NL8700795A - Eiwit van het aids-virus. - Google Patents

Description

N034391 1

Eiwit van het AIDS-virus

De uitvinding heeft betrekking op een eiwit dat wordt aangeduid als gag/env, dat het kerneiwit (gag) en het omhullingseiwit (env) omvat 5 van het HTLV-III-virus, de veroorzaker van het verworven afweergebrek (acquired immune deficiency syndrome, AIDS). Dit eiwit wordt bereid door middel van organisch-synthetische werkwijzen of door gebruikmaking van recombinant-DNA-technieken waarbij de vereiste gensequenties door middel van een geschikte DNA-vector in een daarmee verenigbaar eencel-10 lig gastheerorganisme worden ingelast.

De uitvinding heeft verder betrekking op het isoleren en zuiveren van het gag- en env-eiwit en op werkwijzen voor het opsporen van AIDS-antilichamen of -virussen in menselijk serum of andere biologische vloeistoffen en voor de immunoprofylactische bescherming van mensen 15 tegen AIDS, op basis van het gebruik van het eiwit.

In 1985 werd bij bijna 8.000 mensen AIDS vastgesteld en sindsdien is het aantal gestaag toegenomen. Verwacht wordt dat in 1986 nog eens 15.000 gevallen worden gediagnostiseerd en dit aantal zou in 1987 wel eens opnieuw kunnen verdubbelen [New York Times Magazine, 2 maart 1986, 20 blz. 42]. AIDS is gekenmerkt door het optreden van zware opportunistische infecties na een effect op het afweersysteem van het lichaam [Gottlieb e.a., New. Eng. «J. Med. 305, 1425 (1981)]. De aandoening is gevonden bij homosexuele mannen, patiënten die bloedprodukten krijgen toegediend, spuitverslaafden en personen afkomstig van Haiti en Midden-25 Afrika [Piot e.a., Lancet 11, 65 (1984)].

Vermoed werd dat de veroorzaker van virale oorsprong was omdat het epidemiologische patroon van AIDS overeenstemde met dat van een overdraagbare ziekte. Tenminste drie retrovirussen zijn geïsoleerd'uit gekweekte T-cellen van verscheidene~AIDS-patiënten of uit witte 30 bloedlichaampjes van mensen met kans op de ziekte. Er werd een nieuw menselijk retrovirus dat met lymfadenopathie geassocieerd virus (LAY) werd genoemd ontdekt en de eigenschappen daarvan stemden overeen met een ziekte veroorzakende rol bij AIDS. Het virus werd geïsoleerd uit een patiënt met lymfadenopathie en vandaar de naam [Montagnier e.a.

35 in Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C. Gallo e.a. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, blz. 363-370 (1984)].

Ook zijn andere mensélijke retrovirussen geïsoleerd, in het bijzonder twee deelgroepen van het menselijk T-cel leukemie/lymfoom/lymfo-tropisch virus, typen I [Poiesz e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 40 7415 (1980)] en III [Popovic e.a., Science 224, 497 (1984)]. Nog een 8700793 f 2 ander virus, het met AIDS-geassocieerde retrovirus (ARV) genaamd, is als veroorzaker voorgesteld [Levy e.a., Science 225, 840 (1984)]. Zowel het HTLV-III als het ARY retrovirus vertonen soortgelijke biologische en seroepidemiologische eigenschappen als LAV [Levy e.a., zie boven, 5 Popovic e.a., zie boven]. Er zijn dus tenminste drie retrovirussen gepostuleerd als veroorzaker van AIDS: LAV, ARV en HTLV-III. Voor deze aanvrage worden deze virussen tezamen aangeduid als de AIDS-virussen. Aangezien HTLV-III het prototypische virus voor deze groep is dienen onder de term "antigene determinant overeenkomend met de sequenties van 10 een eiwit van een HTLV-III-virus" feitelijk te worden verstaan de sequenties van de eiwitten van elk van de AIDS-virussen.

Een oorzaak van de moeilijkheid de werkelijke veroorzaker van AIDS te bepalen was de reactiviteit van verschillende retrovirale anti genen met serummonsters van AIDS-patiënten. Zo bleken serummonsters van 15 AIDS-patiënten te reageren met anti genen van zowel HTLV-I [Essex e.a., Science 220, 859 (1983)] als HTLV-III [Sarngadharan e.a., Science 224, 506 (1984)]. Omhul!ings-genprodukten van HTLV vertoonden antigeni-teiten die kruiselings reactief waren met antilichamen in serums van volwassen T-cel-leukemie-patiënten [Kiyokawa e.a., Proc. Natl. Acad.

20 Sci. U.S.A., _81, 6202 (1984)]. T-cel leukemie bij volwassenen (ATL) verschilt van AIDS doordat HTLV-I kwaadaardigheid van T-cellen veroorzaakt, gekenmerkt door een ongeremde groei van T-cellen. Bij AIDS vindt er in plaats van cel groei cel afsterving plaats. Dit cytopatische kenmerk van HTLV-III was essentieel voor het uiteindelijk kunnen bepalen 25 van de specifieke retrovirale oorsprong van de ziekte.

De veroorzaker van AIDS werd geïsoleerd door gebruikmaking van geïmmortaliseerde menselijke neoplastische T-cellijnen (HT) geïnfecteerd met het voor AIDS kenmerkende cytopatische retrovirus dat uit aan AIDS lijdende patiënten werd geïsoleerd. Seroepidemiologisch 30 onderzoek met dit virus toonde een volledige correlatie aan tussen AIDS en de aanwezigheid van antilichamen tegen virale anti genen van HTLV-III [Montagnier e.a., zie boven; Sarngadharan e.a., zie boven; Schiipbach e.a., Science 224, 503 (1984)]. Bovendien werd gevonden dat bijna 85¾ van de patiënten met lymfadenopathiesyndroom en een belangrijk deel 35 van de asymptomatische homosexuele mannen in gebieden met endemisch AIDS circulerende antilichamen tegen HTLV-III droegen. Deze gegevens bij elkaar wijzen op HTLV-III als de belangrijkste veroorzaker van AIDS.

Totdat het AIDS-virus met gebruikmaking van de H-9 cellijn met 40 succes werd gekweekt, was het env-AIDS-eiwit van het AIDS-virus niet 8700795 .................

3 geïsoleerd, gekarakteriseerd of gesynthetiseerd. D1t was grotendeels een gevolg van het feit dat het virus cytopatisch 1s en Isolering van het virus niet moge!ijk was [Popovic e.a., zie boven]. Toen eenmaal een menselijke T-cellijn was ontdekt die tegen de cytopatische effecten van 5 het virus bestand was, kon het moleculair klonen van proviraal DNA van AIDS worden uitgevoerd.

De behoefte aan gevoelige en snelle methoden voor de diagnose van AIDS in menselijk bloed en andere biologische vloeistoffen en voor een methode voor het voorkomen van de ziekte door vaccinatie is zeer groot. 10 Vrijwel alle thans beschikbare bepalingen en proeven zijn behept met fouten. Het Center for Disease Control (COC) heeft te kennen gegeven dat de thans beschikbare tests uitsluitend dienen te worden gebruikt voor het testen van eenheden bloed op de aanwezigheid van anti lichamen tegen HTLY-III. Het COC is zelfs nog verder gegaan door te verklaren IS dat de thans beschikbare tests voor enzymgebonden immunosorptiebepaling (ELISA) niet dienen te worden gebruikt voor algemeen onderzoek van populaties met hoog risico of als diagnostische test voor AIDS [Federal Register 50(48), 9909, 12 maart 1985].

De fouten in voorheen gebruikte AIDS-tests zijn teruggevoerd op 20 het niet gebruiken van een specifiek anti geen eiwit van de veroorzaker van AIDS. De vroeger gebruikte eiwitten waren afkomstig van een viraal lysaat. Aangezien het lysaat bereid is uit met het virus geïnfecteerde menselijke cellen, d.w.z. met cellen waarin het virus is gekweekt, zal het lysaat zowel menselijke als virale eiwitten bevatten. Bereiding 25 van een zuiver antigeen van viraal eiwit is zeer moeilijk. De tot nu toe gebruikte antigenen produceren daarom zowel ten onrechte positieve als ten onrechte negatieve resultaten [Budiansky, Nature 312, 583 (1984)]. De fouten als gevolg van het gebruik van dergelijke lysaatei-witten/peptiden zouden kunnen worden vermeden door gebruikmaking van 30 een samenstelling voor het binden van AIDS-antilichamen die zo goed als geen niet voor AIDS specifieke eiwitten bevat. Samenstellingen van vrijwel zuiver omhullings- en kerneiwit van AIDS kunnen als antigenen worden gebruikt.

Zowel de omhullings- als de kerneiwitten van HTLV-III hebben anti-35 gene determinanten behouden waarmee het mogelijk zou moeten zijn onderzoek te doen naar de aanwezigheid van AIDS-virussen, deze vast te stellen en/of er door vaccinatie bescherming tegen te bieden. Elk individu dat aan HTLV-III is blootgesteld en derhalve het gevaar loopt AIDS op te doen of de ziekte heeft, kan worden herkend aan de hand van de aan-40 wezigheid in het bloed van antilichamen voor het virale kerneiwit (gag) 8700733 Ϋ s 4 en/of het omhul!ingseiwit (env), [Sarngadharan e.a., Science 224, 506 (1984) ].

De beschikbaarheid van een betrouwbare en gevoelige test op de aanwezigheid in het bloed of in andere biologische vloeistoffen, van 5 het AIDS-virus zelf of van deeltjes daarvan is ook van belang. Groopman e.a. [Blood 66, 742 (1985)] hebben gemeld dat antilichamen tegen AIDS-virussen niet altijd in het bloed van AIDS-slachtoffers aanwezig zijn. Zij hebben een patiënt met AIDS en een andere met verwante aandoeningen (ARC) onderzocht en van hen bloedmonsters genomen die negatief op 10 antilichamen waren maar waaruit wel HTLV-III kon worden gekweekt.

De recombinant DNA-technologie wordt sinds kort op het AIDS-pro-bleem toegepast. Van de moleculaire kloning en expressie van het env-gen van HTLV-III is melding gemaakt [Crowl e.a., Cell 41, 979 (1985) ; Chang e.a., Biotechnology _3> 905 (1985)]. Dowbenko e.a. [Proc. 15 Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7748 (1985)] hebben het kerneiwit van HTLV-III in E. coli tot expressie gebracht.

Als gevolg van het gebruik van dergelijke genetische technieken zijn gezuiverde virale anti genen beschikbaar gekomen die veilig, betrouwbaar en goedkoper te bereiden zijn. Gunstiger nog zou echter de 20 beschikbaarheid van een viraal eiwit zijn met antigene determinanten die zowel op het env- als op het gag-eiwit aanwezig zijn. Een dergelijk eiwit zal een bijzonder krachtig instrument zijn voor het opsporen van AIDS-antilichamen en zou kunnen dienen als basis voor een reeks gevoelige diagnostische tests en voor een mogelijk vaccin tegen het AIDS-vi-25 rus.

Daarom is er een nieuw eiwit, aangeduid als gag/env, met een met tenminste een antigene determinant van een HTLV-III gag-eiwit en van een HTLV-III env-eiwit overeenkomende aminozuursequentie verschaft, waarmee onderzoek ("screening") kan worden uitgevoerd naar de aanwezig-30 heid van het AIDS-virus, deze aanwezigheid kan worden vastgesteld en/of door vaccinatie bescherming tegen het virus kan worden geboden. Het nieuwe gag/env-eiwit kan worden weergegeven door het geheel of een gedeelte van de in figuur 2 afgebeelde aminozuursequentie of een functioneel equivalent daarvan.

35 De uitvinding verschaft verder de vereiste DNA-sequenties die voor het gag/env-polypeptide volgens de uitvinding coderen, recombinant-vectoren die dergelijke DNA-sequenties bevatten en eencellige organismen die bruikbaar zijn voor de bereiding door middel van recombinant DNA-technologie van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding alsmede werk-40 wijzen voor de bereiding van dergelijke DNA-sequenties, recombinant- 87 0 0 7 9 5 λ i 5 vectoren en eencellige organismen. Daarnaast worden methoden beschreven voor de expressie en isolatie van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding. Het alsdus bereide gag/env-eiwit kan volgens werkwijzen van de uitvinding worden gebruikt voor een aantal belangrijke immunologische 5 processen.

Als diagnostisch reagens kan het gag/env-eiwit worden gebruikt voor het opsporen van de aanwezigheid van antilicharaen tegen AIDS-vi-russen in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen zoals tranen» zaad, vaginale afscheiding en speeksel. Omdat het eiwit in ho-10 mogene vorm kan worden bereid, worden problemen met niet-specifieke reacties die in het verleden het gebruik van diagnostische middelen op basis van betrekkelijk ruwe eiwitfracties van HTLV-III-virussen teisterden, vermeden.

Als immunogen kan het gag/env-eiwit worden gebruikt voor het pro-15 duceren van antilichamen in dieren tegen daarin aanwezige anti gene determinanten. Dergelijke antilichamen kunnen op hun beurt, in samenhang met het gag/env-eiwit dat op geschikte wijze is gemerkt, worden gebruikt in een radioimmunoassay (RIA) of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het opsporen van de aanwezigheid van HTLV-III-virussen 20 of deeltjes daarvan in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen zoals tranen, zaad, vaginale afscheiding en speeksel. Deeltjes (of brokstukken) die aldus kunnen worden aangetoond zijn uiteraard ondermeer stukken van de virale kern- of omhul!ingseiwftten.

Het gag/env-eiwit volgens de uitvinding kan, door opneming in een 25 geschikte vaccinsamenstelling, verder worden gebruikt ter bestrijding van de verspreiding van AIDS door middel van preventieve immunisatie.

Belangrijke voordelen zijn verbonden aan het gebruik van het gag/env-eiwit volgens de uitvinding vergeleken met het gebruik van de gag/env-eiwitten afzonderlijk. Het env-eiwit zelf is zeer slecht oplos-30 baar waardoor zuivering moeilijk is. Combinatie van de twee eiwitten leidt tot een produkt dat gemakkelijker op te lossen is en derhalve eenvoudiger kan worden gezuiverd. Produktie en zuivering op grote schaal worden uiteraard ook vereenvoudigd omdat slechts een enkele verbinding behoeft te worden geïsoleerd. Tenslotte opent het gag/env-ei-35 wit de mogelijkheid een diagnostisch pakket (kit) te ontwikkelen dat in een antigen-sandwich bepaling beter functioneert dan afzonderlijke gag-en env-eiwitten.

Opgemerkt dient te worden dat, hoewel het gag/env-eiwit werd verkregen uit HTLV-III, de hier bechreven diagnostische en immunoprofylac-40 tische methoden toepasbaar zijn op de opsporing van elk ander viraal 8700755 ΐ 6 agens dat zich bij AIDS voordoet of daarmee in verband is gebracht zoals het met lymfadenopathie geassocieerde virus (LAV) en het met AIDS geassocieerde retrovirus (ARV). De grond hiervoor is dat Crowl e.a. [Cell 41, 979 (1985)] hebben aangetoond dat eiwitten van deze virale 5 agentia immunologisch verwant zijn met die van HTLV-III en daarmee ami-nozuursequentiesegmenten gemeen hebben.

De uitvinding kan worden toegelicht op basis van de volgende uitvoerige beschrijving in samenhang met de figuren.

Figuur 1 is een schematische weergave van expressieplasmi den die ^ de synthese van gag-(boven) en gag/env-(onder)eiwitten richt. De restrict! e-endonuclease-plaatsen die de gag- en env-genen karakteriseren zijn aangegeven en het gearceerde gedeelte duidt het env-segment aan van het gag/env-fusiegen. In beide piasmiden wordt de transcriptie geregeld door de ^ P[_ promotor en zijn de translatie-startsignalen af-komstig van het piasmi de pEV-vrf2.

Figuur 2 geeft de nucleïnezuursequentie van het gag/env-fusiegen weer (waarbij bepaalde positienummers en restrictie-endonuclease-plaatsen zijn aangegeven), alsmede de aminozuursequentie van het gag/env-eiwit zoals daaruit voorspeld.

^ Figuur 3 geeft de resultaten weer van SDS-polyacrylamide-gel-elec- troforese van het in E. coli geproduceerde gag/env-eiwit. Paneel 1 toont Coomassie-blauw gekleurde totale-celeiwitten uit cellen die het recombinantplasmide met daarin het gag/env-fusiegen herbergen en van controlecellen. Panelen 2 en 3 zijn Western blots van totale-celeiwit ^ gesondeerd met konijn-antilichamen tegen env-peptide 500-511 (paneel 2) of schaap-antilichamen tegen gag p24 (paneel 3). De immuun-complexen op panelen 2 en 3 werden zichtbaar gemaakt met een tweede met mierikpero-xidase gemerkt antilichaam. Bij alle drie panelen duidt g/e op het gag/env-eiwit en c op een negatief controlemonster dat werd gebruikt ^ voor het aantonen van de specificiteit. De door molecuulgewichtstan-daarden (in kD) afgelegde afstand is weergegeven en de positie van de band van het gag/env-eiwit op de gelen is met de pijlen aangeduid.

De werkwijzen volgens de uitvinding houden een aantal stappen in en wel, in logische volgorde: (1) identificatie en isolering van de ge- 3c 3 nen die de gag- en env-eiwitten of fragmenten daarvan coderen, (2) inlassing van deze genen of genfragmenten in een geschikte klonende drager ter bereiding van een recombinant-vector die een gag/env-fusiegen bevat, (3) overdracht van de recombinante klonende drager naar een verenigbaar eencellig gastheerorganisme, (4) selectie en kweek van aange-40 paste gastheren die de ingelaste gensequenties kunnen repliceren en tot 87 0 0 7 S 5""................

Λ * 7 expressie kunnen brengen, (5) Identificatie en zuivering van het gen-produkt, (6) toepassing van het genprodukt voor het opsporen van anti-lichamen tegen HTLV-III of verwante virussen of als immunogeen voor de bereiding van antilichamen die op hun beurt weer kunnen worden gebruikt 5 voor het opsporen van de virussen zelf of van fragmenten daarvan in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen, (7) toepassing van het gag/env-eiwit in een vaccinpreparaat voor eventuele immunopro-fylactische bescherming tegen AIDS.

Geïsoleerde HTLV-ΠΙ virionen zouden kunnen worden gebruikt als 10 bron zowel voor de gag- als voor de env-genen volgens de uitvinding.

Dowbenko e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 812, 7748 (1985)] hebben bijvoorbeeld een fragment yan 2,2 kilobase (kb) van het 5'-gebied van het virale genoom gebruikt als bron van het gag-gen. In plaats daarvan kan genomisch DNA uit cellen waarin het provirale genoom van HTLV-III 15 is opgenomen, de genbron zijn [Shaw e.a., Science 226, 1165 (1984)].

Crowl e.a. [Cel! 41, 979 (1985)] hebben dergelijk genomisch DNA uit met HTLV-III geïnfecteerde H9-cellen gebruikt voor het verkrijgen van het env-gen.

Alternatieven voor het isoleren van de gag- en env-genen zijn on-20 der meer de chemische synthese van de gensequenties en de bereiding van DNA dat complementair is aan het uit de genen gevormde boodschapper-RNA.

Ongeacht de herkomst kan DNA dat de gag- en env-eiwitten codeert in bacteriën worden gekloond en kunnen de gag- of env-genen bevatten-25 de klonen kenbaar worden gemaakt met in de techniek bekende methoden. Bijvoorbeeld kunnen complementaire DNA(cDNA)-sondes uit de genen worden bereid en worden gebruikt voor het opsporen van de klonen die de genen dragen door middel van hybridisatietechnieken.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding werd een geno-30 menbibliotheek die door Xbal afbraak van het DNA van de hierboven beschreven met HTLV-III geïnfecteerde H9-cellen is opgebouwd, met behulp van een faag"X - vector gekloond en werden de klonen die het HTLV-III provirale genoom droegen geïdentificeerd door hybridisatie met HTLV-III cDNA. Een van die klonen werd aangeduid als AhXB-3 en er werd 35 een fragment van 1700 base-paren dat het grootste deel van het gag-pre-cursor-eiwit codeert geïsoleerd door Clal/HincII afbraak van het DNA uit deze kloon.

De in de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding gebruikte directe bron van env-gensequenties was een derivaat van piasmi de pEV3/env 40 44-640 dat env-codonen had overeenkomende met de verwijderde residuen 8700795 i i 8 514-524* Verrassenderwijs is het gevolg van deze verwijdering een belangrijke toename van de expressie van het env-gen. Env-sequenties die de codonen 467-640 bevatten werden verkregen door middel van splitsing met BglII/HindlII van plasmide pEV3/env 44-640.

5 Eenmaal geïdentificeerd en geïsoleerd, worden de gag- en env- genen van HTLV-III ingevoegd in een geschikte expressiedrager die de voor transcriptie en translatie van de ingevoegde gensequenties benodigde elementen bevat. Bruikbare klonende dragers kunnen bestaan uit segmenten van chromosomale, niet-chromosomale en synthetische DNA-se-10 quenties zoals verschillende bekende bacteriële plasmiden, faag-DNA, combinaties van plasmiden en faag-DNA's zoals plasmiden die voor het gebruik van faag-DNA of andere expressie regulerende sequenties zijn aangepast, of gistplasmi den. Bijzondere klonende dragers die zouden kunnen worden gebruikt zijn, onder meer, de pEV-vrf-plasmi den (pEV-vrf-15 1, -2 en -3), SV40, adenovirus, gist, lambda-gt-WES-lambda B, Charon 4A en 28, lambda-gt-l-lambda B, van M13 afgeleide vectoren zoals pUC8, 9, 18 en 19, pBR313, 322 en 325, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYC184, pUBllO, pMB9, ColEl, pSClOl, pml21, RSF2124, pCRl of RP4.

De invoeging van de gag- en env-genen in een klonende vector ge-20 schiedt gemakkelijk wanneer zowel de genen als de gewenste klonende drager zijn geknipt met hetzelfde restrict!e-enzym of -enzymen, omdat daarbij complementaire DNA-einden worden gevormd. Als dat niet mogelijk is, kan het nodig zijn de geproduceerde knipeinden te modificeren door enkelstrengig DNA terug te digereren tot afgekante einden of door het-25 zelfde resultaat te verkrijgen doordat de enkelstrengige uiteinden met een geschikte DNA-polymerase worden opgevuld. Alsdus kan binding van het afgekante einde worden uitgevoerd met een enzym zoals T4 DNA-liga-se. In plaats daarvan kan elke geschikte positie worden verkregen door koppeling van nucleotide-sequenties (linkers) op DNA-einden. Dergelijke 30 linkers kunnen specifieke oligonucleotide-sequenties omvatten die her-kenningssequenties voor het restrict!egebied coderen. De gesplitste vector en de gag- en env-genfragmenten kunnen ook worden gemodificeerd door homopolymere staartvorming ("tailing") zoals beschreven door Morrow [Methods in Enzymology 68, 3 (1979)].

35 Wanneer eenmaal hetzij het gag- of env-gen hetzij een fragment daarvan in een geschikte klonende drager is ingevoegd kan het andere gen of genfragment in de drager worden aangebracht door voorzichtige splitsing met restrictie-endonuclease, zodat het tweede gen of genfragment naast het eerste terechtkomt en een fusiegen ontstaat. Uiteraard 40 kan het fusiegen, indien de gag- en env-genen chemisch worden bereid, 8700795...........................

i i 9 rechtstreeks worden geproduceerd en als enkel DNA-fragment in de klonende drager worden ingevoerd.

In de voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding werd het Cl al /Hindi digestief ra gment met daarin het eerder beschreven gag-gen 5 van HXB-3 gekoppeld in pEV-vrf2 dat met Cl al en PuvII was gesplitst onder vorming van een recombinant-expressie-plasmide pEY/gag 15-512 (fig. 1, boven) dat de synthese van een eiwit van 56 Kd dat de gag-re-siduen 15-512 omvatte richtte. De gag-sequenties voorbij een BglII gebied in de buurt van residu 437 werden vervolgens met env-sequenties 10 herschikt in een BglII/HindlII fragment uit het bovenbeschreven derivaat van piasmide pEY/env 44-640 (waaruit de residuen 514-524 waren verwijderd) waarbij plasmi de pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 dat het gag-env-fusiegen droeg werd gevormd (fig. 1, onder).

Een volledige beschijving van deze constructie is te vinden in het 15 voorbeeld, in het bijzonder bij de onderdelen B-E. De nuclefnezuurse-quentie van het gag/env-gen volgens de voorkeursuitvoeringsvorm [bepaald met de chemische splitsingsmethode van Maxam e.a., Methods in En-zymology 65, 499 (1980)] en de op grond daarvan voorspelde aminozuur-volgorde van het gag/env-eiwit zijn afgebeeld in figuur 2.

20 Veel van de in de uitvinding bruikbare klonende dragers bevatten een of meer kenmerkende werkingen die gebruikt kunnen worden voor het selecteren van gewenste transformanten zoals resistentie tegen ampicil-line en tetracycline in pBR322, resistentie tegen ampicilline en B-ga-lactosidase-activiteit in pUC8 en ampicilline-resistentie in pEV-vrf2.

25 Selectie van gastheercellen waarin dergelijke vectoren zijn ingevoegd wordt aanzienlijk vergemakfcelijkt wanneer de gastheercellen zelf de door de vectoren aangedragen werkingen missen.

Opgemerkt dient te worden dat de nucleotide-sequenties van de op een bepaalde plaats in een klonende drager ingevoegde gag- en env-gen-30 fragmenten nucleotiden kunnen bevatten die geen deel uitmaken van de feitelijke structurele genen. Andersom is het mogelijk dat genfragmenten slechts een deel van de volledige genen bevatten. Het enige dat vereist is, is dat de in de klonende drager ingevoegde genfragmenten in staat zijn de produktie in een geschikt gastheerorganisme van een poly-35 peptide of een eiwit met tenminste een anti gene determinant die overeenkomt met de sequenties van de gag- en env-eiwitten te richten.

De selectie van een geschikt gastheerorganisme wordt medebepaald door een aantal bekende factoren. Deze factoren zijn onder meer bijvoorbeeld de verenigbaarheid met de gekozen vector, de toxiciteit van 40 de door het hybride plasma gecodeerde eiwitten, het gemak waarmee het 8700795 ï 10 gewenste eiwit wordt gewonnen, de expressiekenmerken, de biologische veiligheid en de kosten. Tussen deze factoren moet het juiste evenwicht worden gevonden en daarbij moet in aanmerking worden genomen dat niet alle gastheren even doeltreffend een bepaald recombinant DNA-molecuul 5 tot expressie brengen.

Geschikte eencellige gastheerorganismen die volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt zijn, onder meer, zoogdier- en gistcellen en bacteriën zoals Escherichia coli, Bacillus subtil1s, Bacillus stearo-thermophilus en Actinomyces. De door Casadaban e.a. [J. Mol. Biol. 138, 10 179 (1980)] beschreven stam MC1061 van E. coli is even goed te gebruiken als elke andere stam van E. coli K-12 die het plasmide pRK248cIts bevat. Het plasmide pRK248cIts voor gebruik in andere E. coli K-12 stammen is vrij beschikbaar uit de American Type Culture Collection (ATCC) en heeft toegangsnummer ATCC 33766. De E. coli stam MC1061 is 15 ook bij de ATCC gedeponeerd (toegangsnummer ATCC 53338) en is ook op verzoek vrij beschikbaar.

Overbrenging van de recombinante klonende vector naar de gastheercel kan op verscheidene manieren geschieden. Naar gelang van het gekozen vector/gastheercel systeem kan die overbrenging plaatsvinden door 20 transformatie, transductie of transfectie. Zodra een gemodificeerde gastheercel wordt geproduceerd kan de cel worden gekweekt en kan het eiwitexpressieprodukt uit de kweek worden geïsoleerd.

Bij produktie in E. coli is het gag/env-eiwit grotendeels beperkt tot cytoplasmische insluitingslichamen (onoplosbare eiwitaggregraten) 25 van de bacterie, waardoor de zuivering van het eiwit belangrijk wordt vergemakkelijkt. Ter isolatie van het gag/env-eiwitprodukt volgens de uitvinding worden de bacteriële cellen bij voorkeur opengebroken of ontbonden en wordt het onoplosbare eiwit door centrifugeren gewonnen. Een aanzienlijke zuivering kan worden verkregen door achtereenvolgens 30 wassen van het neerslag met toenemende concentraties ureum gevolgd door toepassing van standaardwerkwijzen voor de zuivering van eiwitten.

Voor geringe hoeveelheden materiaal zoals monsters voor polyacryl-amidegel-electroforese-analyse kunnen de cellen worden opengebroken door behandeling met een detergent zoals natriumdodecylsu.lfaat (SDS).

35 Grotere hoeveelheden van het eiwit kunnen het best worden gewonnen met behulp van gel uidstriHingen of met andere mechanische splitsingstechnieken zoals de Franse drukcel.

Cel verbreking kan ook geschieden langs chemische of enzymatische weg. Aangezien voor de instandhouding van het celmembaan dikwijls twee-40 waardige kationen vereist zijn, kan behandeling met geschikte chelaat- 8700795 * * 11 vormende middelen zoals EDTA of EGTA voldoende openbreking geven om het uitlekken van het eiwit uit de cellen te vergemakkelijken. Ook zijn enzymen zoals lysozym voor dit doel gebruikt. Dat enzym hydrolyseert het peptidoglycanskelet van de celwand. Ook kan beurtelings bevriezen en 5 ontdooien in combinatie met behandeling met lysozym worden toegepast.

Wanneer het gag/env-eiwit uit de cel is bevrijd, kan het volgens elke bekende methode in het mengsel worden aangetoond. Bijvoorbeeld kan er een radioimmunoassay (RIA) of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) worden uitgevoerd onder gebruikmaking van antilichamen tegen 10 het eiwit. Bij voorkeur wordt het eiwit geïdentificeerd door middel van electroforese met SOS op polyacrylamidegel gevolgd door Western blot of soortgelijke analyse.

Het gag/env-eiwit volgens de uitvinding kan worden geconcentreerd door neerslaan met zouten zoals natrium- of ammoniumsulfaat, door ul-15 trafiltreren of door gebruikmaking van andere voor de deskundige bekende methoden. Verdere zuivering kan worden verkregen door gangbare ei-witzuiveringstechnieken zoals, onder meer, gel filtratie, ionenuitwisse-lingschromatografie, preparatieve schijfgel- of gordijnelectroforese, isoelektrische concentratie, fractionering met een organisch oplosmid-20 del bij lage temperatuur of tegenstroomverdeling.

Omdat het gag/env-eiwit anti gene determinanten van twee belangrijke componenten van het HTLV-III-virus bevat en omdat dit virus de belangrijkste veroorzaker bij AIDS is en immunologisch verwant is met de overige virale agentia die een rol spelen bij of in verband gebracht 25 zijn met AIDS of ARC, is het eiwit een krachtig diagnostisch instrument voor de opsporing van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum, De fusie kan op talrijke bekende wijzen voor dit doel worden gebruikt.

Het gag/env-eiwit kan bijvoorbeeld op een of andere wijze worden 30 gemerkt, het gemerkte eiwit kan dan aan een menselijk serummonster waarvan wordt vermoed dat het antilichamen tegen AIDS-virussen bevat worden toegevoegd onder vorming van gemerkte complexen van fusie-eiwit en antilichamen en de aldus gevormde complexen kunnen op geschikte wijze worden gedetecteerd. In een ander voorbeeld kan het eiwit op een 35 vaste drager worden geïmmobiliseerd en vervolgens met het menselijke serummonster in contact worden gebracht. Antilichamen tegen AIDS-virus-sen in het monster zullen zich dan met het geïmmobiliseerde eiwit binden en de aldus gevormde complexen kunnen dan, nadat niet-gecomple-xeerde eiwitten en antilichamen uitgewassen zijn, met behulp van een 40 reagens zoals Staphylococcus aureus eiwit A (gemerkt met b.v. jodium- 8700795 ï > 12 125) worden ontdekt. Veel variaties van deze mogelijkheden, waarvan er hieronder enkele worden aangegeven, zullen de deskundigen duidelijk zijn.

Op basis van het gebruik van anti lichamen tegen het gag/env-eiwit 5 kan een reeks diagnostische tests voor de aanwezigheid van AIDS-virussen of deeltjes daarvan in menselijk serum of in andere biologische vloeistoffen worden ontworpen. Die anti lichamen kunnen worden geproduceerd door injectie bij een zoogdier of een vogel van een voldoende hoeveelheid van een vaccinsamenstelling die het eiwit en een daarmee 10 verenigbare farmaceutische drager omvat ten einde de produktie van anti! ichamen tegen het eiwit op gang te brengen. De vereiste geschikte hoeveelheid eiwit is de deskundige bekend of kan op gebruikelijke wijze proefondervindelijk worden bepaald. In verband met de uitvinding kunnen onder de term "farmaceutische drager" worden verstaan hetzij de stan-15 daardsamenstellingen die geschikt zijn voor toediening aan de mens of de gangbare bij diervaccinaties gebruikte adjuvantia.

Geschikte adjuvantia voor het vaccineren van dieren zijn onder meer Freund's onvolledig of volledig adjuvans (niet geschikt voor gebruik bij de mens of bij vee), adjuvans 65 (dat arachide-olie, mannide-20 mono-oleaat en aluminiummonostearaat bevat) en minerale gelen zoals aluminiumhydroxide, aluminiumfosfaat en aluin; oppervlakte-actieve stoffen zoals hexadecylamine, octadecyfamine, lysolecithine, dimethyl-dioctadecylammoniumbromide, N,N'-dioctadecyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-propaandiamine, methoxyhexadecylglycerol en "pluronic"-polyolen; poly-25 anionen zoals pyran, dextransulfaat, poly-IC, polyacrylzuur, carbopol; peptiden zoals muramyldipeptide, dimethyl glycine, tuftsin; en olie-emulsies. Het gag/env-eiwit kan ook worden toegediend na opneming in liposomen of andere microdragers of na koppeling met polysacchariden, andere eiwitten en andere polymeren.

30 Typerend wordt de eerste vaccinering na enige weken gevolgd door een of meer "versterkings"-vaccinaties waarvan het netto effect is de produktie van hoge concentraties anti!ichamen tegen het gag/env-eiwit, die op de gebruikelijke wijze kunnen worden gewonnen.

Uiteraard kunnen monoklonale anti!ichamen tegen het eiwit volgens 35 de huidige technologie worden geproduceerd om tot hetzelfde resultaat te komen. Somatische cellen met het vermogen anti!ichamen te produceren zoals B-cellen kunnen worden gefuseerd met myeloom-cellijnen en dan hy-bridoomcellen produceren. Deze cellen kunnen in vitro of als ascites-tumoren oneindig worden gekweekt waardoor grote hoeveelheden specifieke 40- antilichamen worden gevormd. Aangezien hybridoomcellen gemakkelijk kun- 87 0 0 7 9 Λ * 13 nen worden gekloond is het mogelijk snel grote aantallen cellen te produceren die alle dezelfde specifieke anti!ichaammolecu!en, gericht op een gemeenschappelijke antigene determinant, produceren. Deze uitzonderlijke uniformiteit in antilichaamproduktie kan voordelig zijn wan-5 neer de antilichamen in specifieke diagnostische tests moeten worden gebruikt.

Lymfknobbels en milten van dieren geïnjecteerd met een antigen zijn geschikte bronnen van B-cellen, al is het even goed mogelijk deze cellen uit ongesensibiliseerde dieren te verwijderen en ze na isolatie 10 in vitro te injecteren. Veel gebruikt bij de produktie van hybridoom zijn B-lymfocyten van muis en rat, maar in plaats daarvan kunnen ook cellen van konijnen, mensen, kikkers en andere dieren worden gebruikt.

Er zijn tal van gespecialiseerde myeloom-cellijnen ontwikkeld uit lymfocytische tumoren voor gebruik bij de hybridoomproduktie [Köhler 15 en Mil stein, European J. Immunol . 6, 511 (1976); Shu!man e.a., Nature 276, 269 (1978)]. Van de geproduceerde cellijnen worden P3/X63-Ag 8, P3/NSI/l-Ag 4-1, Sp2/0-Agl4 en S194/5.XX0.BU.1 vaak gebruikt.

De fusie van de antilichaam producerende milt- of lymfknobbelcellen met myeloomcellen voor de produktie van hybridomen geschiedt ge-20 woon!ijk met een overmaat splenocyten of lymfocyten ten opzichte van de myeloomcellen, welke overmaat tot 20:1 kan bedragen, al worden meestal lagere verhoudingen gebruikt. Fusie wordt vergemakkelijkt bij gebruik van een fusie-hulpmidde! zoals met UV gedeactiveerd Sendai virus of po-lyethyleenglycol (PEG). Gefter e.a. [Somatic Cell Genet. 3, 231 (1977)3 25 hebben gemeld dat combinatie van dimethyl sulfoxide met PEG de cel fusie verder versnelt. Er zijn ook elektrische inrichtingen beschikbaar die cellen met een uitzonderlijk hoge doelmatigheid kunnen fuseren.

Wanneer de fusie eenmaal heeft plaatsgevonden moeten de hybridoom-cell en uit de niet-gefuseerde moeder-celstammen worden geselecteerd.

30 Deze selectie kan vlot plaatsvinden wanneer de cellen worden gekweekt in een medium dat de groei van hybridoomcellen wel maar die van moedercellen niet steunt. De bij de fusie gebruikte somatische B-cellen hebben in cultuur een beperkte levensduur en gaan dus verloren bij veroudering en versterf, maar de moedermyeloomcellen die in cultuur een on-35 beperkte levensduur hebben moeten met speciale selectietechnieken worden verwijderd.

In een veel gebruikt systeem worden myeloomcellen zonder hypoxan-thine-fosforibosyl-transferase (HPRT“) gebruikt. Deze cellen beschikken niet over de vangmogelijkheid voor het hergebruik van vrije hypo-40 xanthine-base en overleven niet indien een remmer zoals aminopterine 8700795 Λ * 14 wordt gebruikt om de nieuwbereiding van purinen te blokkeren. De myelo-me moedercellen kunnen dus worden geselecteerd door het fusiemengsel in een hypoxanthine/aminopterine/thymidine (HAT) medium te kweken, waarbij de hybridoomcellen als gevolg van de bijdrage van HPRT door de antili-5 chaam producerende fusie-moedercellen overleven.

Na een periode van selectiekweek kunnen de overlevende iiybridoom-cellen worden gekloond en kunnen voorraden worden gekweekt volgens standaardcelkweekmethoden en de klonen die de gewenste specifieke immu-noglobulinen produceren kunnen door middel van enzyme-linked immunosor-10 bent assay (ELISA) of met andere proeven die zijn gebaseerd op het gebruik van het antigen waartegen de antilichamen zijn gericht worden gedetecteerd.

De door toepassing van de uitvinding te verkrijgen anti-gag/env-eiwitantilichamen kunnen verder worden gebruikt voor het opstellen van 15 een verscheidenheid aan diagnostische tests voor AIDS-virussen of deeltjes daarvan. Dergelijke diagnostische systemen kunnen de vorm hebben van een radioimmunoassay, hetzij in vrije oplossing hetzij in vaste toestand. In plaats daarvan kunnen ELISA-bepalingen worden verkregen alsmede bepalingen op basis van een immunoblot analyse. Deze bepalingen 20 kunnen direct of indirect zijn, met toepassing van een tweede antili-chaam tegen de anti-gag/env-eiwitantilichamen. Aan de antilichamen kunnen tal van enzymatische werkingen worden gekoppeld, waarbij peroxidase, glucoseoxidase, 8-galactosidase en alkalisch fosfatase slechts enige voorbeelden zijn.

25 Het basisprincipe van deze tests is dat een monster van menselijk serum of van een andere biologische vloeistof waarin de aanwezigheid van AIDS-virussen of fragmenten daarvan wordt vermoed tot reactie wordt gebracht met een bekende titer aan antilichamen tegen het gag/env-eiwit ter vorming van antigen-antilichaamcomplexen. De aldus gevormde comple-30 xen worden met geschikte middelen aangetoond.

De deskundige zal ook inzien dat er vele andere manieren zijn waarop het anti-gag/env-eiwitantiserum diagnostisch kan worden gebruikt zoals in een of meer agglutinatietests. In dergelijke agglutinatiebepa-lingen kan de interactie van antilichamen en AIDS-virussen of virale 35 fragmenten worden opgespoord met behulp van systemen waarin deeltjes zijn bekleed met de anti-gag/env-eiwitantilichamen. Dergelijke deeltjes kunnen latexkralen, liposomen, erytrocyten, polyacrylamidekorrels of andere polymeren zijn.

De hierboven beschreven werkwijze voor het bepalen van AIDS-virus 40 of van antilichamen tegen AIDS-virus kan worden uitgevoerd met een ge- 870 0 795 ·« ·» 15 schikt testpakket dat in een houder het gag/env-eiwit volgens de uitvinding of antilichamen tegen AIDS-virus die zijn opgewekt door het gag/env-eiwit volgens de uitvinding omvat.

Door Crowl e.a. [Cel! 41, 979-986 (1985)] is beschreven dat het 5 serum van alle 50 AIDS patiënten die met genetisch gemanipuleerd env-eiwit waren onderzocht sterk reactief was ten opzichte van het eiwit, dit ondanks het feit dat de helft van de patiënten afkomstig was van de westkust van de Verenigde Staten en de helft van de oostkust.

Dat al de onderzochte serums reactief waren met het env-eiwit betekende 10 dat de virussen die de aldus reagerende antilichamen produceerden, ondanks de geografische scheiding en de waarschijnlijkheid van geringe genetische verschillen, tenminste een gemeenschappelijke of behouden antigene determinant in hun omhullende eiwitten moeten hebben gehad.

Het gag-kerneiwit van het AIDS-retrovirus blijkt bij een hoog per-15 centage individuen die eerder aan een virus waren blootgesteld de vorming van antilichamen op gang te brengen [Montagnier e.a., zie boven; SchÜpbach e.a·, zie boven; Sarngadharan e.a., zie boven].

Samengevat doen de bovengenoemde waarnemingen vermoeden dat het gag/env-eiwit volgens de uitvinding, dat tenminste een antigene deter-20 minant heeft die met de sequenties van de gag- en env-eiwitten waaruit het is opgebouwd overeenkomt, immunogeen is bij de mens en bruikbaar kan zijn als AIDS-vaccin.

Het gag/env-eiwit {geproduceerd op de wijze zoals hier beschreven danwel chemisch gesynthetiseerd) kan derhalve in een vaccinsamenstel-25 ling die het eiwit en een geschikte farmaceutische drager omvat worden gebruikt. Het eiwit kan in een dergelijke samenstelling in de verkregen gezuiverde vorm worden gebruikt of kan meer immunogeen worden gemaakt via in de techniek bekende modificaties. Het eiwit kan bijvoorbeeld in een sterk immunogene matrix worden omgezet door reactie met een verkno-30 pingsmiddel zoals 1,3-dicyclohexylcarbodiimide. Ook kan het eiwit covalent worden gekoppeld met een sterk immunogeen eiwitdragermolecuul, hetzij rechtstreeks hetzij met een geschikt verbindingsmolecuul. Bruikbare dragermolecu!en zijn onder meer patella-hemocyanine en verschillende bacteriële toxoiden (inactieve toxinen) zoals difterietoxoide.

35 Wanneer het gag/env-eiwit is gekoppeld aan een bacterieel toxoide kan een dubbel werkende vaccinsamenstelling worden geproduceerd die bescherming biedt zowel tegen AIDS als tegen de bacterie waaruit het toxoide afkomstig is.

Toedieningswegen, antigendoses, aantal en frequentie van injecties 40 zijn factoren die tot de normale deskundigheid horen.

8700795 16

.................. VOORBEELD

Het hierna volgende is een niet beperkend voorbeeld ter illustratie van de werkwijzen volgens welke een recombinant-vector kan worden geproduceerd die het gag/env-eiwit van het HTLV-III virus codeert. In 5 dit voorbeeld werden de volgende stappen uitgevoerd die in detail worden beschreven: (1) De DNA-sequentie die de residuen 15-512 (alle behalve de eerste 14 amino-eindstandige residuen) van het gag-gen codeert werd uit recombinant faag-kloon λΗΧΒ-3 geknipt en in E. coli expressie- 10 piasmi de pEV-vrf2 gekoppeld onder vorming van piasmi de pEV2/gag 15-512; (2) De DNA-sequenties overeenkomende met de env-aminozuurresiduen 319-331 werden uit expressie-plasmi de pEV3/env 44-640 verwijderd door primer-gerichte mutagenese onder vorming van piasmi de pEV/env 15 44-640 <j> 319-331; (3) Op piasmi de pEV/env 44-640 Δ 319-331 werd primer-gerichte mutagenese uitgevoerd waarbij de nucleotiden die aminozuurresiduen 514-524 coderen werden gedeleteerd en piasmi de pEV3/env 44-640 φ 319-331 Δ 514-524 werd gevormd; en 20 (4) Een restrictie-endonuclease-fragment van het env-gen uit piasmi de pEV/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 dat de env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert werd in gesplitst piasmi de pEV/gag 15-512 gebonden onder vorming van een fusiegen dat gag-residuen 15-436 en env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert in piasmi de pEV2/gag 15-436/env 25 467-640 Δ 514-524.

In elk stadium van de opbouw werden piasmi den gereproduceerd door transformatie in E. coli-stam MC1061 (pRK248cIts).

A. ALGEMENE WERKWIJZEN VOOR DE BEREIDING VAN RECOMBINANT-VECTOREN DNA BEREIDING

30 Isolatie op kleine schaal van plasmide-DNA uit 1 ml verzadigde culturen van een nacht vond plaats volgens de werkwijze van Birnboim e.a. [Nucleic Acids Research 1513 (1979)]. Volgens deze werkwijze kan een geringe hoeveelheid DNA uit een bacteriële kolonie worden geïsoleerd voor analytische doeleinden. Grotere hoeveelheden piasmi de 35 DNA werden bereid met 1-1iter culturen volgens een standaardwerkwijze met centrifugeren met cesiumchloride.

OMSTANDIGHEDEN VOOR ENZYMATISCHE REACTIES

De gebruikte restrict!e-enzymen en het T4 DNA ligase waren produk-ten van New England BioLabs, Beverly, MA, USA. Deze enzymen werden ge-40 bruikt volgens methoden en onder omstandigheden zoals gepubliceerd door 8.7 0 0 79 5 17 de fabrikant.

Voor de restrictie-endonucleasen is een eenheid van activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is voor een volledige omzetting van 1,0 juq DNA in 60 minuten in een totaal reactievolu-5 me van 0,05 ml waarbij de afbraak bij 37*C wordt uitgevoerd. De diges-tiemengsels bevatten naast het te splitsen DNA, 100 yug/ml run-derserum-albumine en de volgende buffercomponenten:

BglII : 100 nW NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 en 10 mM 2-mercaptoethanol (2-ME) 10 Cl al : 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9) en 6 mM MgCl2

Hindi : 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 7 mM MgCl2 en 1 mM dithiotreitol (DTT)

HindlII : 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 10 mM MgCl2

Hpal r 6 mM KC1, 10 nfl Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 en 1 mM DTT

15 PstI : 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 10 mM MgCl2

PvuII : 60 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 en 6 mM 2-ME

Stul : 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2 en

6 mM 2-ME

De T4 DNA-koppeling werd bij 16eC uitgevoerd in een mengsel dat 20 het DNA en 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,0 mM ATP en 50 yug/ml runderserum-albumine bevatte. Een eenheid T4 DNA Tigase-activiteit is gedefinieerd als de hoeveelheid die nodig is om 50% koppeling van HindlII-fragmenten van lambda DNA te verkrijgen in 30 minuten bij 16eC in 20 ytil incubatiemengsel en een concentra-25 tie aan 5’-DNA einden van 0,12 fltH (300 yug/ml).

ZUIVERING VAN DNA-FRAGMENTEN IN AGAROSE

Na de splitsing met restrictie-endonuclease werden DNA-fragmenten voor het klonen geïsoleerd door electroforese in 1% agarose. Na zichtbaarmaking met 1 yug/rnl ethidiumbromide werden plakjes van 30 het gel met daarin de gewenste DNA-fragmenten door een naald maat 21 geëxtrudeerd in 4 ml van een oplossing die 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA en 300 mM NaCl bevatte. Dit mengsel werd vervolgens 3 uur bij -80eC ingevroren, 30 minuten bij 37°C ontdooid en 30 minuten bij 10.000 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd door een 0,45 35 micron Millex filter gefiltreerd, tot 0,25 ml geconcentreerd met sec-butanol en driemaal met ethanol met 10 yug E. coli tRNA/transfer RNA) als drager neergeslagen.

{(WEEKMEDIA

Het M9CA medium bevatte 10 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g 40 NaCl en 1 g NH4C1 per liter, en daarbij 1 mM MgS04, 0,5% glucose en 8700795 18 ..... 0,5% casaminozuren, ingesteld of pH 7,4.

Luria Broth (LB) bevatte 5 g Bacto-gist extract, 10 g Bacto-tryp-ton en 10 g NaCI per liter, ingesteld op pH 7,5.

De antibiotica tetracycline en ampicilline werden tot eindconcen-5 traties van respectievelijk 15 en 50 ^ug/ml, waar aangegeven, toegevoegd.

TRANSFORMATIE EN ISOLATIE VAN RECOMBINANTEN

De transformatie van E. coli-stam MC1Q61 (pRK248cIts) werd uitgevoerd door middel van een gewijzigde versie van de werkwijze van 10 Kushner [in Genetic Engineering, eds. Boyer e.a., Elsevier/North-Hol-land, Amsterdam, blz. 17 (1978)], en wel in hoofdzaak als volgt.

Tweehonderd ml bacteriële cellen werden bij 30°C in LB gekweekt tot een O.D.ggo tussen 0,5 en 1,0 waarna de cellen werden verzameld door centrifugeren bij 6000 g gedurende 5 minuten bij 4°C en op-15 nieuw werden gesuspendeerd in 50 ml van een oplossing die 10 mM morfo-linopropaansulfonzuur (MOPS; pH 7,0) en 10 mM RbCl bevatte. De cellen werden nogmaals verzameld door centrifugeren en opnieuw gesuspendeerd in 30 ml van een oplossing die 10 mM MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCl2 en 10 mM RbCl bevatte. Na incubatie bij 0°C gedurende 30 minuten werden de 20 cellen verzameld, opnieuw in 6 ml 10 mM MOPS (pH 6,5) met 50 mM CaCl2, 10 mM RbCl en 15% glycerol gesuspendeerd en verdeeld over 40 Eppendorfbuizen (300 yul per buis) en bij -80°C ingevroren.

De transformatie werd uitgevoerd door ontdooien van een hoeveelheid van 100 yul cellen en incuberen gedurende 30, 2 en 2 minu-25 ten bij respectievelijk 0°, 37° en 0°C in aanwezigheid van een 10 yUl monster ligeringsmengsel dat ongeveer 100 ng DNA bevatte en toevoegen van 0,1 tot 0,5 ml LB in de buis. De buis werd vervolgens 60 minuten bij 22°C geïncubeerd waarna 200 yul van de cel suspensie op een LB-plaat die ampicilline bevatte verspreid en 20 uur bij 30 30°C geïncubeerd.

CELKWEEK EN INDUCTIE VAN GENEXPRESSIE

Culturen van E. coli MC1061 die piasmi de pRK248cIts en een expres-sieplasmide bevatten werden in M9CA medium bij 30°C gekweekt tot de mid-logfase en vervolgens op 42°C gebracht ter deactivering van de 35 Λ Pj_ repressor. Na 2 uur incuberen bij 42°C werden cellen uit 1 ml van de geïnduceerde cultuur verzameld door centrifugeren en opnieuw in TG buffer die 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) en 10% glycerol bevatte gesuspendeerd als voorbereiding op de analyse.

ELECTROFORESE MET SDS OP POLYACRYLAMIDEGEL EN WESTERN BLOT ANALYSE 40 In Tris-glycine (TG)-buffer gesuspendeerde geïnduceerde cellen 870 0 ? s 5 19 werden met een gelijk volume 2x monsterbuffer gemengd [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)], 5 minuten bij 95eC geïncubeerd en op de door Laemntli beschreven wijze aan polyacrylamidegel-electroforese met SDS in 12,5¾ gelen onderworpen. Na de electroforese werden de eiwitten uit het 5 gel aan electroblotting onderworpen op een nitrocellulosemembraan van 0,1 micron bij 95 volt gedurende 6 uur in 12,5 mM Tris en 96 mM glycine met 20¾ methanol en 0,01¾ SDS bij pH 7,5. Vervolgens werd een Western blotanalyse uitgevoerd zoals beschreven door Towbin e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4350 (1979)].

10 PRIMER-GERICHTE MUTAGENESE

Primer-gerichte, plaatsspecifieke mutagenese werd uitgevoerd volgens de door Morinaga e.a. beschreven werkwijzen [Biotechnology 2, 636 (1984)]. De voor de uitvoering van de mutagenese gebruikte synthetische oligonucleotiden werden volgens de fosfietmethode [Beaucage e.a., Te-15 trahedron Lett. 22, 1859 (1981); Matteucci e.a., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] bereid met behulp van een geautomatiseerd synthese-appa-raat en doormiddel van polyacrylamidegel electroforese volgens de werkwijze van Maxam e.a., [Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] gezuiverd.

20 K0L0NIE-HYBRIDISATIES

Kolonie-hybridisaties werden uitgevoerd volgens de werkwijze van Grunstein e.a. [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 22, 3961 (1975)]. Hetzelfde oligonucleotide dat was gebruikt voor de primer-gerichte plaatsspecifieke mutagenese werd gebruikt als sonde voor de hybridisaties na 25 merking van het 5'-einde met 32p_(_Ajp.) met behulp van polynucleotide-kinase zoals beschreven door Maniatis e.a. [Cel! _15» 687 (1978)].

B. 0PB0UW VAN PLASMIDE pEV2/GAG 15-512

Zoals eerder aangegeven werd de opbouw van een uiteindelijk expressi epl asmi de dat het gag/env-fusie-eiwit tot expressie brengt ge-30 start met de constructie van een piasmide (pEV2/gag 15-512) dat nucleo-tiden bevat dat alle behalve de eerste 14 amino-eindstandige residuen coderen. Enkele van de nucleotiden die de carboxyl-eindstandige gag-re-siduen coderen werden vervolgens door env-sequenties vervangen waarbij het uiteindelijke fusieprodukt werd verkregen.

35 Voor het bereiden van piasmi de pEV2/gag 15-512 werd de DNA-sequen-tie die de residuen 15-512 van het gag-eiwit codeert verkregen uit 50 yug recombinant faag lambda kloon λΗΧΒ-3 die het HTLV-III provirale genoom bevat, door splitsing met 50 eenheden Cl al en 50 eenheden Hindi gedurende 120 minuten bij 37°C onder vorming van een frag-40 ment van 1700 baseparen. Dit DNA-fragment werd geïsoleerd door middel 8700705 20 van preparatieve gel-electroforese op agarose en opnieuw in 0,lx TE buffer [1 mM Tris-HCl (pH 7,4) met 0,1 mM EDIA] gesuspendeerd tot een eindconcentratie van 0,03 pmol/yul.

Voor het verkrijgen van het gag-DNA-fragment werd 2 yug van 5 het expressieplasmide pEV-vrf2 van E.coli gedurende 60 minuten bij 37°C gesplitst met 5 eenheden Cl al en 5 eenheden PvuII en werd een fragment van 1700 baseparen met daarin dej\PL-promotor door electroforese in 1% agarosegel geïsoleerd en na precipitatie met ethanol opnieuw gesuspendeerd tot een eindconcentratie van 0,03 pmol/yUl.

10 Het bij deze opbouw gebruikte plasmide pEV-vrf2 is een derivaat van het gemakkelijk beschikbare plasmide pBR322 [ATCC 31344]. De opbouw van plasmide pEV-vrf2 is in detail beschreven door Crowl e.a. [Gene 38, 31 (1985)]. De bij deze constructie gebruikte recombinante faag lambda kloon^HXB-3 is door Shaw e.a. beschreven [Science 226, 1165 (1984)]. 15 Deze kloon werd met behulp van standaard recombinant DNA technieken verkregen uit de hierboven beschreven met HTLV-III geïnfecteerde H9 cellijn. Een met HTLV-III geïnfecteerde menselijke cellijn, aangeduid als H9/HTLV—IIIB, die geschikt is voor gebruik volgens de uitvinding, is bij de American Type Culture Collection gedeponeerd met toegangsnum-20 mer CRL8543. Aangezien Shaw e.a. de sequentie van het HTLV-III genoom hebben gepubliceerd kan een DNA-sonde met behulp van die gegevens gemakkelijk worden geconstrueerd en worden gebruikt ter isolatie van het genoom van H9 of van elke andere lijn die in staat is het virus te vermeerderen.

25 0,03 (300) pmol van het gag/Cl al-Hindi fragment werden gemengd met 0,03 pmol van het pEV-vrf2/Clal-PvuII fragment en met 200 eenheden T4 DNA ligase 18 uur bij 15°C in een eindvolume van 10 yul gekoppeld. Het koppelingsprodukt werd vervolgens in E. coli-stam MC1061 (pRK248cIts) getransformeerd en de transformanten werden geselecteerd 30 door kweek op LB-agarplaten met ampicilline na incubatie gedurende 18 uur bij 30°C. De recombinante plasmide-DNA's werden na splitsing met BglII, PstI of HindlII geanalyseerd op de juiste afmeting van het restrictief ragment. De met DNA-maatanalyse positieve geïsoleerde fracties werden vervolgens onderzocht voor de synthese van het voorlopende 35 gag-polypeptide door middel van polyacrylamidegel-electroforese met SDS en Western blot-analyse.

Culturen die plasmide pEV2/gag 15-512 bevatten werden bij 40eC geïnduceerd en van de geïnduceerde cellen werden duplomonsters bereid voor analyse door middel van SDS-polyacrylamidegel-electroforese. Na 40 electroforese werd het gel in tweeën gesneden en werd de helft van 8700795 i- * > 21 het gel gekleurd met Coomassie briljantblauw, terwijl de anderè helft werd onderworpen aan electroblotting en Western blot-analyse met behulp van anti-gag antilichamen.

Uit de analyse bleek dat de geïnduceerde cellen eiwitten produ-5 ceerden die zich in de gelen als twee hoofdbanden met schijnbare mole-cuulgewichten van ongeveer 56 en 53 Kd verplaatsten. De omvang van het volledige gag 15-512 eiwit is ongeveer 56 Kd. De beide belangrijkste eiwitten reageren met de anti-gag antilichamen. Tevens werd een aantal minder belangrijke eiwitten met lager molecuul gewicht, die met de anti-10 lichamen reageerden, waargenomen.

C. OPBOUW VAN PLASMIDE pEV3/env 44-640 Δ 319-331

De in het uiteindelijke voorbeeldplasmide volgens de uitvinding aanwezige env-sequenties werden in twee fasen verwerkt (beschreven in deze afdeling en in afdeling D verderop) waarbij in beide gevallen 15 specifieke korte nucleotidesequenties door middel van primer-gerichte, plaatsspecifieke mutagenese werden gedeleteerd. De eerste van deze deleties (beschreven in deze afdeling) was nodig voor het produceren van piasmide pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 (afdeling D).

Het expressieplasmide pEV3/env 44-640, waarvan de opbouw uit 20 Λ HXB-3 en de pEV-vrf piasmiden is beschreven door Crowl e.a. [Cell. 41, 979 (1985)] stuurt de synthese van een HTLV-III env-specifiek eiwit van 68 Kd in E. coli. Met de env-aminozuurresiduen 319-331 overeenkomende DNA-sequenties werden gedeleteerd door primer-gerichte mutagenese met behulp van een 18-mer synthetisch oligonucleotide met sequentie 5' GCA 25 TTT GTT AAC ATT AGT 3'. Dit oligonucleotide werd ontworpen als complement op de env-sequenties zodat de nucleotiden die residu 318 coderen werden gekoppeld aan die welke residu 332 coderen. Als gevolg van het samenvoegen van deze sequenties werd een nieuwe unieke Hpal-plaats in plasmide-DNA geïntroduceerd terwijl 39 baseparen werden gedeleteerd. De 30 Stul en HindlII plaatsen in piasmide pEV3/env 44-640 werden gebruikt voor het vormen van het "gat" voor het heteroduplexmolecuul.

DNA uit geïsoleerde kolonies die op hybridisatie met het met 32p gemerkte synthetische oligonucleotide tijdens kolonie-onderzoek positief waren werden in MC1061 (pRK248cIts) getransformeerd en geanaly-35 seerd op de aanwezigheid van de nieuwe, unieke Hpal plaats.

D. OPBOUW VAN PLASMIDE pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524

Een tweede deletie binnen de env coderende sequenties werd tot stand gebracht door middel van primer-gerichte mutagenese met behulp van een synthetisch oligonucleotide met de sequentie 5' AGA GCA GTG GCA 40 GCA GGA 3*. Dit oligonucleotide plaatste sequenties die residu 513 van 8700795 ? 22 het env-eiwit coderen naast die welke residu 525 coderen en vergemakkelijkte de deletie van de nucleotiden die residuen 514-524 coderen. Deze deletie werd in het piasmi de tot stand gebracht met behulp van de re-strictieplaatsen Hpal en HindiII onder vorming van een enkel strengs gat 5 binnen het env-gebied.

Na retransformatie werd DNA uit positieve isolatiefracties die waren geïdentificeerd met de met 32p gemerkte ol igonucleotide-sonde, geanalyseerd op de deletie van 33 baseparen door middel van restrictie-splitsing met Hpal en HindiII gevolgd door electroforese in 1¾ agarose. 10 Deze verwijdering werd ook bevestigd door DNA-sequentiëring na de chemische splitsingsmethode van Maxam en Gilbert [Methods in Enzymology 65,. 499 (1980)].

Zoals al eerder opgemerkt levert de deletie Δ 514-524 een belangrijke verhoging van de expressie van env.

15 E. OPBOUW VAN PLASMIDE pEV2/gag 15-436/env 467-640 A 514-524

Twee /lig pEV2/gag 15-512 werd dubbel gedigereerd met hetzij 5 eenheden Clal en 4 eenheden BglII waarbij een fragment van ongeveer 1300 baseparen dat de gag-residuen 15-436 codeert werd geproduceerd, hetzij met 10 eenheden PstI en 5 eenheden Clal waarbij een fragment van 20 ongeveer 1 Kb dat de XP|_ promoter bevat werd geproduceerd.

0,3 /ug pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 werd met 10 eenheden PstI en 4 eenheden BglII aan restrictie onderworpen onder vorming van een fragment van ongeveer 4 Kb dat env-residuen 467-640 Δ 514-524 codeert. De verschillende aldus geproduceerde DNA-fragmenten werden in 1% 25 agarose gescheiden en op de eerder aangegeven wijze gewonnen.

0,03 pmol van elk van de geïsoleerde DNA-fragmenten werd gemengd en bij 15°C gedurende 18 uur gekoppeld in aanwezigheid van 200 eenheden T4 DNA ligase. De produkten van het koppelingsmengsel werden vervolgens getransformeerd in MC1061 (pRK248cIts) en de transformanten werden op 30 LB-agarplaten met ampicilline geselecteerd. Plasmide-DNA werd bereid uit.unieke kolonies en geanalyseerd op de juiste maat van het restrictief ra gment na digestie met PvuII.

Elf van de 12 geïsoleerde fracties waren bij DNA analyse positief wat betreft de verwachte PvuII fragmenten van 3505 en 2882 basepa-35 ren. Twee positieve geïsoleerde fracties werden verder onderzocht voor de synthese van het gag/env-fusie-eiwit. Deze culturen werden geïnduceerd en er werden celmonsters genomen voor analyse door middel van SDS-polyacrylamidegel-electroforese, electroblotting en Western blots waarvan de resultaten zijn weergegeven in figuur 3.

40 Paneel 1 in figuur 3 toont Coomassie-blauw gevlekte totale-celei- 8 7,0 0 7 9 5 * * 23 witten van cellen die het het gag/env-fusiegen dragende recombinant plasmide herbergen (g/e) en van controlecellen (c). De panelen 2 en 3 geven de resultaten van duplomonsters die zijn onderworpen aan Western blot-analyse met polyklonale antilichamen van konijnen tegen een met 5 env-residuen 500-511 overeenkomend synthetisch polypeptide (paneel 2) of roet behulp van polyklonale antilichamen van schapen tegen eiwit p24 dat in de handel verkrijgbaar is [paneel 3; zie Dowbenko e.a., Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 7748 (1985) voor beschrijving van p24 eiwit]. In figuur 3 zijn op panelen 2 en 3 de iiranuun-complexen met een 10 tweede met mierikperoxidase gemerkt antilichaam zichtbaar gemaakt en is de afgelegde afstand van molecuulgewichtstandaarden (in Kd) aangegeven.

De posities van de gag/env-eiwitbanden in de gelen zijn met pijlen aangegeven.

Vele aanpassingen en varianten van deze uitvinding kunnen worden 15 gemaakt zonder van de kern en van de strekking daarvan af te wijken zoals de deskundige duidelijk zal zijn. Zo kunnen er in het nucleine-zuur in het gen dat het gag/env-eiwit volgens de uitvinding codeert,, substituties worden aangebracht (gebruik makend van de sequent!egege-vens uit de referenties) en kan daaruit een enigszins verschillend 20 (maar functioneel gelijkwaardig) fusie-eiwit worden geproduceerd. Een dergelijk gewijzigd produkt valt nog steeds onder de uitvinding zolang het tenmiste een antigene determinant heeft die overeenkomt met de sequenties van een gag- en env-eiwit van een HTLV-IIÏ virus. Op soortgelijke wijze kan de aminozuurvolgorde van het eiwit zelf rechtstreeks 25 worden gemanipuleerd met hetzelfde resultaat. De beschreven bijzondere uitvoeringsvormen dienen alleen als voorbeeld.

8700795

Claims (38)

1. Eiwit met een aminozuursequentie die overeenkomt met tenminste een anti gene determinant van een HTLV-III gag-eiwit en van een HTLV-III 5 env-eiwit.

2. Eiwit volgens conclusie 1 met de aminozuursequentie: Met Asn Arg IIe Arg IIe His Arg Trp 61u Lys IIe Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His II e Val Trp Al a Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu

3. Eiwit volgens conclusie 1 of 2 in nagenoeg zuivere vorm.

4. DNA-sequentie die voor een eiwit volgens een der conclusies 1-3 10 codeert.

5. DNA-sequentie volgens conclusie 4 met het kenmerk dat deze het geheel of een gedeelte van de nucleinezuursequentie ATGAATAGAA TTCGGATCCA TCGATGGGAA AAAATTCGGT TAAGGCCAAG GGGAAAGAAA AAATATAAAT TAAAACATAT AGTATGGGCA AGCAGGGAGC 15 TAGAACGATT CGCAGTTAAT CCTGGCCTGT TAGAAACATC AGAAGGCTGT AGACAAATAC TGGGACAGCT ACAACCATCC CTTCAGACAG GATCAGAAGA ACTTAGATCA TTATATAATA CAGTAGCAAC CCTCTATTGT GTGCATCAAA GGATAGAGAT AAAAGACACC AAGGAAGCTT TAGACAAGAT AGAGGAAGAG CAAAACAAAA GTAAGAAAAA AGCACAGCAA GCAGCAGCTG ACACAGGACA 20 CAGCAGTCAG GTCAGCCAAA ATTACCCTAT AGTGCAGAAC ATCCAGGGGG AAATGGTACA TCAGGCCATA TCACCTAGAA CTTTAAATGC ATGGGTAAAA GTAGTAGAAG AGAAGGCTTT CAGCCCAGAA GTAATACCCA TGTTTTCAGC ATTATCAGAA GGAGCCACCC CACAAGATTT AAACACCATG CTAAACACAG TGGGGGGACA TCAAGCAGCC ATGCAAATGT TAAAAGAGAC CATCAATGAG 25 GAAGCTGCAG AATGGGATAG AGTACATCCA GTGCATGCAG GGCCTATTGC ACCAGGCCAG ATGAGAGAAC CAAGGGGAAG TGACATAGCA GGAACTACTA GTACCCTTCA GGAACAAATA GGATGGATGA CAAATAATCC ACCTATCCCA GTAGGAGAAA TTTATAAAAG ATGGATAATC CTGGGATTAA ATAAAATAGT AAGAATGTAT AGCCCTACCA GCATTCT6GA CATAAGACAA GGACCAAAAG 30 AACCTTTTAG AGACTATGTA GACCGGTTCT ATAAAACTCT AAGAGCCGAG CAAGCTTCAC AGGAGGTAAA AAATTGGATG ACAGAAACCT TGTTGGTCCA AAATGCGAAC CCAGATTGTA AGACTATTTT AAAAGCATTG GGACCAGCGG CTACACTAGA AGAAATGATG ACAGCATGTC AGGGAGTAGG AGGACCCGGC CATAAGGCAA GAGTTTTGGC TGAAGCAATG AGCCAAGTAA CAAATACAGC 35 TACCATAATG ATGCAGAGAG GCAATTTTAG GAACCAAAGA AAGATGGTTA AGTGTTTCAA TTGTGGCAAA GAAGGGCACA CAGCCAGAAA TTGCAGGGCC CCTAGGAAAA AGGGCTGTTG GAAATGTGGA AAGGAAGGAC ACCAAATGAA AGATTGTACT GAGAGACAGG CTAATTTTTT AGGGAAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA GTGAATTATA TAAATATAAA 40 GTAGTAAAAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG CAAAGAGAAG 8700795 * AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGTGGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAAT GACGCTGAGG GTACAGGCCA GACAATTATT GTCTGGTATA GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCT ATTGAGGCGC AACAGCATCT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAATCCTGG 5 CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGAT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC TACTTTGCAC CACTGCTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGAACAGA TTTGGAATCA CACGACGTGG ATGGAGTGGG ACAGAGAAAT TAACAATTAC ACAAGCTTTA ATGCGGTAGT TTATCACAGT TAA 10 of een functioneel equivalent daarvan omvat.

5 Leu Glu Gin He Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Phe Asn Ala Val Val Tyr His Ser of een functioneel deel of equivalent daarvan.

6. Recombinant-vector die een DNA-sequentie volgens conclusie 4 of 5 omvat en in staat is de expressie van de DNA-sequentie in een verenigbaar eencellig gastheerorganisme te richten.

7. Recombinant-vector volgens conclusie 6, met het kenmerk dat de-15 ze het piasmi de pÈV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 is.

8. Eencellig organisme dat een recombinant-vector volgens conclusie 6 of 7 bevat.

9. Eencellig organisme volgens conclusie 8, met het kenmerk dat het een prokaryotische cel is.

10. Eencellig organisme volgens conclusie 9, met het kenmerk dat het een cel van Escherichia coli is.

10 Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin IIe Leu Gly Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg IIe Glu IIe Lys Asp Thr Lys Glu Al a Leu Asp Lys Π e Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys Lys Lys Al a Gin Gin Al a Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Ser Gin

11. Eencellig organisme volgens conclusie 10, met het kenmerk dat het een cel van Escherichia coli MC1061 is.

12. Eencellig organisme volgens conclusie 8, met het kenmerk dat 25 het een eukaryotische cel is.

13. Eiwit volgens een der conclusies 1-3 als bestanddeel van een vaccin.

14. Eiwit volgens een der conclusies 1-3 als antigen.

15. Werkwijze voor de bereiding van een eiwit volgens een der con-30 clusies 1-3, met het kenmerk dat men (a) een eencellig organisme dat een recombinant-vector volgens conclusie 6 of 7 bevat kweekt onder geschikte groeiomstandigheden zodanig dat het eiwit tot expressie wordt gebracht; en (b) het eiwit uit de cultuur isoleert en indien gewenst zuivert.

15 Val' Ser Gin Asn Tyr Pro He Val Gin Asn He Gin Gly Gin Met Val His Gin Ala He Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val He Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk dat het een cellige organisme een cel van E. coli is.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk dat de recombinant-vector het piasmi de pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 is.

18. Werkwijze voor het bereiden van een eencellig organisme vol-40 gens een der conclusies 8-12, met het kenmerk dat men een recombinant- 87.0 0 7 3 5 t vector volgens conclusie 6 of T in een eencellig organisme invoert.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk dat men de re-eombinant-vector door transformatie in het eencellige organisme invoert.

20. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk dat men de re- combinant-vector door transductie in het eencellige organisme invoert.

20 Glu Thr lie Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro He Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin He Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro He Pro Val Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp He He Leu Gly Leu Asn Lys He Val Arg Met Tyr

21. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk dat men de re-combinant-vector door transfectie in het eencellige organisme invoert.

22. Werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van antilicha- 10 men tegen AIDS-virussen in menselijk serum, waarbij men (a) een eiwit volgens een der conclusies 1-3 merkt; (b) het gemerkte eiwit van stap (aj laat reageren met een menselijk serummonster en in het reactiemengsel gemerkte eiwit-antilichaam-complexen laat ontstaan, en 15 (c) de gemerkte eiwit-antilichaamcomplexen van stap (b) bepaalt.

23. Werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van antilicha-men tegen AIDS-virussen in menselijk serum, waarbij men (a) een eiwit volgens een der conclusies 1-3 op een vaste drager immobiliseert; 20 (b) een menselijk serummonster met het geïmmobiliseerde eiwit van stap Ca) in contact brengt en geïmmobiliseerde eiwit-antilichaam-complexen laat ontstaan; (c) niet gebonden eiwit en antilichamen uit de complexen van stap (b) wast; en 25 (d) de complexen bepaalt door toevoeging van een gemerkt eiwit A van Staphylococcus aureus of een gemerkt tweede anti-menselijk-IgG anti! ichaam.

24. Werkwijze voor het opsporen van de aanwezigheid van AIDS-vi-russen of fragmenten daarvan in menselijk serum of een andere biologi- 30 sche vloeistof, waarbij men: (a) een monster van menselijk serum of van een andere biologische vloeistof laat reageren met een bekende titer van antilichamen die zijn opgewekt tegen een eiwit volgens een der conclusies 1-3; (b) de antilichamen en het monster met elkaar laat reageren onder 35 vorming van antigen-antilichaamcomplexen in het reactiemengsel; en (cj de antigen-antilichaamcomplexen volgens stap (b) opspoort.

25. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk dat de antilichamen met enzym gemerkt zijn en de in het reactiemengsel gevormde antigen-antilichaamcomplexen worden opgespoord door middel van enzym- 40 gebonden immunosorbent-bepaling. 8700795

“ 26. Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk dat een beken de hoeveelheid van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 dat radioactief is gemerkt aan het monster van het serum of andere biologische vloeistof toevoegt en de in het reactiemengsel gevormde antigen-antili-5 chaamcomplexen opspoort door middel van radioimmuno-bepaling.

25 Ser Pro Thr Ser He Leu Asp He Arg Gin Gly Pro Lys GTu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr He Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly

27. Werkwij'ze voor de bereiding van een vaccin, met het kenmerk dat men een eiwit volgens een der conclusies 1-3 mengt met een fysiologisch aanvaardbare drager.

28. Werkwijze voor de bereiding van antilichamen tegen AIDS-virus-10 sen met het kenmerk dat men in een zoogdier of een vogel een voldoende hoeveelheid van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 injecteert om tot produktie van antilichamen tegen het eiwit aan te zetten en de antilichamen uit het serum van het dier wint.

29. Vaccinsamenstelling dat een eiwit volgens een der conclusies 15 1-3 en een verenigbare farmaceutische drager omvat.

30. Antilichamen opgewekt tegen een eiwit volgens een der conclusies 1-3.

30 Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Thr Ala Thr He Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr

31. Antilichamen volgens conclusie 30 met het kenmerk dat dit mo-noklonale antilichamen zijn.

32. Toepassing van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 voor de bereiding van een beschermend afweervaccin.

33. Toepassing van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 voor de bereiding van antilichamen tegen AIDS-virussen.

34. Toepassing van een eiwit volgens een der conclusies 1-3 voor 25 het opsporen van de aanwezigheid van antilichamen tegen AIDS-virussen in menselijk serum.

35. Eiwit volgens een der conclusies 1-3 bereid volgens de werkwijze van conclusie 15.

35 Glu Arg Gin Ala Asn· Phe Leu Gly Lys lie Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys lie Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lys Arg Ala Val Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin

40 Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala 8700795 * Ite GTu Ata GTn Gin Hfs Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gin Leu Gin Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Leu Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser

36. Eencellig organisme volgens een der conclusies 8-12, bereid 30 volgens de werkwijzen van een der conclusies 18-21.

37. Antilichamen volgens conclusie 30 of 31 bereid volgens de werkwijze van conclusie 28.

38. Vaccin volgens conclusie 29 bereid volgens de werkwijze van conclusie 27. 35 8 7 0 0 7 9 5