JPH03501722A - Htlv‐iペプチド抗原および分析法 - Google Patents
Htlv‐iペプチド抗原および分析法Info
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- JPH03501722A JPH03501722A JP50210388A JP50210388A JPH03501722A JP H03501722 A JPH03501722 A JP H03501722A JP 50210388 A JP50210388 A JP 50210388A JP 50210388 A JP50210388 A JP 50210388A JP H03501722 A JPH03501722 A JP H03501722A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、ヒ)T細胞白血病ウィルスI型(HTLV−1)に関し、さ
らに詳細には、IITLV−1に感染した個体に存在する抗HTLV−1抗体に
対して免疫反応性を有する組換え体ペプチド抗原に関する。
2、参考文献
)1uynh、 T、 V、ら、”DNA Cloning、Volume 1
” D、!J、Glover編、ワシントンD、C,:IRLプレス、1985
(チャプター2)Maniatis、T、ら、Mo1ecular Clon
ing:A Laboratory Manual。
Co1d Spring tlarbor Laboratory(1982)
ヒ)T細胞白血病ウィルス(HTLV)は、3種類の既知のメンバーの一群のT
細胞レトロウィルスである。tlTLV I型(HTLV−1)は、インビトロ
で形質転換活性を有し、病因論的に、成人T細胞白血病と関連がある。この成人
T細胞白血病は、世界のいくつかの地域に固有なものとして知られている。HT
LV−nはインビトロで形質転換能を有する、他のレトロライスルであり、毛様
細胞性白血病にかかった患者のT細胞変種から単離されている。)ITLV−I
は、リンパ節症関連ウィルスとも呼ばれ、現在ではヒト免疫不全症ウィルス(H
mとして知られ、ある種のT細胞に対して溶解性を有し、病因論的には後天性免
疫不全症候群(AIDS>に関連している。HTLV−1および)ITLV−n
とは異なり、)ITLV−IIIは、インビトロでの形質転換活性を有していな
いことが知られている。
HTLV−1に対して反応性を有するモノクローナル抗体(Mab)が、すでに
報告されている(Matsush 1ta)。0.5αと呼ばれるその抗体は、
HTLV−1に感染したT細胞の細胞膜に結合し、補体の存在下で細胞溶解を起
こすIgG+ Mabである。電気プロット法による研究により、このMabは
HTLV−1の主要エンベロープタンパクと反応することが示されている OJ
a t s u s h i t a )。
このタンパクはgp46と呼ばれており、env遺伝子産物の外膜の成分である
。プロウィルスHTLV−1のゲノムが単離され、その全体の配列が決定されて
いる(Seiki)。競合阻害結合分析法を用いると、成人T細胞白血病の15
名の患者のうちの15名が、粉砕されたIITLV−1ピリオンにこのMabが
結合するのを阻止する抗体を有することが観察された(Matsush 1ta
)。この抗体は、HTLV−IIもしくはHTLV−I[Iのピリオン、または
感染細胞には結合しないようである。
上記の研究は、)ITLV−1感染症の診断に抗)ITLV−1抗体を用いる可
能性を示しているが、この方法には2つの大きな欠点がある。第1に、分析シス
テムが比較的面倒であり、IITLV−1ピリオン、感染細胞、もしくは分画さ
れたgp46タンパクの起源と;競合結合分析法フォーマットに組み合わせた抗
HTLV−I J、tabとの両者が必要である。第2に、全ピリオンまたはそ
の分画されたタンパクでさえも、1を超える数のエピトープ特異的抗)ITLV
−1抗体と反応するようであり、そのため、この試験法の感度と特異性とが低下
する。
4、発明の要旨
従って、T細胞白血病に感染した患者を含む1(TLV−1に感染したすべての
患者に存在することが知られている抗体と免疫反応性であり、HTLV−1感染
症のある段階の病状を特異的に示す1またはそれ以上のHTLV−1ペプチド抗
原を提供することは、HTLV−1感染症を診断するのに有用である。このよう
な抗原は、)ITLV−I感染症の病状を示す抗体を迅速に測定するための、単
純な固相抗体結合分析法もしくは均一系抗体結合分析法に使用され得る。本発明
のひとつの一般的な目的は、HTLV−1関連T細胞白血病にかかっている患者
に存在する抗HTLV−1抗体に特異的なHTLV−1ペプチド抗原を提供する
ことにある。
本発明の他の目的は、そのような抗原を用いる、簡単かつ迅速で比較的安価な免
疫分析法を提供することにある。
本発明には、(a)HTLV−1工ンベロープタンパクgp46由来で、(b)
T細胞白血病の個体中に存在する抗1(TLV−r抗体と免疫反応性の組換え体
ペプチド抗原が含まれる。この抗原はグリコジル化されておらず、そして、好ま
しくは、次のアミノ酸配列を含む: Leu−Leu−Va 1−Asp−Al
a−Pro−G 1y−Tyr−Asp−Pro−11e−Trp−Phe−L
eu−Asn−Thr−G1 u−Pro−3er−G1 n−Leu−Pro
−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−)11
s−3er−Asn−Leu−Asp−H1s−11e−Leu−G 1u−P
ro−er 0
本発明の他の態様では、この抗原は、好ましくは、T細胞白血病の一体を含むt
lTLV−1に感染した個体の血清中に存在する抗体と免疫反応性である。
本発明にはまた、被検個体中のHTLV−1感染症を検出するシステムと方法と
が含まれる。その方法を実施する際には、上記のタイプの抗原を、被検個体由来
の血清と反応させ、次いで結合した抗体の存在が試験される。その分析システム
は固相式であってもよく均−系であってもよい。上記固相式においては、抗原が
固体支持体に保持されており、上記均一系においては、抗原がレポーターと結合
し、抗原に結合する抗体がレポーターシグナル(これが検出される)を変化させ
る。
さらに他の態様においては、本発明には、T細胞白血病に対して個体を免疫化す
るワクチンが含まれる。このワクチンは、薬学的に受容され得るアジュバント中
に上記のタイプの組換え体ペプチドを含有している。
本発明の上記およびその他の目的と特徴は、本発明の下記の詳細な説明を添付図
面を参照して読めばより充分に理解されるであろう。上記図面のAにおいては、
tlTLV−1ゲノムの一部分が示され、已においては、本発明の3種のペプチ
ド抗原をコードするヌクレオチド配列に対応するゲノムの拡大領域(expan
ded regions)が示され、モしてCにおいては、この3種のペプチド
抗原の遺伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列とが示されている。
この項では、IITLV−1関連T細胞白血病の個体に見出される抗11TLV
−1抗体と免疫反応性を有するHTLV−1ペプチド抗原の調製について述べる
。この抗原は、適切な発現ベクターにクローン化され次に免疫反応性ペプチドの
発現について抗体で選択された、長さが100〜300塩基対のランダムIIT
LV−1遺伝子配列を用いて調製される。
)ITLV−1のゲノムライブラリーは、HTLV−1プロウイルスゲノムを含
有する細胞DNAから、従来の方法で調製される。二本鎖口NAは、HTLV−
1ウイルスに感染していることが知られている患者から単離されたT細胞または
既知の細胞系を含む、)ITLV−1感染細胞から調製される。上記既知の細胞
系としては、例えば、HUT102−82 (Poiesz)、MT−2(Mi
yoshi)、およびMJ−腫瘍(Popovic)細胞(これらはすべてHT
LV−1ウイルスを産生ずることが知られている。)がある。ウィルスのゲノム
がこれらの細胞の宿主DNAに組み込まれている。IITLV−1ゲノムを含有
する細胞系の調製法は前記文献に詳細に記載されている。
上記細胞系由来の全宿主ゲノムDNAは、15〜20キロ塩基のたはAlu I
のようなフリークエントカッター(frequent cutter7で部分的
に消化され、得られた消化産物を、例えば、スクロース勾配遠心分離法で分画し
て15〜20キロ塩基の断片が単離される。得られた断片は、次いで適切なりロ
ーニングベクター、好ましくは15〜20キロ塩基の挿入物を有効に組み込むこ
とができるファージのクローニングベクター、にクローン化メチラーゼで処理さ
れ、次にそれらの末端に、標準条件下(Maniatis)で、EC0RIリン
カ−が連結され、次いで、唯一のEc。
R1挿入部位を有するλシャロン4aのようなファージベクターにクローン化さ
れる。
得られたクローン化ゲノム断片は、全コピー1(TLV−1ゲノムの9選択され
た配列に相補的はプローブでスクリーニングされる。選択された配列のための、
放射能標識された合成オリゴヌクレオチドプローブの調製法と同様に、ITLV
−1の配列も公知である(Seiki)。さらに、特定の配列の合成オリゴヌク
レオチドは、5ynthetic Geneties、 Inc、(カリフォル
ニア州、サンジエゴ)により提供されるような商業的サービスにより調製され得
る。このようなオリゴヌクレオチドプローブを用いて、IITLV−1配列を含
む分子クローンは、標準的なハイブリダイゼーション法(Man iat is
、 322頁)によって、上記ライブラリーから単離される。このクローンは、
まず、制限部位分析法により分析され、全ウィルスゲノム配列が存在することが
確認される。その存在は、組み込まれたウィルスゲノムに隣接する長い直接末端
重複部分の存在により示される。同定された分子クローンは、適切なエンドヌク
レアーゼで消化され、全コピーウィルスゲノムが放出される。この目的のために
好ましいエンドヌクレアーゼはSac Iであり、これは長い末端重複部分(L
TR)中のウィルスゲノムを、ウィルスのコード配列のどちらかの末端を切断す
るが、内部切断を起こさない。クローンのHTLV−1ゲノムが、3番目の内部
Sac 1部位を有する変異体である場合には、適切な制限酵素を選択すること
により、全長のゲノムが単離される。精製した全コピー配列は、約9.5キロ塩
基の断片である。あるいは、env遺伝子配列だけを示すゲノムの断片を精製す
る′ことにより発現ライブラリーが調製され得る。
あるいは、全コピーHTLV−に本鎮DNAを含有するクローニングベクターが
報告されており(Seiki) 、実施例工に示すように、その研究者から直接
入手することができる。
所望の)ITLV−1ゲノムライブラリーを調製するために、全コピーHTLV
−1挿入物を、例えばSac Iで完全消化することによって、上記クローニン
グベクターから切出して、実施例工に述べるようにして、9.5キロ塩基の断片
が単離される。単離された全コピー断片は消化されて、DNA断片、好ましくは
主として約100から300塩基対の間の大きさのランダム断片が調製される。
実施例は、このような断片のONアーゼ消化法による調製が述べられている。約
30から100の間のアミノ酸からなるペプチド抗原を得ることが望ましいので
、消化断片はサイズ分画を行うのが好ましく、例えば、ゲル電気泳動法によって
約100から300塩基対の間の大きさの範囲の断片が選択される。
ゲノム消化断片は、適切なりローニングベクターであって、好ましくは適切な宿
主中でコードされたペプチドを発現できる発現ベクターに挿入される。1つの好
ましい発現ベクターはλgtllであり、このベクターは、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の翻訳終止コドンの53塩基対上流に、唯一のEcoRI挿入部位を有
する。したがって、この挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のN末
端部の大部分、その非相同ペプチド、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のC末
端領域の少なくとも一部分を含有するβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクとして
発現される。またこのベクターは、例えば32℃の許容温度でウィルスの溶原化
を起こし、例えば42℃の高温ではウィルスが溶解するに至る、温度感受性レプ
レッサー(c1857)を産生ずる。このベクターの利点は次の通りである:(
1)高効率での組換え体の生成;(2)許容温度では宿主細胞の増殖に基づいて
溶原化した宿主細胞を選択でき、非許容温度ではこのような選択ができないとい
う性能;および(3)組換え体融合タンパクの高レベルの産生。さらに、非相同
の挿入物を有するファージは、不活性β−ガラクトシダーゼ酵素を産生ずるので
、挿入物を有するファージは、β−ガラクトシダーゼ呈色基質反応で容易に同定
することができる。
発現ベクターに挿入するために、ウィルス消化断片は、従来の方法により、EC
0RI!Jンカーのような選択された制限部位リンカ−を含むように、必要に応
じて修飾される。実施例工は消化断片をλgtll中にクローン化する方法を例
示しておる工程が含まれる。得られたウィルスゲノムライブラリーをチェックし
、比較的大きなく代表的な)ライブラリーが産生されていることがvL認される
。この[Uは、λgtllベクターの場合には、適切な細菌宿主を感染させて、
その細菌をプレートシ、次いで、β−ガラクトシダーゼ活性の損失についてプラ
ークを検査することによって実施され得る。実施例Iに記載の方法を用いると、
約60%のプラークが酵素活性の損失を示した。酵素活性の損失を示すバックグ
ラウンドファージのレベルは、実施例Iに見られるように比較的低い。
B、ペプチド抗原の発現
上記で形成されたゲノムライブラリーは、問題のヒト抗11TLV−1抗体と免
疫反応性を有するペプチド抗原(融合タンパクとして発現される)を調製するた
めにスクリーニングされる。
HTLV−1感染症を診断するのに特に重要な1つの抗体は、0.5a抗体であ
り、これは前記のように)ITLV−1感染症に関連するT細胞白血病の患者に
存在している。この抗体は、 EBVで形質転換されたB IJンパ球細胞系C
ATCC寄託番号HC8755(実施例■参照)〕で産生され、IITLV−1
のgP46エンベローブタンパクと反応することが示されている(Matsus
h 1ta)。
フタ−が感染した宿主細胞を上記のようにプレートし、次にこのプレートをニト
ロセルロースフィルターでプロットし、細胞で産生された組換え体抗原をフィル
ターに転移させる。
次にそのフィルターを、抗HTLV−1抗体と反応させ、洗浄して未反応の抗体
を除去し、レポーターで[2された抗ヒト抗体と反応させる。その結果この抗体
は、抗HTLV−1抗体を介してサンドイッチ形でフィルターに結合する。
典型的には、問題の組換え体抗原の産生によって同定されるファージプラークは
、抗体反応性タンパクの産生について。
比較的低密度で再試験される。実験例Hに記載のスクリーニング法がその例であ
る。免疫反応性組換え体抗原を産生じたいくつかの組換え体ファージのクローン
をこの方法で同定した。
上記のようにして同定された1種もしくはそれ以上のライブラリーベクターは、
塩基対配列決定法で分析して、 HTLV−1ゲノム内のペプチドをコードする
領域の位置を決定するのが好ましい。非相同挿入物(必要に応じて、融合タンノ
くりの隣接コード配列を含む)を選択されたライブラリーのベクターから切り出
して、切り出された断片を精製し配列決定する方法は、実施例■に述べるような
公知の方法で一般に行われる。
0.5a抗体に対して免疫反応性であることが見い出され、3種のペプチドのコ
ード配列が図面に示されている。この3種の非相同配列は、 IITLV−1の
公知の配列(Seiki)と一致した。
実施例■においてより充分に考察されているが、全配列が。
HTLV−1のエンベロープタンパクgP46をコードする遺伝子中のHTLV
−1ゲノムの5565〜5895の塩基対(図のA部分)の範囲内に入り、 5
664および5790の塩基対の間(図のB部分)に重複コード配列(図中、2
つの矢印で示す)を有する。図から分かるように、C部分の重複配列が、下記の
アミノ酸配列を有する41のアミノ酸ペプチドの抗原をコードしている:Leu
−Leu−Va 1−Asp−A ] ]a−Pro−G1 y−Ty r−A
sp−P ro−11e−Tr p−Phe−Leu−Asn−Th r−G
1u−Pro−3er−G 1 n−Leu−Pro−P r o−Th r−
A 1a−Pr o−Pro−Leu−Leu−Pro−H1s−Set−As
n−Leu−Asp−H1s−11e−Leu−G 1u−Pro−Ser 0
さらに一般的に、この発明のペプチドは、(a) HTLV−1工ンベロープタ
ンパクgp46から誘導され、かつ(b)T細胞白血病の個体に存在する抗HT
LV−1抗体と免疫反応性である。ここで。
“〜由来の”という用語は、その組換え体ペプチドの合成が。
ここで同定された5664から5790の塩基対間の、 HTLV−1工ンベリ
ーブタンパクgp46をコードする領域の大部分と、コドンの配列が実質的に同
一のコード配列によって行われることを意味する。
大規模生産用には9組換え体タンパクを精製するために。
選択されたクローンが用いられる。大規模生産は、すでに報告されている次のよ
うな各種の方法のうちのひとつを用いて実施される=(a)イー、コリのような
適切な宿主を9選択されたλgtl1組換え体で溶原化し、(b)生成した形質
導入細胞を高レベルの非相同ペプチドが得られる条件下で培養し、(C)溶解細
胞から組換え体抗原を生成する方法。
上記λgtllクローニングベクターを含む好ましい方法では。
高産生性のイー・コリ宿主BNN103を9選択されたライブラリーファージに
感染させ、そして、2枚のプレートにレプリカプレートする。これらプレートの
1枚を、32℃で培養すると。
この温度ではウィルスの溶原化が起こる。他方のプレートを42℃で培養すると
、感染しているファージが溶菌状態になるので細胞の増殖が阻止される。従って
、低温では増殖するが高温では増殖しない細胞は、溶原化が成功していると考え
られる。
溶原化された宿主細胞は9次に、ウィルス挿入物を含有する融合タンパクを大量
に生産するのに好都合な液体培養条件下で培養され1次いで急速凍結によって溶
菌して所望の融合タンパクを放出させる。これらの方法は、以下の実施例■およ
び■で詳述する。
C,ペプチドの精製
組換え体ペプチドは、示差沈澱法9分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、焦点電気泳動法。
ゲル電気泳動法およびアフィニティークロマトグラフィーを含む標準的なタンパ
ク精製法で精製され得る。上記のようにして調製したβ−ガラクトシダーゼ融合
タンパクのような融合タンパクの場合には、タンパク単離法は、天然タンパクの
単離に用いる方法のなかから選択して適用され得る。しだがって、β−ガラクト
シダーゼ融合タンパクを単離するには。
そのタンパクは、その表面に抗β−ガラクトシダーゼ抗体を結合させて有する固
体支持体上を。細胞溶解物質を通過させることによる。簡単なアフィニティーク
ロマトグラフィーによって容易に単離され得る。この方法は、そのウィルスペプ
チドの配列を図面に示しであるMTA4/Bβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク
の精製を行う実施例■で用いられている。
■、有用性
この項では9本発明の抗原ペプチドの、 HTLV−1感染症を診断する用途、
およびHTLV−1感染症に対する強力なワクチンとしての用途について述べる
。
A。診断上の用途
ペプチド抗原の3種の基本的な診断上の用途について述べる。第1図の用途は、
ペプチドによる。補体を介する抗体依存性細胞溶解の阻害に基づくものである。
この方法では、被検個体由来の血清が、補体の保存(preserve)下でH
TLV−1に感染したT細胞クロニンと反応する。抗)ITLV−1抗体の存在
は。
例えばトリパンブルー色素排除法で判断する細胞溶解によって証明される。細胞
溶解が観察された場合には、 )ITLシー!ペプチドに対する抗HTLV−1
抗体の特異性が、まず血清を過剰のペプチドと反応させ1次にその血清を補体の
存在下で細胞と混合することによって証明される。抗体の特異性は、細胞溶解が
顕著に減少することによって示される。この方法は実施例■に記載されている。
またこの方法は。血清をペプチドの増加量について滴定し1次に、細胞溶解の程
度について顕著な効果が最初に観察された場合にそのペプチドの濃度を測定する
ことにより、被分析物である血清中の抗体力価を定量するのに利用できる。
第2の一般的分析法は固相免疫分析法である。この方法では9表面に結合したペ
プチドを有する固相試薬を、抗体を試薬上のペプチドの結合させる条・件下で、
被分析物である血清と反応させる。固相試薬を洗浄して未結合の血清成分を除い
た後、この試薬をレポーターで標識した抗ヒト抗体と反応させて、リポータ−を
、固相支持体に結合した抗HTLV−1抗体の量に比例して該試薬に結合させる
。この試薬を再び洗浄して。
未結合の標識抗体を除き、そして。試薬と結合したレポーターの量を測定する。
典型的には、実施例■に君己載した系のように、レポーターは、適切な螢光分析
もしくは比色分析用基質の存在下で固相試薬をインキュベートすることによって
検出される酵素である。
上記分析法で用いられる固相面を有する試薬は、タンパク物質を、ポリマービー
ズ、浸漬スティックまたはフィルター材のような固体支持材料に結合させる公知
の方法で製造される。一般にこれらの結合法には、タンパクを支持体(例えば。
実施例■に述べるフィルター支持体)に非特異的に吸着させる方法、またはタン
パクを9代表的には遊離のアミン基を介して固体支持体上の化学反応性基9例え
ば活性化されたカルボキシル基、水酸基もしくはアルデヒド基に共有結合させる
方法がある。
第3の一般的な分析法は均一系分析法である。この方法では、固体支持体に結合
している抗体は9反応媒体中である種の変化を起こし、その変化はその媒体中で
直接検出することができる。既知の一般のタイプの均一系分析法には次の方法が
包含される:(a)スピン標識レポーター法;この方法では。
抗原に結合する抗体が、レポーターの移動度の変化で検出される(スピン分裂の
ピークの幅が広くなる);(b)螢光レポーター法;この方法では、結合は螢光
効率の変化で検出される;(e)酵素レポーター法;この方法では、抗体の結合
は酵素/基質の相互作用で行われる;および(d)リポソーム結合レポーター法
;この方法では、結合によって、リポソームが溶解して封入されたレポーターが
放出される。これらの方法をこの発明のペプチドに適用する際には、均一系分析
法の試薬の通常の製造法が利用される。
上記の3種の一般的な各分析法では、試験個体由来の血清を抗体と反応させ、結
合した抗体の存在について抗原の試験が行われる。第1の分析法では、試験は、
抗体が、ペプチドに結合するときに、抗体を介する細胞溶解が減少するのを観察
することによって行われる。固相分析法では、試験は、標識抗ヒト抗体を、被検
体に結合させ、そして9個体支持体に結合したレポーターの量を測定して行われ
る。第3の検定法では、試験は、均一系分析法の試薬に結合する抗体の作用を観
察することによって行われる。
B・ペプチドのワクチン
本発明のペプチド抗原は、ワクチンとしても用いられ得。
細胞毒性の抗11LTV−1抗体を誘発する。ここでは、0.5αモノクローナ
ル抗体が、補体の存在下で、 HTLV−1ウイルスに感染したT細胞に対して
細胞毒性になることに留意することが大切である。このペプチドは、適切な担体
/アジュバントによって製剤化され、細胞毒性抗HTLV−[抗体の有意な力価
が血清中に検出されるまで、所定の間隔をおいて注射される。このワクチンは、
初期のHTLV−1感染症に対して、抗体を介する細胞毒性によって防御を行う
。
上記の説明から9本発明により、いかに種々の目的と特徴が達成されるかが理解
されるであろう。本発明のペプチド抗原は、成人のT細胞白血病の症状を示す抗
)ITLV−1抗体と特異的に反応するので、T細胞白血病の迅速で安価な分析
法に用いられる。同時に、このペプチド抗原は、既存の0.5αモノクローナル
抗体によって行われる細胞毒性抗体反応を誘発する。
下記の実施例は9本発明の種々の態様を例示するが1本発明の範囲を限定するも
のではない。
(以下余白)
旺
以下の実施例で使用された材料は、次の通りであった。
酵素:DNアーゼ■およびアルカリホスファターゼをBoehr inger
Mannheim Biochemicals (BMB% インディアナ州、
インディアナポリス)より得た。EcoRI、 EcoRIメチラーゼ、DNA
リガーゼおよびポリメラーゼIをNew England Biolabs (
NEB、 vサチニーセッツ州、ベヴアリー)より得た。RNアーゼをSign
a(ミズーリ州、セントルイス)より得た。
他の試薬二釘!■リンカ−をNEBより得た。そしてニトロブルーテトラゾリウ
ム(NBT)、S−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェ−) (BC
rP)、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシ
ド(X−gal)、およびイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IP
TG)をSigmaから得た。
夾里ヨーユ
HTLV−4ゲノムライブラリーの−1ゲノム ・のライブラリーソース: )
ITLV−1ゲノムに由来する全コピーDNA挿入物を含有するバクテリオファ
ージを合衆国国立衛生研究所のthe Laboratory of Tumo
r Ce1l Biology (メリーランド州、ベテスダ)のDr、R,C
,Ga1loおよびDr、 F、 Wong−Staalより得た。バクテリオ
ファージを5aclで完全に消化し、ウィルスゲノム挿入物を放出させた。消化
された材料を標準10%アガロースゲルで電気泳動にかけ、電気溶離によって得
られた9、5キロ塩基の断片をエタノール沈澱前に、フェノール/クロロホルム
で抽出した。
旺l旦:精製ゲノムDNAを標準消化バッファー(0,5M TrisHCl、
pH7,S; IB/ml BSA; 10mM MnC12)に懸濁し、約
In+g/mlの濃度とし、室温で約5分間DNアーゼ■で消化した。これらの
反応条件は、較正のために前もって研究で決定され、主として100〜300塩
基対の断片を製造するのに必要なインキュベートの時間が決定された。上記消化
物を、エタノール沈澱前に、フェノール/クロロホルムで抽出した。
EcoR1リンカ−の・ :上記のゲノム断片を、標準条件(Huynh)下で
DNA Pol Iで平滑末端にし、次いでフェノール/クロロホルムで抽出し
、エタノールで沈澱させた。平滑末端にされた材料を標準条件下でEcorRI
リンカ−で連結しくManfa目S。
pp396.397>、その後、L旦R1で消化し、余剰のリンカ−末端を取り
除いた。これをその後、アガロースゲル分画し、非連結リンカ−を取り除き、サ
イズ選択を行った(以下を参照)。
ニエエ五五二上記の工程で得られた断片をΦX174/Hael !Iおよびλ
/Hindlllサイズマーカーを用いて、1.2%アガロースゲル電気泳動(
5〜lOV/am)で分析した。 100〜300bpの画分をNA45ストリ
ツプ(Schleicherおよび5chuel 1)に溶出し、その後、溶離
溶液(I M NaC1,50+l1Mアルギニン、 pH9,0)で1.5m
l?イクロチューブに入れ、30〜60分間67℃でインキュベートした。
DNA(溶液中に存在する)を、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。ペレットを、20μI TE (0゜Of M Trfs H
CI、 pH7,5,0,001M EDTA)中に再び懸濁させた。
λ tllへの およびインビトロでのパッケージλgtllファージベクター
(Huynh)を、Promega Biotec (ウィスコンシン州マジソ
ン)より得た。このクローニングベクターは、β−ガラクトシダーゼ翻訳終止コ
ドンの53塩基対上流に唯一のEcoRIクローニング部位を持つ。上記のゲノ
ム断片を、0、5〜1. OμgノEcoRI−切断gtll、0.5〜3μm
ノ上記HTLV−1ゲノム断片、0.5μmのリガーゼ(200単位)および蒸
留水5μmを混合することで、EcoRr部位に導入した。混合物を、標準方法
(Maniatis、 pp、256−268)により、−晩、14℃でインキ
ュベートし、インビトロパッケージを行った。
パッケージされたファージは、DNAX (カリフォルニア州パロアルト)のD
r、Kevin Mooreより得たε、 Co1t、 KM392株を感染さ
せるのに、使用された。または、アメリカンタイプカルチャーコレクション(A
TCC337197)より入手可能なE、 Co11゜Y1090株も使用され
得る。感染したバクテリアをプレートし、生じたコロニーを、標準X−gal基
質プラークアッセイ方法(Maniatis)を用いて、X−galの存在下で
β−ガラクトシダーゼ活性−(クリアープラーク)の欠失を検査した。下記の表
1に、EcoRI末端HTLV−1断片(列1)の挿入で得られた組換え体くク
リアー)プラークの数を示す。EcoRIリンカ−の対照(列2)およびバック
グラウンドを持たない対照(列3)も、実施された。表1かられかるように、約
50%のファージプラークが、酵素(組換え体)の欠失を示した。EcoRIリ
ンカ−が存在するもプラークの約60%が、酵素活性の欠失を示した。ファージ
材料は、約106ブラーク形成ユニツト(pfu)/mxを含有していた。
モノクローナル :ヒト細胞系(ATCC#C8755)に由来する精製した0
、5α抗体を、合衆国国立衛生研究所のthe National cance
r In5titute (メリーランド州、ベテスダ)のDr、 Sawue
l Broaderより得た。アルカリホスファターゼと結合した状態で誘導さ
れた(covalently clerivatized with alka
line phosphatase)マウス抗ヒトIgG抗体を、Promeg
a Biotec (ウィスコンシン州、マジソン)カラ得た。
組 え 46の石 :実施例1からの約10’pfuのファージストックで感染
した1M392細胞の一面のコロニー(lawn of KM392 cell
s)を、150mmプレートで調製し、37℃で約5〜8時間にわたりインキュ
ベートし、衰退した。ローンに、ニトロセルロースシートを敷き、プラークから
紙へ分泌されたHTLV−1組換え体タンパクを転移させた。プレートおよびフ
ィルターは、対応するプレートおよびフィルター位置にあわせるために、印を付
けた。
フィルターを、TBSTバッファー(10mM Tris、 pH8,0,15
0mMNaC1,0,05%Tveen20)で2回洗浄し、AIB(1%ゼラ
チンを含むTBSTバッファー)でブロックし、TBSTで再び洗浄し、0.5
αモノクローナル抗体(AIBで1〜2μg/mlに希釈; 12〜15m1/
プレート)を加えた後、−晩、インキュベートした。TBSTでシートを2回洗
浄し、その後、酵素標識抗ヒト抗体と接触させ、0.5α抗体で認識される抗原
を含むフィルター部位に標識抗体を付着させた。最終洗浄の後、フィルターを、
5mlのアルカリホスファターゼバッフy−(100mM Tris、 9.5
.100mM Na1l。
5mM MgC12)中の16μI BCIP (SoCに維持された50+n
g/mlのストック溶液)と混合した33μINBT(5℃に維持されたSon
g/mlのストック溶液)を含有する基質媒体中で発色させた。抗原産生点(O
95x抗体で認識される)では、紫色が現れた。
二゛プ1/−ティング:前記工程で決定された抗原産生領域を、82mmプレー
トに、約100〜200pfuで再びプレートした。上記工程、つまり、まず、
5〜8時間インキュベートし、NBT/BCIFによる発色の工程を、0.5α
抗体と反応し得る抗原を分泌するプラークを同定するために、繰り返した。同定
されたプラークを、取り上げ°、ファージバッファーで溶出した(Maniat
is、 p、443)。抗体反応性ペプチドを分泌する組換え体ファージプラー
クのうちの3つを、実施例3の方法による配列決定のために選択した。対応する
感染したファージは、MTA4. MTAIおよびMTASと命名された。
夾上ば一−Lは
ファージ ゛およびDNA
ファージMTA4゜MTA 1およびMTA 5を、感染したE、coli Y
1088バクテリアのプレート培養物より単離した。これらの細胞は、ATCC
(ATCC#31195)より入手可能である。プレートで生産された物質を、
低速遠心分離法によりバクテリア破砕物より精製し、上清をSII’27チュー
ブに注いだ。RNアーゼおよびDNアーゼを1mg/miのストック溶液から各
lμg/mlの濃度でそれぞれ加えた。試料を37℃で30分間イン牛1べ一ト
シ、20%m、v、 8000PEG、 5.8g NaC1,2、Og Mg
SO4−7120,IM TrisCl、 pH7,5,および2%ゼラチンを
含むポリエチレングリコール(PEG)溶液を等容量前えた。試料を1時間水浴
に置き、ファージ粒子を沈澱させ、その後、4°Cで約20分間10にで遠心分
離により単離した。
上清をデカンチーシランによって除き、ペレットを0.6mIPDBバッフy
−(S、8g NaC1,2,Og ygso、−’71(2o、50m1 L
M TrisCl、 pH7,5,および5m12%ゼラチン)中に再び懸濁さ
せ、1.5mlのボリブロビレンマイクロチューブに移した。5μm 10%S
DS、 5μm 0.5M EDTA、 および2.5μlプofイナーゼK(
201i1G/ML)を加え、試料を15分間50℃でインキュベートした。
洗浄剤および酵素処理された材料を、等量のフェノール/クロロホルムで抽出し
、遠心分離して相の分離を確実にした。
水相を新しいチューブに移し、抽出/遠心分離工程をクロロホルムとイソアミル
アルコールとの混合物を用いて繰り返した。等容量のイソプロパツールを加え、
試料を数回逆にして混合し、−70°Cで20分間冷却した。試料を5分間遠心
分離にかけ、上清をデカンテショーンで除いた。ベレットを70%エタノール中
で洗浄し、37℃ヒートブロックで簡単に乾燥し、100μI TEバッフ7−
1pH7,5に再び懸濁させた。
単離したファージDNAを■1および5aclで消化し、その後、KBLI/5
aclで切断したプラスミドベクターpGEM−3(PromegaBiote
c)と結合させ、所望の挿入物を有するプラスミド組換え体を単離した。HTL
V−1挿入物を、その後、標準ジデオキシ配列決定法を用い、EcoRI挿入部
位に隣接するλgtll配列の前後のプライマーを用いて配列決定した。
図は、試験された3つの融合ペプチドのそれぞれについて、コード配列、および
上記の方法によって形成された融合タンパクの一部分であり、上記コード配列に
対応するアミノ酸配列を示す。3つの各挿入配列で与えられたβ−gal遺伝子
の末端G塩基および隣接するenv遺伝子のCC塩基は、GCC(Ala)コド
ンを生じ、通常、3つの全てのHTLV−1env挿入物においてそののコドン
位置で生じるSetコドンを置換する。示されるように、MTA4の挿入物は、
HTLV−1:ff−ド領域ノ5565塩基から5790塩基まで延びている2
25塩基対配列を含み、これは、gp46g列の129から203位のアミノ酸
に対応する。MTA 1挿入物は、HTLV−1フード領域の5664塩基から
5807塩基まで延びている143塩基対配列を含み、これは、gp、aa配列
の161から209位のアミノ酸1こ対応する。MTA5ファージの挿入物もま
た、5664塩基で始まり、5895塩基まで延びている。この231塩基対配
列は、gp46タン/fりの161から240位のアミノ酸をカバーする。
5664から5790の挿入物の重なりの領域は、天然のgp46タンパクの1
61から203位のアミノ酸の41アミノ酸配列を含む。
E、coli C600株ヲ、スタッフォード大学 (カリフォルニア州、スタ
ンフォード)のDr、R,Davisより得た。または、E、cout Y10
89(ATCC#37196)も使用し得る。−晩培養し、飽和した1mlの細
胞培養物を、実施例IIIの3つのファージのひとつで感染させた。上記感染は
、−晩培養したバクテリア培養物50μlに、溶出したプラークストックを10
μI吸着させることにより行った。感染バクテリアを、LB寒天プレート(Ma
niatis。
p、 440)にまき、32℃でインキュベートした。個々のコロニーを、無菌
つまようじでつまみ上げ、2つの別々のプレートの対応するグリッドに付与した
。プレートの一方を32℃でインキュベートし、他方を42℃でインキュベート
した。低い方の温度で増殖した(ファージレプレッサータンパクの存在で産生さ
れた溶原状態を示した)が、高い方の温度ではく細胞溶解のため)増殖しなかっ
た細胞は、溶原性であると推定された。
3つの各ファー、ジのタイプから多くの溶原性のコロニーが見い本実施例は、M
TA4ファージを用いて実施例!■で調製されたλgtll溶原菌からHTLV
−1エピトープを含む組換え体タンノくりの誘導を説明する。上記で示されるよ
うに、抗原は、ファージβ−galタンパクのN末端部分を含むβ−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパクの形で製造される。
スーパーブロスを、35gバクトドリブトン、2gノ寸クトイーストエクストラ
クト、5g NaC1および5ml IN NaOHを、11の蒸留水中に含有
させて調製した。500m1のスーツで−ブロスに、上記の実施例で調製された
一晩培養した旦Co11λgtll溶原菌の飽和培養物を1:100で接種した
。この培養物を、激しくエアレーションを行ないながらA61111が、約0.
4〜0.5となるまで培養した。
タンパクの製造を最大にするために、培養物の温度を43〜44℃に上げた。そ
のことにより、温度感受性のβ−ガラクトシダーゼリプレッサー遺伝子が不活性
化された。温度を、65°Cの水槽中でエアレーションを行いながら15分間に
わたり43℃に維持した。更にタンパクの製造を増加させるために、IPTGを
プロスに加えた。このIPTGは、拮抗的にβ−galリブレ・ノサーに結合す
ることでβ−ガラクトシダーゼ発現を誘発する。培養物を、約1時間38°Cの
シェーカーに戻した。細胞をその後、37℃で15分間6,000 x gでペ
レ・2ト化し、溶解ノイ・ノファー(10mM Tris、 pH7,4,2%
TritonX−100,1% aprotinin、 50μg PMSF
)中に再懸濁し、そして、その後すぐに、液体N2に投入した。
溶解は、冷凍試料の解凍で完了した。
爽羞」L二■
融合タンパクの
前記実施例で得られた細胞溶解物を解凍し、37℃に暖めた。
10μmのDNアーゼ(1gg/ml)を加え、混合物を粘性が減少するまでイ
ンキユベートした。溶解物を水で急冷し、マイクロフニージ中で5分間4°Cに
て清澄化し、5epharose 4B (Pharmacia)に結合した抗
β−ガラクトシダーゼの6mlのカラムに負荷した。カラムを1〜2時間平衡化
し、7容量(カラム容積量)のTXバッフy −(10mM Tris、 pH
8,0,2%Triton X−100,50μg/rnI PMSF)で洗浄
し、5mM 3.5−ショートサリチル酸を含むTXバッファー2容量で洗浄し
た。融合タンパクをその後、35mM 3.5−ショートサリチル酸を含むTX
バッファーでカラムから溶離した。タンパクの大部分は、最初の3〜4容量で溶
離され、除去は、実質的に7容量で完了した。
溶離試料を脱塩し、Am1conフイルター(マサチニーセッツ州Danver
s)を用いて濃縮した。
HUT 102−82細胞をDr、R,C,Ga1lo、 LTCB、 NIH
から得た。これは、HTLV−1を製造することが知られている長期培養T−細
胞系である。
0.5α抗体(約5μg/ml IgG)もしくはアイソタイプの、適合したヒ
トIgGの対照を、MTA4組換え体ペプチドもしくは無関係な組換え体ととも
に30分間、室温でプレインキュベ・−トした。
50 μmのこれらの混合物を、その後、96ウエルマイクロタイタープレート
中の5x10’のHUT102B2に加え、室温で30分間インキュベートした
。ウェル当り、30μlのウサギの補体を加え、37℃で1時間インキュベート
した。細胞の生存を、顕微鏡観察で決定した。細胞溶解は、MTA4ペプチド抗
原の添加で明ら力)に阻止されたが、無関係な組換え体ペプチド抗原とのプレイ
ンキニベーションでは、阻止されなかった。組換え体抗原もしくは無関係な組換
え体ペプチド抗原とのプレインキニベーション後の、アイソタイプの対応ヒトI
gGは、HUT102−82生存に効果はなかった。
実施例 Vlll
1監エエ竺ヱ
精製MTA4ペプチド抗原を実施例IVの様に調製し、ニトロセルロースフィル
ターにド・ノトブロフトした。次0で、これをT−細胞白血病の患者(11TL
V−1感染の6人の患者)の血清抗体のアッセイに用いた。各場合とも、被検個
体からの0.1v11の様々な血清希釈溶液を、1:100から1:50,00
0の範囲で、フィルターに加え、30分間室温で反応させた。フィルターをその
後、TBSTバッファー(実施例II)で2回洗浄し、実施例11の様(こアル
カリホスファターゼと結合した抗ヒト抗体とともζこインキユベートした。抗体
の存在は、実施例IIと同様に、NBTおよびBCIPでの発色で決定された。
本発明を、特定の実施態様、構築方法および使用につtlて説明してきたが、本
発明から逸脱することなく、様々な変化および改変がなされ得ることは、当業者
には明らかである。
HTL一工
FIG、 IC
補正書の翻訳文提出書(特許法第184条の8)平成2年7月12日直
Claims (10)
- 1.組換え体ペプチド抗原であって、該抗原は、(a)HTLV−Iエンベロー プタンパクgp46に由来し、そして、(b)T細胞白血病の個体中に存在する 抗HTLV−I抗体と免疫反応性である。
- 2.請求項1に記載の抗原であって、該抗原は、非グリコシル化β−ガラクトシ ダーゼ融合タンパクである。
- 3.請求項1に記載の抗原であって、該抗原は、ATCC番号HC8755によ って特徴付けられる細胞系で産生される抗HTLV−I抗体と免疫反応性である 。
- 4.請求項1に記載の抗原であって、該抗原は、41個のアミノ酸を有する。
- 5.請求項1に記載の抗原であって、該抗原は、次のアミノ酸配列を有する: 【配列があります】
- 6.被検個体中のHTLV−I感染症を検出する方法であって、該方法は次の工 程を包含する: (a)HTLV−Iエンベロープタンパクgp46に由来し、そして(b)AT CC番号HC8755によって特徴付けられる細胞系で産生されるヒト抗HTL V−I抗体と免疫反応性である抗原を提供する工程;被検個体由来の血清と、そ のような抗原とを反応させる工程;および 結合した抗体の存在について、抗原を試験する工程。
- 7.請求項6に記載の方法であって、前記提供される抗原は固体支持体に付着し 、前記反応はそのような血清と支持体との接触を包含し、前記試験は支持体およ び結合した抗体とレポーター標識抗ヒト抗体との反応を包含する。
- 8.HTLV−Iに対する抗体の存在を確かめるためのキットであって、該キッ トは、 その表面に組換え体ペプチド抗原が結合した固体支持体を有し、該抗原は、(a )HTLV−Iエンベロープタンパクgp46に由来し、そして、(b)ATC C番号HC8755によって特徴付けられる細胞系で産生される抗ヒトHTLV −I抗体と免疫反応性であり;そして、 レポーター標識抗ヒト抗体、を有する。
- 9.T細胞白血病に対して個体を免疫化するワクチンであって、該ワクチンは、 薬理学的に受容され得るアジユバント中に組換え体ペプチドを有し、該ペプチド は、(a)HTLV−Iエンベロープタンパクgp46に由来し、そして、(b )T細胞白血病の個体中に存在する抗HTLV−I抗体と免疫反応性である。
- 10.請求項9に記載のワクチンであって、前記ペプチドは、次のアミノ酸配列 を有する: 【配列があります】。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP63502103A JP2559482B2 (ja) | 1988-01-12 | 1988-01-12 | Htlvーiペプチド抗原および分析法 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH09151199A (ja) * | 1995-08-30 | 1997-06-10 | Genelabs Technol Inc | Htlv−iペプチド抗原および分析法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62244393A (ja) * | 1986-04-04 | 1987-10-24 | エフ.ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー | Htlv−3gag/env遺伝子蛋白質の発現と精製 |
-
1988
- 1988-01-12 JP JP63502103A patent/JP2559482B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JPS62244393A (ja) * | 1986-04-04 | 1987-10-24 | エフ.ホフマン ― ラ ロシュ アーゲー | Htlv−3gag/env遺伝子蛋白質の発現と精製 |
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JPH09151199A (ja) * | 1995-08-30 | 1997-06-10 | Genelabs Technol Inc | Htlv−iペプチド抗原および分析法 |
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