NL192275C - Eiwit van het AIDS-virus. - Google Patents

Description

1 192275

Eiwit van het AIDS-virus

De uitvinding heeft betrekking op een eiwit dat wordt aangeduid als gag/env, dat ten minste een antigene H determinant van het kemeiwit (gag) en tegelijkertijd ten minste een antigene determinant van het I 5 omhullingseiwit (env) omvat van het HTLV-lll-virus, de veroorzaker van het verworven afweergebrek H (acquired immune deficiency syndrome, AIDS). Dit eiwit wordt bereid door middel van organisch- I synthetische werkwijzen of door gebruikmaking van recombinant-DNA-technieken waarbij de vereiste I gensequenties door middel van een geschikte DNA-vector in een daarmee verenigbaar eencellig gastheer- organisme worden ingelast.

H 10 De uitvinding heeft verder betrekking op het isoleren en zuiveren van het gag/env-eiwit en op werkwijzen voor het opsporen van AIDS-antilichamen of -virussen in menselijk serum of andere biologische vloeistoffen en voor de immunoprofylactische bescherming van mensen tegen AIDS, op basis van het gebruik van het eiwit.

In 1985 werd bij bijna 8.000 mensen AIDS vastgesteld en sindsdien is het aantal gestaag toegenomen.

I 15 Verwacht wordt dat in 1986 nog eens 15.000 gevallen worden gediagnostiseerd en dit aantal zou in 1987 I wel eens opnieuw kunne verdubbelen [New York Times Magazine, 2 maart 1986, blz. 42]. AIDS is gekenmerkt door het optreden van zware opportunistische infecties na een effect op het afweersysteem van I het lichaam [Gottlieb e.a., New. Eng. J. Med. 305, 1425 (1981)]. De aandoening is gevonden bij homosexuele mannen, patiënten die bloedproducten krijgen toegediend, spuitverslaafden en personen I 20 afkomstig van Haiti en Midden-Afrika [Piot e.a., Lancet ;M, 65 (1984)].

I Vermoed werd dat de veroorzaker van virale oorsprong was omdat het epidemiologische patroon van I AIDS overeenstemde met dat van een overdraagbare ziekte. Ten minste drie retrovirussen zijn geïsoleerd I uit gekweekte T-cellen van verscheidene AIDS-patiënten of uit witte bloedlichaampjes van mensen met kans I op de ziekte. Er werd een nieuw menselijk retrovirus dat met iymfadenopathie geassocieerd virus (LAV) 25 werd genoemd ontdekt en de eigenschappen daarvan stemden overeen met een ziekte veroorzakende rol I bij AIDS. Het virus werd geïsoleerd uit een patiënt met Iymfadenopathie en vandaar de naam [Montagnier I e.a. in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C. Gallo e.a. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, blz.

363-370 (1984)].

Ook zijn andere menselijke retrovirussen geïsoleerd, in het bijzonder twee deelgroepen van het menselijk 30 T-cel leukemie/lymfoom/lymfotropisch virus, typen I [Poiesz e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7415 I (1980)] en III [Popovic e.a., Science 224, 497 (1984)]. Nog een ander virus, het met AIDS-geassocieerde I retrovirus (ARV) genaamd, is als veroorzaker voorgesteld [Levy e.a., Science 225, 840 (1984)]. Zowel het I HTLV-lli als het ARV retrovirus vertonen soortgelijken biologische en seroepidemiologische eigenschappen I als LAV [Levy e.a., zie boven, Popovic e.a., zie boven]. Er zijn dus ten minste drie retrovirussen gepostu- I 35 leerd als veroorzaker van AIDS: LAV, ARV en HTLV-III. Voor deze aanvrage worden deze virussen I tezamen aangeduid als de AIDS-virussen. Aangezien HTLV-III het prototypische viius voor deze groep is dienen onder de term ’’antigene determinant overeenkomend met de sequenties van een eiwit van een HTLV-lll-virus” feitelijk te worden verstaan de sequenties van de eiwitten van elk van de AIDS-virussen.

Een oorzaak van de moeilijkheid de werkelijke veroorzaker van AIDS te bepalen was de reactiviteit van I 40 verschillende retrovirale antigenen met serummonsters van AIDS-patiënten. Zo bleken serummonsters van AIDS-patiënten te reageren met antigenen van zowel HTLV-I [Essex e.a., Science 220, 859 (1983)] als HTLV-III [Samgadharan e.a., Science 224, 506 (1984)]. Omhullings-genproducten van HTLV vertoonden I antigeniteiten die kruiselings reactief waren met antilichamen in serums van volwassen T-cel-leukemie- I patiënten [Kiyokawa e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6202 (1984)]. T-cel leukemie bij volwassenen I 45 (ATL) verschilt van AIDS doordat HTLV-I kwaadaardigheid van T-cellen veroorzaakt, gekenmeikt door een I ongeremde groei van T-cellen. Bij AIDS vindt er in plaats van celgroei celafsterving plaats. Dit cytopatische I kenmerk van HTLV-III was essentieel voor het uiteindelijk kunnen bepalen van de specifieke retrovirale I oorsprong van de ziekte.

I De vetooizaker van AIDS werd geïsoleerd door gebruikmaking van geïmmortaliseerde menselijke 50 neoplatische T-cellijnen (HT) geïnfecteerd met het voor AIDS kenmerkende cytopatische retrovirus dat uit I aan AIDS lijdende patiënten werd geïsoleerd. Seroepidemiologisch onderzoek met dit virus toonde een I volledige correlatie aan tussen AIDS en de aanwezigheid van antilichamen tegen virale antigenen van I HTLV-III [Montagnier e.a., zie boven; Samgadharan e.a., zie boven; Schüpbach e.a., Science 224, 503 I (1984)]. Bovendien werd gevonden dat bijna 85% van de patiënten met lymfadenopathiesyndroom en een I 55 belangrijk deel van de asymptomatische homosexuele mannen in gebieden met endemisch AIDS drcule- I rende antilichamen tegen HTLV-III droegen. Deze gegevens bij elkaar wijzen op HTLV-III als de belangrijk- I ste veroorzaker van AIDS.

1192275 2

Totdat het AIDS-vims met gebruikmaking van de H-9 cellijn met succes werd gekweekt, was het env-AIDS-eiwit van het AIDS-virus niet geïsoleerd, gekarakteriseerd of gesynthetiseerd. Dit was grotendeels een gevolg van het feit dat het virus cytopatisch is en isolering van het viius niet mogelijk was [Popovic e.a., zie boven]. Toen eenmaal een menselijke T-cellijn was ontdekt die tegen de cytopatische effecten van het 5 virus bestand was, kon het moleculair klonen van proviraal DNA van AIDS worden uitgevoerd.

De behoefte aan gevoelige en snelle methoden voor de diagnose van AIDS is menselijk bloed en andere biologische vloeistoffen en vooreen methode voor het voorkomen van de ziekte door vaccinatie is zeer groot. Vrijwel alle thans beschikbare bepalingen en proeven zijn behept met fouten. Het Center for Disease Control (CDC) heeft te kennen gegeven dat de thans beschikbare tests uitsluitend dienen te worden 10 gebruikt voor het testen van eenheden bloed op de aanwezigheid van antilichamen tegen HTLV-III. Het CDC is zelfs nog verder gegaan door te verklaren dat de thans beschikbare tests voor enzymgebonden immunosorptiebepaling (ELISA) niet dienen te worden gebruikt voor algemeen onderzoek van populaties met hoog risico of als diagnostische test voor AIDS [Federal Register 50 (48), 9909,12 maart 1985].

De fouten in voorheen gebruikte AIDS-tests zijn teruggevoerd op het niet gebruiken van een specifiek 15 antigeen eiwit van de veroorzaker van AIDS. De vroeger gebruikte eiwitten waren afkomstig van een viraal lysaat. Aangezien het lysaat bereid is uit met het virus geïnfecteerde menselijke cellen, d.w.z. met cellen waarin het virus is gekweekt, zal het lysaat zowel menselijke als virale eiwitten bevatten. Bereiding van een zuiver antigeen van viraal eiwit is zeer moeilijk. De tot nu toe gebruikte antigenen produceren daarom zowel ten onrechte positieve als ten onrechte negatieve resultaten [Budiansky, Nature 312, 583 (1984)]. De fouten 20 als gevolg van het gebruik van dergelijke lysaateiwitten/peptiden zouden kunnen worden vermeden door gebruikmaking van een samenstelling voor het binden van AIDS-antilichamen die zo goed als geen niet voor AIDS specifieke eiwitten bevat. Samenstellingen van vrijwel zuiver omhullings- en kemeiwit van AIDS kunnen als antigenen worden gebruikt.

Zowel de omhullings- als de kemeiwitten van HTLV-III hebben antigene determinanten behouden 25 waarmee het mogelijk zou moeten zijn onderzoek te doen naar de aanwezigheid van AIDS-virussen, deze vast te stellen en/of er door vaccinatie bescherming tegen te bieden. Eik individu dat aan HTLV-III is blootgesteld en derhalve het gevaar loopt AIDS op te doen of de ziekte heeft, kan worden herkend aan de hand van de aanwezigheid in het bloed van antilichamen voor het virale kemeiwit (gag) en/of het omhullingseiwit (env), [Samgadharan e.a., Science 224, 506 (1984)].

30 De beschikbaarheid van een betrouwbare en gevoelige test op de aanwezigheid in het bloed of in andere biologische vloeistoffen, van het AIDS-virus zelf of van deeltjes daarvan is ook van belang. Groopman e.a. [Blood 66, 742 (1985)] hebben gemeld dat antilichamen tegen AIDS-virussen niet altijd in het bloed van AIDS-slachtoffers aanwezig zijn. Zij hebben een patiënt met AIDS en een andere met verwante aandoenin- — — gen (ARC) onderzocht en van hen bloedmonsters genomen die negatief op antilichamen waren maar____ 35 waaruit wel HTLV-III kon worden gekweekt.

De recombinant DNA-technologie wordt sinds kort op het AIDS-probleem toegepast. Van de moleculaire kloning en expressie van het env-gen van HTLV-III is melding gemaakt [Crowl e.a., Cell 979 (1985);

Chang e.a., Biotechnology 3, 905 (1985)]. Dowbenko e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7748 (1985)] hebben het kemeiwit van HTLV-III in E. coli tot expressie gebracht.

40 In Biotechnology, vol. 4, nr. 2 van februari 1986 wordt op pagina’s 128-132 de bacteriële expressie van een deel van het veronderstelde GP41 env en de serologische karakterisatie ervan beschreven. In dit artikel wordt geen suggestie gedaan omtrent een fusie-eiwit van GP41 en manteleiwit met een kemeiwit. Er wordt zelfs gesuggereerd dat in gevallen waarbij sera wel met P24 (kemeiwit) reactie vertoonde maar niet met GP41 (manteleiwit) te wijten waren aan een foute positieve reactie van P24 met een ARC complex, een 45 cytamegalovitus of een Epstein Barr virus. In dit artikel wordt aangevoerd dat dergelijke fout-positieve detectie met GP41 niet voorkomen en wordt niet ingezien dat een combinatie van P24 met GP41 wellicht zou leiden tot betere detectie van besmetting met AIDS-vims.

Als gevolg van het gebruik van dergelijke genetische technieken zijn gezuiverde virale antigenen beschikbaar gekomen die veilig, betrouwbaar en goedkoper te bereiden zijn. Gunstiger nog zou echter de 50 beschikbaarheid van een viraal eiwit zijn met antigene determinanten die zowel op het env- als op het gag-eiwit aanwezig zijn. Een dergelijk eiwit zal een bijzonder krachtig instrument zijn voor het opsporen van AIDS-antilichamen en zou kunnen dienen als basis voor een reeks gevoelige diagnostische tests en voor een mogelijk vaccin tegen het AIDS-vims.

Daarom is er een nieuw eiwit, aangeduid als gag/env, met een met ten minste een antigene determinant 55 van een HTLV-lll-gag-eiwit en tevens met een met ten minste een antigene determinant van een HTLV-III-env-eiwit overeenkomende aminozuursequentie verschaft, waarbij onderzoek (’’screening”) kan worden 13 192275 vaccinatiebescherming tegen het virus kan worden geboden. Het nieuwe gag/env-eiwit kan worden weergegeven door het geheel of een gedeelte van de in figuur 2 afgebeelde aminozuursequentie of een functioneel equivalent daarvan. Een functioneel equivalent kan een enigszins gewijzigde aminozuursequentie (substitutie) bevatten. Als enig voorbehoud geldt dat een aldus gewijzigd eiwit en de daarin 5 aanwezige antigene determinanten nog door antilichamen worden herkend. Dit kan eenvoudig experimenteel worden vastgesteld. Voor zowel een functioneel equivalent als voor een gedeelte van de in figuur 2 afgebeelde sequentie geldt dat het eiwit ten minste het aantal aminozuren omvat dat vereist is om een env-en een gagdeterminant voor te stellen.

De uitvinding verschaft verder de vereiste DNA-sequenties die voor het gag/env-polypeptide volgens de 10 uitvinding coderen, recombinant-vectoren die dergelijke DNA-sequenties bevatten en eencellige organismen die bruikbaar zijn voor de bereiding door middel van recombinant DNA-technologie van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding alsmede werkwijzen voor de bereiding van dergelijke DNA-sequenties, recombinant-vectoren en eencellige organismen. Daarnaast worden methoden beschreven voor de expressie en isolatie van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding. Het aldus bereide gag/env-eiwit kan volgens werkwijzen van de 15 uitvinding worden gebruikt voor een aantal belangrijke immunologische processen.

Als diagnostisch reagens kan het gag/env-eiwit worden gebruikt voor het opsporen van de aanwezigheid van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen zoals tranen, zaad, vaginale afscheiding en speeksel. Omdat het eiwit in homogene vorm kan worden bereid, worden problemen met niet-specifieke reacties die in het verleden het gebruik van diagnostische middelen op basis 20 van betrekkelijk ruwe eiwitfracties van HTLV-lll-virussen teisterden, vermeden.

Als immunogen kan het gag/env-eiwit worden gebruikt voor het produceren van antilichamen in dieren tegen daarin aanwezige antigene determinanten. Dergelijke antilichamen kunnen op hun beurt, in samenhang met het gag/env-eiwit dat op geschikte wijze is gemerkt, worden gebruikt in een radioimmunoassay (RIA) of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het opsporen van de aanwezigheid van 25 HTLV-lll-virussen of deeltjes daarvan in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen zoals tranen, zaad, vaginale afscheiding en speeksel. Deeltjes (of brokstukken) die aldus kunnen worden aangetoond zijn uiteraard ondermeer stukken van de virale kem- of omhullingseiwitten.

Het gag/env-eiwit volgens de uitvinding kan, door opneming in een geschikte vaccinsamenstelling, verder worden gebruikt ter bestrijding van de verspreiding van AIDS door middel van preventieve immunisatie.

30 Belangrijke voordelen zijn verbonden aan het gebruik van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding vergeleken met het gebruik van de gag/env-eiwitten afzonderlijk. Het env-eiwit zelf is zeer slecht oplosbaar waardoor zuivering moeilijk is. Combinatie van de twee eiwitten leidt tot een product dat gemakkelijker op te lossen is en derhalve eenvoudiger kan worden gezuiverd. Productie en zuivering op grote schaal worden uiteraard ook vereenvoudigd omdat slechts een enkele verbinding behoeft te worden geïsoleerd. Tenslotte 35 opent het gag/env-eiwit de mogelijkheid een diagnostisch pakket (kit) te ontwikkelen dat in een antigen-sandwich bepaling beter functioneert dan afzonderlijke gag- en env-eiwitten.

Opgemerkt dient te worden dat, hoewel het gag/env-eiwit werd verkregen uit HTLV-III, de hier beschreven diagnostische en immunoprofylactische methoden toepasbaar zijn op de opsporing van elk ander viraal agens dat zich bij AIDS voordoet of daarmee in verband is gebracht zoals het met lymfadenopathie 40 geassocieerde virus (LAV) en het met AIDS geassocieerde retrovirus (ARV). De grond hiervoor is dat Crowl e.a. [Cell 41, 979 (1985)] hebben aangetoond dat eiwitten van deze virale agentia immunologisch verwant zijn met die van HTLV-III en daarmee aminozuursequentiesegmenten gemeen hebben.

De uitvinding kan worden toegelicht op basis van de volgende uitvoerige beschrijving in samenhang met de 45 figuren.

Figuur 1 is een schematische weergave van expressieplasmiden die de synthese van gag-(boven) en gag/env-(onder)eiwitten richt. De restrictie-endonuclease-plaatsen die de gag- en env-genen karakteriseren zijn aangegeven en het gearceerde gedeelte duidt het env-segment aan van het gag/env-fusiegen. In beide plasmiden wordt de transcriptie geregeld door de λ PL promotor en zijn de translatie-startsignalen afkomstig 50 van het plasmide pEV-vrf2.

Figuur 2 geeft de nucleïnezuursequentie van het gag/env-fusiegen weer (waarbij bepaalde positie-nummers en restrictie-endonuclease-plaatsen zijn aangegeven), alsmede de aminozuursequentie van het gag/env-eiwit zoals daaruit voorspeld.

Figuur 3 geeft de resultaten weer van SDS-polyacryfamide-gel-electroforese van het in E. coli geprodu-55 ceerde gag/env-eiwit. Paneel 1 toont Coomassie-blauw gekleurde totale-celeiwitten uit cellen die het recombinantplasmide met daarin het gag/env-fusiegen herbergen en van controlecellen. Panelen 2 en 3 zijn Western blots van totale-celeiwit gesondeerd met konijn-antilichamen tegen env-peptide 500-511 (paneel 2) 192275 4 of schaap-antilichamen tegen gag p24 (paneel 3). De immuun-complexen op panelen 2 en 3 werden zichtbaar gemaakt met een tweede met mierikperoxidase gemerkt antilichaam. Bij alle drie panelen duidt g/e op het gag/env-eiwit en c op een negatief controlemonster dat werd gebruikt voor het aantonen van de specificiteit. De door moleculegewichtstandaarden (in kD) afgelegde afstand is weergegeven en de positie 5 van de band van het gag/env-eiwit op de genen is met de pijlen aangeduid.

De werkwijzen volgens de uitvinding houden een aantal stappen in en wel, in logische volgorde: (1) identificatie en isolering van de genen die de gag- en env-eiwitten of fragmenten daarvan coderen, (2) inlassing van deze genen of genfragmenten in een geschikte klonende drager ter bereiding van een recombinant-vector die een gag/env-fusiegen bevat, (3) overdracht van de recombinante klonende drager 10 naar een verenigbaar eencellig gastheerorganisme, (4) selectie en kweèk van aangepaste gastheren die de ingelaste gensequenties kunnen repliceren en tot expressie kunnen brengen, (5) identificatie en zuivering van het genproduct, (6) toepassing van het genproduct voor het opspoien van antilichamen tegen HTLV-III of verwante virussen of als immunogeen voor de bereiding van antilichamen die op hun beurt weer kunnen worden gebruikt voor het opsporen van de virussen zelf of van fragmenten daarvan in menselijke serum of 15 in andere biologische vloeistoffen, (7) toepassing van het gag/env-eiwit in een vaccinpreparaat voor — eventuele immunoprofylactische bescherming tegen AIDS.

Geïsoleerde HTLV-III virionen zouden kunnen worden gebruikt als bron zowel voor de gag- als voor de env-genen volgens de uitvinding. Dowbenko e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7748 (1985)] hebben bijvoorbeeld een fragment van 2,2 kilobase (kb) van het 5'-gebied van het virale genoom gebruikt als bron 20 van het gag-gen. In plaats daarvan kan genomisch DNA uit cellen waarin het provirale genoom van HTLV-III is opgenomen, de genbron zijn [Shaw e.a., Science 226,1165 (1984)]. Crowl e.a. [Cell £[, 979 (1985)] hebben dergelijk genomisch DNA uit met HTLV-III geïnfecteerde H9-cellen gebruikt voor het verkrijgen van het env-gen.

Alternatieven voor het isoleren van de gag- en env-genen zijn onder meer de chemische synthese van 25 de gensequenties en de bereiding van DNA dat complementair is aan het uit de genen gevormde boodschapper-RNA.

Ongeacht de herkomst kan DNA dat de gag- en env-eiwitten codeert in bacteriën worden gekloond en kunnen de gag- of env-genen bevattende klonen kenbaar worden gemaakt met in de techniek bekende methoden. Bijvoorbeeld kunnen complementaire DNA (cDNA)-sondes uit de genen worden bereid en 30 worden gebruikt voor het opsporen van de klonen die de genen dragen door middel van hybridisatie-technieken.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding werd een genomenbibliotheek die door Xbal afbraak van het DNA van de hierboven beschreven met HTLV-III geïnfecteerde H9-cellen is opgebouwd, met behulp van een faag λ-vector gekloond en werden de klonen die het HTLV-III provirale genoom droegen geïdentifi-35 ceerd door hybridisatie met HTLV-III cDNA. Een van die klonen werd aangeduid als λ HXB-3 en er werd een fragment van 1700 base-paren dat het grootste deel van het gag-precursor-eiwit codeert geïsoleerd door Clal/Hincll afbraak van het DNA uit deze kloon.

De in de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding gebruikte directe bron van env-gensequenties was een derivaat van plasmide pEV3/env 44-640 dat env-codonen had overeenkomende met de verwijderde 40 residuen 514-524. Verrassenderwijs is het gevolg van deze verwijdering een belangrijke toename van de expressie van het env-gen. Env-sequenties die de codonen 467-640 bevatten werden verkregen door middel van splitsing met Bglll/Hindlll van plasmide pEV3/env 44-640.

Eenmaal geïdentificeerd en geïsoleerd, worden de gag- en env-genen van HTLV-III ingevoegd in een geschikte expressiedrager die de voor transcriptie en translatie van de ingevoegde gensequenties 45 benodigde elementen bevat. Bruikbare klonende dragers kunnen bestaan uit segmenten van chromosomale, niet-chromosomale en synthetische DNA-sequenties zoals verschillende bekende bacteriële piasmi den, faag-DNA, combinaties van plasmiden en faag-DNA’s zoals plasmiden die voor het gebruik van faag-DNA of andere expressie regulerende sequenties zijn aangepast, of gistplasmiden. Bijzonder klonende dragers die zouden kunnen worden gebruikt zijn, onder meer, de pEV-vrf-plasmiden (pEV-vrf-1, -2 en -3), SV40, 50 adenovirus, gist, lambda-gt-WES-lambda B, Charon 4A en 28, lambda-gt-1-lambda B, van M13 afgeleide vectoren zoals pUC8, 9, 18 en 19, pBR313, 322 en 325, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACY184, pUB110, pMB9, Co1E1, pSC101, pm121, RSF2124, pCR1 of RP4.

De invoeging van de gag- en env-genen in een klonende vector geschiedt gemakkelijk wanneer zowel de genen als de gewenste klonende drager zijn geknipt met hetzelfde restrictie-enzym of -enzymen, omdat 55 daaibij complementaire DNA-einden wórden gevormd. Als dat niet mogelijk is, kan het nodig zijn de geproduceerde knipeinden te modificeren door enkelstrengig DNA terug te digereren tot afgekante einden of ιΗλΜ Ha AnUfiletrAnninA ι riteihHan mot oon noerhilHo DMA- 5 192275 polymerase worden opgevuld. Aldus kan binding van het afgekante einde worden uitgevoerd met een enzym zoals T4 DNA-ligase. In plaats daarvan kan elke geschikte positie worden verkregen door koppeling van nucleotide-sequenties (linkers) op DNA-einden. Dergelijke linkers kunnen specifieke oligonucleotide-sequenties omvatten die herkenningssequenlies voor het restrictiegebied coderen. De gesplitste vector en 5 de gag- en env-genfragmenten kunnen ook worden gemodificeerd door homopolymere staartvorming ("tailing") zoals beschreven door Morrow [Methods in Enzymology 68, 3 (1979)].

Wanneer eenmaal hetzij het gag- of env-gen hetzij een fragment daarvan in een geschikte klonende drager is ingevoegd kan het andere gen of genfragment in de drager worden aangebracht door voorzichtige splitsing met restrictie-endonuclease, zodat het tweede gen of genfragment naast het eerste terechtkomt en 10 een fusiegen ontstaat. Uiteraard kan het fusiegen, indien de gag- en env-genen chemisch worden bereid, rechtstreeks worden geproduceerd en als enkel DNA-fragment in de klonende drager worden ingevoerd.

In de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding werd het Clal/Hincll digestiefragment met daarin het eerder beschreven gag-gen van HXB-3 gekoppeld in pEV-vrf2 dat met Clal en Puvll was gesplitst onder vorming van een recombinant-expressie-plasmide pEV/gag 15-512 (figuur 1, boven) dat de synthese van 15 een eiwit van 56 Kd dat de gag-residuen 15-512 omvatte richtte. De gag-sequenties voorbij een Bglll gebied in de buurt van residu 437 werden vervolgens met env-sequenties herschikt in een Bgill/Hindlil fragment uit het bovenbeschreven derivaat van plasmide pEV/env 44-640 (waaruit de residuen 514-524 waren verwijderd) waarbij plasmide pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 dat het gag-env-fusiegen droeg werd gevormd (figuur 1, onder).

20 Een volledige beschrijving van deze constructie is te vinden in het voorbeeld, in het bijzonder bij de onderdelen B-E. De nucleïnezuursequentie van het gag/env-gen volgens de voorkeursuitvoeringsvorm [bepaald met de chemische splitsingsmethode van Maxam e.a., Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] en de op grond daarvan voorspelde aminozuurvolgorde van het gag/env-eiwit zijn afgebeeld in figuur 2.

Veel van de in de uitvinding bruikbare klonende dragers bevatten een of meer kenmerkende werkingen 25 die gebruikt kunnen worden voor het selecteren van gewenste transformanten zoals resistentie tegen ampicilline en tetracycline in pBR322, resistentie tegen ampicilline en β-galactosidase-actjviteit in pUC8 en ampiciiline-resistentie in pEV-vrf2. Selectie van gastheercellen waarin dergelijke vectoren zijn ingevoegd wordt aanzienlijk vergemakkelijkt wanneer de gastheercellen zelf de door de vectoren aangedragen werkingen missen.

30 Opgemerkt dient te worden dat de nucleotide-sequenties van de op een bepaalde plaats in een klonende drager ingevoegde gag- en env-genfragmenten nucleotiden kunnen bevatten die geen deel uitmaken van de feitelijke structurele genen. Andersom is het mogelijk dat genfragmenten slechts een deel van de volledige genen bevatten. Het enige dat vereist is, is dat de in de klonende drager ingevoegde genfragmenten in staat zijn de productie in een geschikt gastheerorganisme van een polypeptide of een eiwit met ten minste 35 een antigene determinant die overeenkomt met de sequenties van de gag- en env-eiwitten te richten.

De selectie van een geschikt gastheerorganisme wordt mede bepaald door een aantal bekende factoren. Deze factoren zijn onder meer bijvoorbeeld de verenigbaarheid met de gekozen vector, de toxiciteit van de door het hybride plasma gecodeerde eiwitten, het gemak waarmee het gewenste eiwit wordt gewonnen, de expressiekenmerken, de biologische veiligheid en de kosten. Tussen deze factoren moet het juiste 40 evenwicht worden gevonden en daarbij moet in aanmerking worden genomen dat niet alle gastheren even doeltreffend een bepaald recombinant DNA-molecule tot expressie brengen.

Geschikte eencellige gastheerorganismen die volgens de uitvinding kunnen woiden gebruikt zijn, onder meer, zoogdier- en gistcellen en bacteriën zoals Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermo-philus en Actinomyces. De door Casadaban e.a. [J. Mol. Biol. 138,179 (1980)] beschreven stam MC1061 45 van E. coli is even goed te gebruiken als elke andere stam van E. coll K-12 die het plasmide pRK248clts bevat. Het plasmide pRK248clts voor gebruik in andere E. coli K-12 stammen is vrij beschikbaar uit de American Type Culture Collection (ATCC) en heeft toegangsnummer ATCC 33766. De E. coli stam MC1061 is ook bij de ATCC gedeponeerd (toegangsnummer ATCC 53338) en is ook op verzoek vrij beschikbaar.

Overbrenging van de recombinante klonende vector naar de gastheercel kan op verscheidene {panieren 50 geschieden. Naar gelang van het gekozen vector/gastheercelsysteem kan die overbrenging plaatsvinden door transformatie, transductie of transfectie. Zodra een gemodificeerde gastheercel wordt geproduceerd kan de cel worden gekweekt en kan het eiwitexpressieproduct uit de kweek worden geïsoleerd.

Bij productie in E. coli is het gag/env-eiwit grotendeels beperkt tot cytoplasmische insluitingslichamen (onoplosbare eiwitaggiegraten) van de bacterie, waardoor de zuivering van het eiwit belangrijk wordt 55 vergemakkelijkt. Ter isolatie van het gag/env-eiwitproduct volgens de uitvinding worden de bacteriële cellen bij voorkeur opengebroken of ontbonden en wordt het onoplosbare eiwit door centrifugeren gewonnen. Een aanzienlijke zuivering kan worden verkregen door achtereenvolgens wassen van het neerslag met 1192275 6 toenemende concentraties ureum gevolgd door toepassing van standaardwerkwijzen voor de zuivering van eiwitten.

Voor geringe hoeveelheden materiaal zoals monsters voor polyacrylamidegel-elektroforese-analyse kunnen de cellen worden opengebroken door behandeling met een detergent zoals natriumdodecylsulfaat 5 (SDS). Grotere hoeveelheden van het eiwit kunnen het best worden gewonnen met behulp van geluidstrillin-gen of met andere mechanische splitsingstechnieken zoals de Franse drukcel.

Celverbreking kan ook geschieden langs chemische of enzymatische weg. Aangezien voor de instandhouding van het celmembaan dikwijls tweewaardige kationen vereist zijn, kan behandeling met geschikte chelaatvormende middelen zoals EDTA of EGTA voldoende openbreking geven om het uitlekken van het 10 eiwit uit de cellen te vergemakkelijken. Ook zijn enzymen zoals lysozym voor dit doel gebruikt. Dat enzym hydrolyseert het peptidoglycanskelet van de celwand. Ook kan beurtelings bevriezen en ontdooien in combinatie met behandeling met lysozym worden toegepast.

Wanneer het gag/env-eiwit uit de cel is bevrijd, kan het volgens elke bekende methode in het mengsel worden aangetoond. Bijvoorbeeld kan er een radioimmunoassay (RIA) of enzyme-linked immunosorbent 15 assay (ELISA) worden uitgevoerd onder gebruikmaking van antilichamen tegen het eiwit. Bij voorkeur wordt het eiwit geïdentificeerd door middel van elektroforese met SDS op polyacrylamidegel gevolgd door Western blot of soortgelijke analyse.

Het gag/env-eiwit volgens de uitvinding kan worden geconcentreerd door neerslaan met zouten zoals natrium- of ammoniumsulfaat, door ultrafiltreren of door gebruikmaking van andere voor de deskundige 20 bekende methoden. Verdere zuivering kan worden verkregen door gangbare eiwitzuiveringstechnieken zoals, onder meer, gelfiltratie, ionenuitwisselingschromatografie, preparatieve schijfgel- of gordijneiectrofo-rese, isoelektrische concentratie, fractionering met een organisch oplosmiddel bij lage temperatuur of tegenstroomverdeling.

Omdat het gag/env-eiwit antigene determinanten van twee belangrijke componenten van het HTLV-III-25 virus bevat en omdat dit virus de belangrijkste veroorzaker bij AIDS is en immunologisch verwant is met de overige virale agentia die een rol spelen bij of in verband gebracht zijn met AIDS of ARC, is het eiwit een krachtig diagnostisch instrument voor de opsporing van antilichamen tegen AlDS-vi russen in menselijk serum. De fusie kan op talrijke bekende wijzen voor dit doel worden gebruikt.

Het gag/env-eiwit kan bijvoorbeeld op een of andere wijze worden gemerkt, het gemerkte eiwit kan dan 30 aan een menselijk serummonster waarvan wordt vermoed dat het antilichamen tegen AIDS-virussen bevat worden toegevoegd onder vorming van gemerkte complexen van fusie-eiwit en antilichamen en de aldus gevormde complexen kunnen op geschikte wijze worden gedetecteerd. In een ander voorbeeld kan het eiwit op een vaste drager worden geïmmobiliseerd en vervolgens met het menselijke serummonster in contact worden gebracht. Antilichamen tegen AIDS-virussen in het monster zullen zich dan met het geïmmobili-35 seerde eiwit binden en de aldus gevormde complexen kunnen dan, nadat niet-gecomplexeerde eiwitten en antilichamen uitgewassen zijn, met behulp van een reagens zoals Staphylococcus aureus eiwit A (gemerkt met b.v. jodium 125) worden ontdekt. Veel variaties van deze mogelijkheden, waarvan er hieronder enkele worden aangegeven, zullen de deskundigen duidelijk zijn.

Op basis van het gebruik van antilichamen tegen het gag/env-eiwit kan een reeks diagnostische tests 40 voor de aanwezigheid van AIDS-virussen of deeltjes daarvan in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen worden ontworpen. Die antilichamen kunnen worden geproduceerd door injectie bij een zoogdier of een vogel van een voldoende hoeveelheid van een vaccinsamenstelling die het eiwit en een daarmee verenigbare farmaceutische drager omvat teneinde de productie van antilichamen tegen het eiwit op gang te brengen. De vereiste geschikte hoeveelheid eiwit is de deskundige bekend of kan op gebruikelijke wijze 45 proefondervindelijk worden bepaald. In verband met de uitvinding kan onder de term ’’farmaceutische drager" worden verstaan hetzij de standaardsamenstellingen die geschikt zijn voor toediening aan de mens of de gangbare bij diervaccinaties gebruikte adjuvantia.

Geschikte adjuvantia voor het vaccineren van dieren zijn onder meer Freund’s onvolledig of volledig adjuvans (niet geschikt voor gebruik bij de mens of bij vee), adjuvans 65 (dat arachide-olie, mannide-mono-50 oleaat en aluminiummonostearaat bevat) en minerale gelen zoals aluminiumhydroxide, aluminiumfosfaat en aluin; oppeivlakte-actieve stoffen zoals hexadecylamine, octadecylamine, lysolecithine, dimethyldioctade-cylammoniumbromide, N,N'-dioctadecyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-propaandiamine, methoxyhexadecylglycerol en ”pluronic”-polyolen; poly-anionen zoals pyran, dextransutfaat, poly-IC, polyacrylzuur, carbopol; peptiden zoals muramyldipeptide, dimethylglycine, tuftsin; en olie-emulsies. Het gag/env-eiwit kan ook worden 55 toegediend na opneming in liposomen of andere microdragers of na koppeling met polysacchariden, andere eiwitten en andere polymeren.

Typerend wordt de eerste vaccinering na enige weken gevolgd door een of meer "versterkings”- 7 192275 vaccinaties waarvan het netto effect is de productie van hoge concentraties antilichamen tegen het gag/env-eiwit, die op de gebtuikelijke wijze kunnen worden gewonnen.

Uiteraard kunnen monoklonale antilichamen tegen het eiwit volgens de huidige technologie worden geproduceerd om tot hetzelfde resultaat te komen. Somatische cellen met het vermogen antilichamen te 5 produceren zoals B-cellen kunnen worden gefuseerd met myeloom-cellijnen en dan hybridoomcellen produceren. Deze cellen kunnen in vitro of als ascites-tumoren oneindig worden gekweekt waardoor grote hoeveelheden specifieke antilichamen worden gevormd. Aangezien hybridoomcellen gemakkelijk kunnen worden gekloond is het mogelijk snel grote aantallen cellen te produceren die alle dezelfde specifieke antilichaammoleculen, gericht op een gemeenschappelijke antigens determinant, produceren. Deze 10 uitzonderlijke uniformiteit in antilichaamproductie kan voordelig zijn wanneer de antilichamen in specifieke diagnostische tests moeten worden gebruikt.

Lymfknobbels en milten van dieren geïnjecteerd met een antigen zijn geschikte bronnen van B-cellen, al is het even goed mogelijk deze cellen uit ongesensibiliseerde dieren te verwijderen en ze na isolatie in vitro te injecteren. Veel gebruikt bij de productie van hybridoom zijn B-lymfocyten van muis en rat, maar 'm plaats 15 daarvan kunnen ook cellen van konijnen, mensen, kikkers en andere dieren worden gebruikt.

Er zijn tal van gespecialiseerde myeloom-cellijnen ontwikkeld uit lymfocytische tumoren voor gebruik bij de hybridoomproductie [Kohier en Milstein, European J. Immunol. 6, 511 (1976); Shulman e.a., Nature 276, 269 (1978)]. Van de geproduceerde cellijnen worden P3/X63-Ag 8, P3/NSI/1-Ag 4-1, Sp2/0-Ag14en S194/5.XXO.BU.1 vaak gebruikt.

20 De fusie van de antilichaam producerende milt- of lymfknobbelcellen met myeloomcellen voor de productie van hybridomen geschiedt gewoonlijk met een overmaat splenocyten of lymfocyten ten opzichte van de myeloomcellen, welke overmaat tot 20:1 kan bedragen, al worden meestal lagere verhoudingen gebruikt. Fusie wordt vergemakkelijkt bij gebruik van een fusie-hulpmiddel zoals met UV gedeactiveerd Sendai virus of polyethyleenglycol (PEG). Gefter e.a [Somatic Cell Genet. 3, 231 (1977)] hebben gemeld dat 25 combinatie van dimethylsulfoxide met PEG de celfusie verder versnelt. Er zijn ook elektrische inrichtingen beschikbaar die cellen met een uitzonderlijk hoge doelmatigheid kunnen fuseren.

Wanneer de fusie eenmaal heeft plaatsgevonden moeten de hybridoomcellen uit de niet-gefuseerde moeder-celstammen worden geselecteerd. Deze selectie kan vlot plaatsvinden wanneer de cellen worden gekweekt in een medium dat de groei van hybridoomcellen wel maar die van moedercellen niet steunt. De 30 bij de fusie gebruikte somatische B-cellen hebben in cultuur een beperkte levensduur en gaan dus verloren bij veroudering en versterf, maar de moedermyeloomcellen die in cultuur een onbepeikte levensduur hebben moeten met speciale selectietechnieken worden verwijderd.

In een veel gebruikt systeem worden myeloomcellen zonder hypoxanthine-fosforibosyl-transferase (HPRT ) gebruikt. Deze cellen beschikken niet over de vangmogelijkheid voor het hergebruik van vrije 35 hypoxanthine-base en overleven niet indien een remmer zoals aminopterine wordt gebruikt om de nieuwbereiding van purinen te blokkeren. De myelome moedercellen kunnen dus worden geselecteerd door het fusiemengsel in een hypoxanthine/aminopterine/thymidine (HAT) medium te kweken, waarbij de hybridoomcellen als gevolg van de bijdrage van HPRT door de antilichaam producerende fusie-moedercellen overleven.

40 Na een periode van selectiekweek kunnen de overlevende hybridoomcellen worden gekloond en kunnen voorraden worden gekweekt volgens standaardcelkweekmethoden en de klonen die de gewenste specifieke immunoglobulinen produceren kunnen door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of met andere proeven die zijn gebaseerd op het gebruik van het antigen waartegen de antilichamen zijn gericht worden gedetecteerd.

45 De door toepassing van de uitvinding te verkrijgen anti-gag/env-eiwitantilichamen kunnen verder worden gebruikt voor het opstellen van een verscheidenheid aan diagnostische tests voor AIDS-virussen of deeltjes daarvan. Dergelijke diagnostische systemen kunnen de vorm hebben van een radioimmunoassay, hetzij in vrije oplossing hetzij in vaste toestand. In plaats daarvan kunnen ELISA-bepalingen worden verkregen alsmede bepalingen op basis van een immunoblot analyse. Deze bepalingen kunnen direct of indirect zijn, 50 met toepassing van een tweede antilichaam tegen de anti-gag/env-eiwitantilichamen. Aan de antilichamen kunnen tal van enzymatische werkingen worden gekoppeld, waarbij peroxidase, glucoseoxidase, β-galactosidase en alkalisch fosfatase slechts enige voorbeelden zijn.

Het basisprincipe van deze tests is dat een monster van menselijk serum of van een andere biologische vloeistof waarin de aanwezigheid van AIDS-virussen of fragmenten daarvan wordt vermoed tot reactie wordt 55 gebracht met een bekende titer aan antilichamen tegen het gag/env-eiwit ter vorming van antigen-antilichaamcomplexen. De aldus gevomtde complexen worden met geschikte middelen aangetoond.

De deskundige zal ook inzien dat er vele andere manieren zijn waarop het anti-gag/env-eiwitsenrm ____I _ 192275 8 diagnostisch kan worden gebruikt zoals in een of meer agglutinatietests. In dergelijke agglutinatiebepalingen kan de interactie van antilichamen en AIDS-virussen of virale fragmenten wórden opgespoord met behulp van systemen waarin deeltjes zijn bekleed met de anti-gag/env-eiwitlichamen. Dergelijke deeltjes kunnen latexfaalen, liposomen, erytrocyten, polyacrylamidekorrels of andere polymeren zijn.

5 Qe hierboven beschreven werkwijze voor het bepalen van AIDS-virus of van antilichamen tegen AIDS-virus kan worden uitgevoerd met een geschikt testpakket dat in een houder het gag/env-eiwit volgens de i itvinding of antilichamen tegen AIDS-viius die zijn opgewekt door het gag/env-eiwit volgens de uitvinding omvat. Een dergelijk testpakket kan deeltjes omvatten die zijn bekleed met de antilichamen tegen AIDS-virus die zijn opgewekt door een eiwit volgens de uitvinding. De hierboven beschreven testpaketten 10 vom ten tevens onderdeel van de onderhavige uitvinding.

[toor Crowl e.a. [Cell <M, 979-986 (1985)] is beschreven dat het serum van alle 50 AIDS-patiënten die met genetisch gemanipuleerd env-eiwit waren onderzocht sterk reactief was ten opzichte van het eiwit, dit ondanks het feit dat de helft van de patiënten afkomstig was van de westkust van de Verenigde Staten en de helft van de oostkust. Dat al de onderzochte serums reactief waren met het env-eiwit betekende dat de _ 15 virussen die de aldus reagerende antilichamen produceerden, ondanks de geografische scheiding en de waarschijnlijkheid van geringe genetische verschillen, ten minste een gemeenschappelijke of behouden antigene determinant in hun omhullende eiwitten moeten hebben gehad.

Het gag-kemeiwit van het AIDS-retrovirus blijkt bij een hoog percentage individuen die eerder aan een virus waren blootgesteld de vorming van antilichamen op gang te brengen [Montagnier e.a., zie boven; 20 Schüpbach e.a., zie boven; Samgadharan e.a., zie boven].

Samengevat doen de bovengenoemde waarnemingen vermoeden dat het gag/env-eiwit volgens de uitvinding, dat ten minste een antigene determinant heeft die met de sequenties van de gag- en env-eiwitten waaruit het is opgebouwd overeenkomt, immunogeen is bij de mens en bruikbaar kan zijn als AIDS-vaccin. Het gag/env-eiwit (geproduceerd op de wijze zoals hier beschreven dan wel chemisch gesynthetiseerd) 25 kan derhalve in een vaccinsamenstelling die het eiwit en een geschikte farmaceutische drager omvat worden gebruikt. Het eiwit kan in een dergelijke samenstelling in de verkregen gezuiverde vorm worden gebruikt of kan meer immunogeen worden gemaakt via in de techniek bekende modificaties. Het eiwit kan bijvoorbeeld in een sterk immunogene matrix worden omgezet door reactie met een verknopingsmiddel zoals 1,3-dicyclohexylcarbodiimide. Ook kan het eiwit covalent worden gekoppeld met een sterk immu-30 nogeen eiwitdragermolecule, hetzij rechtstreeks hetzij met een geschikt verbindingsmolecule. Bruikbare dragermoleculen zijn onder meer patella-hemocyanine en verschillende bacteriële toxoiden (inactieve toxinen) zoals difterietoxoide. Wanneer het gag/env-eiwit is gekoppeld aan een bacterieel toxoide kan een dubbel werkende vaccinsamenstelling worden geproduceerd die bescherming biedt zowel tegen AIDS als tegen de bacterie waaruit het toxoide afkomstig is.

35 Toedieningswegen, antigendoses, aantal en frequentie van injecties zijn factoren die tot de normale deskundigheid horen.

Voorbeeld

Het hierna volgende is een niet beperkend voorbeeld ter illustratie van de werkwijzen volgens welke een 40 recombinant-vector kan worden geproduceerd die het gag/env-eiwit van het HTLV-III virus codeert. In dit voorbeeld werden de volgende stappen uitgevoerd die in detail worden beschreven: (1) De DNA-sequentie die de residuen 15-512 (alle behalve de eerste 14 amino-eindstandige residuen) van het gag-gen codeert werd uit recombinant faag-kloon λΗΧΒ-3 geknipt en in E. coli expressieplasmide pEV-vrf2 gekoppeld onder vorming van plasmide pEV2/gag 15-512; 45 (2) De DNA-sequenties overeenkomende met de env-aminozuurresiduen 319-331 werden uit expressieplasmide pEV3/env 44-640 verwijderd door primer-gerichte mutagenese onder vorming van plasmide pEV/env 44-640 φ 319-331; (3) Op plasmide pEV/env 44-640 A 319-331 werd primer-gerichte mutagenese uitgevoerd waarbij de nucleotiden die aminozuurresiduen 514-524 coderen werden gedeleteerd en plasmide pEV3/env 44-640 φ 50 319-331 Δ 514-524 werd gevormd; en (4) Een restrictie-endonudease-fragment van het env-gen uit plasmide pEV/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 dat de env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert werd in gesplitst plasmide pEV/gag 15-512 gebonden onder vorming van een fusiegen dat gag-residuen 15-436 en env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert in plasmide pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524.

55 in elk stadium van de opbouw werden plasmiden gereproduceerd door transformatie in E. coli-stam MC1061 (pRK248clts).

9 192275 A. Algemene werkwijzen voor de bereiding van recombinant-vectoren DNA-bereiding Isolatie op kleine schaal van ptasmide-DNA uit 1 ml verzadigde culturen van één nacht vond plaats volgens de werkwijze van Bimboim e.a. [Nucleic Acids Research 7,1513 (1979)]. Volgens deze weikwijze kan een gëringe hoeveelheid DNA uit een bacteriéle kolonie worden geïsoleerd voor analytische doeleinden. Grotere 5 hoeveelheden plasmide DNA werden bereid met 1-liter culturen volgens een standaardwerkwijze met centrifugeren met cesiumchloride.

Omstandigheden voor enzymatische reacties

De gebiuikte restrictie-enzymen en het T4 DNA ligase waren producten van New England BioLabs, Beverly, 10 MA, USA. Deze enzymen werden gebruikt volgens methoden en onder omstandigheden zoals gepubliceerd door de fabrikant.

Voor de restrictie-endonucleasen is een eenheid van activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is voor een volledige omzetting van 1,0 pg DNA in 60 minuten in een totaal reactievolume van 0,05 ml waarbij de afbraak bij 37°C wordt uitgevoerd. De digestiemengels bevatten naast het te splitsen DNA, 15 100 pg/ml runderserum-albumine en de volgende buffercomponenten:

Elglll: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM MgCI2 en 10 mM 2-mercaptoethanol (2-ME) (/lal: 50 mM NaCI, 6 mM Tris-HCI (pH 7,9) en 6 mM MgCI2

Hindi: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 7 mM MgCI2 en 1 mM dithiotreitol (DTT) 20 Hindlll: 50 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) en 10 mM MgCi2

Hpal: 6 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM MgCI2 en 1 mM DTT

Pstl: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) en 10 mM MgCI2

Pvull: 60 mM NaCI. 6 mM Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM MgCI2 en 6 mM 2-ME

Stul: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM MgCI2 en 6 mM 2-ME

25 De T4 DNA-koppeling werd bij 16°C uitgevoerd in een mengsel dat het DNA en 50 mM Tris-HCI (pH 7,8), 10 mM MgCI2, 20 mM DTT, 1,0 mM ATP en 50 pg/ml runderserum-albumine bevatte. Een eenheid T4 DNA ligase-activiteit is gedefinieerd als de hoeveelheid die nodig is om 50% koppeling van Hindlll-fragmenten van lambda DNA te verkrijgen in 30 minuten bij 16°C in 20 pl incubatiemengsel en een concentratie aan 5'-DNA einden van 0,12 μΜ (300 pg/ml).

30

Zuivering van DNA-fragmenten in agarose

Na de splitsing met restrictie-endonuclease werden DNA-fragmenten voor het klonen geïsoleerd door elektroforese in 1% agarose. Na zichtbaarmaking met 1 pg/ml ethidiumbromide werden plakjes van het gel met daarin de gewenste DNA-fragmenten door een naald maat 21 geëxtrudeerd in 4 ml van een oplossing 35 die 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1 mM EDTA en 300 mM NaCI bevatte. Dit mengsel werd vervolgens 3 uur bij -80°C ingevroren, 30 minuten bij 37°C ontdooid en 30 minuten bij 10.000 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd dooreen 0,45 micron Millex filter gefiltreerd, tot 0,25 ml geconcentreerd met secbutanol en driemaal met ethanol met 10 pg E. coli tRNA/transfer RNA) als drager neergeslagen.

40 Kweekmedia

Het M9CA medium bevatte 10 g NaaHPO,,, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCI en 1 g NH4CI per liter, en daarbij 1 mM ;MgS04, 0,5% glucose en 0,5% casaminozuren, ingesteld op pH 7,4.

Luria Broth (LB) bevatte 5 g Bacto-gistextract, 10 g Bacto-trypton en 10 g NaCI per liter, ingesteid op pH

7,5.

45 De antibiotica tetracycline en ampicilline werden tot eindconcentraties van respectievelijk 15 en 50 pg/fril, waar aangegeven, toegevoegd.

Transformatie en isolatie van recombinanten

De transformatie van E. coli-stam MC1061 (pRK248clts) werd uitgevoerd door middel van een gewijzigde 50 versie van de werkwijze van Kushner [in Genetic Engineering, eds. Boyer e.a., Elsevier/North-Holland, Amsterdam, blz. 17 (1978)], en wel in hoofdzaak als volgt.

Tweehonderd ml bacteriéle cellen werden bij 30°C in LB gekweekt tot een ΟΟ.^ tussen 0,5 en 1,0 waarna de cellen werden verzameld door centrifugeren bij 6000 g gedurende 5 minuten bij 4°C en opnieuw werden gesuspendeerd in 50 ml van een oplossing die 10 mM morfolinopropaansulfonzuur (MOPS; pH 7,0) 55 en 10 mM RbCI bevatte. De cellen werden nogmaals verzameld door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in 30 ml van een oplossing die 10 mM MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCI2 en 10 mM RbCI bevatte. Na incubatie bij 0° C gedurende 30 minuten werden de cellen verzameld, opnieuw in 6 ml 10 mM MOPS (pH

1192275 10 6,5) met 50 mM CaCI2, 10 mM RbCI en 15% glycerol gesuspendeerd en verdeeld over 40 Eppendorfbuizen (300 μΙ per buis) en bij -80°C ingevroren.

De transformatie werd uitgevoerd door ontdooien van een hoeveelheid van 100 μ! cellen en incuberen gedurende 30, 2 en 2 minuten bij respectievelijk 0°, 37° en 0°C in aanwezigheid van een 10 μΙ monster 5 ligeringsmengsel dat ongeveer 100 ng DNA bevatte en toevoegen van 0,1 tot 0,5 ml LB in de buis. De buis werd vervolgens 60 minuten bij 22°C geïncubeerd waarna 200 μΙ van de celsuspensie op een LB-plaat die ampicilline bevatte verspreid en 20 uur bij 30°C geïncubeerd.

Celkweek en inductie van genexpressie 10 Culturen van E. coli MC1061 die plasmide pRK248clts en een expressieplasmide bevatte werden in M9CA medium bij 30eC gekweekt tot de mid-logfase en vervolgens op 42°C gebracht ter deactivering van de XPL repressor. Na 2 uur incuberen bij 42°C werden cellen uit 1 ml van de geïnduceerde cultuur verzameld door centrifugeren en opnieuw in TG buffer die 10 mM Tris-HCi (pH 7,4) en 10% glycerol bevatte gesuspendeerd als voorbereiding op de analyse.

15

Elektroforese met SDS op polyacrylamidegel en western blöt analyse

In Tris-glycine (TG)-buffer gesuspendeerde geïnduceerde cellen werden met een gelijk volume 2x monsterbuffer gemengd [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)], 5 minuten bij 95°C geïncubeerd en op de door Laemmlï beschreven wijze aan polyacrylamidegel-elektroforese met SDS in 12,5% gelen onderworpen. Na 20 de elektroforese werden de eiwitten uit het gel aan elektroblotting onderworpen op een nitrocellulosemem-braan van 0,1 micron bij 95 volt gedurende 6 uur in 12,5 mM Tris en 96 mM glycine met 20% methanol en 0,01% SDS bij pH 7,5. Vervolgens werd een Western blotanalyse uitgevoerd zoals beschreven doorTowbin e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4350 (1979)].

25 Primer-gerichte mutagenese

Primer-gerichte, plaatsspecifieke mutagenese werd uitgevoerd volgens de door Morinaga e.a. beschreven werkwijzen [Biotechnology 2, 636 (1984)]. De voor de uitvoering van de mutagenese gebruikte synthetische oligonucleotiden werden volgens de fosfietmethode [Beaucage e.a., Tetrahedron Lett. 22,1859 (1981); Matteucci e.a., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] bereid met behulp van een geautomatiseerd 30 synthese-apparaat en door middel van polyacrylamidegel elektroforese volgens de werkwijze van Maxam e.a., [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] gezuiverd.

Kolonie-hybridisaties

Kolonie-hybridisaties werden uitgevoerd volgens de werkwijze van Grunstein e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci., 35 U.S.A., 72, 3961 (1975)]. Hetzelfde oligonucleotide dat was gebruikt voor de primer-gerichte plaatsspecifieke mutagenese werd gebruikt als sonde voor de hybridisaties na marking van het 5'-einde met 32p-(-ATP) met behulp van polynucleotide-kinase zoals beschreven door Maniatis e.a. [Cell 1_5, 687 (1978)].

B. Opbouw van plasmide pEV2/gag 15-512 40 Zoals eerder aangegeven werde de opbouw van een uiteindelijk expressieplasmide dat het gag/env-fusie-eiwit tot expressie brengt gestart met de constructie van een plasmide (pEV2/gag 15-512) dat nucleotiden bevat dat alle behalve de eerste 14 amino-eindstandige residuen coderen. Enkele van de nucleotiden die de carboxyl-eindstandige gag-residuen coderen werden vervolgens door env-sequenties vervangen waarbij het uiteindelijke fusieproduct werd verkregen.

45 Voor het bereiden van plasmide pEV2/gag 15-512 werd de DNA-sequentie die de residuen 15-512 van het gag-eiwit codeert verkregen uit 50 μΙ recombinant faag lambda kloon λΗΧΒ-3 die het HTLV-III provirale genoom bevat, door splitsing met 50 eenheden Clal en 50 eenheden Hindi gedurende 120 minuten bij 37°C onder vorming van een fragment van 1700 baseparen. Dit DNA-fragment werd geïsoleerd door middel van preparatieve gel-elektroforese op agarose en opnieuw in 0,1x TE buffer [1 mM Tris-HCI (pH 7,4) met 0,1 50 mM EDTA] gesuspendeerd tot een eindconcentratie van 0,03 pmol/μΙ.

Voor het verkrijgen van het gag-DNA-fragment werd 2 pg van het expressieplasmide pEV-vrf2 van E.coli gedurende 60 minuten bij 37°C gesplitst met 5 eenheden Clal en 5 eenheden Pvull en werd een fragment van 1700 baseparen met daarin de XPL-promotor door elektroforese in 1% agarosegel geïsoleerd en na precipitatie met ethanol opnieuw gesuspendeerd tot een eindconcentratie van 0,03 pmol/μΙ.

55 Het bij deze opbouw gebruikte plasmide pEV-vrf2 is een derivaat van het gemakkelijk beschikbare plasmide pBR322 [ATCC 31344]. De opbouw van plasmide pEV-vrf2 is in detail beschreven door Crawl e.a. [Gene 38, 31 (1985)]. De bij deze constructie gebruikte recombinante faag lambda kloon λΗΧΒ-3 is door 11 192275

Shaw e.a. beschreven [Science 226, 1165 (1984)]. Deze kloon werd met behulp van standaard recombinant DNA technieken verkregen uit de hierboven beschreven met HTLV-III geïnfecteerde H9 cellijn. Een met HTLV-III geïnfecteerde menselijke cellijn, aangeduid als H9/HTLV-IIIB, die geschikt is voor gebruik volgens de uitvinding, is bij de American Type Culture Collection gedeponeerd met toegangsnummer CRL 8543.

5 Aangezien Shaw e.a. de sequentie van het HTLV-III genoom hebben gepubliceerd kan een DNA-sonde met behulp van die gegevens gemakkelijk worden geconstrueerd en worden gebruikt ter isolatie van het genoom van H9 of van elke andere lijn die in staat is het virus te vermeerderen.

0,03 (300) pmol van het gag/Clal-Hincll fragment werden gemengd met 0,03 pmol van het pEV-vrt2/Clal-Pvull fragment en met 200 eenheden T4 DNA ligase 18 uur bij 15°C in een eindvolume van 10 pl gekop-10 peld. Het koppelingsproduct werd vervolgens in E.coli-stam MC106T (pRK248clts) getransformeerd en de transformanten werden geselecteerd door kweek op LB-agaiptaten met ampicilline na incubatie gedurende 18 uur bij 30°C. De recombinante plasmide-DNA’s werden na splitsing met Bglll, Pstl of Hindlll geanalyseerd op de juiste afmeting van het restrictiefragment. De met DNA-maatanalyse positieve geïsoleerde fracties werden vervolgens onderzocht voor de synthese van het voorlopende gag-polypeptide door middel 15 van polyacrylamidegel-elektroforese met SDS en Western blot-analyse.

Culturen die plasmide pEV2/gag 15-512 bevatten werden bij 40°C geïnduceerd en van de geïnduceerde cellen werden duplomonsters bereid voor analyse door middel van SDS-polyacrylamidegel-elektroforese. Na elektroforese werd het gel in tweeën gesneden en werd de helft van het gel gekleurd met Coomassie briljantblauw, terwijl de andere helft werd onderworpen aan elektroblotting en Western blot-analyse met 20 behulp van anti-gag antilichamen.

Uit de analyse bleek dat de geïnduceerde cellen eiwitten produceerden die zich in de gelen als twee hoofdbanden met schijnbare moleculegewichten van ongeveer 56 en 53 Kd verplaatsten. De omvang van het volledige gag 15-512 eiwit is ongeveer 56 Kd. De beide belangrijkste eiwitten reageren met de anti-gag antilichamen. Tevens werd een aantal minder belangrijke eiwitten met lager moleculegewicht, die met de 25 antilichamen reageerden, waargenomen.

C. Opbouw van plasmide pEV3/env 44-640 Δ 319-331

De in het uiteindelijke voorbeeldplasmide volgens de uitvinding aanwezige env-sequenties werden in twee fasen verwerkt (beschreven in deze afdeling en in afdeling D verderop) waarbij in beide gevallen specifieke 30 korte nucleotidesequenties door middel van primer-gerichte, plaatsspecifieke mutagenese werden gedele-teerd. De eerste van deze deleties (beschreven in deze afdeling) was nodig voor het produceren van plasmide pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 (afdeling D).

Het expressieplasmide pEV3/env 44-640, waarvan de opbouw uit λΗΧΒ-3 en de pEV-vrf plasmiden is beschreven door Crowl e.a. [Cell 41, 979 (1985)] stuurt de synthese van een HTLV-III env-spedfiek eiwit 35 van 68 Kd in E. coli. Met de env-aminozuurresiduen 319-331 overeenkomende DNA-sequenties werden gedeleteerd door primer-gerichte mutagenese met behulp van een 18-mer synthetisch oligonucleotide met sequentie 5' GCA TTT GTT AAC ATT AGT 3'. Dit oligonudeotide werd ontworpen als complement op de env-sequenties zodat de nucleotiden die residu 318 coderen werden gekoppeld aan die welke residu 332 coderen. Als gevolg van het samenvoegen van deze sequenties werd een nieuwe unieke Hpai-plaats in 40 plasmide-DNA geïntroduceerd terwijl 39 baseparen werden gedeleteerd. De Stul en Hindlll plaatsen in plasmide pEV3/env 44-640 werden gebruikt voor het vormen van het ”gat” voor het heteroduplexmolecuut.

DNA uit geïsoleerde kolonies die op hybridisatie met het met ^ gemerkte synthetische oligonudeotide tijdens kolonie-onderzoek positief waren werden in MC1061 (pRK248clts) getransformeerd en geanafyseerd op de aanwezigheid van de nieuwe, unieke Hpal plaats.

45 D. Opbouw van plasmide pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524

Een tweede deletie binnen de env coderende sequenties werd tot stand gebracht door middel van primer-gerichte mutagenese met behulp van een synthetisch oligonudeotide met de sequentie 5' AGA GCA GTG GCA GCA GGA 3'. Dit oligonudeotide plaatste sequenties die residu 513 van het env-eiwit coderen 50 naast die welke residu 525 coderen en vergemakkelijkte de deletie van de nucleotiden die residuen 514-524 coderen. Deze deletie werd in het plasmide tot stand gebracht met behulp van de restrictie-plaatsen Hpal en Hindlll onder vorming van een enkelstrengs gat binnen het env-gebied.

Na retransformatie werd DNA uit positieve isolatiefradies die waren geïdentificeerd met de met ^ gemerkte oligonucleotide-sonde, geanalyseerd op de deletie van 33 baseparen door middel van restridie-55 splitsing met Hpal en Hindlll gevolgd door elektroforese in 1% agarose. Deze verwijdering werd ook bevestigd door DNA-sequentiëring na de chemische splitsingsmethode van Maxam en Gilbert [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)].

Claims (23)

1192275 12 Zoals al eerder opgemerkt levert de deletie Δ 514-524 een belangrijke verhoging van de expressie van env. E. Opbouw van plasmide pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 51Φ-524 5 Twee pg pEV2/gag 15-512 werd dubbel gedigereerd met hetzij 5 eenheden Clal en 4 eenheden Bglll waarbij een fragment van ongeveer 1300 baseparen dat de gag-residuen 15-436 codeert werd geproduceerd, hetzij met 10 eenheden Pstl en 5 eenheden Clal waarbij een fragment van ongeveer 1 Kb dat de XPL promoter bevat werd geproduceerd. 0,3 pg pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 werd met 10 eenheden Pstl en 4 eenheden Bglll aan restrictie onderworpen onder vorming van een fragment van ongeveer 4 Kb 10 dat env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert. De verschillende aldus geproduceerde DNA-fragmenten werden in 1% agarose gescheiden en op de eerder aangegeven wijze gewonnen. 0,03 pmoi van elk van de geïsoleerde DNA-fragmenten werd gemengd en bij 15°C gedurende 18 uur gekoppeld in aanwezigheid van 200 eenheden T4 DNA ligase. De producten van het koppelingsmengsel werden vervolgens getransformeerd in MC 1061 (pRK248clts) en de transformanten werden op 15 LB-agarplaten met ampicilline geselecteerd. Plasmide-DNA werd bereid uit unieke kolonies en geanalyseerd op de juistelnaat van het restrictiefragment na digestie met Pvull. Elf van de 12 geïsoleerde fracties waren bij DNA analyse positief wat betreft de verwachte Pvull fragmenten van 3505 en 2882 baseparen. Twee positieve geïsoleerde fracties werden verder onderzocht voor de synthese van het gag/env-fusie-eiwit. Deze culturen werden geïnduceerd en er werden celmonsters 20 genomen voor analyse door middel van SDS-polyacrylamidegel-elektroforese, elektroblotting en Western blots waarvan de resultaten zijn weergegeven in figuur 3. Paneel 1 in figuur 3 toont Coomassie-blauw gevlekte totale-celeiwitten van cellen die het het gag/env-fusiegen dragende recombinant plasmide herbergen (g/e) en van controlecellen (c). De panelen 2 en 3 geven de resultaten van duplomonsters die zijn onderworpen aan Western blot-analyse met polyklonale 25 antilichamen van konijnen tegen een met env-residuen 500-511 overeenkomend synthetisch polypeptide (paneel 2) of met behulp van polyklonale antilichamen van schapen tegen eiwit p24 dat in de handel verkrijgbaar is [paneel 3; zie Dowbenko e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985) voor beschrijving van p24 eiwit], in figuur 3 zijn op panelen 2 en 3 de immuun-complexen met een tweede met mterikperoxi-dase gemerkt antilichaam zichtbaar gemaakt en is de afgelegde afstand van moleculegewichtstandaarden 30 (in Kd) aangegeven. De posities van de gag/env-eiwitbanden in de gelen zijn met pijlen aangegeven. Vele aanpassingen en varianten van deze uitvinding kunnen worden gemaakt zonder van de kem en van de strekking daarvan af te wijken zoals de deskundige duidelijk zal zijn. Zo kunnen er in het nucleïnezuur in het gen dat het gag/env-eiwit volgens de uitvinding codeert, substituties worden aangebracht (gebruik makend van de sequentiegegevens uit de referenties) en kan daaruit een enigszins verschillend (maar 35 functioneel-gelijkwaardig) fusie-eiwit worden geproduceerd. Een dergelijk gewijzigd product valt nog steeds onder de uitvinding zolang het ten minste een antigene determinant heeft die overeenkomt met de sequenties van een gag- en env-eiwit van een HTLV-III virus. Op soortgelijke wijze kan de aminozuur-volgorde van het eiwit zelf rechtstreeks worden gemanipuleerd met hetzelfde resultaat. De beschreven bijzondere uitvoeringsvormen dienen alleen als voorbeeld. 40

1. Eiwit met een aminozuursequentie die overeenkomt met ten minste een antigene determinant van een 45 HTLV-III gag-eiwit en tegelijkertijd met een antigene determinant van een HLTV-III env-eiwit.

2. Eiwit volgens conclusie 1 met de aminozuursequentie: Met Asn Arg He Arg lie His Arg Trp Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His He Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu

50 Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin He Leu Gly Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg He Glu He Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys He Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Ser Gin

55 Val Ser Gin Asn Tyr Pro lie Val Gin Asn He Gin Gly Gin Met Val His Gin Ala He Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys 13 192275 Val Val Glu Glu Lys Ala Pha Ser Pro Glu Val He Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys

3. Eiwit volgens conclusie 1 of 2 in nagenoeg zuivere vorm.

4. DNA-molecule met een sequentie die voor een eiwit volgens een der conclusies 1-3 codeert.

5 CCTAGGAAAA AGGGCTGTTG GAAATGTGGA AAGGAAGGAC ACCAAATGAA AGATTGTACT GAGAGACAGG CTAAI II 11 I AGGGAAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAAAAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGTGGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG

5. DNA-molecule volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat deze het geheel of een gedeelte van de nucleïnezuursequentie ATGAATAGAA TTCGGATCCA TCGATGGGAA AAAATTCGGT TAAGGCCAAG GGGAAAGAAA AAATATAAAT TAAAACATAT AGTATGGGCA AGCAGGGAGC TAGAACGATT CGCAGTTAAT CCTGGCCTGT TAGAAACATC AGAAGGCTGT

40 AGACAAATAC TGGGACAGCT ACAACCATCC CTTCAGACAG GATCAGAAGA ACTTAGATCA TTATATAATA CAGTAGCAAC CCTCTATTGT GTGCATCAAA GGATAGAGAT AAAAGACACC AAGGAAGCTT TAGACAAGAT AGAGGAAGAG CAAAACAAAA GTAAGAAAAA AGCACAGCAA GCAGCAGCTG ACACAGGACA CAGCAGTCAG GTCAGCCAAA ATTACCCTAT AGTGCAGAAC ATCCAGGGGG

45 AAATGGTACA TCAGGCCATA TCACCTAGAA CTTTAAATGC ATGGGTAAAA GTAGTAGAAG AGAAGGCTTT CAGCCCAGAA GTAATACCCA TGTTTTCAGC ATTATCAGAA GGAGCCACCC CACAAGATTT AAACACCATG CTAAACACAG TGGGGGGACA TCAAGCAGCC ATGCAAATGT TAAAAGAGAC CATCAATGAG GAAGCTGCAG AATGGGATAG AGTACATCCA GTGCATGCAG GGCCTATTGC

50 ACCAGGCCAG ATGAGAGAAC CAAGGGGAAG TGACATAGCA GGAACTACTA GTACCCTTCA GGAACAAATA GGATGGATGA CAAATAATCC ACCTATCCCA GTAGGAGAAA TTTATAAAAG ATGGATAATC CTGGGATTAA ATAAAATAGT AAGAATGTAT AGCCCTACCA GCATTCTGGA CATAAGACAA GGACCAAAAG AACCTTTTAG AGACTATGTA GACCGGTTCT ATAAAACTCT AAGAGCCGAG

55 CAAGCTTCAC AGGAGGTAAA AAATTGGATG ACAGAAACCT TGTTGGTCCA AAATGCGAAC CCAGA7TGTA AGACTATTTT AAAAGCATTG GGACCAGCGG 1192275 14 CTACACTAGA AGAAATGATG ACAGCATGTC AGGGAGTAGG . AGGACCCGGC CATAAGGCAA GAGTTTTGGC TGAAGCAATG AGCCAAGTAA CAAATACAGC TACCATAATG ATGCAGAGAG GCAATTTTAG GAACCAAAGA AAGATGGTTA AGTGTTTCAA TTGTGGCAAA GAAGGGCACA CAGCCAGAAA TTGCAGGGCC

5 Glu Thr He Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro lie Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin lie Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro He Pro Val Gly Glu He Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys He Val Arg Met Tyr 1Q Ser Pro Thr Ser He Leu Asp He Arg Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Τφ Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr He Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Thr Ala Thr lie Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Τφ Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr 2Q Glu Arg Gin Ala Asn Phe Leu Gly Lys lie Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Τφ Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys He Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lys Arg Ala Val Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala He Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Τφ Gly lie Lys Gin Leu Gin Ala Arg He Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly He Τφ Gly Cys Ser Gly Lys Leu Leu Cys Thr Thr Ala Val Pro Τφ Asn Ala Ser Τφ Ser Asn Lys Ser Leu Glu GJn He Τφ Asn His Tbr Thr Τφ Met Glu Τφ Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Phe Asn Ala Val Val Tyr His Ser of een functioneel deel of equivalent daarvan.

6. Recombinant-vector die een DNA-molecule volgens conclusie 4 of 5 omvat en in staat is de expressie van de DNA-sequentie in een verenigbaar eencellig gastheerorganisme te richten.

7. Recombinant-vector volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat deze het plasmide pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 is.

8. Eencellig organisme dat een recombinant-vector volgens conclusie 6 of 7 bevat.

9. Werkwijze voor de bereiding van een eiwit volgens een der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men a. een eencellig organisme dat een recombinant-vector volgens conclusie 6 of 7 bevat, kweekt onder geschikte groeiomstandigheden zodanig dat het eiwit tot expressie wordt gebracht; en b. het eiwit uit de cultuur isoleert en indien gewenst zuivert.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het eencellige organisme een cel van E. coli is en 30 de recombinant-vector het plasmide pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 is.

10 CAGCGTCAAT GACGCTGACG GTACAGGCCA GACAATTATT GTCTGGTATA GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCT ATTGAGGCGC AACAGCATCT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAATCCTGG CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGAT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC TACTTTGCAC CACTGCTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG

11. Werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum, waarbij men a. een eiwit volgens een der conclusies 1-3 merkt;b. het gemeikte eiwit van stap a. laat reageren met een menselijk serummonster en in het reactiemengsel gemerkte eiwit-antiiichaamcomplexen laat 35 ontstaan, ene. de gemerkte eiwit-antilichaamcomplexen van stap b. bepaalt.

12. Werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum, waarbij men a. een eiwit volgens een der conclusies 1-3 op een vaste drager immobiliseert;b. een menselijk serummonster met het geïmmobiliseerde eiwit van stap a. in contact brengt en geïmmobiliseerde 40 eiwit-antilichaamcomplexen laat ontstaan;c. niet gebonden eiwit en antilichamen uit de complexen van stap b. wast; end. de complexen bepaalt door toevoeging van een gemerkt eiwit A van Staphylococcus aureus of een gemerkt tweede anti-menselijk-lgG antilichaam.

13. Weikwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van AIDS-virussen of fragmenten daarvan in menselijk serum of een andere biologische vloeistof, waarbij men: 45 a. een monster van menselijk serum of van een andere biologische vloeistof laat reageren met een bekende titer van antilichamen die zijn opgewekt tegen een eiwit volgens een der conclusies 1-3;b. de antilichamen en het monster met elkaar laat reageren onder vorming van antigen-antilichaamcomplexen in het reactiemengsel; ene. de antigen-antilichaamcomplexen volgens stap b. opspoort.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de antilichamen met enzym gemerkt zijn en de 50 in het reactiemengsel gevormde antigen-antilichaamcomplexen worden opgespoord door middel van enzym gebonden immunosorbent-bepaling.

15. Werkwijze voor de bereiding van antilichamen tegen AIDS-virussen, met het kenmerk, dat men in een zoogdier of een vogel een voldoende hoeveelheid van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 injecteert om tot productie van antilichamen tegen het eiwit aan te zetten en de antilichamen uit het serum van het 55 dier wint.

15 TAATAAATCT CTGGAACAGA TTTGGAATCA CACGACGTGG ATGGAGTGGG ACAGAGAAAT TAACAATTAC ACAAGCTTTA ATGCGGTAGT TTATCACAGT TAA of een functioneel equivalent daarvan omvat.

16. Antilichamen opgewekt tegen een eiwit volgens een der conclusies 1-3.

17. Toepassing van een eiwit voor de bereiding van antilichamen, met het kenmerk, dat men een eiwit 15 192275 volgens een der conclusies 1-3 voor de bereiding van antilichamen tegen AIDS-virussen toepast.

18. Toepassing van een eiwit voor het opsporen van antilichamen, met het kenmerk, dat men eiwit volgens een der conclusies 1-3 voor het opsporen van de aanwezigheid van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum toepast.

19. Eiwit volgens een der conclusies 1-3 bereid volgens de werkwijze van conclusie 9.

20. Antilichamen volgens conclusie 16 bereid volgens de werkwijze van conclusie 15.

21. Testpakket voor de bepaling van antiiichaam tegen AIDS-virus welk testpakket in een houder een eiwit volgens één van de conclusies 1-3 omvat.

22. Een testpakket voor de bepaling van AIDS-virus welk testpakket in een houder antiiichaam gericht 10 tegen AIDS-virus die zijn opgewekt door een eiwit volgens één van de conclusies 1-3 omvat.

23. Een testpakket volgens conclusie 22 welke deeltjes omvat die zijn bekleed met de antilichamen tegen AIDS-virus die zijn opgewekt door een eiwit volgens één van de conclusies 1-3. Hierbij 4 bladen tekening