。所述方法还可包括基于癌症患者的样品中那些基因的表达将所述患者分类为T细胞治疗的候选者。所述方法还可涉及向鉴定为T细胞治疗的候选者的癌症患者施用T细胞。
例如，本文中描述了用于治疗或鉴定可受益于施用T细胞(包括Vγ9Vδ2 T细胞)的癌症患者的方法。所述方法可包括：(a)将取自一个或更多个怀疑患有癌症的对象的一个或更多个样品中的以下基因的各自表达水平与所述基因表达的各自参考值进行比较：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合；以及(b)从一个或更多个对象(可治疗的对象)获得表现出以下基因的表达水平改变的T细胞：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。所述方法还可涉及扩增从一个或更多个可治疗对象获得的T细胞以提供一个或更多个T细胞群。所述方法还可涉及向一个或更多个可治疗对象施用一个或更多个T细胞群。在一些情况下，扩增和/或施用的T细胞是Vγ9Vδ2 T细胞。
因此，本文中所述BTN3A和/或BTN3A调节子的变化可用于检测癌症、感染或其组合。对测定混合物中癌细胞上BTN3A1的检测和/或对其进行定量可用于鉴定癌细胞是否可被T细胞或本文中所述的任何调节子或调节剂治疗。
样品
可通过评价本文中所述基因的表达模式或谱来评估可受益于T细胞治疗或通过调节BTN3A或其任何调节子的表达或活性而受益的患有癌症的对象。例如，可评价BTN3A和/或其任何调节子的表达水平以鉴定可受益于T细胞治疗和/或通过施用可调节BTN3A或其任何调节子的药剂而受益的候选者。一个或更多个对象样品中表达特别具有信息性的基因包括，例如，参与氧化磷酸化的BTN3A调节子基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。术语对象或对象样品是指无论健康和/或疾病状态的个体。对象可以是患者、研究参与者、对照对象、筛选对象或从中获得样品并且使用本文中所述的标志物和/或方法来评估的任何其他类别的个体。因此，对象可被诊断为患有癌症、可呈现一种或更多种癌症症状、可具有诱发因素(例如家族(遗传)或病史(医学)因素)、可正在接受癌症的治疗或疗法等。或者，对象可在关于任何上述因素或标准方面是健康的。应当理解，本文中使用的术语“健康的”是相对于癌症状态的，因为术语“健康的”不可被定义为对应于任何绝对的评价或状态。因此，参照任何特定疾病或疾病标准而定义为健康的个体实际上可被诊断为患有任何一种或更多种其他疾病，或表现出任何一种或更多种其他疾病标准，包括一种或更多种除癌症以外的感染或病症。健康对照优选无任何癌症。
在一些情况下，用于检测、预测、评估癌症的预后和/或评估对象的T细胞治疗的益处的方法可包括收集包含细胞或组织的生物样品，例如体液样品、组织样品或原发性肿瘤组织样品。“生物样品”意指其中可检测基因表达的任何取样的细胞、组织或体液。这样的生物样品的实例包括但不限于活检和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴、尿、唾液、乳头抽吸物、妇科液体、造血细胞、精液或任何其它身体分泌物或其衍生物。血液可包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中，生物样品包括细胞，特别是造血细胞。生物样品可通过多种技术从对象获得，所述技术包括例如，通过使用针抽出或抽吸细胞或体液、通过刮擦或擦拭区域、或通过移出组织样品(即，活检)。在一些实施方案中，样品包括造血细胞、免疫细胞、B细胞或其组合。
可稳定样品以用于评价一个或更多个对象样品中以下基因的表达水平和/或对其进行定量：氧化磷酸化(OXPHOS)基因、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。
在一些情况下，可将固定剂和染色溶液剂施加至一些细胞或组织以用于保存标本并便于检查。可将生物样品转移至玻片以用于在放大条件下观察。生物样品可以是福尔马林固定的和/或石蜡包埋的乳腺组织样品。然而，在一些情况下，例如通过破坏细胞、破坏蛋白质、添加RNA酶抑制剂或其组合来立即处理样品以保存RNA。
样品可具有癌细胞，但也可不具有癌细胞。在一些情况下，样品可包括白血病细胞、淋巴瘤细胞、霍奇金病(Hodgkin’s Disease)细胞、软组织和骨的肉瘤、肺癌细胞、间皮瘤、食管癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肝胆癌细胞、小肠癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、直肠癌细胞、肾癌细胞、尿道癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、内分泌系统癌细胞、皮肤癌细胞、中枢神经系统癌细胞、皮肤和/或眼内来源的黑素瘤细胞、AIDS相关癌细胞或其组合。另外，处于任何进展阶段的转移性癌细胞，例如微转移性肿瘤细胞、大转移性肿瘤细胞(megametastatic tumor cell)和复发性癌细胞，都可在测定中测试。例如，如本文所解释的，样品中恶性病相关应答特征表达水平可相对于来自同一对象的正常组织或来自另一对象的样品或来自正常对象样品的储库来评估。
基因表达
多种方法可用于评价一个或更多个对象样品中的以下基因的表达水平和/或对其进行定量：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。“评价和/或定量”是指确定RNA转录物或其表达产物(即，蛋白质产物)的量或存在。
BTN3A基因的实例包括BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、其变体和同种型、或其组合。一种或更多种转录因子基因的实例包括CTBP1、IRF1、IRF8、IRF9、NLRC5、RUNX1、ZNF217或其组合。一种或更多种甲羟戊酸途径基因的实例包括FDPS、HMGCS1、MVD、FDPS、GGPS1或其组合。一种或更多种嘌呤生物合成(PPAT)基因的实例包括PPAT、GART、ADSL、PAICS、PFAS、ATIC、ADSS、GMPS或其组合。CtBP1是代谢传感基因的一个实例。
存在许多OXPHOS基因，并且这些OXPHOS基因中的任一者的表达可在本文中所述的方法中进行评价/测量。例如，以下基因中的一种或更多种为OXPHOS基因：ATP5A1，ATP5B，ATP5C1，ATP5D，ATP5E，ATP5F1，ATP5G1，ATP5G2，ATP5G3，ATP5H，ATP5I，ATP5J，ATP5J2，ATP5L，ATP5O，ATP5S，COX4I1，COX4I2，COX5A，COX5B，COX6A1，COX6A2，COX6B1，COX6B2，COX6C，COX7A1，COX7A2，COX7B，COX7B2，COX7C，COX8A，COX8C，CYC1，NDUFA1，NDUFA10，NDUFA11，NDUFA12，NDUFA13，NDUFA2，NDUFA3，NDUFA4，NDUFA5，NDUFA6，NDUFA7，NDUFA8，NDUFA9，NDUFAB1，NDUFB1，NDUFB10，NDUFB11，NDUFB2，NDUFB3，NDUFB4，NDUFB5，NDUFB6，NDUFB7，NDUFB8，NDUFB9，NDUFC1，NDUFC2，NDUFS1，NDUFS2，NDUFS3，NDUFS4，NDUFS5，NDUFS6，NDUFS7，NDUFS8，NDUFV1，NDUFV2，NDUFV3，SDHA，SDHB，SDHC，SDHD，UQCR10，UQCR11，UQCRC1，UQCRC2，UQCRFS1，UQCRH，UQCRQ，或其组合。
在一些情况下，以下OXPHOS基因中的一种或更多种可以以本文中所述方法评价/测量：ATP5、ATP5A1、ATP5B、ATP5D、ATP5J2、COX(例如，COX4I1、COX5A、COX6B1、COX6C、COX7B、COX8A)、GALE、NDUFA(例如，NDUFA2、NDUFA3、NDUFA6和/或NDUFB7)、NDUFB、NDUFC2、NDUFS、NDUF5V1、SDHC、TIMMDC1、UQCRC1、UQCRC2或其组合。
用于检测基因表达的方法，包括基因表达谱分析，可涉及基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组织化学方法和基于蛋白质组学的方法。该方法一般地涉及检测由所述基因编码的表达产物(例如，mRNA或蛋白质)。
在一些情况下，对RNA转录物进行逆转录和测序。例如，定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)可用于评价基因的表达水平。在一些情况下，下一代测序(next generation sequencing，NGS)可用于评价表达水平。例如，使用NGS的RNA测序(RNA sequencing，RNA-Seq)可检测已知和新的转录物二者。因为RNA-Seq不需要预先设计的探针，因此数据集是无偏倚的，允许无假设的实验设计。
在一些情况下，使用基于PCR的方法，可包括逆转录PCR(reverse transcriptionPCR，RT-PCR)(Weis et al.，TIG 8：263-64，1992)，基于阵列的方法例如微阵列(Schena etal.，Science 270：467-70，1995)，或其组合。“微阵列”意指有序排列的可杂交阵列元件，例如，如在基底上的多核苷酸探针。术语“探针”是指能够与特定的目的靶生物分子选择性结合的任何分子，例如，所述靶生物分子为由以下一种或更多种基因编码的核苷酸转录物或蛋白质，或者对应于以下一种或更多种基因的核苷酸转录物或蛋白质：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。探针可特别设计为经标记的。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始物质通常是从生物样品中分离的总RNA，所述生物样品例如一种或更多种类型的细胞或组织样品、一种或更多种类型的造血细胞、一种或更多种类型的肿瘤或肿瘤细胞系、一种或更多种类型的相应的正常组织或细胞系、或其组合。如果RNA的来源是来自对象的样品，则RNA(例如，mRNA)可例如从稳定、冷冻或存档的石蜡包埋或固定(例如福尔马林固定)的组织或细胞样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取。
用于RNA提取的一般方法是可用的并在分子生物学的标准教科书(包括Ausubelet al.，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York1987-1999)中公开。例如，在Rupp and Locker(Lab Invest.56：A67，1987)和De Andres etal.(Biotechniques 18：42-44，1995)中公开了用于从石蜡包埋组织中提取RNA的方法。在一些情况下，可使用商用制造商(例如Qiagen(Valencia，Calif.))提供的纯化试剂盒、缓冲液套组和蛋白酶根据制造商说明进行RNA分离。例如，可使用Qiagen RNeasy微柱来分离来自细胞的总RNA。另一些市售RNA分离试剂盒包括MASTERPURETM完整DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre，Madison，Wis.)以及石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion，Austin，Tex.)。例如，可使用RNA Stat-60(Tel-Test，Friendswood，Tex.)来分离来自组织样品的总RNA。可例如通过氯化铯密度梯度离心来分离从组织或细胞样品(例如肿瘤)制备的RNA。另外，可使用可用的技术例如如Chomczynski的一步RNA分离方法(美国专利No.4,843,155)容易地处理大量的组织样品。
分离的RNA可用于杂交或扩增测定，包括但不限于PCR分析和探针阵列。一种用于检测RNA水平的方法涉及使分离的RNA与核酸分子(探针)接触，该核酸分子(探针)可与被检测基因编码的mRNA杂交。核酸探针可以是例如全长cDNA或其一部分，例如长度为至少7、15、30、60、100、250或500个核苷酸并且足以在严格条件下与以下任一者特异性杂交的寡核苷酸：参与氧化磷酸化的RNA转录物的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、或这些基因的组合、BTN3A基因、或者任何其DNA或RNA片段。mRNA与探针杂交表明所讨论的以下基因正在表达：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。
在一些情况下，来自样品的mRNA例如通过将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上运行并将mRNA从凝胶转移至膜(例如硝酸纤维素)而被固定在固体表面上并与探针接触。在另一些情况下，例如在Agilent基因芯片阵列中，探针被固定在固体表面，并使mRNA与探针接触。技术人员可容易地调整可用的mRNA检测方法以用于检测以下基因的表达水平：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。
用于确定样品中基因表达水平的另一种方法可涉及一种或更多种mRNA(或其cDNA)的核酸扩增，例如通过RT-PCR(美国专利No.4,683,202)、连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-93，1991)、自持续序列复制(Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-78，1990)、转录扩增系统(Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-77，1989)、Q-β复制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 6：1197，1988)、滚环复制(美国专利No.5,854,033)或任何其它核酸扩增方法，随后使用可用技术检测扩增的分子。如果这样的核酸分子以非常低的数目存在，则这些检测方案对于核酸分子的检测是特别有用的。
在一些情况下，通过定量RT-PCR评估基因表达。许多不同的PCR或QPCR方案是可用的，并且可直接应用或经调整以用于参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。一般而言，在PCR中，通过与至少一个寡核苷酸引物或寡核苷酸引物对反应来扩增靶多核苷酸序列。引物与靶核酸的互补区杂交，并且DNA聚合酶延伸引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，一种尺寸的核酸片段在反应产物中占优势(靶多核苷酸序列，其是扩增产物)。重复扩增循环以提高单一靶多核苷酸序列的浓度。反应可在常用于PCR的任何热循环仪中进行。然而，优选具有实时荧光测量能力的循环仪，例如(Cepheid，Sunnyvale，Calif.)，ABI PRISM(Applied Biosystems，Foster City，Calif.)，ROTOR-GENETM(Corbett Research，Sydney，Australia)，/>(Roche Diagnostics Corp，Indianapolis，Ind.)，/>(Biorad Laboratories，Hercules，Calif.)和/>(Stratagene，La Jolla，Calif.)。
在一些情况下，优选定量PCR(quantitative PCR，QPCR)(也称为实时PCR)，因为其不仅提供定量测量，而且还减少时间和污染。在一些情况下，由于对新鲜冷冻组织和专业实验室设备的要求，因此全基因表达谱分析技术的可用性受到限制，使得这样的技术在临床环境中的常规使用变得困难。然而，QPCR基因测量可应用于标准福尔马林固定石蜡包埋临床肿瘤块，例如用于存档组织库和常规手术病理标本的那些(Cronin et al.(2007)ClinChem 53：1084-91)[Mullins 2007][Paik 2004]。本文中使用的“定量PCR(或“实时QPCR”)是指在PCR扩增过程发生时对其进行直接监测，而不需要对反应产物重复取样。在定量PCR中，反应产物在其产生并在信号升高到高于背景水平之后但在反应达到平台期之前追踪时，可通过信号传导机制(例如荧光)来监测。达到可检测或“阈值”荧光水平所需的循环数直接随PCR过程开始时可扩增靶标的浓度而变化，使信号强度的测量能够实时提供样品中靶核酸量的测量。
在一些情况下，使用微阵列进行表达谱分析。由于不同实验之间的可再现性，因此微阵列特别适合于此目的。DNA微阵列为同时测量大量基因的表达水平提供了一种方法。每个阵列由与固体支持物连接的捕获探针可再现图案组成。将标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，并随后通过激光扫描进行检测。确定阵列上每个探针的杂交强度，并将其转换为表示相对基因表达水平的定量值。参见，例如，美国专利No.6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860、和6,344,316。高密度寡核苷酸阵列特别可用于确定样品中大量RNA的基因表达谱。使用机械合成方法来合成这些阵列的技术在例如美国专利No.5,384,261中描述。虽然可使用平面阵列表面，但阵列可在几乎任何形状的表面上制造，或者甚至在多个表面上制造。阵列可以是在珠、凝胶、聚合物表面、纤维(例如光纤)、玻璃或任何其他合适的基底上的核酸(或肽)。参见，例如，美国专利No.5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。阵列可以以使得允许诊断或全包装置(all-inclusive device)的其他操作的这样的方式包装。参见，例如，美国专利No.5,856,174和5,922,591。
当使用微阵列技术时，可将cDNA克隆的PCR扩增插入物以密集阵列施加至基底。固定在微芯片上的微阵列基因适合于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过对从目的组织中提取的RNA进行逆转录并入荧光核苷酸来产生。施加至芯片的经标记的cDNA探针与阵列上的每个DNA点特异性杂交。在严格洗涤以去除非特异性结合的探针之后，通过共聚焦激光显微术或通过另一种检测方法(例如CCD相机)对芯片进行扫描。对每个阵列元件的杂交进行定量以用于评估相应的mRNA丰度。
借助于双色荧光，从两个RNA来源产生的分别标记的cDNA探针可与阵列成对杂交。因此，来自两个来源的对应于每个特定基因的转录物的相对丰度被同时确定。小型化的规模可用于杂交，其为大量基因的表达模式提供了方便和快速的评价。这样的方法已显示出具有检测罕见转录物(以每个细胞数个拷贝表达)所需的敏感性，并且可再现地检测表达水平的至少约两倍差异(Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：106-49，1996)。微阵列分析可例如通过使用Affymetrix GenChip技术或Agilent喷墨微阵列技术(Agilent inkjet microarray technology)按照制造商的方案通过市售设备进行。用于基因表达的大规模分析的微阵列方法的开发使得在多种肿瘤类型中系统地检索癌症分类和结局预测的分子标记物成为可能。
本文中使用的“水平”是指转录产物(例如mRNA)或翻译产物(例如蛋白质或多肽)的量或浓度的量度。
本文中使用的“活性”是指转录产物或翻译产物产生生物作用的能力的量度或生物活性分子水平的量度。
本文中使用的“表达水平”进一步是指基因表达水平或基因活性。基因表达可定义为通过转录和翻译利用基因中包含的信息导致基因产物的产生。
与本文中所述基因或生物标志物的表达相关的术语“提高的”或“提高”通常意指统计学上显著量的提高。为了避免任何疑问，术语“提高的”或“提高”意指与参考值相比提高至少10％，例如提高至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或高达且包括100％提高，或者与参考值或水平相比10％至100％之间的任何提高，或者与参考水平相比至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、至少约10倍提高、2倍至10倍之间的任何提高、或至少约25倍提高、或更多。在一些实施方案中，与参考值相比，提高为至少约1.8倍提高。
类似地，与本文中所述基因或生物标志物的表达相关的术语“减少”、或“降低的”或“降低”、或“抑制”通常是指统计学上显著量的降低。然而，为了避免疑问，“降低的”、“降低”或“减少”、或“抑制”意指与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或高大且包括100％降低(例如与参考样品相比无水平或水平不可检测)，或者与参考水平相比10％至100％之间的任何降低。
“参考值”是预定的参考水平，例如如来自健康对象群体的生物样品中以下基因中每一种的表达水平的平均值或中位数：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。参考值可以是与所测试对象的实际年龄相匹配的实际年龄组中每个基因或生物标志物的表达水平的平均值或中位数。在一些实施方案中，参考生物样品也可以是性别匹配的。在一些实施方案中，阳性参考生物样品可以是来自以下的含癌组织：例如1期、2期、3期、或1级、2级、3级癌症、非转移性癌症、未经治疗癌症、激素治疗抗性癌症、HER2扩增的癌症、三阴性癌症、雌激素阴性癌症的特定患者亚组，或其它相关的生物学或预后亚组。
如果基因或生物标志物的表达水平大于或小于参考或平均表达水平，则基因或生物标志物的表达水平被分别称为是“提高的”或“降低的”，如本文所定义的那些术语。本文中说明了用于对基因或生物标志物的表达进行分类、确定恶性病相关应答特征状态、以及对样品的恶性病相关应答特征生物标志物的表达进行评分的示例性分析方法。
BTN3A
BTN2A1-3A1-3A2细胞表面复合物可被甲羟戊酸途径的磷酸抗原通过与BTN3A1胞内结合而激活，从而使得BTN2A1与Vγ9Vδ2 T细胞受体(T cell receptor，TCR)结合。以前的Vγ9Vδ2 T细胞-靶细胞相互作用模型依赖于表面嗜乳脂蛋白复合物的静态丰度，其中磷酸抗原丰度是主要的相关变量。
如本文所确定的，BTN3A1丰度是一个重要变量。然而，该应用也表明，BTN3A1丰度受多种途径、转录开关和细胞代谢状态调节。BTN3A1水平和细胞代谢状态可向监视T细胞发信号，即靶细胞可能被转化或可能受到应激。
本文中所述的实验揭示了存在多层调节框架，其通过进行以下来调节这种相互作用：调节BTN3A1的丰度和/或可及性(通过转录调节子(例如，IRF1、NLRC5、ZNF217、RUNX1))、糖基化和唾液酸化(CMAS)、铁-硫簇形成(FAM96B)、运输(RER1)、代谢传感(CtBP1)和多种代谢途径(嘌呤生物合成的PPAT；OXPHOS的NDUFA2和TIMMDC1；半乳糖代谢的GALE)。此外如本文中所示，AMPK是经历能量危机的细胞中BTN3A1表达的调节子。因此，本文中所示的实验结果阐明了关键γδT细胞-癌细胞相互作用的应激调节机制。
嗜乳脂蛋白(butyrophilin，BTN)基因是一组主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)相关基因，其编码具有2胞外免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)结构域和胞内B30.2(PRYSPRY)结构域的I型膜蛋白。人BTN基因的三个亚家族位于MHC I类区域：单拷贝BTN1A1基因(MIM 601610)和BTN2(例如，BTN2A1；MIM613590)以及BTN(例如，BNT3A1)基因，它们经过串联重复，导致各自的三个拷贝。
因此，至少有三种BTN3A基因在人中已被表征，即BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3，它们是位于主要组织相容性复合体I类区域的端粒末端的嗜乳脂蛋白基因大家族的成员，并且编码细胞表面表达的蛋白质，所述蛋白质在其胞外结构域中具有高度相似性，但在其胞内结构域的结构域结构中存在差异。BTN3A1和BTN3A3二者都包含胞内B30.2结构域，而BTN3A2则不包含。B30.2结构域最初被鉴定为由人I类主要组织相容性复合体区域(染色体6p21.3)中的外显子(命名为B30-2)编码的蛋白质结构域。
例如，智人(Homo sapiens)嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1(butyrophilin subfamily3 member A1，BTN3A1)同种型a前体可以是513个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为NP_008979.3(GI：37595558)(SEQ ID NO：1)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型b前体可以是352个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为NP_919423.1(GI：37221189)(SEQ ID NO：2)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型c前体可以是461个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为NP_001138480.1(GI：222418658)(SEQ ID NO：3)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型d前体[智人]是378个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为NP_001138481.1(GI：222418660)(SEQ ID NO：4)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型X1前体可以是506个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为XP_005248890.1(GI：530381430)(SEQ ID NO：5)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型X3前体可以是352个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为XP_005248891.1(GI：530381432)(SEQ ID NO：6)。
智人嗜乳脂蛋白亚家族3成员A1同种型X2前体可以是419个氨基酸的蛋白质，NCBI登录号为XP_006715046.1(GI：578811397)(SEQ ID NO：7)。
本文中提供的序列是示例性的。本文中所述BTN3A序列的同种型和变体也可用于本文中所述的方法中。
例如，当BTN3A蛋白和核酸的同种型和变体与本文中所述“参考”BTN3A序列基本上相同时，则它们可用于本文中所述的方法。术语“基本上相同”表示多肽或核酸包含与参考序列具有55％至100％序列同一性的序列，例如在特定的比较窗口中与参考序列具有至少55％序列同一性，优选60％、优选70％、优选80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％序列、优选至少98％、优选至少99％同一性。最佳比对可使用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443-53(1970)的同源性比对算法来确定或进行。
负BTN3A调节子
负BTN3A调节子包括表1中所列那些中的任一者。这些负调节子蛋白和核酸中任一者的人序列可从例如NCBI数据库(ncbi.nlm.nih.gov)或Uniprot数据库(uniprot.org)获得。BTN3A的负调节子可用于降低或抑制BTN3A的表达或功能。
然而，癌细胞的BTN3A负调节子表达提高可指示T细胞治疗不可有效治疗该癌细胞。或者，癌细胞的BTN3A负调节子表达降低可指示T细胞治疗可有效治疗该癌细胞。例如，如果与参考值或对照相比，样品中癌细胞表达了提高水平的ZNF217(负调节子)，则提供该样品的对象可能是γδT细胞治疗的不良候选者，所述治疗的形式为细胞转移、靶向或增强γδT细胞-癌症相互作用的抗体或类似增强这样的相互作用的药物。然而，如果样品中的癌细胞以低水平表达ZNF217(负调节子)，则该患者是γδT细胞治疗的良好候选者，所述治疗的形式为细胞转移、靶向或增强γδT细胞-癌症相互作用的抗体或类似增强这样的相互作用的药物。
BTN3A的负调节子可包括任何表1中所列那些中的任一种。在一些情况下，本文中所述的方法和组合物利用表1中所列前五十个负BTN3A1调节子。前五十个负BTN3A调节子是
CTBP1，UBE2E1，RING1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8和AHCYL1。
在一些情况下，所述方法和组合物集中于使用BTN3A的以下负调节子：ZNF217、CTBP1、RUNX1、GALE、TIMMDC1、NDUFA2、PPAT、CMAS、RER1、FAM96B或其组合。
CTBP1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q13363；SEQ ID NO：8)。
该CTBP1蛋白由NCBI数据库中登录号为U37408.1的cDNA序列编码。
UBE2E1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P51965；SEQ ID NO：9)。
该UBE2E1蛋白由NCBI数据库中登录号为X92963的cDNA序列编码。
RING1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q06587；SEQ ID NO：10)。
该RING1蛋白由NCBI数据库中登录号为Z14000的cDNA序列编码。
ZNF217蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O75362；SEQ ID NO：11)。
/>
该ZNF217蛋白由NCBI数据库中登录号为AF041259的cDNA序列编码。
HDAC8蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9BY41；SEQ ID NO：12)。
该HDAC8蛋白由NCBI数据库中登录号为AF230097的cDNA序列编码。
RUNX1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q01196；SEQ ID NO：13)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为L34598的cDNA序列编码。
RBM38蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9H0Z9；SEQ ID NO：14)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF432218的cDNA序列编码。
CBFB蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q13951；SEQID NO：15)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF294326的cDNA序列编码。
RER1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O15258；SEQID NO：16)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AJ001421的cDNA序列编码。
IKZF1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q13422；SEQ ID NO：17)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U40462的cDNA序列编码。
KCTD5蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NXV2；SEQ ID NO：18)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK000047的cDNA序列编码。
ST6GAL1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P15907；SEQ ID NO：19)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X17247的cDNA序列编码。
ZNF296蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q8WUU4；SEQ ID NO：20)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为BC019352的cDNA序列编码。
NFKBIA蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P25963；SEQ ID NO：21)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M69043的cDNA序列编码。
ATIC蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P31939；SEQID NO：22)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U37436的cDNA序列编码。
TIAL1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q01085；SEQ ID NO：23)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M96954的cDNA序列编码。
人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出作为CMAS蛋白的序列(UniprotQ8NFW8；SEQ ID NO：24)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF397212的cDNA序列编码。
CSRNP1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q96S65；SEQ ID NO：25)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AB053121的cDNA序列编码。
GADD45A蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P24522；SEQ ID NO：26)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M60974的cDNA序列编码。
EDEM3蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9BZQ6；SEQ ID NO：27)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK315118的cDNA序列编码。
AGO2蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9UKV8；SEQID NO：28)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AC067931的cDNA序列编码。
RNASEH2A蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotO75792；SEQ ID NO：29)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为Z97029的cDNA序列编码。
SRD5A3蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9H8P0；SEQ ID NO：30)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK023414的cDNA序列编码。
ZNF281蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9Y2X9；SEQ ID NO：31)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF125158的cDNA序列编码。
MAP2K3蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P46734；SEQ ID NO：32)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为L36719的cDNA序列编码。
SUPT7L蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O94864；SEQ ID NO：33)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF197954的cDNA序列编码。
SLC19A1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P41440；SEQ ID NO：34)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U15939的cDNA序列编码。
CCNL1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9UK58；SEQ ID NO：35)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF180920的cDNA序列编码。
AUP1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9Y679；SEQID NO：36)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF100754的cDNA序列编码。
ZRSR2蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q15696；SEQ ID NO：37)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为D49677的cDNA序列编码。
CDK13蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q14004；SEQ ID NO：38)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AJ297709的cDNA序列编码。
RASA2蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q15283；SEQ ID NO：39)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为D78155的cDNA序列编码。
ERF蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P50548；SEQID NO：40)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U15655的cDNA序列编码。
EIF4ENIF1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotQ9NRA8；SEQ ID NO：41)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF240775的cDNA序列编码。
PRMT7蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NVM4；SEQ ID NO：42)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK001502的cDNA序列编码。
MOCS3蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NVM4；SEQ ID NO：43)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK001502的cDNA序列编码。
HSCB蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q8IWL3SEQID NO：44)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AY191719的cDNA序列编码。
EDC4蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q6P2E9SEQID NO：45)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为L26339的cDNA序列编码。
CD79A蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P11912；SEQ ID NO：46)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为S46706的cDNA序列编码。
SLC16A1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P53985；SEQ ID NO：47)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为L31801的cDNA序列编码。
RBM10蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P98175；SEQ ID NO：48)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为D50912的cDNA序列编码。
GALE蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q14376；SEQID NO：49)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为IA1668的cDNA序列编码。
MEF2B蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q02080；SEQ ID NO：50)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X68502的cDNA序列编码。
FAM96B蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9Y3D0；SEQ ID NO：51)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF151886的cDNA序列编码。
ATXN7蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O15265；SEQ ID NO：52)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AJ000517的cDNA序列编码。
COG8蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q96MW5；SEQID NO：53)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK056344的cDNA序列编码。
DERL1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9BUN8；SEQ ID NO：54)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AY358818的cDNA序列编码。
TGFBR2蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P37173；SEQ ID NO：55)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M85079的cDNA序列编码。
CHTF8蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P0CG13；SEQ ID NO：56)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为BC018700的cDNA序列编码。
AHCYL1蛋白的人负BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O43865；SEQ ID NO：57)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF315687的cDNA序列编码。
本文中提供的序列是示例性的。本文中所述序列的同种型和变体以及表1和表2中所列任何调节子的同种型和变体也可用于本文中所述的方法和组合物。
例如，当蛋白质和核酸的同种型和变体与本文中所述“参考”序列基本上相同和/或与表1或2中所列任何基因基本上相同时，则它们可用于本文中所述的方法和组合物。术语“基本上相同”表示多肽或核酸包含与参考序列具有55％至100％序列同一性的序列，例如在特定的比较窗口中与参考序列具有至少55％序列同一性，优选60％、优选70％、优选80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％序列、优选至少98％、优选至少99％同一性。最佳比对可使用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443-53(1970)的同源性比对算法来确定或进行。
正BTN3A1调节子
正BTN3A1调节子可用作鉴定可被T细胞(例如γδT细胞或Vγ9Vδ2 T细胞)杀伤的癌细胞类型的标志物。因此，本文中描述了用于鉴定和/或治疗可受益于T细胞治疗的对象的方法，所述方法可涉及检测怀疑包含癌细胞的样品中的正BTN3A1调节子表达水平和/或对其进行定量。例如，如果样品显示出本文中所述任何BTN3A或任何BTN3A正调节子的表达水平提高(相对于参考值或阴性对照)，则从中获得样品的对象是用于T细胞治疗的良好候选者。然而，如果样品显示出本文中所述任何BTN3A负调节子的表达水平提高(相对于参考值或阴性对照)，则从中获得样品的对象可能不是用于T细胞治疗的良好候选者。
BTN3A1的负调节子和正调节子的列表提供于表1和表2中。在一些情况下，评价一种或更多种以下基因的表达：参与氧化磷酸化的基因(OXPHOS基因)、参与甲羟戊酸途径的基因、参与代谢传感的基因、参与嘌呤生物合成的基因(PPAT基因)、转录因子基因、BTN3A基因或这些基因的组合。例如，可作为指示T细胞治疗有用的标志物的BTN3A的正调节子可例如包括表2中所列前50个基因。表2中所列前50个正BTN3A1调节子是ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5、IRF8、NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，CI7orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，和KIAA0391。
在一些情况下，可作为指示T细胞治疗有用的良好标志物的BTN3A的正调节子包括IRF1、IRF8、IRF9、NLRC5、SPI1、SPIB、AMP活化蛋白激酶(AMPK)或其组合。注意，AMPK由以下三个亚基组成，每个亚基由2或3个不同的基因编码：α-PRKAA1、PRKAA2；β-PRKAB1、PRKAB2；和γ-PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3。因此，AMPK的水平可通过测量这三个AMPK亚基中的任一个(或更多个)来测量。当测量BTN3A正调节子表达水平时，测量BTN3A表达水平也可以是有用的。
正BTN3A1调节子包括表2中所列那些中的任一者。这些正调节子蛋白和核酸中任一者的人序列可从例如NCBI数据库(ncbi.nlm.nih.gov)或Uniprot数据库(uniprot.org)获得。
例如，表2中所列前50个正BTN3A1调节子是
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，KIAA0391，和IRF9。
ECSIT蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9BQ95；SEQ ID NO：58)。
/>
该ECSIT蛋白由NCBI数据库中登录号为AF243044的cDNA序列编码。
FBXW7蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q969H0；SEQ ID NO：59)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AY033553的cDNA序列编码。
SPIB蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q01892；SEQID NO：60)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X66079的cDNA序列编码。
IRF1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P10914；SEQID NO：61)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X14454.1的cDNA序列编码。
NLRC5蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q86WI3；SEQ ID NO：62)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF389420的cDNA序列编码。
IRF8蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q02556；SEQID NO：63)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M91196的cDNA序列编码。
NDUFA2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O43678；SEQ ID NO：64)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF047185的cDNA序列编码。
NDUFV1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P49821；SEQ ID NO：65)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF053070的cDNA序列编码。
NDUFA13蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9P0J0；SEQ ID NO：66)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF286697的cDNA序列编码。
USP7蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q93009；SEQID NO：67)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为Z72499的cDNA序列编码。
C17orf89蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotA1L188；SEQ ID NO：68)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为BC127837的cDNA序列编码。
RFXAP蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O00287；SEQ ID NO：69)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK313912的cDNA序列编码。
UBE2A蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P49459；SEQ ID NO：70)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M74524的cDNA序列编码。
SRPK1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q96SB4；SEQ ID NO：71)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U09564的cDNA序列编码。
NDUFS7蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O75251；SEQ ID NO：72)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK091623的cDNA序列编码。
PDS5B蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NTI5；SEQ ID NO：73)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U95825的cDNA序列编码。
CNOT11蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9UKZ1；SEQ ID NO：74)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF103798的cDNA序列编码。
NDUFB7蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P17568；SEQ ID NO：75)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M33374的cDNA序列编码。
BTN3A2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P78410；SEQ ID NO：76)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U90546的cDNA序列编码。
FOXRED1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q96CU9；SEQ ID NO：77)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF103801的cDNA序列编码。
NDUFS8蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O00217；SEQ ID NO：78)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U65579的cDNA序列编码。
JMJD6蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q6NYC1；SEQ ID NO：79)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AB073711的cDNA序列编码。
NDUFS2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O75306；SEQ ID NO：80)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF050640的cDNA序列编码。
NDUFC2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O95298；SEQ ID NO：81)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF087659的cDNA序列编码。
HSF1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q00613；SEQID NO：82)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M64673的cDNA序列编码。
ACAD9蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9H845；SEQ ID NO：83)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF327351的cDNA序列编码。
NDUFAF5蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q5TEU4；SEQ ID NO：84)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK025977的cDNA序列编码。
TIMMDC1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NPL8；SEQ ID NO：85)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF210057的cDNA序列编码。
HSD17B10蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotQ99714；SEQ ID NO：86)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U96132的cDNA序列编码。
BRD2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P25440；SEQID NO：87)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X62083的cDNA序列编码。
NDUFA6蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P56556；SEQ ID NO：88)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF047182的cDNA序列编码。
CNOT4蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O95628；SEQ ID NO：89)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U71267的cDNA序列编码。
SPI1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P17947；SEQID NO：90)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为X52056的cDNA序列编码。
MDH2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P40926；SEQID NO：91)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF047470的cDNA序列编码。
DARS2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q6PI48；SEQ ID NO：92)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为BC045173的cDNA序列编码。
TMEM261蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotQ96GE9SEQ ID NO：93)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK292632的cDNA序列编码。
STIP1蛋白的人BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P31948；SEQID NO：94)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M86752的cDNA序列编码。
FIBP蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O43427；SEQID NO：95)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF010187的cDNA序列编码。
FXR1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P51114；SEQID NO：96)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为U25165的cDNA序列编码。
NFU1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9UMS0；SEQID NO：97)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AJ132584的cDNA序列编码。
GGNBP2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9H3C7；SEQ ID NO：98)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF268387的cDNA序列编码。
STAT2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot P52630；SEQ ID NO：99)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为M97934的cDNA序列编码。
TRUB2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O95900；SEQ ID NO：100)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF131848的cDNA序列编码。
BIRC6蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9NR09；SEQ ID NO：101)。
/>
/>
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF265555的cDNA序列编码。
MARS2蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q96GW9；SEQ ID NO：102)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AB107013的cDNA序列编码。
NDUFA9蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q16795；SEQ ID NO：103)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AF050641的cDNA序列编码。
USP19蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot O94966；SEQ ID NO：104)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AB020698的cDNA序列编码。
UBA6蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot A0AVT1；SEQID NO：105)。
/>
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AY359880的cDNA序列编码。
MTG1蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q9BT17；SEQID NO：106)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AK074976的cDNA序列编码。
KIAA0391蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(UniprotO15091；SEQ ID NO：107)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为AB002389的cDNA序列编码。
IRF9蛋白的人正BTN3A1调节子序列的一个实例在下面示出(Uniprot Q00978SEQID NO：108)。
该蛋白由NCBI数据库中登录号为BC035716.2的cDNA序列编码。
本文中提供的序列是示例性的。本文中所述序列的同种型和变体以及表1和表2中所列任何调节子的同种型和变体也可用于本文中所述的方法和组合物。
例如，当蛋白质和核酸的同种型和变体与本文中所述“参考”序列基本上相同和/或与表1或2中所列任何基因基本上相同时，它们可用于本文中所述的方法和组合物。术语“基本上相同”表示多肽或核酸包含与参考序列具有55％至100％序列同一性的序列，例如在特定的比较窗口中与参考序列具有至少55％序列同一性，优选60％、优选70％、优选80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％序列、优选至少98％、优选至少99％同一性。最佳比对可使用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48：443-53(1970)的同源性比对算法来确定或进行。
两个多肽序列基本上相同的指示了，这两个多肽具有相同的功能——用作BTN3A1表达或活性的调节子。与BTN3A1调节子序列基本上相同的多肽，其活性水平可能与BTN3A1调节子不完全相同。相反，与表1或表2中所列那些或本文记载的任何序列相比，基本上相同的多肽可表现出更高或更低水平的BTN3A1调节子活性。例如，当通过类似测定操作测量时，基本上相同的多肽或核酸可具有至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约100％、或至少约105％、或至少约110％、或至少约120％、或至少约130％、或至少约140％、或至少约150％、或至少约200％的本文中所述BTN3A1调节子的活性。
或者，当第二多肽与针对第一多肽(例如，由表1和表2中所列任何基因编码的多肽)产生的抗体具有免疫反应性时，则存在基本同一性。因此，例如，在两个多肽仅不同之处在于保守替换的情况下，则多肽与第一多肽基本上相同。另外，如果抗体识别的表位基本上相同，当多肽与第一多肽不同之处在于非保守改变时，则该多肽与第一多肽可能是基本上相同的。“基本上相似”的多肽共有如上所示的序列，除了一些不相同的残基位置可能因保守氨基酸变化而不同。
表达系统
可将编码一种或更多种BTN3A1蛋白和/或者一种或更多种BTN3A1调节子蛋白的核酸区段、或作为BTN3A1抑制性核酸的核酸区段、和/或作为BTN3A1调节子抑制性核酸的核酸区段插入到任何合适的表达系统中或与任何合适的表达系统一起使用。可从这样的表达系统产生有用量的一种或更多种BTN3A1蛋白和/或BTN3A1调节子蛋白。治疗有效量的BTN3A负蛋白、治疗有效量的BTN3A负调节子核酸、或治疗有效量的结合BTN3A1负调节子核酸的抑制性核酸也可从这样的表达系统中产生。
核酸(或抑制性核酸)的重组表达使用载体例如质粒来有效地完成。载体可包含与编码一种或更多种BTN3A1抑制性核酸或一种或更多种BTN3A1负调节子蛋白的核酸区段可操作地连接的启动子。
载体还可包括转录和翻译所需的其他元件。本文中使用的载体指任何包含外源DNA的载体。因此，载体是将外源核酸转运到细胞中而不发生降解的试剂，并且包括在其被递送到的细胞中产生核酸表达的启动子。载体包括但不限于质粒、病毒核酸、病毒、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体。多种原核和真核表达载体适于携带、编码和/或表达BTN3A1负调节子蛋白或正调节子蛋白。可使用适合于携带、编码和/或表达BTN3A1抑制性核酸或BTN3A1调节子抑制性核酸的多种原核和真核表达载体。这样的表达载体包括，例如，pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母载体。载体可用于例如多种体内和体外情况。
表达盒、表达载体以及盒或载体中的序列可以是异源的。本文中使用的术语“异源”当用于提及表达盒、表达载体、调节序列、启动子或核酸时，是指以一些方式已被操作的表达盒、表达载体、调节序列或核酸。例如，异源启动子可以是与目的核酸非天然连接的启动子，或已通过细胞转化程序引入到细胞中的启动子。异源核酸或启动子还包括原产于生物体但已以一些方式改变(例如，置于不同的染色体位置、突变、以多个拷贝添加、与非天然启动子或增强子序列连接等)的核酸或启动子。异源核酸可包含含有cDNA形式的序列；cDNA序列可以以有义(以产生mRNA)或反义方向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)表达。异源编码区可与内源编码区区分开，例如，当异源编码区与包含未被发现与编码区天然缔合的调节元件(例如启动子)的核苷酸序列连接时，或者当异源编码区与不存在于自然界的染色体的一部分(例如，在由编码区编码的蛋白质不正常表达的基因座中表达的基因)缔合时。类似地，异源启动子可以是与编码区连接的启动子，所述编码区在自然界中并不与之连接。
可使用的病毒载体包括与逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney MurineLeukemia Virus，M-MLV)、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养性病毒、辛德毕斯病毒和其它病毒有关的那些。另外，可用的是共享这些病毒特性的任何病毒家族，所述特性使其适合于用作载体。可使用的逆转录病毒载体包括在Verma，I.M.，Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology-1985，American Society for Microbiology，pp.229-232，Washington，(1985)中描述的那些。例如，这样的逆转录病毒载体可包括鼠莫洛尼白血病病毒(MMLV)，和表达期望特性的其他逆转录病毒。通常来说，病毒载体包含非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和衣壳化所必需的反向末端重复、以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当改造为载体时，病毒通常去除了一个或更多个早期基因，并且基因或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中以代替去除的病毒核酸。
多种调节元件可包含在表达盒和/或表达载体中，包括启动子、增强子、翻译起始序列、转录终止序列和其他元件。“启动子”通常是处于相对于转录起始位点的相对固定位置时发挥作用的DNA的一个序列或多个序列。例如，启动子可位于编码BTN3A1或BTN3A1调节子蛋白的核酸区段的上游。在另一个实例中，启动子可位于BTN3A1抑制性核酸区段的上游，或位于一种或更多种BTN3A1调节子的抑制性核酸区段的上游。
“启动子”包含RNA聚合酶与转录因子基本相互作用所需的核心元件，并且可包含上游元件和响应元件。“增强子”通常是指在距转录起始位点无固定距离处发挥作用的DNA序列，并且可以在转录单元的5’或3’处。此外，增强子可在内含子内以及在编码序列本身内。其长度通常为10至300并且其以顺式发挥作用。增强子发挥作用以提高来自附近启动子的转录。与启动子一样，增强子通常也包含介导转录调节的响应元件。增强子通常确定表达的调节。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可包含用于终止转录的序列，其可影响mRNA的表达。这些区域转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化区段。3’非翻译区还包括转录终止位点。优选的是，转录单元还包含多腺苷酸化区域。该区域的一个益处在于其提高了所转录单元将被加工和转运(如mRNA)的可能性。在表达构建体中鉴定和使用多腺苷酸化信号已得到很好的证实。优选在转基因构建体中使用同源的多腺苷酸化信号。
来自表达盒或表达载体的BTN3A1蛋白、一种或更多种BTN3A1调节子蛋白、BTN3A1抑制性核酸分子或任何BTN3A1调节子抑制性核酸分子的表达可由能够在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子控制。可使用的原核启动子的实例包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。可使用的真核启动子的实例包括但不限于组成型启动子(例如病毒启动子例如CMV、SV40和RSV启动子)以及可调节型启动子(例如诱导型或阻遏型启动子例如tet启动子、hsp70启动子和由CRE调节的合成启动子)。用于细菌表达的载体包括pGEX-5X-3，并且用于真核表达的载体包括pCIneo-CMV。
表达盒或载体可包含编码标记产物的核酸序列。这种标记产物用于确定基因是否已经被递送至细胞，并且一旦递送就正在表达。标记基因可包括编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌(E.coli)lacZ基因和绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，标记可以是可选择标记。当这样的可选择标记成功地转移至宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，经转化的宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的独特类别的选择性方案。第一类别是基于细胞的代谢和使用缺乏独立于所补充培养基能够生长的突变体细胞系。第二类别是显性选择，其是指用于任何细胞类型的选择方案并且不需要使用突变体细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表达传递药物抗性的蛋白质，并将在选择中存活。这样的显性选择的实例使用药物新霉素(Southern P.and Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.and Berg，P.Science 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.et al.，Mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。
基因转移可利用在包括但不限于质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、黏粒和人工染色体中直接转移遗传物质来获得，或者通过在细胞或载体(例如阳离子脂质体)中转移遗传物质来获得。这样的方法在本领域中是公知的并且很容易适用于本文中所述方法中。转移载体可以是用于将基因递送至细胞中的任何核苷酸构建体(例如质粒)，或者作为递送基因的一般策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ramet al.Cancer Res.53：83-88，(1993))。用于转染的合适手段，包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法，例如电穿孔和DNA的直接扩散，被描述于例如Wolff，J.A.，et al.，Science，247，1465-1468，(1990)和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。
例如，编码BTN3A1蛋白、编码一种或更多种BTN3A1调节子蛋白、或编码BTN3A1抑制性核酸分子、或编码BTN3A1调节子抑制性核酸分子的核酸分子、表达盒和/或载体可通过任何方法(包括但不限于钙介导的转化、电穿孔、显微注射、脂转染、粒子轰击等)引入至细胞。细胞可在培养物中扩增，并随后施用于对象，例如哺乳动物，例如人。所施用细胞的量或数目可变化，但可使用约106至约109个细胞范围内的量。细胞通常在生理溶液例如盐水或缓冲盐水中递送。细胞也可在载剂例如脂质体、外排体或微囊泡的群体中递送。
在一些情况下，转基因细胞可产生包含编码BTN3A1、一种或更多种BTN3A1调节子、或其组合的核酸分子、表达盒和/或载体的外排体或微囊泡。在一些情况下，转基因细胞可产生包含可靶向BTN3A1核酸的抑制性核酸分子、BTN3A1调节子的一个或更多个核酸、或其组合的外排体或微囊泡。微囊泡可介导多种蛋白质、脂质、mRNA和微RNA的分泌，与邻近细胞相互作用，并且从而可在细胞间传递信号、蛋白质、脂质和核酸(参见，例如，Shen et al.，JBiol Chem.286(16)：14383-14395(2011)；Hu et al.，Frontiers in Genetics 3(April2012)；Pegtel et al.，Proc.Nat’l Acad Sci 107(14)：6328-6333(2010)；WO/2013/084000；其各自均通过引用整体并入本文。产生这样的微囊泡的细胞可用于表达BTN3A1蛋白、一种或更多种BTN3A1调节子蛋白、或其组合和/或BTN3A1的抑制性核酸、一种或更多种BTN3A1调节子或其组合。
转基因载体或具有异源表达盒或表达载体的细胞可表达BTN3A1、一种或更多种BTN3A1调节子或其组合，还可任选地表达BTN3A1抑制性核酸、BTN3A1调节子抑制性核酸或其组合。任何这些载体或细胞均可施用于对象。由转基因细胞产生的外排体可用于向对象中的肿瘤和癌细胞施用BTN3A1核酸、BTN3A1调节子核酸或其组合。由转基因细胞产生的外排体可用于将BTN3A1抑制性核酸、BTN3A1调节子抑制性核酸或其组合递送至对象中的肿瘤和癌细胞。
包含BTN3A1抑制剂、BTN3A1调节子或其任何组合的方法和组合物可涉及使用CRISPR修饰，或针对BTN3A1、BTN3A1调节子或其任何组合的抗体或抑制性核酸。抗体、抑制性核酸、小分子及其组合可用于降低肿瘤负荷、癌症症状和/或癌症进展。在一些情况下，可制备选择性地与一种或更多种BTN3A蛋白、或一种或更多种BTN3A调节子(例如，BTN3A的任何正调节子)结合的抗体。也可制备和使用靶向或增强γδT细胞-癌细胞相互作用的抗体。
治疗
本文中描述了用于治疗癌症的方法。这样的方法可涉及施用治疗剂，所述治疗剂可治疗表现出提高的BTN3A水平、或提高的本文中所述任何BTN3A正调节子水平、或其组合的癌细胞。这样的治疗剂的实例可包括施用T细胞(例如，γδT细胞和/或Vγ9Vδ2 T细胞)。这样的治疗剂的另外的实例包括BTN3A抑制剂、本文中所述任何BTN3A正调节子的抑制剂、BTN3A负调节子、调节(例如，增强)γδT细胞-癌症相互作用的药剂、或其组合。
在一些情况下，可从其样品表现出BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子表达提高的对象中分离免疫细胞，包括T细胞。免疫细胞(包括T细胞)可在培养物中扩增并随后施用于对象，例如哺乳动物，例如人。施用的细胞的量或数目可变化，但可使用约106至约109个细胞范围内的量。细胞通常在生理溶液例如盐水或缓冲盐水中递送。细胞也可在载剂例如脂质体、外排体或微囊泡的群体中递送。
待施用的T细胞可以是T细胞与一些其他免疫细胞的混合物。然而，在一些情况下，T细胞基本上不含其他类型的细胞。例如，待施用于对象的T细胞群可以是至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％、或高达且包括100％T细胞。在一些情况下，T细胞是γδT细胞。然而，在一些情况下，施用的T细胞是Vγ9Vδ2 T细胞。
本文中所述的治疗方法还可包括施用降低BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子的表达或功能的药剂。用于降低BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子的表达或功能的合适方法可包括：抑制mRNA的转录；通过包括但不限于使用干扰RNA(interfering RNA，RNAi)的方法来降解mRNA；通过包括但不限于使用反义核酸或核酶的方法来阻断mRNA的翻译，等等。在一些实施方案中，用于下调表达的合适方法可包括向癌症提供靶向BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子或其组合的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。用于降低BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子或其组合的功能或活性的合适方法还可包括施用抑制BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子的功能或活性的小分子抑制剂。
在一些情况下，可施用一种或更多种BTN3A抑制剂或本文中所述BTN3A正调节子的一种或更多种抑制剂以治疗鉴定为表达提高水平的BTN3A或本文中所述任何BTN3A正调节子的癌症。
合适的抑制剂的实例包括但不限于反义寡核苷酸、寡肽、干扰RNA，(例如小干扰RNA(siRNA))、小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)、适配体、核酶、小分子抑制剂、或其抗体或片段、及其组合。
在一些情况下，癌症包括血液学癌症、实体瘤和半实体瘤。例如，癌症可以是乳腺癌、胆管癌(例如胆管细胞癌)、脑癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和其他癌症。在一些实施方案中，癌症包括髓系肿瘤、淋巴肿瘤、肥大细胞病症、组织细胞肿瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。
本文中使用的“实体瘤”意在包括但不限于以下肉瘤和癌：纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤(Wilms′tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。实体瘤也旨在涵盖上皮癌。
BTN3A1的任何调节子(例如，负BTN3A调节剂)以及其抑制剂(例如，正BTN3A调节剂的抑制剂)可用于本文中所述的治疗方法和组合物。BTN3A1或BTN3A1调节子的抑制剂可以是例如小分子、抗体、核酸、表达盒、表达载体、抑制性核酸、指导RNA、核酸酶(例如，一种或更多种cas核酸酶)、或其组合。
筛选
BTN3A和/或任何BTN3A调节子均可用于获得有效治疗癌症的新药剂。本文中描述的方法可包括在测定混合物中使一种或更多种BTN3A蛋白、一种或更多种BTN3A核酸、一种或更多种BTN3A调节子蛋白、一种或更多种BTN3A调节子核酸或其组合与测试剂接触。测定混合物可在足以观察一种或更多种BTN3A蛋白、BTN3A核酸、BTN3A调节子蛋白、BTN3A调节子核酸或其组合的表达或功能是否发生调节的时间和条件下孵育。然后可测试测定混合物以确定BTN3A蛋白、BTN3A核酸、BTN3A调节子蛋白、BTN3A调节子核酸、或其组合中的一种或更多种的表达或功能是否降低或提高。在一些情况下，测定混合物中可包含T细胞和/或癌细胞，并且可测量测试剂对T细胞和/或癌细胞的作用。这样的测定操作也可用于鉴定新的BTN3A1调节子。
例如，测试剂可包括一种或更多种本文中所述的BTN3A1调节子、一种或更多种抗BTN3A1抗体、一种或更多种可调节BTN3A1表达的BTN3A1抑制性核酸、一种或更多种可结合BTN3A1核酸的指导RNA、一种或更多种可结合本文中所述任何BTN3A1调节子的抗体、一种或更多种可调节本文中所述任何BTN3A1调节子表达的抑制性核酸、一种或更多种可结合编码本文中所述任何BTN3A1调节子的核酸的指导RNA、一种或更多种可调节BTN3A1的小分子、一种或更多种可调节任何BTN3A1调节子的小分子、一种或更多种指导RNA、或其组合。下文描述了这样的抗体的实例。
在存在或不存在测试剂的情况下，BTN3A1活性或BTN3A1调节子活性的类型、量或程度可通过多种测定操作(包括本文中所述的那些)进行评价。例如，除了本文中所述的小分子、抗体、抑制性核酸、指导RNA、肽和多肽之外，新类型的小分子、抗体、指导RNA、cas核酸酶(例如，cas9核酸酶)、抑制性核酸、指导RNA、肽和多肽可用作测试剂以使用本文中所述的测定来鉴定和评价以确定活性的类型(正或负)、活性的量和/或BTN3A1调节子活性的程度。
例如，用于评价可进行调节以鉴定BTN3A1调节子活性的类型(正或负)、量和/或程度的新的和现有的药剂的方法可涉及使一种或更多种表达BTN3A1的细胞(或细胞群)与测试剂(例如，癌细胞)接触以提供测试测定混合物，并评价以下中的至少一者：
·检测测试测定混合物中一种或更多种细胞的表面上或者一种或更多种细胞内的BTN3A1蛋白或BTN3A1调节子蛋白；
·对测试测定混合物中一种或更多种细胞内或者一种或更多种细胞的表面上的BTN3A1蛋白或BTN3A1调节子蛋白的量进行定量；
·对细胞群中表达BTN3A1蛋白或BTN3A1调节子蛋白的细胞数目进行定量；
·检测测试测定混合物中的α-βCD4或CD8 T细胞数目和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的α-βCD4或CD8 T细胞增殖和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞数目和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞应答和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞增殖和/或对其进行定量；
·对测试测定混合物中的癌细胞数目进行定量；
·对测试测定混合物中的微生物细胞或感染原数目进行定量；或
·其组合。
BTN3A1在组织和细胞类型中普遍表达。多种细胞和细胞群可在测定混合物中使用。在一些情况下，细胞被修饰以表达或过表达BTN3A1。在一些情况下，细胞天然表达BTN3A1。在一些情况下，细胞具有表达BTN3A1的潜力，但当最初与测试剂混合时，细胞不表达可检测量的BTN3A1。
与测试剂接触的细胞或细胞群可包括多种BTN3A1表达细胞，例如健康的非癌细胞、患病细胞、癌细胞、免疫细胞或其组合。多种类型的健康细胞和/或患病细胞可用于所述方法。例如，细胞或组织可被细菌、病毒、原生动物或其组合感染。可使用这样的感染，可例如包括由疟疾(疟原虫(Plasmodium)))、李斯特菌(单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes))、结核(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、病毒及其组合引起的感染。可使用的免疫细胞包括CD4 T细胞、CD8 T细胞、Vγ9Vδ2 T细胞、其他γδT细胞、单核细胞、B细胞和/或αβT细胞。所用的癌细胞可包括白血病细胞、淋巴瘤细胞、霍奇金病细胞、软组织和骨的肉瘤、肺癌细胞、间皮瘤、食管癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肝胆癌细胞、小肠癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、直肠癌细胞、肾癌细胞、尿道癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、内分泌系统癌细胞、皮肤癌细胞、中枢神经系统癌细胞、皮肤和/或眼内来源的黑素瘤细胞、AIDS相关癌细胞或其组合。另外，处于任何进展阶段的转移性癌细胞，例如微转移性肿瘤细胞、大转移性肿瘤细胞和复发性癌细胞，都可用于所述测定。
可在有效检测测定混合物中测试剂是否可调节BTN3A1的表达或活性、BTN3A1调节子的表达或活性、或至少一种细胞的表达或活性的时间和条件下，将细胞与测试剂一起孵育。例如，细胞和测试剂可在有效进行以下的时间和条件下孵育：
·检测测试测定混合物中一种或更多种细胞的表面上的BTN3A1蛋白表达；
·对测试测定混合物中一种或更多种细胞内或者一种或更多种细胞的表面上的BTN3A1蛋白的量进行定量；
·对细胞群中表达BTN3A1蛋白的细胞的数目进行定量；
·检测测试测定混合物中的α-βCD4或CD8 T细胞数目和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的α-βCD4或CD8 T细胞应答和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞数目和/或对其进行定量；
·检测测试测定混合物中的Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞应答和/或对其进行定量；
·对测试测定混合物中的癌细胞数目进行定量；或
·其组合。
在细胞与测试剂混合并孵育之后，可使用多种操作来检测测定混合物和对其进行定量。操作的实例包括BTN3A1的抗体染色、一种或更多种BTN3A1调节子的抗体染色、细胞流式细胞术、RNA检测、RNA定量、RNA测序、蛋白质检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA测序、细胞因子检测、干扰素检测、及其组合。
测试剂可以是本文中所述的任何BTN3A1调节子、一种或更多种抗BTN3A1抗体、一种或更多种可调节任何BTN3A1表达的BTN3A1抑制性核酸、一种或更多种可结合本文中所述任何BTN3A1调节子的抗体、一种或更多种可调节本文中所述任何BTN3A1调节子表达的抑制性核酸、一种或更多种可调节BTN3A1的小分子、一种或更多种可调节本文中所述任何BTN3A1调节子的小分子、或其组合。
表现出调节BTN3A1的量或活性或者调节本文中所述任何BTN3A1调节子的量或活性的体外活性的测试剂可在动物疾病模型中评价。这样的动物疾病模型可包括癌症疾病动物模型、免疫系统疾病动物模型、感染病动物模型或其组合。
本文中还描述了用于评价测试剂是否可选择性地调节表现出提高或降低水平的BTN3A1或表现出提高或降低水平的任何BTN3A1调节子的细胞的增殖或生存力的方法。
如果与正常对照细胞相比，在存在测试化合物的情况下，表现出提高或降低水平的BTN3A1或者表现出提高或降低水平的本文中所述任何BTN3A1正调节子的细胞的增殖或生存力降低，则该测试化合物具有用于降低表现出这样的提高的染色体不稳定性的细胞的生长和/或转移的效用。
测定可包括确定化合物是否可特异性地导致多种细胞类型中BTN3A1的水平降低或提高。如果该化合物确实导致BTN3A1水平降低或提高，则可选择/确定该化合物以用于进一步研究，例如其作为治疗剂来治疗癌症的适用性。例如，通过例如将化合物施用于动物模型，可进一步检查通过本发明中表征的选择方法鉴定的候选化合物其靶向肿瘤或治疗癌症的能力。
所评价的细胞可包括转移细胞、良性细胞样品和细胞系，包括如癌细胞系。所评价的细胞还可包括来自患有癌症的患者(包括患有转移性癌症的患者)的细胞，或来自已知癌症类型或癌细胞系的细胞，或表现出过量产生BTN3A1或本文中所述任何BTN3A1调节子的细胞。可向患者施用可调节来自任何这些细胞类型的BTN3A1的产生或活性的化合物。
例如，一种方法可包括(a)从患者获得细胞或组织样品；(b)测量从来自该样品的已知数目或重量的细胞或组织产生的BTN3A1或BTN3A调节子的量或浓度，以产生参考BTN3A1值或BTN3A调节子参考值；(c)将来自所述样品的相同已知数目或重量的细胞或组织与测试化合物混合以产生测试测定；(d)测量该测试测定中(例如，在细胞表面上)BTN3A1或BTN3A调节子的量或浓度，以产生测试测定BTN3A1值或测试测定BTN3A调节子值；(e)任选地重复步骤(c)和(d)；以及选择与参考BTN3A1值或BTN3A调节子参考值相比具有更低或更高的测试测定BTN3A1值的测试化合物或者选择具有更低或更高的测试测定BTN3A调节子值的测试化合物。所述方法还可包括将测试化合物施用于动物模型，例如，以进一步评价所述测试化合物的毒性和/或效力。在一些情况下，所述方法还可包括将所述测试化合物施用于从其获得细胞或组织样品的患者。
化合物(例如，通过本文中所述的任何方法鉴定的靠前命中物(top hit))可用于基于细胞的测定，所述测定使用表达BTN3A1或任何BTN3A1调节子的细胞作为化合物效力的读出。
本文中还描述了用于鉴定和评估可调节BTN3A1或可调节表1和2中所列BTN3A1的任何调节子的药剂的效力的测定方法。
例如，BTN3A1可调节活化的T细胞对细胞因子和干扰素γ的释放。表达BTN3A1或BTN3A1调节子的细胞可与测试剂接触，并且可测量活化的T细胞对细胞因子和/或干扰素γ的释放。可将这样的测试剂相关的细胞因子和/或干扰素γ的水平与未接触测试剂的表达BTN3A1或BTN3A1调节子的细胞中观察到的水平进行比较。
在另一个实例中，抑制BTN3A1或抑制BTN3A1正调节子可提高T细胞应答、γ-δT细胞应答、Vgamm9Vdelta 2(Vγ9Vδ2)T细胞应答、α-βT细胞应答或CD8 T细胞应答。可通过筛选测定来鉴定测试剂，所述筛选测定涉及对针对表达BTN3A1或BTN3A1正调节子的细胞群的T细胞应答进行定量。T细胞应答水平可以是T细胞对其他细胞(例如，癌细胞)的作用。例如，T细胞应答水平可通过测量测定混合物中杀伤的癌细胞的百分比或量来测量。可将测试剂存在时观察到的T细胞应答水平与对照T细胞应答水平进行比较。这样的对照可以是当测试剂不存在但测定中所有其他组分均相同时观察到的T细胞应答水平。
在另一个实例中，BTN3A1表达或活性的提高，或者BTN3A1的任何正调节子的表达或活性的提高，可提高人γ-δT细胞(称为Vgamm9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞)亚群的活化。可将存在测试剂时观察到的Vγ9Vδ2 T细胞应答或增殖的水平与Vγ9Vδ2 T细胞应答的对照水平进行比较。这样的对照可以是当测试剂不存在但测定中所有其他组分均相同时观察到的Vγ9Vδ2 T细胞应答水平。
CRISPR修饰
在一些情况下，成簇的规则间隔的短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相关(CRISPR-associated，Cas)系统可用于在基因组BTN3A1等位基因、任何BTN3A1调节子基因或其任何组合中产生一个或更多个修饰。这样的CRISPR修饰可降低BTN3A1和/或调节子基因产物的表达或功能。例如，CRISPR/Cas系统可用于RNA可编程基因组编辑(参见例如，Marraffini andSontheimer.Nature Reviews Genetics 11：181-190(2010)；Sorek et al.NatureReviews Microbiology 2008 6：181-6；Karginov and Hannon.Mol Cell 2010 1：7-19；Hale et al.Mol Cell 2010：45：292-302；Jinek et al.Science 2012 337：815-820；Bikard and Marraffini Curr Opin Immunol 2012 24：15-20；Bikard et al.Cell Host&Microbe 2012 12：177-186；所有这些通过引用整体并入本文)。
可使用CRISPR指导RNA，其可将Cas酶靶向到基因组中的期望位置，在该位置它可以切割基因组DNA以产生基因组修饰。例如，该技术由Mali et al.Science 2013 339：823-6描述；其通过引用整体并入本文。用于设计和使用CRISPR介导的基因组编辑的试剂盒可商购获得，例如来自System Biosciences，Mountain View，CA的PRECISION X CAS9 SMARTNUCLEASETMSystem(目录号CAS900A-1)。
在另一些情况下，由Abremski et al.1983.Cell 32：1301(1983)，Sternberg etal.，Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology，Vol.XLV 297(1981)等描述的噬菌体P1的cre-lox重组系统可用于促进BTN3A1和/或调节子基因组位点的重组和改变。cre-lox系统利用从噬菌体P1分离的cre重组酶结合重组酶识别的DNA序列(称为lox位点)。该重组系统对于在植物细胞(参见，例如，美国专利No.5,658,772)、动物细胞(美国专利No.4,959,317和美国专利No.5,801,030)和在病毒载体(Hardy et al.，J.Virology 71：1842(1997))中实现重组是有效的。
如此并入的基因组突变可改变编码的BTN3A1和/或调节子基因产物中的一个或更多个氨基酸。例如，经修饰使得在所编码BTN3A1和/或调节子蛋白中更易于降解的基因组位点较不稳定，使得这样的蛋白质的半衰期降低，或者使得BTN3A1和/或调节子具有改善的表达或功能。在另一个实例中，可修饰基因组位点，使得BTN3A1和/或调节子多肽的至少一个氨基酸缺失或突变以改变其活性。例如，可修饰保守氨基酸或保守结构域，以提高或降低BTN3A1和/或调节子多肽的活性。例如，BTN3A1和/或调节子多肽的保守结构域中的一个保守氨基酸或数个氨基酸可被一个或更多个具有不同于该保守氨基酸的物理和/或化学特性的氨基酸替换。例如，为了改变保守氨基酸的物理和/或化学特性，可使该保守氨基酸缺失或被另一类别的氨基酸替换，其中所述类别在下表中标识。
类别 遗传编码
疏水性 A，G，F，I，L，M，P，V，W
芳香族 F，Y，W
非极性 M，G，P
脂肪族 A，V，L，I
亲水性 C，D，E，H，K，N，Q，R，S，T，Y
酸性 D，E
碱性 H，K，R
极性 Q，N，S，T，Y
类半胱氨酸 C
指导RNA和核酸酶可通过一种或更多种载剂引入，例如通过一种或更多种表达载体(例如，病毒载体)、病毒样颗粒、核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)、通过纳米粒、脂质体或其组合引入。载剂可包含可靶向特定细胞类型(例如，识别细胞表面标志物的抗体)、促进细胞通透、降低降解或其组合的组分或试剂。
抑制性核酸
BTN3A1、BTN3A1调节子或其任意组合的表达可例如通过使用特异性识别编码BTN3A1或BTN3A1调节子的核酸的抑制性核酸来抑制。
抑制性核酸可具有至少一个将在胞内或严格条件下与BTN3A1核酸和/或BTN3A1调节子核酸杂交的区段。抑制性核酸可降低编码BTN3A1或BTN3A1调节子的核酸的表达。核酸可与基因组DNA、信使RNA或其组合杂交。可将抑制性核酸并入到质粒载体或病毒DNA中。其可以是单链或双链、环状或线性的。
抑制性核酸是长度超过13个核苷酸的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。抑制性核酸可包括天然存在的核苷酸；合成、经修饰或假核苷酸，例如硫代磷酸酯；以及具有可检测标记例如P32、生物素或地高辛的核苷酸。抑制性核酸可降低BTN3A1核酸和/或BTN3A1调节子核酸的表达和/或活性。这样的抑制性核酸可与内源BTN3A1核酸(例如，RNA)或内源BTN3A1调节子核酸(例如，RNA)的区段完全互补。或者，允许抑制性核酸序列相对于BTN3A1或BTN3A1调节子序列有一些可变性。抑制性核酸可在胞内条件下或在严格的杂交条件下与BTN3A1核酸或BTN3A1调节子核酸杂交，并充分互补以抑制内源BTN3A1核酸或内源BTN3A1调节子核酸的表达。胞内条件是指通常在细胞(例如动物或哺乳动物细胞)内部存在的条件，例如温度、pH和盐浓度。这样的动物或哺乳动物细胞的一个实例是髓样祖细胞。这样的动物或哺乳动物细胞的另一个实例是来源于髓样祖细胞的更分化的细胞。通常来说，选择比特定序列在限定的离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5℃的严格杂交条件。然而，严格条件涵盖比所选序列的热解链点低约1℃至约20℃的温度，这取决于期望的严格程度，如本文中另外所限定。包含例如与BTN3A1编码序列或BTN3A1调节子编码序列精确互补的2、3、4或5段或更多段连续核苷酸(每段由与相邻编码序列不互补的连续核苷酸段分隔)的抑制性寡核苷酸可抑制BTN3A1核酸和/或者任何BTN3A1调节子的一个或更多个核酸的功能。一般而言，每段连续核苷酸的长度为至少4、5、6、7或8个或更多个核苷酸。非互补间插序列的长度可以为1、2、3或4个核苷酸。本领域技术人员可以容易地使用与有义核酸杂交的抑制性核酸的计算熔点来估计抑制特定靶核酸表达所能承受的错配程度。本发明的抑制性核酸包括例如短发夹RNA、小干扰RNA、核酶或反义核酸分子。
抑制性核酸分子可以是单链或双链的(例如小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA))，并且可以以酶依赖性方式或通过空间阻断发挥作用。以酶依赖性方式发挥作用的抑制性核酸分子包括依赖于RNA酶H活性以降解靶mRNA的形式。这些包括单链DNA、RNA和硫代磷酸酯分子，以及双链RNAi/siRNA系统，其涉及通过有义-反义链配对来识别靶mRNA，随后通过RNA诱导的沉默复合物降解靶mRNA。作为RNA酶-H非依赖性的空间阻断抑制性核酸通过与靶mRNA结合并妨碍其他过程来干预基因表达或其他mRNA依赖性细胞过程。空间阻断抑制性核酸包括2’-O烷基(通常与RNA酶-H依赖性反义核酸一起在嵌合体中)、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)和吗啉代反义核酸。
例如，小干扰RNA可用于特异性地降低BTN3A1和/或BTN3A1的任何调节子的翻译，使得所编码BTN3A1和/或调节子多肽的翻译降低。siRNA以序列特异性的方式介导转录后基因沉默。例如，参见网站invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html。一旦并入到RNA诱导的沉默复合物中，siRNA就通过将复合物引导至同源mRNA转录物，然后其被该复合物切割来介导同源内源mRNA转录物的切割。siRNA可与BTN3A1转录物的任何区域和/或BTN3A1调节子的任何转录物同源和/或互补。同源区的长度可以是30个核苷酸或更少，优选小于25个核苷酸，并且更优选长度约21至23个核苷酸。siRNA通常是双链的并且可具有两个核苷酸的3’突出端，例如3’突出的UU二核苷酸。用于设计siRNA的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Elbashir et al.Nature 411：494-498(2001)；Harborth et al.Antisense Nucleic Acid Drug Dev.13：83-106(2003)。
从IMGENEX(San Diego，California)商购的用于表达发夹siRNA的pSuppressorNeo载体可用于产生抑制BTN3A1和/或任何BTN3A1调节子的表达的siRNA。siRNA表达质粒的构建涉及mRNA靶区的选择，这可能是一个试错过程(trial-and-errorprocess)。然而，Elbashir等人提供的指南显示在约80％的时间内有效。Elbashir，S.M.，etal.，Analysis of gene function in somatic mammalian cells using smallinterfering RNAs.Methods，2002.26(2)：p.199-213。因此，对于合成siRNA的合成，可优选选择起始密码子的下游50至100个核苷酸的靶区。应避免5’和3’非翻译区和接近起始密码子的区域，因为这些区域可能富含调节性蛋白结合位点。因为siRNA可以从AA开始，具有有义和反义siRNA链二者的3’UU突出端，并且具有约50％G/C含量。合成siRNA序列的一个实例是5’-AA(N19)UU，其中N是mRNA序列中的任何核苷酸，并且应该为约50％G-C含量。可将所选的序列与人基因组数据库中的其他序列进行比较，以使与其他已知编码序列的同源性最小化(例如，通过Blast检索(例如，通过NCBI网站))。
siRNA可化学合成、通过体外转录产生、或者从siRNA表达载体或PCR表达盒表达。参见例如网站invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/rnai.html.。当siRNA从表达载体或PCR表达盒中表达时，编码siRNA的插入物可表达为折叠成siRNA发夹的RNA转录物。因此，RNA转录物可包含通过间隔区序列与其反向互补的反义siRNA序列连接的有义siRNA序列，该间隔区序列形成发夹环以及3’端处的U串(string)。发夹环可具有任何适当的长度，例如长度为3至30个核苷酸，优选长度为3至23个核苷酸，并且可具有多种核苷酸序列，包括AUG，CCC，UUCG，CCACC，CTCGAG，AAGCUU，CCACACC和UUCAAGAGA(SEQ ID NO：109)。siRNA也可通过切割直接引入或者通过转基因或病毒引入的双链RNA而在体内产生。通过RNA依赖性RNA聚合酶的扩增可在一些生物体中发生。
抑制性核酸，例如短发夹RNA siRNA或反义寡核苷酸，可使用例如通过从包含抑制性核酸序列的表达载体或表达盒中表达的方法来制备。或者，其可通过使用天然存在的核苷酸、经修饰核苷酸或其任意组合的化学合成来制备。在一些实施方案中，抑制性核酸由经修饰核苷酸或非磷酸二酯键制成，例如，其被设计以提高抑制性核酸的生物稳定性或提高抑制性核酸与靶BTN3A1核酸或BTN3A1的任何调节子的靶核酸之间形成的双链体的胞内稳定性。
可使用可用的方法制备抑制性核酸，例如，通过从编码BTN3A1核酸或BTN3A1的任何调节子的核酸的互补序列的表达载体表达。或者，可通过使用天然存在的核苷酸、经修饰核苷酸或其组合的任何混合物的化学合成来制备。在一些实施方案中，BTN3A1核酸和BTN3A1调节子的核酸由经修饰核苷酸或非磷酸二酯键制成，例如，其被设计以提高核酸的生物稳定性或提高抑制性核酸与其它(例如，内源)核酸之间形成的双链体的胞内稳定性。
例如，BTN3A1核酸和BTN3A1调节子的核酸可以是具有肽键而不是磷酸二酯键的肽核酸。
可用于BTN3A1核酸和BTN3A1调节子的核酸的天然存在的核苷酸包括核糖或脱氧核糖核苷酸腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。可用于BTN3A1核酸和BTN3A1调节子的核酸的经修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基鸟苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、鸟苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
因此，BTN3A1和本文中所述BTN3A1的调节子的抑制性核酸可包含经修饰核苷酸，以及天然核苷酸，例如核糖和脱氧核糖核苷酸的组合。抑制性核酸可与野生型BTN3A1或者与本文中所述BTN3A1的任何调节子具有相同的长度。BTN3A1和本文中所述BTN3A1的调节子的抑制性核酸也可以更长，并包含其它有用的序列。在一些实施方案中，BTN3A1和本文中所述BTN3A1调节子的抑制性核酸稍微短一些。例如，BTN3A1和本文中所述BTN3A1调节子的抑制性核酸可包含具有可从5’或3’端缺失多达5个核苷酸、或缺失多达10个核苷酸、或缺失多达20个核苷酸、或缺失多达30个核苷酸、或缺失多达50个核苷酸、或缺失多达100个核苷酸的核酸序列的区段。
抑制性核酸可通过一种或更多种载剂引入，例如通过表达载体(例如，病毒载体)、通过病毒样颗粒、通过核糖核蛋白(RNP)、通过纳米粒、脂质体或其组合引入。载剂可包括可靶向特定细胞类型、促进细胞通透、降低降解或其组合的组分或试剂。
抗体
抗体可用作BTN3A1和本文中所述BTN3A1的任何调节子的抑制剂和激活剂。可产生针对BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的的多种表位的抗体。BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的一些抗体也可商购获得。然而，根据本文中所述的方法和组合物，预期用于治疗的抗体优选是人抗体或人源化抗体，并且对其靶标具有高度特异性。
在一个方面中，本公开内容涉及使用与BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子特异性结合的分离的抗体。这样的抗体可以是单克隆抗体。这样的抗体也可以是人源化或完全人源化的单克隆抗体。抗体可表现出一种或更多种期望的功能特性，例如与BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子高亲和力结合，或者抑制BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的结合的能力。
本文中所述的方法和组合物可包含结合BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的抗体，或抗体的组合，其中每种抗体类型可单独结合BTN3A1或本文中所述BTN3A1的调节子之一。
本文中所称的术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)的高变区，其间散布有称为框架区(framework region，FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的三个CDR和四个FR构成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指抗体的一个或更多个片段，其保留了与抗原(例如，BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的肽或结构域)特异性结合的能力。已经表明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的一些实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(complementarity determining region，CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird et al.(1988)Science 242：423-426和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。这样的单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选用于效用的片段。
本文中使用的“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的分离的抗体基本上不含特异性结合除BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的分离的抗体可与其它抗原(例如来自其它物种的同种型或相关的BTN3A1和BTN3A1调节子蛋白)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中使的用术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，在所述可变区中，框架区和CDR区二者来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的具有可变区的抗体，在所述可变区中，框架区和CDR区二者均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞。
本文中使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因来说为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或者从其制备的杂交瘤中分离的抗体(下文进一步描述)，(b)从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的、组合的人抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，在所述可变区中，框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，使这样的重组人抗体经受体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列呈转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VL和VH区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然来源于人种系VL和VH序列并与之相关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库中。
本文中使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何经修饰形式，例如抗体与其他药剂或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”旨在指这样的抗体，其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已经枝接到人框架序列上。可在人框架序列内进行另外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在指其中可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
本文中使用的“与人BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子特异性结合的抗体”旨在是指以1×10-7M或更小，更优选5×10-8M或更小，更优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小，甚至更优选1×10-8M至1×10-10M或更小的KD与人BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子结合的抗体。
本文中使用的术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合率，而本文中使用的术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离率。本文中使用的术语“KD”旨在指解离常数，其由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域中已建立的方法来确定。用于确定抗体KD的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如BiacoreTM系统。
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体与人BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子特异性地结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力(例如KD为1×10-7M或更小)与BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子结合。抗体可表现出以下特征中的一种或更多种：
(a)以1×10-7M或更小的KD与人BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子结合；
(b)抑制BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的功能或活性；
(c)抑制癌症(例如，表达BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何正调节子的癌细胞)；或
(d)其组合。
可使用评价抗体对BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的结合能力的测定，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过BiacoreTM分析。
鉴于每种主题抗体可与BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子结合，因此VL和VH序列可“混合和匹配”以产生与BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子结合的其它结合分子。这样的“混合和匹配”抗体的结合特性可使用上述结合测定进行测试，并在实施例中描述的测定中进行评估。当VL和VH链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列可被结构相似的VH序列替代。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构相似的VL序列替代。
因此，在一个方面中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)含有重链可变区的氨基酸序列；和
(b)含有轻链可变区的氨基酸序列；
其中所述抗体特异性地结合BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子。
在一些情况下，独立于CDR1和/或CDR2结构域的单独CDR3结构域可确定抗体对同源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列，可预测产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(epithelial glycoprotein-2，EGP-2)抗体)；Rader etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了一组使用重链和轻链可变CDR3结构域的人源化抗整联蛋白αvβ3抗体)。因此，在一些情况下，混合的和匹配的抗体或人源化抗体包含对BTN3A1或本文中所述任何BTN3A1调节子具有特异性的CDR3抗原结合结构域。
小分子调节剂
可直接或间接调节BTN3A1或本文中所述BTN3A1的任何调节子的小分子的实例在下表中示出。
/>
该表中所列许多化合物的结构和/或化学式由Steinberg&Carling，AMP-activated protein kinase：the current landscape for drug development，NatureReviews 18：527(2019)提供。
“治疗”及其变化形式是指治疗性治疗和预防性或防范性措施二者。需要治疗的那些包括已患有病症的那些，以及易患病症的那些，或要预防该病症的那些。
出于施用本文中所述测试剂或组合物的目的，“对象”是指归类为哺乳动物或鸟类的任何动物，包括人、家养动物、农场动物、动物园动物、实验动物、宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。实验动物可包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、狗、猴或其组合。在一些情况下，对象是人。
本文中使用的术语“癌症”包括实体动物肿瘤以及血液恶性病。术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”在本文中可互换使用。
“实体动物肿瘤”包括头颈癌、肺癌、间皮癌、纵隔癌、肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝胆系统癌、小肠癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、妇科器官癌、卵巢癌、乳腺癌、内分泌系统癌、皮肤中枢神经系统癌；软组织和骨的肉瘤；以及皮肤和眼内来源的黑素瘤。另外，可治疗任何进展阶段的转移性癌症，例如微转移性肿瘤、大转移性肿瘤(megametastatic tumor)和复发性癌症。
术语“血液恶性病”包括成人或儿童白血病和淋巴瘤、霍奇金病、淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤、急性和慢性白血病、浆细胞肿瘤和AIDS相关癌症。
本发明的方法和组合物还可用于治疗白血病、淋巴结、胸腺组织、扁桃体、脾、乳腺癌、肺癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胸腺癌、类癌瘤、慢性淋巴细胞白血病、尤因肉瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、肝母细胞瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤或卵巢中的肿瘤。可治疗或检测任何进展阶段的癌症，例如原发性、转移性和复发性癌症。在一些情况下，治疗了转移性癌症，但未治疗原发性癌症。关于多种类型癌症的信息可见于例如美国癌症协会(cancer.org)或见于例如，Wilson et al.(1991)Harrison′s Principles of Internal Medicine，12th Edition，McGraw-Hill，Inc。
在一些实施方案中，待治疗的癌症和/或肿瘤是血液恶性病，或淋巴来源的那些，例如淋巴结、胸腺组织、扁桃体、脾和与其相关的细胞的癌症或肿瘤。在一些实施方案中，待治疗的癌症和/或肿瘤是已对T细胞治疗具有抗性的那些。
转移性癌症的治疗或治疗转移性癌症可包括癌细胞迁移降低或至少一种转移性肿瘤的建立降低。该治疗还包括转移性癌症的超过一种症状的减轻或减弱，所述症状例如咳嗽、气短、咯血、淋巴结病、肝增大、恶心、黄疸、骨痛、骨折、头痛、癫痫发作、全身性疼痛及其组合。该治疗可治愈癌症，例如，其可预防转移性癌症，其可基本上消除转移性肿瘤的形成和生长，和/或其可预防或抑制转移性癌细胞的迁移。
使用本领域技术人员可获得的方法，抗癌活性可降低多种癌症(例如，乳腺癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌)的进展。例如，抗癌活性可通过鉴定阻止癌细胞迁移的本发明药剂的致死剂量(LD100)或50％有效剂量(EDs0)或抑制50％生长的剂量(GI50)来确定。在一个方面中，例如，当通过检测邻近或远离原发性肿瘤部位的部位处癌细胞标志物的表达来测量时，或当使用用于检测转移的可用方法来评估时，抗癌活性是将癌细胞迁移降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的药剂的量。
在另一个实例中，可施用提高或降低BTN3A1表达或功能的药剂，以使肿瘤细胞对免疫治疗敏感。因此，通过施用提高或降低BTN3A1表达或功能的药剂，肿瘤细胞可变得对免疫系统和多种免疫治疗更敏感。
组合物
本发明还涉及包含T细胞和/或其他化学治疗剂的组合物。这样的药剂可以是多肽、编码一种或更多种多肽的核酸(例如，在表达盒或表达载体内)、小分子、通过本文中所述方法鉴定的化合物或药剂、或其组合。组合物可以是药物组合物。在一些实施方案中，组合物可包含可药用载体。“可药用”意指载体、稀释剂、赋形剂和/或盐与制剂的其它成分相容，并且对其接受者无害。
组合物可以以任何方便的形式配制。在一些实施方案中，组合物可包含由表1或2中所列任何基因编码的蛋白质或多肽。在另一些实施方案中，组合物可包含至少一种编码表1或2中所列多肽的核酸或表达盒。在另一些实施方案中，组合物可包含至少一种核酸、指导RNA或表达盒，其包含编码指导RNA或与表1或2中所列基因互补的抑制性核酸的核酸区段。在另一些实施方案中，组合物可包含至少一种抗体，其结合由表1或2中所列至少一种基因编码的至少一种蛋白质。在另一些实施方案中，组合物可包含至少一种结合、激活或抑制表1或2中所列至少一种基因的小分子，或者至少一种结合、激活或抑制由表1或2中所列至少一种基因编码的至少一种蛋白质的小分子。
在一些实施方案中，以“治疗有效量”施用本发明的化学治疗剂(例如，多肽、编码多肽的核酸(例如，在表达盒或表达载体内)、指导RNA、抑制性核酸、小分子、通过本文中所述方法鉴定的化合物、或其组合)。这样的治疗有效量是足以获得所期望生理作用(例如至少一种癌症症状的减轻)的量。例如，化学治疗剂可使细胞转移降低5％、或10％、或15％、或20％、或25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％、或55％、或60％、或65％、或70％、或80％、或90％、095％、或97％、或99％、或5％至100％之间的任何数值百分比。
癌症的症状还可包括肿瘤恶病质、肿瘤诱导的疼痛病症、肿瘤诱导的疲劳、癌细胞生长、肿瘤生长和转移扩散。因此，化学治疗剂还可使肿瘤恶病质、肿瘤诱导的疼痛病症、肿瘤诱导的疲劳、癌细胞生长、肿瘤生长、转移扩散或其组合减轻/降低5％、或10％、或15％、或20％、或25％、或30％、或35％、或40％、或45％、或50％、或55％、或60％、或65％、或70％、或80％、或90％、095％、或97％、或99％、或5％至100％之间的任何数值百分比。
为了实现期望的作用，化学治疗剂可以以单剂量或分开的剂量施用。例如，化学治疗剂可以以至少约0.01mg/kg至约500至750mg/kg、至少约0.01mg/kg至约300至500mg/kg、至少约0.1mg/kg至约100至300mg/kg或至少约1mg/kg至约50至100mg/kg体重的剂量施用，但是其他剂量也可提供有益的结果。所施用量将根据多种因素而变化，所述因素包括但不限于选择用于施用的小分子、化合物、肽、表达系统或核酸的类型、哺乳动物的疾病、体重、身体状况、健康状况和年龄。这样的因素可以由临床医师使用动物模型或本领域可用的其他测试系统容易地确定。
根据本发明的化学治疗剂的施用可以是单剂量、多剂量、连续或间歇的方式，这取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性还是预防性的，以及熟练从业者已知的其他因素。本发明的化学治疗剂和组合物的施用可在预选的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔的剂量。考虑局部和全身施用二者。
为了制备T细胞，合成或以其他方式获得组合物、小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒和其他药剂，根据需要或期望进行纯化。这些T细胞、组合物、小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒和其他药剂可悬浮在可药用载体中。在一些情况下，组合物、小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒和/或其他药剂可被冻干或以其他方式稳定。可将T细胞、组合物、小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒、其他药剂及其组合调节至合适的浓度，并任选地与其他药剂组合。单位剂量中包含的给定T细胞制剂、组合物、小分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂的绝对重量可广泛变化。例如，可施用约0.01至约2g，或约0.1至约500mg的至少一种分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂，或多种分子、化合物、多肽、核酸和/或其它药剂。或者，单位剂量可为约0.01g至约50g、约0.01g至约35g、约0.1g至约25g、约0.5g至约12g、约0.5g至约8g、约0.5g至约4g或约0.5g至约2g不等。
本发明化学治疗剂的日剂量也可以变化。这样的日剂量可例如为约0.1g/天至约50g/天、约0.1g/天至约25g/天、约0.1g/天至约12g/天、约0.5g/天至约8g/天、约0.5g/天至约4g/天以及约0.5g/天至约2g/天。
应当理解，用于治疗的化学治疗剂的量不仅随所选特定载体而变化，还随施用途径、所治疗癌症病症的性质以及患者的年龄和状况而变化。最终，就诊健康护理提供者(attendant health care provider)可确定合适的剂量。另外，药物组合物可配制成单一单位剂型。
因此，包含化学治疗剂的一种或更多种合适的单位剂型可通过多种途径施用，包括肠胃外(包括皮下、静脉内、肌内和腹膜内)、经口、直肠、皮肤、经皮、胸内、肺内和鼻内(呼吸)途径。化学治疗剂也可配制成持续释放(例如，使用微囊化，参见WO 94/07529和美国专利No.4,962,091)。在适当的情况下，制剂可方便地以离散的单位剂型呈现，并且可通过制药领域公知的任何方法制备。这样的方法可包括将化学治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细碎的固体载体或其组合混合，并随后，如有必要的话，将产品引入或塑造到期望的递送系统中的步骤。例如，化学治疗剂可与方便的载体(例如纳米粒、白蛋白、聚亚烷基二醇)连接，或者以前药的形式提供。化学治疗剂及其组合可与载体组合和/或包封在囊泡例如脂质体中。
本发明的组合物可制备成多种形式，包括水溶液剂、混悬剂、片剂、硬或软明胶胶囊剂、和脂质体和其他缓释制剂，例如成型的聚合物凝胶剂。抑制剂的施用还可涉及水溶液剂或缓释载剂的肠胃外或局部施用。
因此，虽然化学治疗剂和/或其他药剂有时可以以经口剂型施用，但是该经口剂型可被配制成以便在小分子、化合物、多肽、编码这样的多肽的核酸、及其组合提供治疗效用之前保护该小分子、化合物、多肽、核酸、表达盒、及其组合免于降解或分解。例如，在一些情况下，小分子、化合物、多肽、编码这样的多肽的核酸、和/或其他药剂可配制成在通过胃之后释放到肠中。这样的制剂描述于例如美国专利No.6,306,434及其包含的参考文献中。
液体药物组合物可以是例如水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂、或在使用前用水或其他合适的载剂构建的干粉剂的形式。这样的液体药物组合物可包含常规添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水性载剂(可包含食用油)或防腐剂。药物组合物可采用如在油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂这样的形式，并且可含有配制剂(formulatory agent)，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的载体包括盐溶液剂、包封剂(例如脂质体)和其他物质。在存在或不存在载体的情况下，化学治疗剂和/或其他药剂可以以干燥形式(例如，以冻干形式)配制。如果载体是期望的，则载体可包含在药物制剂中，或者可单独包装在单独的容器中，用于添加到以干燥形式、混悬形式或可溶浓缩形式包装在方便液体中的抑制剂。
T细胞、化学治疗剂、其他药剂、或其组合可配制成用于肠胃外施用(例如通过注射，例如，推注或连续输注)，并且可以以单位剂型存在于含有所添加防腐剂的安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。
组合物还可包含其他成分，例如化学治疗剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗微生物剂和/或防腐剂。可使用的另外治疗剂的实例包括但不限于：烷化剂，例如氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、乙烯亚胺和三氮烯类；抗代谢剂，例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物；抗生素，例如蒽环素、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、放线菌素D(dactinomycin)和普卡霉素(plicamycin)；酶，例如L-天冬酰胺酶；法尼基-蛋白质转移酶抑制剂(farnesyl-protein transferase inhibitor)；激素剂，例如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素和促黄体素释放激素拮抗剂、乙酸奥曲肽；微管破坏剂，例如海鞘素(ecteinascidin)或其类似物和衍生物；微管稳定剂，例如紫杉醇多西他赛/>和埃坡霉素A-F、或其类似物或衍生物；植物衍生产物，例如长春花生物碱(vinca alkaloid)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；和其他药剂，例如羟基脲、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦、六甲基三聚氰胺、铂配位复合物，例如顺铂和卡铂；以及用作抗癌剂和细胞毒性剂的其它药剂，例如生物应答调节剂、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体。该组合物也可以与放射治疗结合使用。
本说明书通过以下实施例进一步举例说明，其不应被解释为以任何方式进行限制。所有引用的参考文献(包括本申请中通篇引用的文献参考文献、已授权的专利、公开的专利申请)的内容均通过引用明确并入本文。
实施例1：BTN3A1调节子的CRISPR敲除筛选
本实施例描述了对人癌细胞系(Daudi)的全基因组CRISPR敲除筛选，以用于鉴定人基因组中正调节或负调节细胞表面上BTN3A1水平的基因。
用人改进的全基因组敲除CRISPR文库多指导sgRNA文库(Addgene，合并文库#67989)经慢病毒转导稳定表达Cas9的Daudi细胞的等分试样。将细胞用标记的抗BTN3A1抗体(克隆BT3.1，Novus Biologicals)进行染色，并通过荧光激活细胞分选来鉴定和分离表现出统计学上显著提高或降低的BTN3A1表达的细胞。分离其基因组DNA，并将与整合的sgRNA相应的区域扩增并测序以鉴定BTN3A1的调节子。进行三次重复筛选，并且所鉴定的统计学上显著的命中物在所有重复中是一致的。
实施例2：BTN3A1的负调节子
本实施例提供了降低BTN3A1表达的基因产物的列表。
表1：BTN3A1的负调节子
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实施例3：BTN3A1的正调节子
本实施例提供了提高BTN3A1表达的基因产物的列表。
表2：BTN3A1的正调节子
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实施例4：通过癌细胞敲除增强或降低的T细胞杀伤
为了全面鉴定癌细胞中增强或降低经由人Vγ9Vδ2 T细胞的杀伤的基因敲除(KO)，使用CRISPR创建KO癌症靶细胞的全基因组库。
Vγ9Vδ2 T细胞被选为非常规T细胞，介于适应性免疫与固有免疫之间，具有针对恶性B细胞(包括恶性骨髓瘤细胞)反应的天然倾向。Vγ9Vδ2 T细胞从补充有白介素-2(interleukin-2，IL-2)和单剂的唑来膦酸盐(zoledronate，ZOL)的健康供体的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中扩增。
将组成型表达Cas9的Daudi(伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma))细胞(Daudi-Cas9)用慢病毒全基因组敲除(KO)CRISPR文库(针对18,010个人基因的90,709个指导RNA)进行转导。将经转导细胞扩增并用唑来膦酸盐处理24小时，然后进行γδT细胞共培养。唑来膦酸盐(ZOL)，通过抑制甲羟戊酸途径的下游步骤，来人工升高磷酸抗原水平(图1B)。
将KO癌症靶细胞与Vγ9Vδ2 T细胞共培养，允许Vγ9Vδ2 T细胞识别靶细胞中的磷酸抗原积累。考虑到Vγ9Vδ2 T细胞细胞毒性的供体与供体之间的可变性，在存在唑来膦酸盐的情况下，将每个供体的Vγ9Vδ2 T细胞与全基因组KO Daudi-Cas9细胞以两种不同的效应子与靶标(effector-to-target，E∶T)比(1∶2，1∶4)共培养24小时。
在从共培养物中分离存活细胞之后，通过检测相对于全基因组KO Daudi-Cas9细胞中基线KO细胞分布的存活群体中gRNA序列来确定不同单基因KO细胞的损失和富集(图1A)。对于三个T细胞供体中的每一个，选择这样的效应子与靶标(E∶T)的比率，即产生与其他两个供体匹配的Daudi细胞存活(约50％)。三个供体之间的筛选命中(错误发现率[FDR]＜0.05)是一致的，在细胞-细胞相互作用筛选中出现了预期的可变性(Patel et al.，Nature 548，537-542(2017))。示例性结果在表3中示出。
表3：示例性共培养筛选结果(sgRNA)
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
根据基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)，在Vγ9Vδ2 T细胞共培养中赋予癌细胞生存劣势的敲除包括参与多种代谢途径的基因，尤其是参与OXPHOS、三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环和嘌呤代谢KEGG途径的基因，所有这些对于维持适当的ATP平衡都是必需的(图1C；表4)。
表4：负富集途径
KEGG基因集 #基因 FDR q值
氨酰基tRNA生物合成 22 0
剪接体 119 0
核苷酸切除修复 44 0
核糖体 81 0
RNA聚合酶 25 0.000071
错配修复 23 0.000065
DNA复制 34 0.000121
基础转录因子 35 0.000168
蛋白酶体 43 0.000158
嘧啶代谢 93 0.000295
氧化磷酸化 100 0.000739
RNA降解 51 0.000700
同源重组 26 0.000915
N-聚糖生物合成 46 0.001468
叶酸一碳库(One Carbon Pool By Folate) 17 0.002199
嘌呤代谢 149 0.004278
帕金森病(Parkinson’s disease) 98 0.004517
细胞周期 123 0.005302
TCA循环 30 0.006223
蛋白质输出 22 0.008706
癌细胞中OXPHOS、TCA和嘌呤代谢功能的丧失可使这些癌细胞更容易被Vγ9Vδ2 T细胞杀伤。本文中描述的分析揭示了驱动OXPHOS的电子传递链(electron transportchain，ETC)的复合物I至V的结构亚基的缺失显著增强了T细胞对癌细胞的杀伤(图1C)。图1C图的x轴上的垂直线标识了绿框中所列OXPHOS复合物I至V亚基的排序位置——注意敲除这些OXPHOS基因会使癌细胞更容易被T细胞杀伤。OXPHOS系统包含五个多亚基蛋白质复合物，其中NADH-泛醌氧化还原酶(复合物1，CI)是进入电子传递链(ETC)的主要电子进入点，其对于线粒体ATP合成至关重要。敲除某些甲羟戊酸途径酶(HMGCS1、MVD、GGPS1)也显著增强了杀伤(图1C至1D)，其中两种预期会上调磷酸抗原浓度(MVD、GGPS1)。
确定筛选的准确性，在以下的敲除中观察到存活增强：(1)激活Vγ9Vδ2 T细胞受体(TCR)的嗜乳脂蛋白复合物的组分(BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2)；(2)甲羟戊酸途径酶(ACAT2、HMGCR、SQLE)，其中两种在磷酸抗原合成的上游；(3)SLC37A3(FDR＜0.1)，使唑来膦酸盐进入胞质溶胶的转运体；(4)NLRC5，BTN3A1-3基因的反式激活子；以及(5)ICAM1(FDR＜0.1)，即对于Vγ9Vδ2 T细胞识别靶细胞而言重要的表面蛋白(图1C至1D)。多种I型干扰素(type I interferon，IFN-I)信号传导组分(IRF1、IRF8、IRF9、JAK1、STAT1、STAT2)的敲除也在共培养中增强了Daudi细胞存活(图1C)。在公共数据库中的数千个健康样品中，以特征在于对IFN-I和IFN-γ的应答的基因本体途径与BTN3A1基因表达高度相关。靶向相同基因的单独sgRNA的一致富集或耗尽进一步增强了显著命中(FDR＜0.05)的可信度(图1E)。如图1E中所示，敲除一些基因(例如，FDPS、PPAT、NDUFA3、NDUFA2、NDUFB7、NDUFA6)的细胞经常被T细胞杀伤，因此仅在少量细胞中检测到这些基因的sgRNA。然而，敲除另一些基因(BTN3A1、ACAT2、BTN2A1、IRF1)的细胞不那么经常地被T细胞杀伤，因此在显著更多数量的细胞中检测到这些基因的sgRNA(图1E)。
实施例5：调节BTN3A1的遗传修饰
本实施例描述了这样的实验，其设计用于确定在共培养筛选中观察到的任何富集或缺失是否是由于对BTN3A1的作用引起。
使用来自健康组织的可公开获得的数据，本发明人鉴定了与BTN3A1具有强相关性(NLRC5、IRF1、IRF9、SPI1)或中等相关性(MYLIP)的数个正富集的筛选命中物，而富集的上游甲羟戊酸途径酶ACAT2(其KO仅可耗尽磷酸抗原)没有显示出这样的相关性。在整个KEGG氧化磷酸化基因集的情况下，绝大多数OXPHOS基因与免疫组织中的BTN3A1负相关，而全基因组成对BTN3A1相关性的分布遵循以零为中心的正态分布。这种偏斜(skewing)进一步表明BTN3A1表达可受细胞能量状态并尤其是OXPHOS的影响。
为了全面理解哪些共培养筛选命中物通过调节BTN3A1丰度来发挥作用，进行了无偏倚的全基因组筛选以鉴定BTN3A表面水平的正调节子和负调节子。在Daudi-Cas9细胞中重复慢病毒全基因组sgRNA文库转导，同时也使用经转导细胞的选择和生长(outgrowth)。对Daudi KO细胞的全基因组库进行细胞表面BTN3A染色(BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3的组合表达，它们具有相同的胞外结构域)。对顶部和底部BTN3A表达四分位数中的细胞进行FACS分选以鉴定每个区块(bin)中的遗传KO富集(图2A)。始于转导到下一代测序(NGS)文库制备，整个筛选在三个独立的重复中进行，其命中彼此强烈相关。
将来自BTN3A调节子筛选的显著命中物与共培养筛选中的那些进行比较。命中物在其敲除(1)赋予针对T细胞的生存优势和下调的BTN3A，或(2)赋予针对T细胞的生存劣势和上调的BTN3A，则被认为在两个筛选之间是一致的(图2B)。BTN3A筛选中的大部分显著命中物(FDR＜0.01)与共培养筛选一致(图2C)。在共培养筛选中赋予生存优势的许多敲除被确定是BTN3A的正调节子，例如转录调节子NLRC5、IRF1、IRF8、IRF9、SPI1、SPIB等。为了确定两个筛选之间的效应量相关性，比较了共培养筛选和BTN3A筛选的对数倍数变化(log-foldchange，LFC)。保护免于Vγ9Vδ2 T细胞杀伤和下调的BTN3A的一致命中物敲除显示出强的效应量相关性(皮尔森r(Pearson’s r)＝0.77)，而增强T细胞杀伤和上调的BTN3A的一致命中物敲除显示出中度相关性(r＝0.51)(图2D)。
GSEA显示出数个高度富集的代谢途径在筛选之间是一致的，特别是N-聚糖生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢和叶酸KEGG途径的一碳库(图2C，表5)。
表5：正调节或负调节表面BTN3A表达的KEGG基因集的GSEA
/>
/>
OXPHOS是具有下调的表面BTN3A的Daudi细胞中最富集的途径，这是出乎意料的。预期是相反的作用，因为该途径在共培养筛选中在具有存活劣势的Daudi KO中富集。强的差异效应(divergent effect)表明OXPHOS与BTN3A之间的关系是复杂的生物现象，其可能是环境依赖性的。
虽然未知甲羟戊酸途径调节BTN3A表面丰度，但筛选揭示了FDPS缺失的细胞中BTN3A的上调(图2C)。为了验证该结果，在Daudi-Cas9细胞中进行了ZOL(FDPS抑制剂)剂量响应，其结果是BTN3A的显著性且剂量依赖性提高(图2K)。
对于富集途径的子集，本发明人进行了分析，以确定每个途径有多少被两个CRISPR筛选捕获，以及这些途径组分的筛选一致性水平。本发明人绘制了来自从头嘌呤生物合成(图2E)、OXPHOS、铁-硫(Fe-S)簇形成、N-聚糖生物合成和唾液酸化的两个筛选的LFC和显著性(FDR＜0.05)。
嘌呤生物合成途径几乎完全被捕获，所有命中物显示出作为BTN3A的负调节子在两个筛选之间的一致性，并且降低Vγ9Vδ2 T细胞共培养中的存活。该途径产生了IMP、GMP和AMP核苷酸，其中后者通过调节AMP激活蛋白激酶(AMPK)活性和通过再生成ATP二者，在维持适当的能量稳态中是重要的。包含驱动产生ATP的OXPHOS的五电子传递链(ETC)复合物的大多数亚基在两个筛选中是具有相反作用的显著命中，表明该途径对BTN3A水平的作用可依赖于外源培养条件。该筛选还揭示了Fe-S簇形成机制中大多数一致和显著的命中物，该机制为线粒体蛋白质和胞质蛋白质二者产生这种辅基。催化嘌呤生物合成(PPAT)中第一步的酶和OXPHOS复合物I、II和III包含Fe-S簇。最后，负责内质网和高尔基体中蛋白质糖基化的N-聚糖生物合成途径以及使糖基化蛋白质唾液酸化的途径二者作为强富集的途径出现，在整个途径中有许多一致的命中。
令人感兴趣的是，导致发现BTN2A1作为Vγ9Vδ2 TCR的同源配体的初始方法鉴定了两个基因KO，其在所有KO中引起对Vγ9Vδ2 TCR四聚体-配体相互作用的最高破坏——BTN2A1本身和SPPL3。SPPL3下调导致总体高糖基化，并且已表明SPPL3缺失会限制HLA-I与其相互作用配偶体的可及性。
总之，这些观察结果支持了本发明人的两个筛选的发现，即降低的N-连接的糖基化提高了BTN3A表面染色并提高了γδT细胞对靶细胞的杀伤。总之，途径可视化揭示了本文中所述的筛选捕获了不同途径的大部分，进一步增强了这些途径在BTN3A表达和对Vγ9Vδ2T细胞靶向的敏感性中发挥重要作用的可信度。
实施例6：调节BTN3A的基因产物
为了验证BTN3A调节子的子集，使用慢病毒sgRNA方法产生一个BTN3A1 KO和每个其他基因靶标的两个不同的KO，包括与BTN3A调节无关的AAVS1安全港(safe-harbor)切割位点，其用作CRISPR切割的对照。本发明人确定经编辑细胞在＞90％的细胞中具有破坏性的插失。将这些Daudi-Cas9 KO细胞在转导之后13天针对BTN3A进行染色，这与筛选读出时间点相匹配。
对于每个靶标，BTN3A中位荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)在两个不同的KO细胞系之间是一致的。IRF1的缺失对表面BTN3A丰度的作用与NLRC5(BTN3A1-3的唯一已知的转录调节子)的缺失一样强。
本发明人确定了转录阻遏物ZNF217、CtBP1和RUNX1负调节BTN3A丰度(图2F至2G)。令人感兴趣的是，CtBP1——一种转录和运输调节取决于细胞NAD+/NADH比的代谢传感器——是在CRISPR筛选中具有上调的BTN3A的Daudi-Cas9细胞中排序最高的KO(补充表3)。
在破坏唾液酸化机制(CMAS)之后、在破坏内质网分选受体1(RER1)中的驻留之后、以及在破坏Fe-S簇形成(FAM96B)之后，也观察到BTN3A表面丰度提高(图2F至2G)。RER1可控制多蛋白复合物从内质网(endoplasmic reticulum，ER)离开去高尔基体，表明其可控制BTN3A胞内运输，并在BTN2A1-BTN3A1-BTN3A2复合物离开内质网之前维持正确的复合物组装。
本发明人随后确定，表面BTN3A丰度随半乳糖分解代谢(GALE)、从头嘌呤生物合成(PPAT)和OXPHOS复合物I(NDUFA2，TIMMDC1)的缺失而提高(图2G)。复合物I敲除的验证结果与BTN3A筛选结果相矛盾，而与共培养筛选结果相一致。这些数据进一步表明，在OXPHOS与BTN3A表达之间存在复杂的关系，其可能依赖于培养条件，鉴于高覆盖全基因组筛选和培养单独KO细胞的不同要求。使用G115 Vγ9Vδ2 TCR克隆的四聚体，本发明人确定GALE、NDUFA2、PPAT、CMAS和FAM96B KO相对于AAVS1缺失对照始终显示出较高的TCR结合(图2H)。
实施例7：调节BTN3A表达的基因
本实施例描述了设计用于帮助确定一些经验证命中物调节BTN3A的机制的实验。
在Daudi-Ca9 KO细胞系的亚群中测量BTN2A1、BTN3A1和BTN3A2转录水平。RER1 KO细胞用作阴性对照。转录激活子IRF1和NLRC5的KO细胞系被确定为引起BTN3A1/2转录物的下调。BTN3A1/2转录物在转录阻遏物ZNF217和RUNX1敲除的细胞中上调。CTBP1 KO细胞显示出无统计学显著性的BTN3A1/2转录物的微弱上调，表明其对BTN3A表面丰度的作用可能是间接的或通过其运输调节引起。
本发明人还确定了NDUFA2(OXPHOS)和PPAT(嘌呤生物合成)的敲除引起BTN3A1/2转录物的上调，这提供了使本发明人剖析细胞中的代谢扰动如何调节BTN3A的见解(图2I至2J)。RUNX1是唯一对BTN2A1转录具有显著作用的转录调节子，并且尽管两个NDUFA2和两个PPAT KO提高了BTN2A1转录水平，但只有一个NDUFA2KO达到了统计学显著性(图2L)。
通过测试OXPHOS KO细胞中的能量状态失衡或氧化还原状态失衡是否导致BTN3A表达变化，来评价OXPHOS与BTN3A表面丰度之间的关系。复合物I(NDUFA2KO，TIMMDC1 KO)的损伤可导致经由ATP产生不足的能量状态失衡以及由于NADH/NAD+比升高引起的氧化还原状态失衡二者(图3A)。
当细胞在缺乏葡萄糖和丙酮酸的含谷氨酰胺的培养基中培养时，递增的葡萄糖水平引起OXPHOS KO(TIMMDC1、NDUFA2)中BTN3A表面表达上调，而在对照AAVS1 KO细胞中的作用低得多(图3B)。在递增水平的丙酮酸中培养的细胞中没有观察到这样的效应，该效应应该通过在丙酮酸转化成乳酸期间消耗过量NADH来减轻氧化还原失衡。
这些结果表明在OXPHOS KO细胞中的ATP水平与BTN3A的表达之间存在强的联系。当这些OXPHOS KO细胞中的葡萄糖水平提高时，BTN3A表达水平提高。
这种对培养基中葡萄糖水平的依赖性也有助于解释两个筛选之间的OXPHOS特征差异，由于两个筛选中明显不同的细胞浓度和共培养筛选中高度增殖性T细胞的存在，这可具有明显不同的营养条件。
在野生型(wildtype，WT)Daudi-Cas9细胞中测试靶向单独的OXPHOS复合物的抑制剂对BTN3A表达的作用。复合物I抑制(鱼藤酮)在两个较低剂量下引起BTN3A上调，而在一个较高剂量下引起BTN3A下调。引人注目的是，直接抑制复合物III(抗霉素A)、复合物V/ATP合酶(寡霉素A)、或从电子传递链解偶联ATP合成(使用FCCP)导致最高的BTN3A上调(图3C至3D)。此外，用糖酵解阻断2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)处理的野生型细胞显示出上调的BTN3A水平(图3E)，从而在全基因组筛选中将糖酵解的GSEA鉴定确定为负调节BTN3A(表5)。
这些数据表明，经受能量危机的细胞改变了其BTN3A的表达。复合物I抑制对BTN3A表达的剂量依赖性可变效应反映了在筛选和验证中在复合物I敲除(NDUFA2、TIMMDC1)中观察到的可变结果。这些结果表明，抑制最远离ATP合成的复合物I对BTN3A调节具有复杂的作用。
实施例8：AMPK激活上调BTN3A
营养和OXPHOS剥夺(deprivation)通过数个应激传感器来检测，包括AMP激活蛋白激酶(AMPK)、mTOR和整合应激响应(integrated stress response，ISR)途径的那些。本实施例描述了设计用于确定这些中的哪些与经转化细胞中BTN3A水平的调节最相关的实验。
AICAR介导的AMPK的激活(其感知能量危机期间发生的升高的AMP∶ATP比)导致WTDaudi-Cas9细胞中表面BTN3A的急剧提高(图3F)。mTOR的抑制(雷帕霉素)、ISR的抑制(ISRIB)和ISR的激活(胍那苄(guanabenz)、Sal003、salubrinal、raphin1)在对照KO(AAVS1)和嘌呤生物合成KO(PPAT)Daudi-Cas9细胞中对BTN3A表面表达的作用可忽略不计(图3L)。例外是由整合应激响应(ISR)激动剂Sal003引起的下调(图3L)。
使用AMPK的两种直接激动剂——高效的化合物991和低效的A-769662，确定了AMPK激活对表面BTN3A的上调(图3G，3M)。化合物991和A-769662的结构在以下示出。
/>
与经载剂对照处理的细胞相比，用化合物991处理的细胞显示出约五倍高的G115Vγ9Vδ2 TCR四聚体的染色，而AICAR处理将四聚体染色提高40％至80％(图3H)。化合物991处理在转录上上调BTN2A1，以及BTN3A1和BTN3A2，如qPCR所检出(图3I)。这些结果解释了高Vγ9Vδ2 TCR四聚体染色。EphA2(不相关的Vγ9Vδ1 TCR MAU克隆的配体)的细胞表面丰度最近也显示出被AMPK激活上调(Harly et al.，Sci.Immunol.6，eaba9010(2021))，表明参与多种人γδT细胞亚群的共同机制。
AICAR是间接的AMPK激动剂。本发明人通过使用化合物C(AMPK抑制剂)测试AICAR对BTN3A的作用，以确定这些作用是否是AMPK依赖性的。提高量的化合物C降低了AICAR诱导的BTN3A上调，其中BTN3A水平在10mM化合物C和更高的浓度下远低于载剂对照中观察到的那些(图3J)。类似地，由OXPHOS抑制(鱼藤酮、寡霉素、FCCP)或糖酵解抑制(2-DG)引起的BTN3A上调被通过化合物C的AMPK抑制所中和(图3K)。
这些结果表明，经受能量危机的癌细胞通过AMPK依赖性过程上调BTN3A，其可通过直接激活AMPK产生拟表型。
实施例9：全基因组筛选命中物调节γδT细胞活性
本实施例描述了评价来自两个全基因组筛选的命中物是否调节患者肿瘤中的γδT细胞活性并与患者存活是否相关的测试。
产生共培养筛选特征，其涉及获得每个显著命中物(FDR＜0.01)的加权平均表达值，每个权重的大小与特定命中物的p值成比例，并且根据命中物的LFC值的方向为正或负号(Jiang et al.，Nat.Med.24，1550-1558(2018))。本发明人使用来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的数据(总共包括多于11,000名患者和33种癌症类型)估计了肿瘤中的特征水平，并将其与每种癌症类型中的患者存活相关联。
在这些癌症类型中，在低级别胶质瘤(LGG)肿瘤中观察到最强的相关性(图4A)。肿瘤表现出高特征水平的LGG患者相比于具有低特征水平的那些具有显著更好的总体存活。高水平的特征具有高的基因表达，其在KO时降低γδT细胞杀伤，而低水平的基因表达，其KO提高了γδT细胞杀伤。使用Cox回归分析也证实了这样的相关性。
然后，本发明人检查了共培养特征与患者存活的相关性是否取决于患者肿瘤中γδT细胞的存在或不存在。将529名LGG患者根据其肿瘤中TRGV9(Vγ9)和TRDV2(Vδ2)转录物丰度分成两组。然后单独评价每组的存活相关性。
如图4B中所示，仅在具有高Vγ9Vδ2 T细胞浸润的患者组中观察到由高特征水平赋予的存活优势。在具有433名患者的膀胱尿路上皮癌(BLCA)组群中发现了类似的模式，不同之处在于，直到该组群被TRGV9/TRDV2表达水平分开，该特征才与较好的存活显著相关(图4C至4D)。
本发明人从BTN3A筛选中产生了另一特征，并观察到当肿瘤表现出高Vγ9Vδ2 T细胞浸润时，肿瘤具有高BTN3A特征水平(分别为BTN3A1的正/负调节子的高/低肿瘤表达)的LGG患者具有更显著的存活优势(图4E至4F)。
最近，对TCGA和中国胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据的分析揭示，CD4和CD8 T细胞浸润与LGG的不良结局相关，而γδT细胞浸润与LGG患者的较好存活相关(Park et al.Nat.Immunol.22，336-346(2021))。本文中所述结果表明，LGG患者存活可通过BTN3A调节子的活性以Vγ9Vδ2 T细胞依赖性方式进行调节。
实施例10：材料和方法
本实施例描述了本文中所述实验中使用的一些材料和方法。
癌症-T细胞共培养筛选
按照制造商说明将人改进的全基因组敲除CRISPR文库(来自Kosuke Yusa的Addgene Pooled Library#67989；90,709个靶向18,010个基因的gRNA)(Tzelepis et al.，Cell Rep.17，1193-1205(2016))转化到Endura ElectroCompetent大肠杆菌细胞(Lucigen)中。简言之，为了适当的覆盖率，进行了9次转化(1次转化/约10,000个sgRNA)。对于每次转化，将2μL的文库DNA与细胞混合。将混合物装载到1.0mm的吸收池中，并在GenePulser Xcell(Biorad)中进行电穿孔(1800V，10μF，600Ohms)。用975μL的恢复培养基(Lucigen)挽救经电穿孔细胞，并将其在37℃下搅拌孵育1小时。将经转化细胞在含氨苄青霉素的150mL Luria肉汤(Luria broth，LB)中在30℃下培养过夜。通过将经转化细胞的多个稀释液平板接种在含氨苄青霉素的LB琼脂板上来确定适当的转化效率和文库覆盖率(2250倍)。通过以以下组成的反应，围绕gRNA位点通过PCR扩增(在98℃下3分钟；98℃下10秒、62℃下10秒和72℃下25秒的15个循环；72℃下5分钟)来测量文库多样性：由10ng DNA模板、25μL NEBNext Ultra II Q5主混合物(NEB)、1μL Read1-Stagger等摩尔引物混合物(10μM)(NxTRd1.Stgr0-7引物)、1μL Read2-TRACR引物(10μM)、以及使总体积达到50μL的水。PCR产物用于第二PCR反应，其以相同的PCR条件和由以下组成的反应混合物进行：1μL PCR产物(1∶20稀释)、25μL NEBNext Ultra II Q5主混合物、1μL P7.i701(10μL)引物和1μLP5.i501(10μM)引物、以及使总体积达到50μL的水。用SPRI纯化(1.0X)处理最终PCR产物，在NanoDrop上定量，并使用MiniSeq High Output试剂盒(75个循环)(Illumina)在MiniSeq上进行测序。使用MAGeCK算法来分析文库中gRNA的分布(Li et al.，Genome Biol.15，554(2014))。这些方法中提及的相关引物和探针在表6A至6B中列出。
表6A：引物
表6B：探针序列
使用HEK293T细胞(Takara Bio)将全基因组敲除CRISPR文库包装到慢病毒中。在转染之前约16小时，在15cm经TC处理的皿中，将1200万个细胞接种在25mL的补充有以下的包含高葡萄糖和GlutaMAX的DMEM(Gibco)中：10％FBS、100U/mL青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich)、10mM HEPES(Sigma-Aldrich)、1％MEM非必需氨基酸溶液(Millipore Sigma)和1mM丙酮酸钠(Gibco)。使用FuGENE HD转染试剂(Promega)按照制造商方案将HEK293T细胞用17.8μg gRNA转移质粒文库、12μg pMD2.G(Addgene plasmid#12259)和22.1μg psPAX2(Addgene plasmid#12260)进行转染。在转染之后24小时，用补充有ViralBoost试剂(Alstem)的新鲜培养基替换旧培养基。在转染之后48小时收集细胞上清液，以300xg(10分钟，4℃)离心，并将其转移到新试管中。将四体积的上清液与1体积的慢病毒沉淀溶液(Lentivirus Precipitation Solution)(Alstem)混合，并在4℃下孵育过夜。将慢病毒以1500xg(30分钟，4℃)沉淀，以1/100th的原始体积重悬于冷PBS中，并在-80℃下储存。
将Daudi-Cas9细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺(Lonza)和100U/mL青霉素-链霉素中培养。用PCR方法确定细胞对支原体呈阴性。在慢病毒gRNA递送之前两周，将Daudi-Cas9细胞在补充有5μg/ml杀稻瘟菌素(Thermo Fisher)的完全RPMI(cRPMI+Blast)中培养。在慢病毒转导当天，将2.5亿个Daudi-Cas9细胞以300万个细胞/mL重悬于补充有4μg/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich)的cRPMI+Blast中，并等分到6孔板中(2.5mL/孔)。每个细胞孔接受6.25μL的慢病毒全基因组KO CRISPR文库，并将板在25℃下以300xg离心2小时。在离心之后，将细胞在37℃下静置6小时，用cRPMI+Blast替换培养基以30万/mL接种细胞，并将细胞在37℃下培养3天。在转导之后三天，将Daudi-Cas9细胞稀释至0.3×106个细胞/mL，并用5μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher)进行处理。在该时间点，通过用FACS缓冲液(PBS，0.5％牛血清白蛋白[Sigma]，0.02％叠氮化钠)中的7-AAD生存力染料(BioLegend)对细胞进行染色并在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上评估BFP+细胞的水平来确定感染率，为21％。在抗生素选择四天之后，将Daudi-Cas9细胞置于不含杀稻瘟菌素或嘌呤霉素的完全RPMI中。嘌呤霉素选择的细胞＞90％BFP+，如在生存力染色之后通过流式细胞术所测得。从该点开始，将Daudi-Cas9细胞每2至3天传代，每次传代保持至少45×106个细胞，以保持足够的敲除文库多样性(全基因组敲除文库中＞495×覆盖率/gRNA)。在与扩增的γδT细胞共培养之前24小时，将全基因组敲除文库Daudi-Cas9细胞用50μM的唑来膦酸盐(Sigma-Aldrich)进行处理。
根据加利福尼亚大学旧金山机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)和Vitalant IRB批准的方案，在知情同意之后将来自去身份化供体的Trima单采术的去白室(leukoreduction chamber)中的剩余细胞(Vitalant，San Francisco，CA)用作共培养筛选的原代细胞来源。使用Lymphoprep(STEMCELL)和SepMate-50PBMC分离管(STEMCELL)来分离原代人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。为了扩增Vγ9Vδ2 T细胞，将PBMC重悬于含100U/mL人IL-2(AmerisourceBergen)和5μM唑来膦酸盐的cRPMI中。在接种培养物之后2、4和6天，将PBMC培养物补充有100U/mL IL-2。在Vγ9Vδ2 T细胞扩增8天之后，使用定制的人γδT细胞阴性分离试剂盒(无CD16和CD25耗竭)(STEMCELL)按照制造商说明来分离γδT细胞。使用APC缀合的抗γδTCR(克隆B3)和PacificBlueconjugatedcanti-Vδ2 TCR(克隆B6)抗体(BioLegend)通过流式细胞术确定分离的γδT细胞为＞97％Vγ9Vδ2 TCR+。将Daudi-Cas9细胞和分离的γδT细胞二者以200万个细胞/mL重悬于cRPMI中。对于每个供体，将T细胞和Daudi-Cas9细胞以1∶2和1∶4的效应物与靶标(effector-to-target，E∶T)比混合。将培养物补充有5μM唑来膦酸盐和100U/mL IL-2。在与γδT细胞共培养24小时之后收获存活的Daudi-Cas9细胞。使用制造商的耗竭方案，将细胞混合物用EasySep人CD3阳性分离试剂盒II(STEMCELL)进行处理。从T细胞共培养物中分离之后，将Daudi-Cas9细胞在cRPMI+Blast中培养4天，并冷冻成细胞沉淀，用于产生测序文库。使用NovaSeq 6000 S1 SE100试剂盒(Illumina)对最终文库进行测序。
BTN3A表达筛选
如上所述，将Daudi-Cas9细胞用全基因组敲除CRISPR文库进行编辑。所述筛选用Daudi-Cas9细胞合并物的3个重复进行，其各自始于2.5亿个细胞，从慢病毒转导步骤开始保持完全分离。所有重复的感染率为23％至25％。对于每个重复，在慢病毒转导之后14天，将1.8亿个Daudi-Cas9细胞用7-AAD(Tonbo)生存力染料和Alexa Fluor 647缀合的抗BTN3A1抗体(克隆BT3.1，1∶40稀释)(Novus 630 Biologicals)进行染色。使用FACSAriaII、FACSAria III和FACSAria Fusion(BD Biosciences)细胞分选仪对活的BTN3A-高(顶部约25％)和BTN3A-低(底部约25％)Daudi-Cas9细胞进行分选。每个分选的群体具有1200万至2300万个细胞。将细胞沉淀冷冻并用于产生测序文库。使用NovaSeq 6000 S4 PE150试剂盒(Illumina)对最终文库进行测序。
下一代测序文库制备
将细胞沉淀以250万个细胞/416μL裂解反应在400μL细胞裂解缓冲液(1％SDS，50mM Tris，pH 8，10mM EDTA)和16μL氯化钠(5M)中在66℃下裂解过夜。将8μL的RNase A(10mg/mL，Qiagen)添加至细胞裂解溶液，并将其在37℃下孵育1小时。然后添加八微升的蛋白酶K(20mg/mL，Ambion)，并将其在55℃下孵育1小时。通过在17,000xg下旋转该凝胶1分钟来制备5PRIME Phase Lock Gel-Light管(Quantabio)。将等体积的细胞裂解溶液和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，用10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA(Sigma)饱和)添加至5PRIME PhaseLock Gel-Light管。将管剧烈倒置并离心(17,000xg，5分钟，室温)。将凝胶上方包含基因组DNA的水层倒入DNA LoBind管(Eppendorf)中。添加四十(40)μL的乙酸钠(3M)、1μL的GenElute-LPA(Sigma-Aldrich)和600μL的异丙醇，并将溶液涡旋并在-80℃下冷冻。一旦解冻，就将溶液在4℃下以17,000xg离心30分钟。在弃去上清液之后，将DNA沉淀用新鲜室温乙醇(70％)洗涤，并通过将试管倒置进行混合。然后将溶液在4℃下以17,000xg离心5分钟。除去上清液并将DNA沉淀风干15分钟。将DNA洗脱缓冲液(Zymo Research)添加至DNA沉淀，并将其在65℃下孵育15分钟以重悬基因组DNA。
两步PCR法用于扩增和索引(index)基因组DNA样品，以用于下一代测序(NGS)。对于第一PCR反应，将10μg的基因组DNA用于每100μL反应(0.75μL的Ex Taq聚合酶、10μL的10xExTaq缓冲液、8μL的dNTP、0.5μL的Read1-Stagger等摩尔引物混合物(100μM)(NxTRd1.Stgr0-7引物)、以及0.5μL的Read2-TRACR引物(100μM))以扩增整合的gRNA。PCR#1程序是95℃下5分钟；95℃下30秒、53℃下30秒、72℃下20秒的28个循环；72℃下10分钟。将PCR产物溶液用SPRI纯化(1.0X)进行处理，并将DNA在100μL的水中洗脱。为了对样品进行索引，将2μL纯化的PCR产物(1∶20稀释)用于50μL PCR反应，该反应包含25μL的Q5 Ultra II2x主混合物(NEB)、1.25μL的Nextera i5索引引物(indexing primer)(10μM)(P5.i501-508引物)和1.25μL的Nextera i7索引引物(10μM)(P7.i701-708引物)。PCR#2程序是98℃下3分钟；98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下25秒的10个循环；72℃下2分钟。将最终PCR产物用SPRI纯化(0.7X)进行处理，包括在80％乙醇中洗涤两次。将DNA在15μL的水中洗脱。使用Qubit荧光计(Thermo Fisher)确定浓度，并通过凝胶电泳和生物分析仪(Agilent)确定文库大小。将所有经索引样品以等摩尔量合并，并通过NGS进行分析。
全基因组CRISPR筛选分析
使用MAGeCK(版本0.5.8)中的count命令生成每个样品中的单独指导子丰度的表格(Li et a1.Genome Biol.15，554(2014))。将MAGeCK测试命令用于鉴定低与高区块之间或者杀伤之前与杀伤之后条件下差异富集的sgRNA靶标。对于共培养杀伤筛选，具有FDR调整的p值＜0.05的所有基因被认为是显著的。对于BTN3A筛选，具有FDR调整的p值＜0.01的所有基因被认为是显著的。针对两个筛选的基因集富集分析(GSEA)使用GSEA(版本4.1.0[build：27]，UCSD和Broad研究所)(Mootha et al.，Nat.Genet.34，267-273(2003)；Subramanian et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，15545-15550(2005))，使用基因及其对数倍数变化值的排序列表进行。使用以下GSEA设置：1000个排列，无折叠(No Collapse)，基因集数据库C2.CP.KEGG.7.4。Correlation AnalyzeR的web界面和R包(版本1.0.0)二者(Millet&Bishop，BMCBioinformatics 22，206(2021))用于确定由ARCH4储库提供的公开可获得的样品中成对的和全基因集的BTN3A1表达相关性(Lachmann et al.Nat.Commun.9，1366(2018))。
sgRNA质粒和慢病毒
为了制备用于阵列验证研究的sgRNA质粒，通常按照保藏实验室的“gRNA表达载体V2015-8-25的构建”方案，将单独sgRNA克隆到pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W载体(来自Kosuke Yusa的Addgene plasmid#67974)中。简言之，用BbsI-HF(New EnglandBiolabs[NEB])消化载体，在1％琼脂糖凝胶上运行，并经凝胶提取。对于每种sgRNA，使用T4多核苷酸激酶(NEB)和T4 DNA连接酶反应缓冲液(NEB)使具有适当突出端的寡核苷酸对退火。使用T4 DNA连接酶(NEB)来连接退火的插入物和线性化的载体，并将其转化到MultiShot StripWell Stbl3大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen)中，然后在溶源性肉汤(Lysogeny broth，LB)琼脂羧苄青霉素板上在37℃下培养过夜。单菌落在含氨苄青霉素的LB中生长，并通过插入位点的Sanger测序PCR扩增子来筛选正确的sgRNA插入。成功的克隆生长，并将其用Plasmid Plus Midi试剂盒(Qiagen)处理，其中DNA产物用作慢病毒包装期间的转移质粒。对收集的慢病毒进行滴定以用于在Daudi-Cas9细胞中进行最佳转导，并将收集的慢病毒用于产生单基因Daudi-Cas9 KO。
阵列CRISPR sgRNA KO
为了产生单基因Daudi-Cas9 KO，将300万个细胞/mL重悬于含4μg/mL聚凝胺的cRPMI中。将Daudi-Cas9细胞以150μL/孔等分到96孔V型底板中。将针对最佳转导稀释的10μL AAVS1 sgRNA病毒添加至细胞，其中3个重复/sgRNA(6个重复/AAVS1 sgRNA)。将板在25℃下以300xg离心2小时。在离心之后，将细胞在37℃下静置6小时、沉淀、以750,000个细胞/mL重悬于新鲜的cRPMI中、并在37℃下培养3天。在转导之后三天，将Daudi-Cas9细胞稀释至0.3×106个细胞/mL，并用5μg/mL嘌呤霉素(Thermo Fisher)进行处理。在抗生素选择四天之后，将Daudi-Cas9细胞置于不含嘌呤霉素的cRPMI中。从该点开始，将Daudi-Cas9细胞每2至3天进行传代。在转导之后13天收集细胞以评估每个KO的CRISPR靶位点中插失的频率。在同一时间点，通过流式细胞术分析细胞的BTN3A表达。
将BFP+(慢病毒诱导的)Daudi-Cas9 KO细胞用FACS缓冲液中的人TruStain FcX(Fc受体封闭溶液)在4℃下封闭20分钟。将经封闭细胞用FACS缓冲液中的7-AAD生存力染料(1∶150稀释)和APC缀合的抗CD277抗体(克隆BT3.1，1∶50稀释)(Miltenyi Biotec)或APC缀合的IgG1同种型对照抗体(Miltenyi Biotec，1∶50稀释，抗KLH，克隆IS5-21F5)在4℃下染色30分钟。在Attune NxT流式细胞仪上分析经染色和洗涤的细胞。当将细胞用同种型对照抗体染色时，在APC通道中没有检出明显的信号。
CRISPR基因分型引物
为了确定阵列Daudi-Cas9 KO细胞中的插失频率(indel frequency)，围绕多个敲除的CRISPR cute位点产生扩增子的索引NGS文库。用CRISPR(版本4.8)(Concordet etal.，Nucleic Acids Res.46，W242-W245(2018))以选项“--ampLen＝250--ampTm＝60”来设计用于产生围绕CRISPR基因组靶位点的扩增子的引物。为了分析NGS基因分型数据，使用cutadapt(版本2.8)(Martin，EMBnet J.17，10-12(2011))，使用默认设置保持最小50bp的读长，从fastq文件中修剪衔接子序列。然后使用CRISPResso2(版本2.0.42)(Clement etal.Nat.Biotechnol.37，224-226(2019))，以选项“--quantification_window_size 3”和“--ignore_substitutions”)来计算每个CRISPR靶位点处的插入和缺失。
阵列KO的合并CRISPR基因分型
将来自合适样品的约50,000个细胞进行沉淀(300xg，5分钟)，并将其重悬于50μL的QuickExtract DNA提取溶液(Lucigen)中。根据以下方案(QuickExtract PCR)在热循环仪上运行样品：65℃下10分钟，95℃下5分钟740，在12℃下保持。将样品储存在-20℃下，直至进一步的步骤。每个样品的PCR反应由以下组成：5μL提取的DNA样品、1.25μL的10μM预混合正向和反向引物溶液、12.5μL的Q5高保真2X主混合物(NEB)、以及6.25μL的分子生物学级别水。然后根据以下PCR#1程序在热循环仪上运行样品：98℃下3分钟；94℃下20秒、65℃至57.5℃下20秒(每个循环降低0.5℃)、72℃下1分钟的15个循环；94℃下20秒、58℃下20秒、72℃下1分钟的20个循环；72℃下10分钟，4℃下保持。将PCR产物储存在-20℃下，直至进一步的步骤。将PCR#1产物在以下PCR#2反应中进行索引：1μL的PCR#1产物(1∶200稀释)、2.5μL的10μM正向索引引物、2.5μL的10μM反向索引引物、12.5μL的Q5高保真2X主混合物(NEB)、以及6.5μL分子生物学级别水。根据以下程序在热循环仪上运行PCR反应：98℃下30秒；98℃下10秒、60℃下30秒、72℃下30秒的13个循环；72℃下2分钟，4℃下保持。将PCR#2产物在-20℃下储存，直至进一步的步骤。将PCR#2产物合并、SPRI纯化(1.1X)、并在水中洗脱。使用NovaSeq 6000 SP PE150试剂盒(Illumina)对最终文库进行测序。
Sanger测序基因分型
通过Sanger测序对Daudi-Cas9 NLRC5(gRNA#2)KO进行基因分型。将约50,000个细胞进行沉淀(300xg，5分钟)，并将其重悬于50μL QuickExtract DNA提取溶液中。根据QuickExtract PCR程序在热循环仪上运行样品。将样品储存在-20℃下，直至进一步的步骤。每个样品的PCR反应由以下组成：1μL QuickExtract DNA样品、0.75μL的10μM正向引物、0.75μL的10μM反向引物、12.5μL的KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR试剂盒(RocheDiagnostics)、以及10μL的分子生物学级别水。根据以下方案在热循环仪上扩增样品：95℃下3分钟；98℃下20秒、67℃下15秒、72℃下30秒的35个循环；72℃下5分钟，4℃下保持。使用Sanger测序来分析扩增产物，并使用TIDE(通过分解追踪插失(Tracking of Indels byDecomposition))算法(Brinkman et al.，Nucleic Acids Res.42，e168-e168(2014))来评估敲除效率。
Daudi KO和AICAR/991处理的细胞的RT-qPCR
为了对Daudi-Cas9 KO进行测量，在慢病毒转导之后13天收集样品。为了对经药物处理的WT Daudi-Cas9细胞进行测量，将180μL的Daudi-Cas9细胞以275,000个细胞/mL接种在圆底96孔板中。用200μL的无菌PBS或水填充所有周围的孔。每种处理采用四个重复，用20μL的AICAR(终浓度0.5mM)、化合物991(终浓度80μM)、DMSO或水处理细胞。在72小时孵育之后收集细胞以用于RT-qPCR测量。使用Quick-RNA 96试剂盒(Zymo Research)或Direct-zolRNA Microprep试剂盒(Zymo)根据制造商方案从约70,000个细胞/样品中提取RNA，不进行任选的柱上DNA酶I处理。根据制造商的方案，使用RT-qPCR用Maxima第一链cDNA合成试剂盒采用dsDNA酶处理(Thermo Fisher)立即处理1μL的RNA。除逆转录酶负(RT-)阴性对照反应之外，对每个生物学重复进行两个cDNA合成反应。也进行RNA模板负(RNA-)阴性对照。将cDNA样品储存在-20℃下，直至其用于RT-qPCR。为了进行RT-qPCR，将每个生物学重复的两个cDNA样品合并，并在分子生物学级别水中以1∶1稀释。以同样的方式稀释阴性对照。根据制造商的方案，将3μL的经稀释cDNA和阴性对照用于使用包含参考染料的PrimeTime基因表达主混合物(Integrated DNA Technologies[IDT])的RT-qPCR反应。每个生物学重复的RT-qPCR与每个生物学重复的RT-阴性对照、RNA-阴性对照和无cDNA模板阴性对照一起以一式三份进行。阴性对照均未显示出靶标扩增。根据以下程序在QuantStudio 5实时PCR系统(384孔，Thermo Fisher)上运行样品：95℃下3分钟；95℃下5秒、60℃下30秒的40个循环。使用以500μL IDTE缓冲液(IDT)重悬的PrimeTime标准qPCR探针测定(IDT)来扩增BTN2A1、BTN3A1、BTN3A2和ACTB基因座。评估每个样品的三次技术重复中Ct值的由技术失效导致的显著异常值(评估标准偏差高于0.2的以一式三份的任何样品)，并随后求平均。进行以下计算：ΔCt＝CtACTB-Ct靶标；ΔΔCt＝ΔCt(KO或处理)-平均(ΔCt(对照))。单独对照ΔCt测量用于确定对照ΔΔCt的标准偏差。AAVS1 KO用作Daudi KO中qPCR测量的对照，而载剂对照(DMSO，水)用于用AICAR和化合物991处理的Daudi细胞中的测量。
葡萄糖和丙酮酸剂量响应
将Daudi-Cas9 KO细胞(190μL)以250,000个细胞/mL接种在圆底96孔板不含葡萄糖的cRPMI(+谷氨酰胺，+胎牛血清，+青霉素/链霉素，-葡萄糖，-丙酮酸)(FisherScientific)中。将10μL不同浓度的葡萄糖(Life Tech)或丙酮酸钠(Gibco)添加至细胞。用200μL的无菌水或PBS填充板的边缘孔。将细胞在37℃下培养72小时、用FACS缓冲液中的APC缀合的抗人CD277抗体(克隆BT3.1，1∶50稀释)(Miltenyi Biotec)和7-AAD(1∶150稀释)(Tonbo)进行染色、并在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。
抑制剂剂量响应
将Daudi-Cas9细胞(180μL)以275,000细胞/mL接种在圆底96孔板中的cRPMI中。将20μL的不同浓度的唑来膦酸盐、鱼藤酮(MedChemExpress)、寡霉素A(Neta Scientific)、FCCP(MedChemExpress)、抗霉素A(Neta Scientific)、AICAR(Sigma)、2-DG(Sigma)、化合物991(Selleck Chemical)、A-769662(Sigma)、乙醇(载剂)或DMSO(载剂，稀释度与处理相匹配)添加至细胞。用200μL的无菌水或PBS填充板的边缘孔。将细胞在37℃下培养72小时，并用APC缀合的抗人CD277抗体(克隆BT3.1，1∶50稀释)(Miltenyi Biotec)和7-AAD(1∶150稀释)(Tonbo)进行染色。然后在Attune NxT流式细胞仪上分析细胞。
将Daudi-Cas9 AAVS1和PPAT KO细胞(190μL)以250,000个细胞/mL接种在圆底96孔板中。细胞接受10μL的DMSO(载剂)或终浓度为10μM的以下化合物之一：sephin1(APExBIO)、ISRIB(MedChemExpress)、胍那苄乙酸盐(MedChemExpress)、Sal003(MedChemExpress)、salubrinal(MedChemExpress)、raphin1乙酸盐(MedChemExpress)和雷帕霉素(MilliporeSigma)。用200μL无菌PBS或水填充边缘孔。在培养72小时之后，将细胞用APC缀合的抗人CD277抗体(克隆BT3.1，1∶50稀释)(Miltenyi Biotec)和7-AAD(1∶150稀释)(Tonbo)进行染色，并在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。
与AICAR或OXPHOS抑制组合的化合物C剂量响应
将Daudi-Cas9细胞(170μL)以292,000个细胞/mL接种在圆底96孔板中的cRPMI中。将10μL的化合物C(Abcam)以不同浓度添加至所有细胞。在指定的浓度下，将20μL的鱼藤酮、寡霉素A、FCCP、2-DG、AICAR或cRPMI(对照)添加至接受化合物C的孔。将稀释度与化合物C匹配的10μL的DMSO和20μL的cRPMI添加至仅DMSO载剂对照孔。用200μL的无菌水或PBS填充板的边缘孔。将细胞在37℃下培养72小时、用APC缀合的抗人CD277抗体(克隆BT3.1，1∶50稀释)(Miltenyi Biotec)和7-AAD(1∶150稀释)(Tonbo)进行染色、并在Attune NxT流式细胞仪上进行分析。
Vg9Vd2 TCR四聚体产生
使用以下方法产生G115 Vγ9Vδ2 TCR克隆四聚体。将G115γ-845链序列(Davodeau et al.J.Immunol.151，1214-1223(1993))克隆到具有C端酸性拉链的pAcGP67A载体中，并将G115δ链序列((Davodeau et al.(1993))克隆到具有C端AviTag后接碱性拉链的pAcGP67A载体中。拉链使TCR复合物稳定。使TCR在High Five杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达，并通过亲和色谱在镍-NTA柱上进行纯化。使TCR生物素化，并且生物素化使用TrapAvidin SDS-PAGE测定来确定。然后使用尺寸排阻色谱(Superdex200 100/300GL柱，GEHealthcare)进一步纯化G115 TCR，并通过SDS-PAGE来确定纯度。通过将生物素化的TCR与缀合至PE荧光团的链霉亲和素一起孵育来产生四聚体。
γδTCR四聚体染色
在慢病毒转导之后13和14天分析Daudi-Cas9 KO细胞。在用0.5mM AICAR、80μM化合物991、DMSO(浓度匹配化合物991的载剂对照)、或空白(nothing)培养72小时之后，分析WT Daudi-Cas9细胞。在包含人血清(PBS，10％人血清AB[GeminiBio]，3％FBS，0.03％叠氮化钠)的200μL FACS缓冲液中洗涤细胞(300xg，5分钟)，并将其在冰上于黑暗中用7-AAD(1∶150稀释)染色20分钟。在第一染色之后，将细胞沉淀(300xg，5分钟)，并用160nM PE缀合的Vγ9Vδ2 TCR(克隆G115)四聚体在室温下于黑暗中染色1小时。在四聚体染色之后，将细胞在包含人血清的200μL FACS缓冲液中彻底洗涤三次(400xg，5分钟)。在Attune NxT流式细胞仪上分析经染色细胞。
途径可视化
使用Cytoscape(版本3.9.0)和WikiPathways应用程序(版本3.3.7)生成途径数据可视化。使用GlycanBuilder2(版本1.12.0)以SNFG格式生成N-聚糖途径的聚糖图，并使用RCy3包(版本2.14.0)在RStudio(R版本4.0.5)中将其并入到Cytoscape的途径中。所有途径可视化均基于WikiPathways模型[参见网页pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33211851/]；
甲羟戊酸途径改编自WP4718[参见网页wikipathways.org/instance/WP4718]和WP197[参见网页wikipathways.org/instance/WP197]；
嘌呤生物合成途径改编自WP4224[参见网页wikipathways.org/instance/WP4224]；
OXPHOS途径改编自WP111[参见网页wikipathways.org/instance/WP111]；
铁-硫簇生物发生途径对应于WP5152[参见网页wikipathways.org/instance/WP5152]；
唾液酸化途径对应于WP5151[网页wikipathways.org/instance/WP5151]；
N-聚糖生物合成途径基于WP5153[网页wikipathways.org/instance/WP5153]。
共培养筛选和BTN3A调节子筛选特征的产生
使用R包TCGAbiolinks获得来自11,093名患者的TCGA批量RNA-seq和存活数据，并去除匹配的正常样品。使用在共培养筛选或BTN3A筛选中具有显著倍数变化(FDR＜0.01)的基因产生特征。采用Jiang et al.(Nat.Med.24，1550-1558(2018))描述的策略，使用所述特征的水平对TCGA样品进行评分。样品的特征水平被估算为特征基因的归一化基因表达与特征基因的筛选评分之间的斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)：相关性(归一化表达，加权倍数变化)。使用以下：-log10(Padj)×sign(倍数变化)作为每个基因的筛选评分。特征基因的表达通过将其在所有11,093个样品中的平均值相除，而在TCGA样品中归一化。
特征存活相关性
Cox比例风险模型用于检查特征表达与患者存活率的相关性：
h(t，患者)～ho(t)exp(β”+βl(患者))
其中：
h是风险函数(定义为患者在每单位时间内的死亡风险)；
ho(t)是时间t时的基线风险函数；
l(患者)是患者的筛选特征水平；并且
β是存活相关性系数。
β的显著性(沃尔德检验(Wald’s test))是使用R包“存活(Survival)”确定的存活相关性系数。为了使用Kaplan-Meier图显示存活与特征的相关性，使用给定癌症类型中样品中特征水平的中位数将TCGA样品分成两组，并且比较两组之间的存活。使用对数秩检验评估存活差异的显著性。
为了检验存活与特征的相关性对γδT细胞的存在或不存在的依赖性，我们使用样品中TRGV9(Vγ9)和TRDV2(Vδ2)基因的平均表达(每百万份转录物)作为其Vγ9Vδ2 T细胞转录物丰度。筛选特征与TRGV9/TRDV2转录物丰度的可能相互作用使用Cox回归采用以下模型进行估计：
h(t，患者)～hog(t)exp(β0+β1l+β2g+β3l*g)
其中l是特征水平，并且g是TCGA样品中的TRGV9/TRDV2转录物丰度。通过将该模型的似然性与null模型的似然性进行比较，并进行似然比检验，来估计相互作用系数β3的显著性。null模型：
(hnull，(t，患者)～ho(t)exp(β0+β1l+β2g+β3l*g))
为了使用Kaplan-Meier图显示相互作用，使用中位特征水平和中位TRGV9/TRDV2转录物丰度将TCGA样品分成四组。
软件
在R(版本4.0.2)中的ggplot2以及Prism 9(GraphPad)中生成图。在FlowJo(版本10.8.0，Beckton Dickinson)中分析流式细胞术数据。图是用Illustrator(版本26.0，Adobe)编辑的。图表是在BioRender.com中制作的。OXPHOS示意图改编自BioRender.com(2021)的“Electron Transport Chain”，从网站app.biorender.com/biorender-templates检索。
数据可用性
两个筛选的测序数据集将在NCBI基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)库获得(共培养筛选：GSE192828；BTN3A筛选：GSE192827)。
参考文献
1.Silva-Santos，B.，Serre，K.&Norell，H.γδT cells incancer.Nat.Rev.Immunol.15，683-691(2015).
2.Silva-Santos，B.，Mensurado，S.&Coffelt，S.B.γδT cells：pleiotropicimmune effectors with therapeutic potential in cancer.Nat.Rev.Cancer 19，392-404(2019).
3.Sebestyen，Z.，Prinz，I.，Déchanet-Merville，J.，Silva-Santos，B.&Kuball，J.Translating gammadelta(γδ)T cells and their receptors into cancer celltherapies.Nat.Rev.Drug Discov.19，169-184(2020).
4.Raverdeau，M.，Cunningham，S.P.，Harmon，C.&Lynch，L.γδT cells incancer：a small population of lymphocytes with big implications.Clin.Transl.Immunol.8，e01080(2019).
5.Groh，V.，Steinle，A，Bauer，S.&Spies，T.Recognition of stress-inducedMHC molecules by intestinal epithelialγδT cells.Science 279，1737-1740(1998).
6.Strid，J.，Sobolev，O.，Zafirova，B.，Polic，B.&Hayday，A.TheIntraepithelial T Cell Response to NKG2D-Ligands Links Lymphoid StressSurveillance to Atopy.Science 334，1293-1297(2011).
7.Girardi，M.et al.Regulation of cutaneous malignancy byγδTcells.Science 294，605-609(2001).
8.Harly，C.et al.HumanγδT cell sensing of AMPK-dependent metabolictumor reprogramming through TCR recognition of EphA2.Sci.Immunol.6，eaba9010(2021).
9.Rigau，M.et al.Butyrophilin 2A1 is essential for phosphoantigenreactivity byγδT cells.Science 367，eaay5516(2020).
10.Karunakaran，M.M.et al.Butyrophilin-2A1 Directly Binds Germline-Encoded Regions ofthe Vγ9Vδ2 TCR and Is Essential for PhosphoantigenSensing.Immunity 52，487-498.e6(2020).
11.Chien，Y.，Meyer，C.&Bonneville，M.γδT cells：first line of defenseand beyond.Annu.Rev.Immunol.32，121-155(2014).
12.Brenner，M.B.et al.Identification of a putative second T-cellreceptor.Nature 322，145-149(1986).
13.Bank，I.et al.A functional T3 molecule associated with a novelheterodimer on the surface of immature human thymocytes.Nature 322，179-181(1986).
14.Lanier，L.L.et al.The gamma T-cell antigenreceptor.J.Clin.Immunol.7，429-440(1987).
15.Harly，C.et al.Key implication of CD277/butyrophilin-3(BTN3A)incellular stress sensing by a major humanγδT-cell subset.Blood 120，2269-2279(2012).
16.Uhlén，M.et al.Tissue-based map of the human proteome.Science 347，1260419-1260419(2015).
17.Payne，K.K.et al.BTN3A1 governs antitumor responses by coordinatingαβandγδT cells.Science 369，942-949(2020).
18.Sandstrom，A.et al.The intracellular B30.2 domain of butyrophilin3A1 binds phosphoantigens to mediate activation of human Vγ9Vδ2 Tcells.Immunity 40，490-500(2014).
19.Mullen，P.J.，Yu，R.，Longo，J.，Archer，M.C.&Penn，L.Z.The interplaybetween cell signalling and the mevalonate pathway in cancer.Nat.Rev.Cancer16，718-731(2016).
20.Patel，S.J.et al.Identification of essential genes for cancerimmunotherapy.Nature 548，537-542(2017).
21.Yu，Z.et al.Identification of a transporter complex responsible forthe cytosolic entry of nitrogen-containing bisphosphonates.eLife 7，e36620(2018).
22.Dang，A.T.et al.NLRC5 promotes transcription of BTN3A1-3 genes andVγ9Vδ2 T cell-mediated killing.iScience 24，101900(2021).
23.Corvaisier，M.etal.Vγ9Vδ2 T cell response to colon carcinomacells.J.Immunol.175，5481-5488(2005).
24.Sheftel，A.，Stehling，O.&Lill，R.Iron-sulfur proteins in health anddisease.Trends Endocrinol.Metabolism 21，302-314(2010).
25.Voss，M.et al.Shedding of glycan-modifying enzymes by signalpeptide peptidase-like 3(SPPL3)regulates cellular N-glycosylation.EMBO J.33，2890-2905(2014).
26.Jongsma，M.L.M.et al.The SPPL3-Defined Glycosphingolipid RepertoireOrchestrates HLA Class I-Mediated Immune Responses.Immunity 54，132-150.e9(2021).
27.Blevins，M.A.，Huang，M.&Zhao，R.The Role of CtBP1 in OncogenicProcesses and Its Potential as a Therapeutic Target.Mol Cancer Ther 16，981-990 (2017).
28.Annaert，W.&Kaether，C.Bring it back，bring it back，don’t take itaway from me-the sorting receptor RER1.J Cell Sci 133，j cs231423(2020).
29.Mick，E.et al.Distinct mitochondrial detects trigger the integratedstress response depending on the metabolic state of the cell eLife 9，e49178(2020).
30.Herzig，S.&Shaw，R.J.AMPK：guardian of metabolism and mitochondrialhomeostasis.Nat Rev Mol Cell Bio 19，121-135(2018).
31.Jiang，P.et al.Signatures of T cell dysfunction and exclusionpredict cancer immunotherapy response.Nat.Med.24，1550-1558(2018).
32.Park，J.H.et al.Tumor hypoxia repressesγδT cell-mediated antitumorimmunity against brain tumors.Nat.Immunol.22，336-346(2021).
33.Meizlish，M.L.，Franklin，R.A.，Zhou，X.&Medzhitov，R.Tissue Homeostasisand Inflammation.Annu.Rev，Immunol.39，1-25(2021).
34.Warburg，O.，Posener，K.&Negelein，E.Ueber den Stoffwechsel derTumoren.Biochem.Z.152，319-344(1924).
35.Heiden，M.G.V.，Cantley，L.C.&Thompson，C.B.Understanding the WarburgEffect：The Metabolic Requirements of Cell Proliferation.Science 324，1029-1033(2009).
36.Tzelepis，K.et al.A CRISPR Dropout Screen Identifies GeneticVulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.CellRep.17，1193-1205(2016).
37.Shifrut，E.et al.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human TCells Reveal Key Regulators of Immune Function.Cell 175，1958-1971.e15(2018).
38.Li，W.et al.MAGeCK enables robust identification of essential genesfrom genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens.Genome Biol.15，554(2014).
39.Ma，Y.et al.CRISPR/Cas9 Screens Reveal Epstein-Barr Virus-Transformed B Cell Host Dependency Factors.Cell Host Microbe 21，580-591.e7(2017).
40.Jiang，S.et al.CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Epstein-BarrVirus-Transformed Lymphoblastoid B-Cell Lines.Curr.Protoc.Mol.Biol.121，31.12.1-31.12.23(2018).
41.Mootha，V.K.et al.PGC-1α-responsive genes involved in oxidativephosphorylation are coordinately downregulated in humandiabetes.Nat.Genet.34，267-273(2003).
42.Subramanian，A.et al.Gene set enrichment analysis：A knowledge-basedapproach for interpreting genome-wide expressionprofiles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，15545-15550(2005).
43.Miller，H.E.&Bishop，A.J.R.Correlation AnalyzeR：functionalpredictions from gene coexpression correlations.BMC Bioinformatics 22，206(2021).
44.Lachmann，A.et al.Massive mining of publicly available RNA-seq datafrom human and mouse.Nat.Commun.9，1366(2018).
45.Concordet，J.-P.&Haeussler，M.CRISPOR：intuitive guide selection forCRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.Nucleic Acids Res.46，W242-W245(2018).
46.Martin，M.Cutadapt removes adapter sequences from high-throughputsequencing reads.EMBnet J.17，10-12(2011).
47.Clement，K.et al.CRISPResso2 provides accurate and rapid genomeediting sequence analysis.Nat.Biotechnol.37，224-226(2019).
48.Brinkman，E.K.，Chen，T.，Amendola，M.&Steensel，B.van.Easy quantitativeassessment of genome editing by sequence trace decomposition.Nucleic AcidsRes.42，e168-e168(2014).
49.Davodeau，F.et al.Close correlation between Daudi and mycobacterialantigen recognition by hurnan gamma delta T cells and expression of V9JPC1γ/V2DJCδ-encoded T cell receptors.J.Immunol.151，1214-1223(1993).
50.Shannon，P.et al.Cytoscape：A Software Environment for IntegratedModels of Biomolecular Interaction Networks.Genome Res.13，2498-2504(2003).
51.Kutmon，M.，Lotia，S.，Evelo，C.T.&Pico，A.R.WikiPathways App forCytoscape：Making biological pathways amenable to network analysis andvisualization.F1000Res.3，152(2014).
52.Tsuchiya，S.et al.Implementation of GlycanBuilder to draw a widevariety of ambiguous glycans.Carbohyd.Res.445，104-116(2017).
53.Varki，A.et al.Symbol Nomenclature for Graphical Representations ofGlycans.Glycobiology 25，1323-1324(2015).
54.Gustavsen，J.A.，Pai，S.，Isserlin，R.，Demchak，B.&Pico，A.R.RCy3：Networkbiology using Cytoscape from within R.F1000Res.8，1774(2019).
55.Jiang，P.et al.Signatures of T cell dysfunction and exclusionpredict cancer immunotherapy response.Nat.Med.24，1550-1558(2018).
本文中引用或提及的所有专利和出版物均表明本发明所属领域的技术人员的技能水平，并且每个这样的所引专利或出版物均在此通过引用明确地并入，其程度就如同通过引用整体单独地并入或以整体在本文中陈述。申请人保留来自任何这样的引用的专利或出版物的任何和所有材料和信息实际并入到本说明书中的权利。
以下陈述旨在根据说明书中的前述描述来描述和总结本发明的多个实施方案。
陈述：
1.方法，其包括：测量来自一个或更多个对象的至少一种细胞样品中的一个或更多个BTN3A基因、一种或更多种正或负BTN3A调节子基因、或其组合的基因表达水平；以及鉴定样品表现出以下的任何对象：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
2.陈述1所述的方法，其还包括从一个或更多个对象获得T细胞，所述对象的样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
3.陈述2所述的方法，其还包括扩增T细胞以产生T细胞群。
4.陈述2或3所述的方法，其还包括将所述T细胞或所述T细胞群施用于对象，所述对象的样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
5.陈述4所述的方法，其中所施用的T细胞对所述对象而言是自体或同种异体的。
6.陈述1至5中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含γ-δT细胞。
7.陈述1至6中任一项所述的方法，其中所述T细胞包含Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞。
8.陈述1至7中任一项所述的方法，其中一个或更多个BTN3A调节子基因是转录因子基因、代谢传感基因、甲羟戊酸途径基因、OXPHOS基因、嘌呤生物合成(PPAT)基因或其组合。
9.陈述1至8中任一项所述的方法，其中一种或更多种正负BTN3A调节子基因在表1中列出。
10.陈述1至8中任一项所述的方法，其中一种或更多种正BTN3A调节子基因在表2中列出。
11.陈述1至10中任一项所述的方法，其中一种或更多种正BTN3A调节子基因天然提高BTN3A表面表达。
12.陈述1至10中任一项所述的方法，其中一种或更多种负BTN3A调节子基因天然降低BTN3A表面表达。
13.陈述1至12中任一项所述的方法，其中一种或更多种正BTN3A调节子基因是
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C170rf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，或KIAA0391。
14.陈述1至13中任一项所述的方法，其中一种或更多种正BTN3A调节子基因是干扰素调节因子1(IRF1)、IRF8、IRF9、NLRC5、SPIB、SPI1或TIMMDC1。
15.陈述1至14中任一项所述的方法，其中一种或更多种负BTN3A调节子基因是
CTBP1，UBE2E1，RING1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8，AHCYL1，或其组合。
16.陈述1至15中任一项所述的方法，其中一种或更多种负BTN3A调节子基因是ZNF217、CTBP1、RUNX1、GALE、TIMMDC1、NDUFA2、PPAT、CMAS、RER1、FAM96B或其组合。
17.陈述8至16中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述转录因子基因是CTBP1、IRF1、IRF8、IRF9、NLRC5、RUNX1、ZNF217或其组合。
18.陈述8至17中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述甲羟戊酸途径基因是FDPS、HMGCS1、MVD、FDPS、GGPS1或其组合。
19.陈述8至18中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述OXPHOS基因是
ATP5A1，ATP5B，ATP5C1，ATP5D，ATP5E，ATP5F1，ATP5G1，ATP5G2，ATP5G3，ATP5H，ATP5I，ATP5J，ATP5J2，ATP5L，ATP5O，ATP5S，COX4I1，COX4I2，COX5A，COX5B，COX6A1，COX6A2，COX6B1，COX6B2，COX6C，COX7A1，COX7A2，COX7B，COX7B2，COX7C，COX8A，COX8C，CYC1，NDUFA1，NDUFA10，NDUFA11，NDUFA12，NDUFA13，NDUFA2，NDUFA3，NDUFA4，NDUFA5，NDUFA6，NDUFA7，NDUFA8，NDUFA9，NDUFAB1，NDUFB1，NDUFB10，NDUFB11，NDUFB2，NDUFB3，NDUFB4，NDUFB5，NDUFB6，NDUFB7，NDUFB8，NDUFB9，NDUFC1，NDUFC2，NDUFS1，NDUFS2，NDUFS3，NDUFS4，NDUFS5，NDUFS6，NDUFS7，NDUFS8，NDUFV1，NDUFV2，NDUFV3，SDHA，SDHB，SDHC，SDHD，UQCR10，UQCR11，UQCRC1，UQCRC2，UQCRFS1，UQCRH，UQCRQ，或其组合。
20.陈述8至19中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述OXPHOS基因是ATP5、ATP5A1、ATP5B、ATP5D、ATP5J2、COX(例如，COX4I1、COX5A、COX6B1、COX6C、COX7B、COX8A)、GALE、NDUFA(例如，NDUFA2、NDUFA3、NDUFA6和/或NDUFB7)、NDUFB、NDUFC2、NDUFS、NDUFV1、SDHC、TIMMDC1、UQCRC1、UQCRC2或其组合。
21.陈述8至20中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述嘌呤生物合成(PPAT)基因是PPAT、GART、ADSL、PAICS、PFAS、ATIC、ADS、GMPS或其组合。
22.陈述8至21中任一项所述的方法，其中CtBP1是代谢传感基因。
23.陈述1至22中任一项所述的方法，其还包括向对象施用抑制BTN3A的药剂，所述对象的样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
24.陈述1至23中任一项所述的方法，其还包括向对象施用抑制BTN3A正调节子的药剂，所述对象的样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
25.陈述1至24中任一项所述的方法，其还包括向对象施用化学治疗剂，所述对象的样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
26.陈述1至25中任一项所述的方法，其还包括施用一种或更多种化学治疗剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗微生物剂、防腐剂或其组合。
27.陈述1至26中任一项所述的方法，其还包括施用一种或更多种烷化剂(例如，氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、乙烯亚胺、三氮烯)；抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物)；抗生素(例如，蒽环类、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素、普卡霉素)；酶(例如，L-天冬酰胺酶)；法呢基蛋白转移酶抑制剂、激素剂(例如，糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素、促黄体激素释放激素拮抗剂、乙酸奥曲肽)；微管破坏剂(例如，海鞘素)；微管稳定剂(例如，紫杉醇多西他赛/>和埃博霉素A至F)；长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲基三聚氰胺、铂配位络合物(例如，顺铂、卡铂)。
28.陈述1至27中任一项所述的方法，其还包括施用包含一种或更多种化合物的组合物，所述化合物以足以抑制或激活至少一种BTN3A1蛋白调节子的量配制。
29.陈述26所述的方法，其中一种或更多种所述化合物是鱼藤酮、杀青虫素A、二甲双胍、α-酮基-γ-(甲硫基)丁酸、6-巯基嘌呤一水合物、霉酚酸、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐、AICAR、化合物991、A-769662、2，4-二硝基苯酚、小檗碱、卡格列净、二甲双胍、甲氨蝶呤、苯乙双胍、PT-1、槲皮素、R419、白藜芦醇、3(2-(2-(4-(三氟甲基)苯基氨基)噻唑-4-基)乙酸、C2、BPA-CoA、MK-8722、MT 63-78、O304、PF249、水杨酸盐、SC4、ZMP或其组合，所述化合物的量为直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子的活性的量。
30.陈述1至29中任一项所述的方法，其与放射治疗结合使用。
31.方法，其包括使一种或更多种BTN3A1蛋白/核酸或者一种或更多种BTN3A1调节子蛋白/核酸与测试剂接触以提供测试测定混合物，以及：
a.检测所述测试测定混合物中与BTN3A1蛋白结合的测试剂的量或者与一种或更多种BTN3A1调节子蛋白结合的测试剂的量和/或对其进行定量；
b.检测所述测试测定混合物中与BTN3A1核酸结合的测试剂的量或者与一种或更多种BTN3A1调节子核酸结合的测试剂的量和/或对其进行定量；
c.对所述测试测定混合物中的BTN3A1蛋白或者一种或更多种BTN3A1调节子蛋白进行定量；或
d.其组合。
32.方法，其包括使一种或更多种表达BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1调节子的细胞与测试剂接触以提供测试测定混合物，以及
o检测所述测试测定混合物中一种或更多种细胞的表面上的BTN3A1蛋白的量和/或对其进行定量；
ο对所述测试测定混合物中的细胞增殖进行定量；
ο对细胞群中表达BTN3A1蛋白的细胞的数目进行定量；或
ο其组合。
33.陈述31或32所述的方法，其中所述细胞表达以下负BTN3A1调节子中的一种或更多种：
CTBP1，UBE2E1，RING1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8，或AHCYL1。
34.陈述31至33中任一项所述的方法，其中所述细胞表达以下正BTN3A1调节子中的一种或更多种：
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，或KIAA0391。
35.陈述31至34中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞是细胞群。
36.陈述31至35中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞是癌细胞、微生物感染的细胞、T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、α-βCD4 T细胞、α-βCD8 T细胞、γ-δ(γδ)T细胞、Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞、免疫细胞、白血球(leukocyte)、白细胞(white bloodcell)或其组合。
37.陈述31至36中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞具有突变。
38.陈述37所述的方法，其中所述突变在BTN3A1基因中、在任何所述BTN3A1调节子基因中、或在其组合中。
39.陈述31至38中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞经修饰以表达或过表达一种或更多种所述BTN3A1调节子。
40.陈述31至39中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞经修饰以表达或过表达BTN3A1。
41.陈述31至40中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞天然表达BTN3A1或BTN3A1调节子。
42.陈述31至41中任一项所述的方法，其中一种或更多种细胞具有表达BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1调节子的潜能，但当最初与测试剂混合时，所述细胞不表达可检测量的BTN3A1或者一种或更多种所述BTN3A1调节子。
43.陈述31至42中任一项所述的方法，其中一种或更多种所述细胞包含白血病细胞、淋巴瘤细胞、霍奇金病细胞、软组织和骨的肉瘤、肺癌细胞、间皮瘤、食管癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肝胆癌细胞、小肠癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、直肠癌细胞、肾癌细胞、尿道癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、内分泌系统癌细胞、皮肤癌细胞、中枢神经系统癌细胞、皮肤和/或眼内来源的黑素瘤细胞、AIDS相关癌细胞或其组合。
44.陈述31至43中任一项所述的方法，其中一种或更多种细胞包含转移性癌细胞、微转移性肿瘤细胞、大转移性肿瘤细胞、复发性癌细胞或其组合。
45.陈述31至44中任一项所述的方法，其中一种或更多种细胞被细菌、病毒、原生动物或其他感染原感染。
46.陈述31至45中任一项所述的方法，其中一种或更多种细胞还包含编码cas核酸酶的表达盒。
47.陈述46所述的方法，其中所述核酸酶是cas9核酸酶。
48.陈述31至47中任一项所述的方法，其中在有效检测所述测定混合物中所述测试剂是否可调节BTN3A1的表达或活性、BTN3A1调节子的表达或活性、或至少一种细胞的表达或活性的时间和条件下，将蛋白质和/或细胞与所述测试剂一起孵育。
49.陈述31至48中任一项所述的方法，其中所述测试剂是一种或更多种小分子、抗体、核酸、表达盒、表达载体、抑制性核酸、指导RNA、核酸酶(例如，一种或更多种cas核酸酶)或其组合。
50.陈述31至49中任一项所述的方法，其中所述测试剂是一种或更多种本文中所述的BTN3A1调节子、一种或更多种抗BTN3A1抗体、一种或更多种可调节BTN3A1表达的BTN3A1抑制性核酸、一种或更多种可结合BTN3A1核酸的指导RNA、一种或更多种可结合本文中所述任意BTN3A1调节子的抗体、一种或更多种可调节本文中所述任意BTN3A1调节子表达的抑制性核酸、一种或更多种可结合编码本文中所述任意BTN3A1调节子的核酸的指导RNA、一种或更多种可调节BTN3A1的小分子、一种或更多种可调节任意BTN3A1调节子的小分子、一种或更多种指导RNA或其组合。
51.陈述31至50中任一项所述的方法，其还包括BTN3A1的抗体染色、一种或更多种BTN3A1调节子的抗体染色、细胞流式细胞术、细胞计数、细胞生存力、RNA检测、RNA定量、RNA测序、蛋白质检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA测序、细胞因子检测、干扰素检测或其组合。
52.陈述31至51中任一项所述的方法，其还包括定量所述测试测定混合物中的T细胞应答。
53.方法，其包括检测来自哺乳动物对象的核酸样品中BTN3A1基因内或者一种或更多种BTN3A1调节子基因内的突变；以及向所述对象施用治疗剂。
54.陈述53所述的方法，其中所述治疗剂是抗癌剂、抗细菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂或其组合。
55.组合物，其包含通过陈述31至52中任一项所述的方法鉴定的测试剂，所述测试剂可调节BTN3A1的表达或活性。
56.组合物，其包含通过陈述31至55中任一项所述的方法鉴定的测试剂，所述测试剂可调节一种或更多种BTN3A1调节子的表达或活性。
57.陈述56所述的组合物，其中一种或更多种所述BTN3A1调节子是以下负BTN3A1调节子中的一种或更多种：
CTBP1，UBE2E1，RING1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8，或AHCYL1。
58.陈述56或57所述的组合物，其中一种或更多种所述BTN3A1调节子是以下正BTN3A1调节子中的一种或更多种：
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，或KIAA0391。
59.陈述55至58中任一项所述的组合物，其包含小分子、肽、蛋白质、抗体、表达盒、表达载体、抑制性核酸、指导RNA、核酸酶、或其组合。
60.组合物，其包含一种或更多种BTN3A1蛋白调节子。
61.组合物，其包含特异性结合BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1调节子蛋白的抗体。
62.组合物，其包含含有核酸区段的表达盒或表达载体，所述核酸区段包含一种或更多种BTN3A1调节子的一个或更多个编码区。
63.陈述55至62中任一项所述的组合物，其还包含AMPK抑制剂或AMPK激活剂。
64.陈述55至63中任一项所述的组合物，其中一种或更多种所述BTN3A1调节子是以下负BTN3A1调节子中的一种或更多种：
CTBP1，UBE2E1，RENG1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8，或AHCYL1。
65.陈述55至64中任一项所述的组合物，其中一种或更多种所述BTN3A1调节子是以下正BTN3A1调节子中的一种或更多种：
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDSSB，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，或KIAA0391。
66.陈述55至65中任一项所述的组合物，其还包含一种或更多种化学治疗剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗微生物剂、防腐剂或其组合。
67.陈述55至66中任一项所述的组合物，其还包含一种或更多种烷化剂(例如，氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、乙烯亚胺、三氮烯)；抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物)；抗生素(例如，蒽环类、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素、普卡霉素)；酶(例如，L-天冬酰胺酶)；法呢基蛋白转移酶抑制剂、激素剂(例如，糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素、促黄体激素释放激素拮抗剂、乙酸奥曲肽)；微管破坏剂(例如，海鞘素)；微管稳定剂(例如，紫杉醇多西他赛/>和埃博霉素A至F)；长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基蛋白转移酶抑制剂；羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲基三聚氰胺、铂配位络合物(例如，顺铂、卡铂)。
68.陈述55至67中任一项所述的组合物，其与放射治疗结合使用。
69.陈述55至68中任一项所述的组合物，其以治疗有效量配制。
70.方法，其包括向对象施用陈述55至69中任一项所述的组合物。
71.陈述1至70中任一项所述的方法或组合物，其中所述对象是哺乳动物或鸟类。
72.陈述1至71中任一项所述的方法或组合物，其中所述对象是人、家养动物、农场动物、动物园动物、实验动物、宠物动物或其组合。
73.陈述1至72中任一项所述的方法或组合物，其中所述对象是一个或更多个小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、狗、猴或其组合。
74.陈述1至73中任一项所述的方法或组合物，其中所述对象是人。
75.陈述1至74中任一项所述的方法或组合物，其包括以直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子的活性的量向所述对象施用以下化合物中至少一种：鱼藤酮、杀青虫素A、二甲双胍、α-酮基-γ-(甲硫基)丁酸、6-巯基嘌呤一水合物、霉酚酸、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐或其组合。
76.组合物，其包含一种或更多种以足以抑制或激活至少一种BTN3A1蛋白调节子的量配制的化合物。
77.陈述76所述的组合物，其包含直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子之活性的量的以下化合物中至少一种：鱼藤酮、杀青虫素A、二甲双胍、α-酮基-γ-(甲硫基)丁酸、6-巯基嘌呤一水合物、霉酚酸、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐、AICAR、化合物991、A-769662、2，4-二硝基苯酚、小檗碱、卡格列净、二甲双胍、甲氨蝶呤、苯乙双胍、PT-1、槲皮素、R419、白藜芦醇、3(2-(2-(4-(三氟甲基)苯基氨基)噻唑-4-基)乙酸、C2、BPA-CoA、MK-8722、MT 63-78、O304、PF249、水杨酸盐、SC4、ZMP或其组合。
78.方法，其包括在至少一种淋巴样细胞或髓样细胞或其组合中对表1或2中所列任何基因进行离体修饰，以产生至少一种经修饰淋巴样细胞、至少一种经修饰髓样细胞、或经修饰淋巴样细胞与经修饰髓样细胞的混合物。
79.陈述78所述的方法，其中所述修饰是表1或2中所列任何基因的一个或更多个基因组位点处的一个或更多个的缺失、替换或插入。
80.陈述78或79所述的方法，其中所述修饰是用至少一种编码表1或2中所列基因的一个或更多个编码区的表达盒转化所述至少一种淋巴样细胞或髓样细胞或其组合。
81.陈述78、79或80所述的方法，其中所述修饰是表1或2中所列任何基因的一个或更多个CRISPR介导的修饰或激活。
82.陈述78至81中任一项所述的方法，其还包括向对象施用至少一种经修饰淋巴样细胞、至少一种经修饰髓样细胞、或经修饰淋巴样细胞与经修饰髓样细胞的混合物。
83.陈述78至82中任一项所述的方法，其还包括孵育所述至少一种经修饰淋巴样细胞、至少一种经修饰髓样细胞、或经修饰淋巴样细胞与经修饰髓样细胞的混合物，以形成经修饰细胞群。
84.陈述83所述的方法，其还包括向对象施用所述经修饰细胞群。
85.陈述82或84中任一项所述的方法，其中所述对象患有疾病或病症。
86.陈述85所述的方法，其中所述疾病或病症是免疫病症或癌症。
本文中描述的具体方法和组合物代表一些优选实施方案，并且是示例性的并且并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书之后将想到其他目的、方面和实施方案，并且所述其他目的、方面和实施方案均涵盖在由权利要求书的范围所限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可对本文中公开的本发明进行多种替换和修改。
本文中举例说明性地描述的本发明可在不存在本文中未将其具体公开为必要要素的任何一个或更多个要素或一个或更多个限制的情况下适当地实践。本文中举例说明性地描述的方法和过程可以以不同的步骤顺序来实践，并且方法和过程不一定限于本文或权利要求书中指出的步骤顺序。
除非上下文另有明确规定，否则如本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。因此，例如，提及“核酸”或“蛋白质”或“细胞”时，包括多个这样的核酸、蛋白质或细胞的复数(例如，核酸或表达盒的溶液或干燥制剂、蛋白质溶液或细胞群)等。在本文件中，除非另有说明，否则术语“或/或者”用于是指非排他性的或/或者，使得“A或B”包括“A但没有B”、“B但没有A”以及“A和B”。
在任何情况下，均不能将本专利解释为限于本文中具体公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下，均不能将本专利解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员所作的任何陈述的限制，除非这样的陈述在申请人的回应性书面文件中明确地且无条件或保留地明确采纳。
已经使用的术语和表述用作描述性而非限制性术语，并且无意使用这样的术语和表述来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但认识到在所要求保护的本发明的范围内可进行多种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选特征具体公开，但由本领域技术人员可以对本文中公开的概念进行修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是本发明所附权利要求和陈述所限定的本发明的范围内。
本发明已经本文中被广泛和一般地描述。落入一般性公开内容内的每个较窄的物质和亚类分组也形成本发明的一部分。这包括对其中附带条件或否定限制(从该属中去除任何主题)的本发明的一般性描述，而不论所去除的内容是否在本文中进行了具体叙述。另外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明由此也以马库什组的任何单独成员或成员的子组来描述。

Claims (36)

1.方法，其包括向对象施用T细胞治疗、BTN3A抑制剂或BTN3A负调节子，所述对象的细胞样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
2.权利要求1所述的方法，其中所述T细胞治疗包含γ-δ(γδ)T细胞、Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、α-βCD4 T细胞、α-βCD8 T细胞、或其一种或更多种组合。
3.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述BTN3A负调节子在表1中列出。
4.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述负BTN3A1调节子是
CTBP1，UBE2E1，RING1，ZNF217，HDAC8，RUNX1，RBM38，CBFB，RER1，IKZF1，KCTD5，ST6GAL1，ZNF296，NFKBIA，ATIC，TIAL1，CMAS，CSRNP1，GADD45A，EDEM3，AGO2，RNASEH2A，SRD5A3，ZNF281，MAP2K3，SUPT7L，SLC19A1，CCNL1，AUP1，ZRSR2，CDK13，RASA2，ERF，EIF4ENIF1，PRMT7，MOCS3，HSCB，EDC4，CD79A，SLC16A1，RBM10，GALE，MEF2B，FAM96B，ATXN7，COG8，DERL1，TGFBR2，CHTF8，AHCYL1或其组合。
5.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述负BTN3A1调节子作为表达盒或表达载体施用，所述表达盒或表达载体包含与编码一种或更多种所述负BTN3A1调节子的核酸区段可操作连接的启动子。
6.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述BTN3A正调节子在表2中列出。
7.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述BTN3A正调节子是
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，IRF8，IRF9，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK或KIAA0391。
8.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述BTN3A正调节子是以下OXPHOS基因中的一种或更多种：ATP5A1，ATP5B，ATP5C1，ATP5D，ATP5E，ATP5F1，ATP5G1，ATP5G2，ATP5G3，ATP5H，ATP5I，ATP5J，ATP5J2，ATP5L，ATP5O，ATP5S，COX4I1，COX4I2，COX5A，COX5B，COX6A1，COX6A2，COX6B1，COX6B2，COX6C，COX7A1，COX7A2，COX7B，COX7B2，COX7C，COX8A，COX8C，CYC1，NDUFA1，NDUFA10，NDUFA11，NDUFA12，NDUFA13，NDUFA2，NDUFA3，NDUFA4，NDUFA5，NDUFA6，NDUFA7，NDUFA8，NDUFA9，NDUFAB1，NDUFB1，NDUFB10，NDUFB11，NDUFB2，NDUFB3，NDUFB4，NDUFB5，NDUFB6，NDUFB7，NDUFB8，NDUFB9，NDUFC1，NDUFC2，NDUFS1，NDUFS2，NDUFS3，NDUFS4，NDUFS5，NDUFS6，NDUFS7，NDUFS8，NDUFV1，NDUFV2，NDUFV3，SDHA，SDHB，SDHC，SDHD，UQCR10，UQCR11，UQCRC1，UQCRC2，UQCRFS1，UQCRH，UQCRQ或其组合。
9.权利要求1所述的方法，其中一种或更多种所述BTN3A抑制剂是一种或更多种抗体类型、抑制性核酸、指导RNA、cas核酸酶、表达盒、表达载体、小分子、或其组合。
10.权利要求1所述的方法，其还包括施用一种或更多种化合物，所述化合物调节至少一种BTN3A正调节子或至少一种BTN3A负调节子。
11.权利要求1所述的方法，其包括以直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子的活性的量向所述对象施用以下化合物中的至少一种：鱼藤酮、杀青虫素A、二甲双胍、α-酮基-γ-(甲硫基)丁酸、6-巯基嘌呤一水合物、霉酚酸、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐、AICAR、化合物991、A-769662、2，4-二硝基苯酚、小檗碱、卡格列净、二甲双胍、甲氨蝶呤、苯乙双胍、PT-1、槲皮素、R419、白藜芦醇、3(2-(2-(4-(三氟甲基)苯基氨基)噻唑-4-基)乙酸、C2、BPA-CoA、MK-8722、MT 63-78、O304、PF249、水杨酸盐、SC4、ZMP、或其组合。
12.权利要求1所述的方法，其还包括施用一种或更多种化学治疗剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗微生物剂、防腐剂、或其组合。
13.方法，其包括使一种或更多种表达BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1调节子的细胞与测试剂接触以提供测试测定混合物，以及：
○检测所述测试测定混合物中一种或更多种细胞的表面上BTN3A1蛋白的量和/或对其进行定量；
○对所述测试测定混合物中的细胞增殖进行定量；
○对细胞群中表达BTN3A1蛋白的细胞的数目进行定量；或
○其组合。
14.权利要求13所述的方法，其中所述细胞表达以下正BTN3A调节子中的一种或更多种：
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，IRF8，IR9，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，KIAA0391或其组合。
15.权利要求13所述的方法，其中所述测试测定混合物还包含T细胞。
16.权利要求15所述的方法，其中所述T细胞是CD4 T细胞、CD8 T细胞、α-βCD4 T细胞、α-βCD8 T细胞、γ-δ(γδ)T细胞、Vgamma9Vdelta2(Vγ9Vδ2)T细胞、或其组合。
17.权利要求13所述的方法，其中一种或更多种所述细胞是癌细胞或包含癌细胞的细胞群。
18.权利要求17所述的方法，其中一种或更多种癌细胞包含转移性癌细胞、微转移性肿瘤细胞、大转移性肿瘤细胞、复发性癌细胞、或其组合。
19.权利要求17所述的方法，其中一种或更多种所述癌细胞包含白血病细胞、淋巴瘤细胞、霍奇金病细胞、软组织和骨的肉瘤、肺癌细胞、间皮瘤、食管癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肝胆癌细胞、小肠癌细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、直肠癌细胞、肾癌细胞、尿道癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、内分泌系统癌细胞、皮肤癌细胞、中枢神经系统癌细胞、皮肤和/或眼内来源的黑素瘤细胞、AIDS相关癌细胞、或其组合。
20.权利要求13所述的方法，其中所述测试剂是一种或更多种小分子、抗体、核酸、表达盒、表达载体、抑制性核酸、指导RNA、cas核酸酶、或其组合。
21.权利要求13所述的方法，其中所述测试剂是一种或更多种所述BTN3A1调节子、一种或更多种抗BTN3A1抗体、一种或更多种可调节BTN3A1表达的BTN3A1抑制性核酸、一种或更多种可结合BTN3A1核酸的指导RNA、一种或更多种可结合一种或更多种所述BTN3A1调节子的抗体、一种或更多种可调节一种或更多种所述BTN3A1调节子的表达的抑制性核酸、一种或更多种可结合编码一种或更多种所述BTN3A1调节子的核酸的指导RNA、一种或更多种可调节BTN3A1的小分子、一种或更多种可调节一种或更多种所述BTN3A1调节子的小分子、一种或更多种指导RNA、或其组合。
22.权利要求13所述的方法，其中在有效检测所述测定混合物中所述测试剂是否可调节BTN3A1的表达或活性、BTN3A1调节子的表达或活性、或者至少一种细胞的生长、生存力或活性的时间和条件下，将细胞与所述测试剂一起孵育。
23.权利要求13所述的方法，其还包括鉴定一种或更多种测试剂，所述测试剂
a.降低所述测试测定混合物中一种或更多种细胞的表面上BTN3A1蛋白的量；
b.降低所述细胞群中表达BTN3A1蛋白的细胞的数目；
c.降低所述测试测定混合物中的细胞增殖；或
d.其组合。
24.组合物，其包含通过权利要求13所述的方法鉴定的测试剂。
25.权利要求24所述的组合物，其中所述测试剂可调节BTN3A1的表达或活性。
26.权利要求24所述的组合物，其中所述测试剂可调节一种或更多种所述BTN3A1调节子的表达或活性。
27.权利要求24所述的组合物，其中一种或更多种所述BTN3A1调节子是一种或更多种正BTN3A1调节子。
28.权利要求27所述的组合物，其中一种或更多种所述正BTN3A1调节子是
ECSIT，FBXW7，SPIB，IRF1，IRF8，IR9，NLRC5，IRF8，NDUFA2，NDUFV1，NDUFA13，USP7，C17orf89，RFXAP，UBE2A，SRPK1，NDUFS7，PDS5B，CNOT11，NDUFB7，BTN3A2，FOXRED1，NDUFS8，JMJD6，NDUFS2，NDUFC2，HSF1，ACAD9，NDUFAF5，TIMMDC1，HSD17B10，BRD2，NDUFA6，CNOT4，SPI1，MDH2，DARS2，TMEM261，STIP1，FIBP，FXR1，NFU1，GGNBP2，STAT2，TRUB2，BIRC6，MARS2，NDUFA9，USP19，UBA6，MTG1，AMPK，KIAA0391或其组合。
29.权利要求24所述的组合物，其包含一种或更多种BTN3A1蛋白调节子、小分子、肽、蛋白质、抗体、表达盒、表达载体、抑制性核酸、指导RNA、核酸酶、或其组合。
30.权利要求24所述的组合物，其还包含一种或更多种化学治疗剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗微生物剂、防腐剂、或其组合。
31.方法，其包括向对象施用22所述的组合物，所述对象的细胞样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
32.组合物，其包含直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子之活性的量的以下化合物中至少一种：鱼藤酮、杀青虫素A、二甲双胍、α-酮基-γ-(甲硫基)丁酸、6-巯基嘌呤一水合物、霉酚酸、唑来膦酸盐、利塞膦酸盐、阿仑膦酸盐、或其组合。
33.方法，其包括向对象施用权利要求30所述的组合物，所述对象的细胞样品表现出：
a.BTN3A表达提高；
b.BTN3A正调节子表达提高；
c.BTN3A负调节子表达降低；或
d.其组合。
34.权利要求33所述的方法，其中所述对象患有癌症或者免疫系统疾病或病症。
35.权利要求33所述的方法，其中所述组合物以直接或间接调节BTN3A1或者一种或更多种BTN3A1蛋白调节子的活性的量施用。
36.方法，其包括向癌症患者施用Vγ9Vδ2 T细胞，其中与一个或更多个参考值相比，所述癌症患者的癌细胞表达提高水平的以下中一种或更多种：BTN3A1、NLRC5、IRF1、IRF8、IRF9、SPI1、SPIB、ZNF217、RUNX1、AMPK、FDPS、或其组合。
CN202280020423.2A 2021-02-08 2022-02-04 嗜乳脂蛋白亚家族3成员a1（btn3a1，cd277）的调节 Pending CN117295505A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163147050P 2021-02-08 2021-02-08
US63/147,050 2021-02-08
PCT/US2022/070520 WO2022170344A1 (en) 2021-02-08 2022-02-04 Regulation of butvrophilin subfamily 3 member a1 (btn3a1, cd277)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117295505A true CN117295505A (zh) 2023-12-26

Family

ID=82741691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280020423.2A Pending CN117295505A (zh) 2021-02-08 2022-02-04 嗜乳脂蛋白亚家族3成员a1（btn3a1，cd277）的调节

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240115705A1 (zh)
EP (1) EP4288074A1 (zh)
JP (1) JP2024507735A (zh)
CN (1) CN117295505A (zh)
WO (1) WO2022170344A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080769A1 (en) * 2010-12-15 2012-06-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-cd277 antibodies and uses thereof
MX2017006408A (es) * 2014-11-17 2018-03-23 Adicet Bio Inc Linfocitos t gamma delta modificados geneticamente.
AU2018268087B2 (en) * 2017-05-18 2022-03-17 Umc Utrecht Holding B.V. Compositions and methods for cell targeting therapies
CA3064442A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of tumor cytotoxicity via human gamma-delta t-cells

Also Published As

Publication number Publication date
US20240115705A1 (en) 2024-04-11
EP4288074A1 (en) 2023-12-13
JP2024507735A (ja) 2024-02-21
WO2022170344A1 (en) 2022-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Prinzing et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity
Singh et al. Impaired death receptor signaling in leukemia causes antigen-independent resistance by inducing CAR T-cell dysfunction
Tzoneva et al. Clonal evolution mechanisms in NT5C2 mutant-relapsed acute lymphoblastic leukaemia
Ataide et al. BATF3 programs CD8+ T cell memory
US20230375555A1 (en) Markers selectively deregulated in tumor-infiltrating regulatory t cells
Michaels et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells
Lai et al. Regulation of B-cell development and tolerance by different members of the miR-17∼ 92 family microRNAs
Olive et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92
US20200384022A1 (en) Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in h3k27m gliomas
Jung et al. BLIMP1 and NR4A3 transcription factors reciprocally regulate antitumor CAR T cell stemness and exhaustion
Soares et al. CRISPR screen identifies genes that sensitize AML cells to double-negative T-cell therapy
CN115397460A (zh) 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
US20160194718A1 (en) Compositions and Methods for Identification, Assessment, Prevention, and Treatment of Cancer Using Histone H3K27ME3 Biomarkers and Modulators
EP3890777A1 (en) Methods of activating dysfunctional immune cells and treatment of cancer
JP2020526206A (ja) がん治療のための染色体不安定性および下流サイトゾルｄｎａシグナル伝達をターゲティングする方法
CN114929860A (zh) 用于调节细胞老化的方法和组合物
WO2020186101A1 (en) Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
Hajaj et al. Alternative splicing of the inhibitory immune checkpoint receptor SLAMF6 generates a dominant positive form, boosting T-cell effector functions
Chen et al. CDK2 inhibition enhances antitumor immunity by increasing IFN response to endogenous retroviruses
US20210347847A1 (en) Therapeutic targeting of malignant cells using tumor markers
Piras et al. circCsnk1g3-and circAnkib1-regulated interferon responses in sarcoma promote tumorigenesis by shaping the immune microenvironment
Venturutti et al. An aged/autoimmune B-cell program defines the early transformation of extranodal lymphomas
An et al. The loss of epithelial Smad4 drives immune evasion via CXCL1 while displaying vulnerability to combinatorial immunotherapy in gastric cancer
US20220033464A1 (en) Methods and compositons for modulations of immune response
Romero et al. Primary mediastinal large B-cell lymphoma: Transcriptional regulation by miR-92a through FOXP1 targeting

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination