JP2004224798A - Htlv−iiidnaのクローニングおよび発現 - Google Patents
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Abstract
【構成】 HTLV−III cDNAを含む組換えベクターを用いて形質転換した細胞により発現される免疫反応性HTLV−IIIポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法、HTLV−III遺伝子をコードする単離されたcDNA、HTLV−IIIウイルスに特異的なHTLV−IIIゲノムの部分と本質的に相同であるDNA配列からなるDNAプローブ、およびHTLV−IIIポリペプチドが少なくとも1つの他のポリペプチドに結合してなるハイブリッドタンパク質。
【選択図】 図2
Description
免疫反応性HTLV−IIIポリペプチドをコードするHTLV−III DNAのセグメントを単離するために、遺伝子操作法が使用される。これらのポリペプチドはエイズ患者からの血清またはHTLV−IIIに対する抗体と免疫反応性であり、これらにはコアタンパク質、HTLV−III DNAの1.1Kb EcoRI制限断片によりコードされる15Kdのペプチド、およびエンベロープ糖タンパク質が含まれる。これらの方法はまたポリペプチドをコードする断片の塩基配列決定にも使用できる。宿主細胞DNA内に組み込まれたプロウイルス遺伝子は分子的にクローニングされ、そしてクローニングされたプロウイルスのヌクレオチド塩基配列を決定する。
ウエスターンブロット分析もスクリーニングしたとき陽性であったクローンに対して行われる。エイズ患者からの血清が使用され、こうしてHTLV−III特異的抗体と交差反応するHTLV−III−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現するクローンを同定することが可能になる。この方法によって1000個のクローンがスクリーニングされ、そして6個のクローンが陽性であった。
HTLV−III DNAのヌクレオチド配列決定
HTLV−III DNAのヌクレオチド配列決定には遺伝子操作法を使用した。この配列決定に使用することができる1つの技術は、ショットガン/ランダム配列決定法である。HTLV−III DNAを約300〜500bpの大きさの断片にランダムにせん断する。これらの断片は例えばM13を使ってクローニングし、次いでコロニーはHTLV−III DNA断片挿入物を含むものを同定するためにスクリーニングする。その後塩基配列に重複部分が生ずるような多数の分析を行って、そのヌクレオチド配列を決定する。HTLV−III DNAの両鎖の塩基配列を決定してその向きを定める。制限酵素マッピングを用いて得られた塩基配列決定データを調べる。
p24のN末端およびgag p15のC末端(これはpolタンパク質のN末端と重なり合う)をコードする塩基配列位置が示されている。また、pol,sorおよびenv−lorの読み取り枠(ORF)も示される。クローンBH10(Rの一部,U5,tRNAプライマー結合部位およびリーダー配列の一部を含む)に存在しないHTLV−III DNAの残りの182塩基対の配列はクローンHXB2から誘導された。別の2つのクローン(BH8およびBH5)の塩基配列も示される。制限酵素部位はヌクレオチド配列の上に示し、クローンBH8に存在するがクローンBH10に存在しない部位はカッコ内に示す。ヌクレオチド251,254,5671および6987−7001に決失が見られる(〔 〕)。ヌクレオチドの位置(各線の右側)は転写開始部位からスタートしている。アミノ酸残基は4つの最も大きな読み取り枠に対して番号が付けられており(各線の右側)、各々の場合先行する終止コドンの後からスタートするが、gagの場合は最初のメチオニンコドンから数えている。提案されたペプチド切断部位(V)および起こりうるアスパラギン−結合グリコシル化部位(*)をenv−lor読み取り枠に対して示す。図3〜図14の最初に示したクローンBH8およびBH10から誘導されるLTRの塩基配列は各クローンの3′部分から誘導され、これらのウイルスゲノムの組み込まれたコピーの5′−LTRに存在するものと同一であると推定される。
HTLV−IIIに特異的なRNA,RNAプローブおよびDNAプローブの作製
HTLV−IIIからの全遺伝子または遺伝子セグメントであるDNA配列をT7ベクターのようなベクターに挿入する。この具体例は、ベクターがT細胞遺伝子10プロモーターからのTceuプロモーターおよびT細胞遺伝子10タンパク質からの11個のアミノ酸をコードするDNA配列を含む。
HTLV−IIIポリペプチドと反応するモノクローナル抗体の生産
HTLV−IIIポリペプチドと反応するモノクローナル抗体は、抗体産生細胞株によって生産される。抗体産生細胞株は普通ハイブリドーマとして知られるハイブリッド細胞株でありうる。このハイブリッド細胞は、HTLV−IIIポリペプチドに対する抗体を生産する細胞と、不滅性細胞(すなわちハイブリッド細胞に組織培養の長期安定性を付与する細胞)との融合によって作られる。ハイブリッド細胞株を作る場合、その第一の融合パートナー(抗体産生細胞)はHTLV−IIIポリペプチドに対して免疫化した動物の脾臓細胞でありうる。これとは別に、抗体産生細胞はHTLV−III抗原に対する抗体を産生するところの単離されたBリンパ球でありうる。このリンパ球は脾臓、末梢血液、リンパ節またはその組織から得ることができる。第二の融合パートナー(不滅細胞)はリンパ芽細胞または形質細胞腫細胞(例えば、それ自身抗体産生能を有する悪性の骨髄腫細胞)でありうる。
実施例1
超音波処理されたDNA断片の作製
ゲルにより精製したHTLV−III制限酵素断片10μgを超音波処理して、平均500bpの大きさに断片化した。超音波処理後、容量を減らすためにDNAを0.1×TBE中のDEAE−セルロースカラムに通した。DEAE結合DNAは0.2M NaCl−TE(2M NaCl,10mm トリス−HCl pH7.5、1mM EDTA)5mlで洗い、次に1M NaCl−TEで溶出してエタノール沈殿させた。超音波処理したDNAの大きさを1.2%アガロースゲルにより測定した。所望の長さ(200〜500bp)のDNA断片をゲルから溶出した。T4DNAポリメラーゼを使って、超音波処理法によって生じた一本鎖DNA末端を修復および/または切り取った。DNA断片をT4ポリメラーゼと共にヌクレオチドを添加することなく37℃で5分間インキュベートして3′末端からヌクレオチドを除き、次に4種のヌクレオチド前駆体を最終濃度が100μMとなるように加え、この反応混合物をさらに30分インキュベートして5′末端の一本鎖のつき出た部分を修復した。68℃で10分間酵素を熱不活化することによりこの反応を停止させた。DNAは1度フェノール抽出し、エタノール沈殿させ、そしてTE中に再懸濁した。
実施例2
ランダムにせん断したDNA断片のクローニング
超音波処理しかつ平滑末端に修復したHTLV−III DNA断片を、ORF発現ベクターpMR100のSmaI部位に連結し、そして標準形質転換法を使って宿主細胞LG90を形質転換した。形質転換細胞のβ−ガラクトシダーゼ陽性表現型は、その形質転換細胞をアンピシリン(25μg/ml)含有マッコンキー寒天平板上に採置して、表現型を37℃で20時間後に評価することによって同定した。
実施例3
ハイブリッドタンパク質分析
アンピシリン(25μg/ml)含有Lブイヨン中で一晩増殖させた飽和培養物からの細胞10ml試料を遠心分離し、細胞沈殿物を1.2倍に濃縮したレムリ(Laemmli)サンプル緩衝液500μlに再懸濁した。細胞は渦巻混合し、100℃で3分間沸騰させることにより再懸濁した。次に、この溶菌液を22ゲージ針を使って繰り返しせん断し、溶菌液の粘度を低下させた。タンパク質試料約10μlは7.5% SDS−PAGE(SDS−ポリアクリルアミド)ゲルによる電気泳動処理を行った。
実施例4
コロニーハイブリダイゼーションによるHTLV−III ORFライブラリーのスクリーニング
大腸菌LG90形質転換体は意図するDNA領域(例えばHTLV−III
gag,envまたはPx遺伝子の特定配列)を含むHTLV−III DNAプローブを用いてスクリーニングした。ニトロセルロースフィルター上でコロニーを増殖させ、ハイブリダイゼーションプローブとしてニックトランスレーションされたHTLV−III DNAを使い、グルンスタイン(Grunstein)およびホグネス(Hogness)の方法に従ってスクリーニングした。
実施例5
エイズ患者からの血清と免疫反応するHTLV−IIIの組換えDNAによって生産されたペプチド
発現ベクターとしてpIN−III−ompA(ompA)を使用した。ompAはリポタンパク質(大腸菌中で最も豊富なタンパク質)遺伝子プロモーター(lpp)およびlacUV5プロモーター−オペレーターを有する(図16参照)。ompAベクターはさらにlacリプレッサーをコードするDNAセグメントを含み、これは挿入DNAの発現をIPTGのようなlacオペロン誘導物質により調節させる。ompAクローニングベクターは3つの読み取り枠の全てに3つの特異な制限酵素部位EcoRI、HindIIIおよびBamHIを含み、そしてこれらの制限酵素部位のいずれかにDNAが挿入される。
ヌクレオチド位置24−29には6bpのリボソーム結合部位AAGGAG(シャイン−ダルガルノの配列、Shine−Dalgarno sequence)があり、これにより11bp下流(位置41−43)には開始コドンATGが存在する。3つの組換え体の全てによって合成される15Kdのペプチドは、この内部開始コドンを使用して転写物から翻訳されると考えられる。このことが真実である場合には、ペプチドは位置41−43に存在するATGから出発して、位置446−448に存在する停止コドンで終り、それによりHTLV−IIIのpol遺伝子の3′末端セグメントによりコードされる135アミノ酸残基から成るペプチドが生産される。
実施例6
HTLV−IIIの読み取り枠遺伝子セグメントの大腸菌内での発現
HTLV−III DNAをラムダBH10から切り取った。このラムダBH10はベクターラムダgtWESラムダB内に挿入したHTLV−III DNAの9Kbセグメントを含む先に作製した組換えラムダファージである。このHTLV−III DNAを超音波処理し、約0.5KbのDNA断片をゲル電気泳動により精製し、末端修復し、そしてORFベクターpMR100のSmaI部位に挿入した(図21参照)。このベクターはハイブリッドコーディング配列〔バクテリオファージラムダのラムダCI遺伝子のN末端(5′セグメント)がN末端欠失lacIZ遺伝子(3′セグメント)に融合される〕を含む第二DNA断片に結合した細菌lacプロモーターDNAセグメントを含む。SmaIクローニング部位を含む短いリンカーDNA断片を、lacIZコーディングDNAの上流でフレームシフト変異が起こるような方法で、これらの2つの断片の間に挿入した。その結果、pMR100はLac−宿主大腸菌LG90の細胞内に導入したとき検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を示さない。SmaIクローニング部位に読み取り枠を含む外来性DNA(この場合はHTLV−III DNA)を挿入すると、その挿入コーディング配列がラムダCIリーダーおよびlacIZ遺伝子の双方に関して正しい読み取り枠内にある場合、フレームシフト変異を逆転させることができる。形質転換細胞はマッコンキー平板上でスクリーニングして、β−ガラクトシダーゼ酵素活性をその場で発現する個々のクローンを検出した。
産業上の適用可能性
本発明は、体液中のHTLV−III DNAの存在に関するスクリーニングおよびエイズの診断に利用される。
均 等 物
本明細書で述べた特定の物質および方法に均等の多数の物質および方法が、単に日常的な実験法を使用することにより当業者によって認識され、また確認されるであろう。このような均等物は本発明の範囲内であると考えられ、先の特許請求の範囲に包含される。
Claims (16)
- HTLV-IIIのenv/env-lor DNA由来であり、且つ、図3〜図14の塩基配列中の
ヌクレオチド5323から8052である図2AのEcoRI-BamHI DNA断片、
ヌクレオチド5323から8474である図2AのEcoRI-XhoI DNA断片、
ヌクレオチド5323から8592である図2AのEcoRI-KpnI DNA断片、
ヌクレオチド5323から8628である図2AのEcoRI-BglII DNA断片、
ヌクレオチド5924から8052である図2AのKpnI-BamHI DNA断片、
ヌクレオチド5924から8474である図2AのKpnI-XhoI DNA断片、
ヌクレオチド5924から8592である図2AのKpnI-KpnI DNA断片、
ヌクレオチド5924から8628である図2AのKpnI-BglII DNA断片、
ヌクレオチド6618から8052である図2AのBglII-BamHI DNA断片、
ヌクレオチド6618から8474である図2AのBglII-XhoI DNA断片、
ヌクレオチド6618から8592である図2AのBglII-KpnI DNA断片、
ヌクレオチド6618から8628である図2AのBglII-BglII DNA断片、
ヌクレオチド7198から8052である図2AのBglII-BamHI DNA断片、
ヌクレオチド7198から8474である図2AのBglII-XhoI DNA断片、
ヌクレオチド7198から8592である図2AのBglII-KpnI DNA断片、及び
ヌクレオチド7198から8628である図2AのBglII-BglII DNA断片
からなる群から選択されるHTLV-IIIのDNA断片によりコードされる、後天性免疫不全症候群の患者の血清またはHTLV-IIIに対する抗体を含む血清に免疫反応性である、単離された組換えHTLV-III env/env-lorポリペプチド。 - HTLV-IIIのgag DNA由来であり、且つ、図3〜図14の塩基配列中の
ヌクレオチド34から1550である図2AのSstI-ApaI DNA断片、
ヌクレオチド34から1640である図2AのSstI-BglII DNA断片、
ヌクレオチド959から1550である図2AのPstI-ApaI DNA断片、及び
ヌクレオチド959から1640である図2AのPstI-BglII DNA断片
からなる群から選択されるHTLV-IIIのDNA断片によりコードされる、後天性免疫不全症候群の患者の血清またはHTLV-IIIに対する抗体を含む血清に免疫反応性である、単離された組換えHTLV-III gagポリペプチド。 - HTLV-IIIのpol DNA由来であり、且つ、図3〜図14の塩基配列中の
ヌクレオチド2009から3406である図2AのBclI-KpnI DNA断片、
ヌクレオチド2009から4228である図2AのBclI-EcoRI DNA断片、
ヌクレオチド2009から3734である図2AのBclI-KpnI DNA断片、
ヌクレオチド3406から4228である図2AのKpnI-EcoRI DNA断片、及び
ヌクレオチド3734から4228である図2AのKpnI-EcoRI DNA断片
からなる群から選択されるHTLV-IIIのDNA断片によりコードされる、後天性免疫不全症候群の患者の血清またはHTLV-IIIに対する抗体を含む血清に免疫反応性である、単離された組換えHTLV-III polポリペプチド。 - HTLV-IIIDNA断片を含む組換えベクターで形質転換された細胞により発現される、請求項1乃至6の何れか1項に記載のポリペプチド。
- 組換えベクターがOmpAまたはpMR100である、請求項7に記載のポリペプチド。
- β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として生産される、請求項8記載のポリペプチド。
- 以下の工程:
(a)固相に固定した請求項1乃至9の何れか1項に記載の単離されたHTLV-IIIポリペプチドを含む免疫吸着剤を、単離された体液と接触させることにより、体液中のHTLV-IIIポリペプチドに対する抗体を固定化HTLV-IIIポリペプチドと結合させ;
(b)体液から該免疫吸着剤を分離し;
(c)該免疫吸着剤を標識HTLV-IIIポリペプチドまたはヒト免疫グロブリンに対する標識抗体と接触させ;そして
(d)HTLV-IIIに対する抗体の存在の指標として、免疫吸着剤に結合した工程(c)の標識ポリペプチドまたは標識抗体の存在を検出すること;
からなる、単離されたHTLV-IIIポリペプチドに対する体液中の抗体を検出する方法。 - 請求項1乃至9の何れか1項に記載の単離されたHTLV-IIIポリペプチドを試料と接触させ;そして、前記ポリペプチドと結合した抗体の存在を検出する工程からなる、HTLV-IIIに対する抗体を検出するための免疫アッセイ。
- 請求項1乃至9の何れか1項に記載の単離されたHTLV-IIIポリペプチドを含む、診断試薬。
- ポリペプチドが標識されている、請求項12に記載の診断試薬。
- ポリペプチドが固定化されている固相をさらに含む、請求項12に記載の診断試薬。
- 請求項1乃至9の何れか1項に記載の単離されたHTLV-IIIポリペプチドと特異的に反応する固相固定化抗体、および該HTLV-IIIポリペプチドと特異的に反応する標識可溶性抗体を含む、アッセイキット。
- (i) 固相に固定化した請求項1乃至9の何れか1項に記載の単離されたHTLV-IIIポリペプチドを含む、免疫吸着剤、および
(ii)標識HTLV-IIIポリペプチドまたはヒト免疫グロブリンに対する標識抗体
を含む、体液中のHTLV-IIIに対する抗体の存在を測定するためのアッセイキット。
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