JPH10508461A

JPH10508461A - 独特の関連したカポシ肉腫ウイルス配列およびその使用

Info

Publication number: JPH10508461A
Application number: JP8508135A
Authority: JP
Inventors: ユアンチャン、; パトリック・エスムーア、
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1994-08-18
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1998-08-25
Also published as: EP0804547A4; CA2196892A1; AU3321095A; WO1996006159A1; EP0804547A1; AU700913B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、長さが少なくとも３０ヌクレオチドで、且つカポシ肉腫に関連したヘルペスウイルスを独特に定義する単離されたＤＮＡ分子を提供する。本発明は、カポシ肉腫に関連した単離されたヘルペスウイルスを提供する。本発明は、ペプチドに対して特異的な抗体を提供する。また、アンチセンス分子およびトリプレックスオリゴヌクレオチド分子が提供される。本発明は、ＫＳについて患者をワクチン接種する方法、ＫＳをもった患者を予防、診断またはは治療する方法、およびカポシ肉腫に関連したＤＮＡウイルスの細胞内における発現を検出する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】独特の関連したカポシ肉腫ウイルス配列およびその使用ここに開示される発明は、保健社会福祉省の疾病制圧および予防センターの共同研究契約ＣＣＵ210852号の下に、政府の補助を受けてなされたものである。従って、アメリカ合衆国政府は本発明における一定の権利を有する。この出願は、1995年４月11日に出願された米国特許出願第08/420,235号の一部継続出願である。この親出願は、1994年11月21日に出願された米国特許出願第08 /343,101号の一部継続出願であり、これはまた1994年８月18日に出願された米国特許出願第081292,365号の一部継続出願である。これらの関連出願は、参照として本願に組み込まれる。この出願を通して、括弧の中のアラビア数字により種々の刊行物が参照される。これら刊行物の完全な引用は、実験の詳細の各セクションの末尾に列記されている。ここに引用する刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために、その全体が参照として本願に組み込まれる。〔発明の背景〕カポシ肉腫（ＫＳ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者に発生する最も普通の新生物である。免疫力を有する個体では希にしか発生しないこの新生物を、ＡＩＤＳ患者では略15〜20％が発症する。疫学的な証拠は、ＡＩＤＳ関連のＫＳ（ＡＩＤＳ−ＫＳ）が感染性の病因を有することを示唆している。ゲイおよびバイセクシュアルのＡＩＤＳ患者は、血友病ＡＩＤＳ患者に比較して略２０倍もＫＳを発症し易いので、ＫＳは、ＡＩＤＳに罹ったゲイ男性の間での特殊な性的行動に関連している可能性がある。ＫＳは、異性間性交渉若しくは非経腸的ＨＩＶ感染によって感染した成人ＡＩＤＳ患者の間、または垂直ＨＩＶ感染によって感染した小児ＡＩＤＳ患者の間では希である［７７］。以前にＫＳを起こすことが疑われた物質には、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス６、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびマイコプラズマ・ペネトランスが含まれている［１８，２３，８５，９１，９２］。亜硝酸吸入剤のような非感染性の環境物質もまた、ＫＳ腫瘍発生において役割を果たすことが提示されている［３３］。しかしながら、広範な研究によっても、これら物質の何れかとＡＩＤＳ−ＫＳとの間の疫学的な関連は示されていない［３７，４４，４６，９０］。〔発明の概要〕本発明は、少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、またカポシ肉腫に関連したヘルペスウイルスを独特に定義する単離されたＤＮＡ分子を提供する。本発明は、カポシ肉腫に関連した単離されたヘルペスウイルスを提供する。本発明は、ＫＳの患者にワクチン接種する方法、ＫＳに罹った患者を予防診断または治療する方法、および細胞内におけるカポシ肉腫関連ＤＮＡウイルスの発現を検出する方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１：ＡＩＤＳ−ＫＳ組織および無関係の組織に由来するＲＤＡ産物のアガロースゲル電気泳動。ＲＤＡは、ＡＩＤＳ−ＫＳに罹ったホモセクシュアルの男性からオートプシーで得たＫＳ皮膚組織から抽出したＤＮＡと、無関係の正常皮膚組織から抽出されたＤＮＡについて行われた。レーン１は、Ｂａｍ・ＨＩ消化後における、ＡＩＤＳ−ＫＳの初期ＰＣＲ増幅ゲノム表現を示している。レーン２〜４は、その後のＲＤＡ産物のライゲーションサイクル、ハイブリダイゼーションサイクル、および消化サイクルによって、３８０、４５０、５４０および６８０ｂｐの別々のバンドの増幅がもたらされたことを示している。抽出されたＡＩＤＳ− ＫＳ・ＤＮＡのそれ自身に対して行われたＲＤＡは、５４０ｂｐの単一のバンドを生じた（レーン５）。３８０ｂｐおよび６８０ｂｐのバンドは、２８ｂｐのプライミング配列を除去した後の、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍに夫々対応する。４５０および５４０ｂｐのバンドは、ＫＳヒトＤＮＡおよび非ＫＳヒトＤＮＡの両者に対して非特異的にハイブリダイズした。レーンＭは分子量マーカである。図２Ａ〜２Ｂ： ³²ＰでラベルしたＫＳ３３０Ｂａｍ（図２Ａ）およびＫＳ６２７Ｂａｍ（図２Ｂ）の配列の、ＫＳ病巣から抽出し且つＢａｍ・ＨＩで消化した１９のサンプルの代表的なパネルに対するハイブリダイゼーション。ＫＳ３３０Ｂａｍは、ＡＩＤＳ−ＫＳ病巣から得た１９のＤＮＡサンプルのうちの１１のサンプルとハイブリダイズし、またＫＳ６２７Ｂａｍは１９のうちの１２のサンプルとハイブリダイズした。長時間の露出の後に、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍの両者に関して弱いバンドを有する、追加の二つのケース（レーン１２および１３）が示されている。一つの陰性検体（レーン３）は、顕微鏡で検出可能なＫＳを組織内に有していない。追加の８つのＫＳ・ＤＮＡサンプルのうちの７つのサンプルが、両方の配列にハイブリダイズした。図３Ａ〜３Ｆ：ＫＳ３３０₂₃₄プライマーを用いた、ＫＳ由来の代表的なＤＮＡサンプルセットのＰＣＲ増幅。図４Ａは、１９のＫＳ・ＤＮＡサンプル（レーン１〜１９）からの増幅生成物のアガロースゲルを示しており、図４Ｂは、ゲルをニトロセルロースフィルターに移した後の、³²Ｐ末端ラベルされた２５ｂｐ内部オリゴヌクレオチド（図３Ｂ）に対するＰＣＲ生成物の特異的ハイブリダイゼーションを示している。レーン３および１５の陰性サンプルは、それぞれ、顕微鏡で検出可能なＫＳがサンプル中になく、或いは構造的なｐ５３エキソンを増幅せず、これらのサンプルは技術的な理由で陰性であったことを示唆している。追加の８つのＡＩＤＳ−ＫＳサンプルが増幅され、全てＫＳ３３０₂₃₄について陽性であった。レーン２０は陰性対照であり、レーンＭは分子量マーカである。図５：三人の患者（レーン１，２および３）から抽出され且つＰｖｕＩＩで消化されたＡＩＤＳ−ＫＳゲノムＤＮＡに対する、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍのサザンブロットハイブリダイゼーション。配列情報（図３Ａ）に基づいて、ＰｖｕＩＩの制限酵素部位がＫＳＨＶ配列（図３Ａ、配列ＩＤ番号１）のｂｐ 12361〜12362の間、ＫＳ３３０Ｂａｍ（図３Ｂ、配列ＩＤ番号２）におけるｂｐ 134およびＫＳ６２７Ｂａｍ（図３Ｃ、配列ＩＤ番号３）におけるｂｐ414に発生する。ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍは、消化物の同じフラグメントとハイブリダイズせず、介在する一以上のＢａｍＨＩ制限酵素フラグメントによって二つの配列が互いに分離されたことを示した。ＰｖｕＩＩを用いた消化、およびＫＳ３３０Ｂａｍへのハイブリダイゼーションは二つの異なった結合パターン（レーン１および２vs．レーン３）を生じ、ＫＳサンプル間の変化を示唆した。図６：ＫＳ３３０Ｂａｍを含むカポシ肉腫物質のＥＢＶ・ＯＲＦ・ＢＤＬＦ１、ＨＳＶＳＡ・ＯＲＦ２６、および９１８ｂｐのリーディングフレームの間の、アミノ酸相同性の比較。アミノ酸の同一性は、反転文字(reverse lettering)によって指定されている。ＨＳＶＳＡにおいて、ＯＲＦ２６は後期遺伝子産物であるマイナーキャプシドＶＰ２３をコードする。図７：ＢＣＢＬ−１細胞と共培養されたラジ細胞(Raji Cells)のサブ培養物を、ＴＰＡで２日間処理した。ＰＣＲによって、ＫＳＨＶ配列については陽性であることが分かり、この物質が伝染性ウイルスであることが示された。図８：ＫＳ520,710ｂｐのＤＮＡフラグメントについて同定されたＫＳＨＶオープンリーディングフレームの、ＫＳＨＶの配向を示す模式図。ＨＳＶＳＡのＯＲＦ２８に対応する領域（中間の図式セクション）を除いて、ヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＳＶＳＡ；Herpesvirus saimiri）ゲノムの対応する領域に由来する各オープンリーディングフレームに対する相同体が同一の配向の中に存在している。各オープンリーディングフレームに付された陰影は、ＨＳＶＳＡ中のこの相同体と比較したときの、ＫＳＨＶ・ＯＲＦのアミノ酸同一性の概略％を示している。このＤＮＡセクションに存在する注目すべき相同体には、チミジンキナーゼ（ＯＦＲ２１）に対する相同体、ｇＨ糖タンパク（ＯＲＦ２２）に対する相同体、主キャプシドタンパク（ＯＲＦ２５）に対する相同体、および表象的相違分析(r epresentational difference analysis)によって誘導された元のＫＳ３３０Ｂａｍを含んだＶＰ２３（ＯＲＦ２６）に対する相同体が含まれる。図９：ＢＣＢＬ１溶解物（Ｂ１）およびラジ溶解物に対するＫＳ患者血清のウエスタンブロットに現れる、〜２００ｋＤの抗原バンド。Ｍは分子量マーカである。この抗原は略２１０ｋＤおよび２４０ｋＤの間のダブレットである。図１０：ＫＳを含まない５人の対照患者の血清（Ａ１Ｎ，Ａ２Ｎ，Ａ３ＮＡ４Ｎ，Ａ５Ｎ）。Ｂ１＝ＢＣＢＬ１溶解物、ＲＡ＝ラジ溶解物。２２０ｋＤバンドは、ＫＳを含まない患者血清を用いたウエスタンブロットには存在しない。図１１：この図では、0.5ｍｌのグラジエント溶離アリコートを、画分番号１を３０％、画分番号６２を３０％として分画した（画分１〜６２）。夫々の画分をニトロセルロース膜にドットハイブリダイズし、次いでこの膜に対して、³²Ｐ-ラベルしたＫＳＨＶ・ＤＮＡフラグメントであるＫＳ６３１Ｂａｍを、標準の技術を用いてハイブリダイズさせた。この図は、グラジエント溶離液の画分４２〜４８中におけるＫＳＨＶゲノムバンドの主要な可溶化された（即ち、単離された）画分が、画分４４の中に最も高濃度で存在することを示している。可溶化されたＫＳＨＶ・ＤＮＡのバンドは、画分２６〜３２に存在する。図１２：ヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＳＶ）、ウマ・ヘルペスウイルス２（ＥＨＶ２）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の翻訳生成物と比較したときの、ＫＳ５オープンリーディングフレームの位置、特徴および相対的均質度。図１３：ＢＨＬ−６およびＰ３Ｈ３に対するＡＩＤＳ−ＫＳ血清およびＡＩＤＳ対照血清における、Ｐ３Ｈ３を用いた吸着の前後における間接的免疫蛍光法の終点および平均力価（ＧＭＴ）。図１４：ＫＳ５、ＡＩＤＳ−ＫＳ病巣から調製したヒトゲノムライブラリー由来の20.7 ｋｂラムダファージクローン挿入物の遺伝子地図。１７の部分的および完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）が同定され、矢印はリーディングフレームの向きを示す。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムおよびヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＶＳ）のゲノムの対応する領域が示されている。ＫＳＨＶ・ＯＲＦｓの間のアミノ酸類似レベルが、ＥＢＶおよびＨＳＶのＯＲＦｓに陰影を付すことによって示されている（黒は７０％以上の類似性；暗いグレーは５５〜７０％の類似性；明るいグレーは４０〜５４％の類似性；白は検出可能な相同性なし）。保存されたヘルペスウイルス配列ブロックのドメインおよびサブクローニングに用いた制限エンドヌクレアーゼ部位の位置が、ＫＳＨＶ地図の下に示されている（ＢはＢａｍＨＩ部位；ＮはＮｏｔＩ部位）。ＶＰ２３遺伝子ホモローグにおける小さなＢａｍＨＩフラグメント（黒）は、ＫＳ５ラムダファージクローンを同定するために用いられた表象的相違分析(representational differ ence analysis)によって生じたＫＳ３３０Ｂａｍフラグメントに対応する。図１５Ａ〜１５Ｂ：ＭＣＰ遺伝子および連鎖状の９遺伝子セットについての、ヘルペスウイルス類の間で整列されたアミノ酸配列の比較に基づくＫＳＨＶの系統発生ツリー。ＭＣＰ配列（図１５Ａ）の比較は、隣接部結合法(neighbor-joining method)によって得られたものであり、各枝を結ぶノード間のダイバージェンス(部位当たりの置換発生の平均数)に比例した枝の長さを有するルーツのない形(unrooted form) で示されている。最大節減分析(maximum parsimony analysis)によって、比較可能な結果が得られた。夫々の内部枝に示した分類(division)が得られた１００ブートストラップサンプリングからの回数が、夫々の枝の次に示されている；７５未満のブートストラップ値は示されていない。図１５Ｂは、９遺伝子セットＣＳ１（テキスト参照）に基づくガンマヘルペスウイルス配列の系統発生ツリーであり、ＫＳＨＶがガンマ２・ヘルペスウイルスの副系統、即ちラディノウイルス属 (genus Rhadinovirus)に最も密接に関連していることを示している。このＣＳ１アミノ酸配列は、Ｐｒｏｔｍｌ最大可能性法(Protml maximum likelihood metho d)によってツリーを推論するのために用いられた；隣接部結合法および最大節減法を用いて、図示しない比較可能な結果が得られた。中央の枝についてのブートストラップ値は顕著である。ＭＣＰ分析に基づけば、ルーツはＥＢＶと他の三つの種との間に存在しているに違いない。配列比較に用いたウイルス種の略号は次の通りである。１）アルファ・ヘルペスビリナエ：ＨＳＶ１およびＨＳＶ２、単純ヘルペスウイルス１型および２型；ＨＳＶ１、ウマ・ヘルペスウイルス１；ＰＲＶ、シュードラビーウイルス；ＶＺＶ、バリセラ・ゾスターウイルス。２）ベエタ・ヘルペスビリナエ：ＨＣＭＶ、ヒト・サイトメガロウイルス；ＨＨＶ６およびＨＨＶ７、ヒトヘルペスウイルス６および６。３）ガンマ・ヘルペスビリナエ：ＨＶＳ、ヘルペスウイルスサイミリ；ＥＨＶ２、ウマ・ヘルペスウイルス２；ＥＢＶ、エプスタインバーウイルス；およびカポシ肉腫関連ヘルペスウイルス。図１６Ａ〜１６Ｂ：ＫＳ６３１Ｂａｍ（図１６Ａ）およびＥＢＶ末端リピート（図１６Ｂ）にハイブリダイズした、ＢＣＢＬ−１ＤＮＡのＣＨＥＦゲル電気泳動。ＫＳ６３１Ｂａｍは、２７０ｋｂのバンド並びにオリジンでの拡散バンドとハイブリダイズする。ＥＢＶ末端配列は、ゲノムの線形フォームに一致した１５０−１６０ｋｂのバンドにハイブリダイズする。ＫＳ６３１Ｂａｍ（暗い矢印）およびＥＢＶ末端配列は、オリジンの直下の高分子量バンドとハイブリダイズし、連鎖状または環状のＤＮＡの可能性を示している。このＫＳ６３１Ｂａｍがハイブリダイズする高分子量バンドは再現性に乏しいが、もとのオートラジオグラフ上に見られる。図１７：ＴＰＡの濃度を増大させながらの、ＢＣＢＬ−１中へのＫＳＨＶおよびＥＢＶ複製の導入。夫々の測定はＴＰＡインキュベーションの４８時間後に３回行われ、ハイブリダイゼーションは、ベータアクチンに対するハイブリダイゼーションによって細胞ＤＮＡの量に対して標準化された。図は、非誘導ＢＣＢＬ−１に比較した、ＴＰＡにより誘導されたＥＢＶおよびＫＳＨＶについての、ハイブリダイズするゲノムの相対的増大の平均および範囲を示している。２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡは、４８時間でのＥＢＶゲノム（上の線）において８倍の増加を誘導した。これに対して、ＫＳＨＶゲノム（下の線）は1.4倍しか増大しなかった。ＫＳＨＶ誘導は低レベルではあるが、１０ｎｇ／ｍｌを越えるＴＰＡ濃度での誘導の後に、ＫＳＨＶゲノムの増大した複製が再現性をもって検出された。図１８Ａ〜１８Ｃ：ＯＲＦ２６オリゴマーを用いたＢＣＢＬ−１細胞、ラジ細胞およびＲＣＣ−１細胞に対するin situハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーションは、ＫＳＨＶに感染したＢＣＢＬ−１の核に対しては生じたが（図１８Ａ）、非感染ラジ細胞（図１８Ｂ）に対しては生じなかった。ＲＣＣ−１細胞ライン、即ち、0. 45μのフィルターにより分離された連通するチャンバ内においてラジ細胞とＢＣＢＬ−１細胞との培養によって誘導されたラジ細胞ラインは、ＫＳＨＶ・ＯＲＦ２６プローブに対して積極的にハイブリダイズする珍しい細胞を示した。図１９Ａ〜１９Ｄ：ＡＩＤＳ−ＫＳ患者血清およびＫＳを伴わないＨＩＶ感染患者からの対照血清を用いた、ＢＨＬ−６のＩＦＡ染色の代表例。ＡＩＤＳ−ＫＳ血清（図１９Ａ）および対照血清（図１９Ｂ）は、１：５０の希釈で、ＢＨＬ−６の均質な染色を示している。パラホルムアルデヒド固定されたＰ３Ｈ３を用いた吸着により、リンパ球およびＥＢＶ抗原に対して交差反応する抗体を除去した後に、ＡＩＤＳ− ＫＳ血清由来の抗体はＢＨＬ−６核に集中した（図１０Ｃ）。対照血清のＰ３Ｈ３吸着は、ＢＨＬ−６の免疫蛍光染色を排除した（図１９Ｄ）。図２０Ａ〜２０Ｂ：ＡＩＤＳ−ＫＳ患者（Ａ）およびＫＳを伴わないホモセクシュアル／バイセクシュアルＡＩＤＳ患者（Ｂ）から得た、対のＢＰＭＣサンプルのＫＳＨＶ・ＤＮＡについての長手方向ＰＣＲ試験(longitudinal PCR examination)。時間０は、症例のＫＳ発症日、またはＡＩＤＳを定義する他の病気の対照についての発症日である。全てのサインプルはランダム化され、盲検で試験された。全体に、ＫＳ患者のうちの７人は、両方の試験日（塗りつぶしたバー）においてＫＳＨＶ陽性であり、また５人は、ＫＳ発症の直前または発症後に陰性から陽性ＰＢＭＣサンプル（前方に向かう縞のバー）に変った。以前に陽性であった二人のＫＳ患者は、ＫＳ診断の後に陰性であり（逆向きの縞バー）、残りのＫＳ患者は何れの時点でも陰性であった（白のバー）。ＫＳを伴わない二つのホモセクシュアル／バイセクシュアルの対照サンプルは陰性から陽性に転換し、一人の対照患者はＫＳＨＶ・ＤＮＡについてＰＣＲ陽性から陰性に反転した。図２１：ＡＩＤＳ−ＫＳ患者、ゲイ／バイセクシャルのＡＩＤＳ患者および血友病ＡＩＤＳ患者に特徴的なサンプルコレクション。図２２：カポシ肉腫を伴う患者および腫瘍対照に由来するＤＮＡサンプル中におけるＫＳ３３０₂₃₃のＰＣＲ分析。図２３：ＫＳを伴う患者およびＫＳを伴わない患者の研究ポピュレーションの特徴。図２４：ＫＳを伴うＨＩＶ−１陽性患者およびＫＳを伴わないＨＩＶ−１陽性患者における、ＫＳＨＶ・ｐ４０に対する抗体の普及。図２５：ＫＳＨＶ・ｐ４０に対する抗体を有するＫＳ患者および有さないＫＳ患者の比較。図２６：ＫＳを伴うＨＩＶ−１陽性患者およびＫＳを伴わないＨＩＶ−１陽性患者において、化学的に誘導されたＢＣＢＬ−１おけるＫＳＨＶ抗原に対する間接免疫蛍光法により検出可能な抗体の普及。図２７Ａ〜７Ｂ：化学的に処理されたＢＣＢＬ−１細胞における、ＫＳＨＶポリペプチドの特異的認識。図２７Ａは、未処理のＢＣＢＬ−１細胞およびＢ９５−８細胞のＲＭとの反応性を示しており、参照はＥＢＶに対するヒト抗体である。ＲＭは、ＢＣＢＬ−１細胞におけるＥＢＶポリペプチドＥＢＮＡ１およびｐ２１を認識する。図２７Ｂは、ＫＳを伴う患者由来の血清０１−０３との間での、未処理細胞および化学処理細胞の反応性を示している。細胞は、ＴＰＡおよびｎ−ブチレートで４８時間処理された。細胞ラインの説明については、材料および方法の章を参照されたい。免疫ブロットは、免疫ブロットは、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから調製された。図２８Ａ〜２８Ｄ：ＫＳを伴う患者由来の血清による、ＫＳＨＶ・ｐ４０の検出。化学的誘導剤、即ちｎ−ブチレート、ＴＰＡもしくはこれら二つの薬剤の組合せで４８時間誘導された、または非誘導のＢＣＢＬ−１細胞（ＫＳＨＶおよびＥＢＶを含む）およびクローンＨＨ５１４−１６細胞（ＥＢＶのみを含む）から抽出物を調製した。１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから調製されたイムノブロットを、ＨＩＶ −１陽性患者由来血清の１：２００希釈液と反応させた。図２８Ａは、ＫＳを伴う患者由来の血清０１〜０６を示している。図２８Ｂは、ＫＳを伴わない患者由来の血清０１〜０７を示している。図２８Ｃは、ＫＳを伴う患者からの血清０４〜０１を示している。図２８Ｄは、ＫＳを伴う患者からの血清０１−０３を示している。図２９Ａ〜２９Ｆ：間接的免疫蛍光法によるＫＳＨＶ溶解サイクルの検出。ＢＣＢＬ−１細胞を非処理のままとするか（図２９Ａ、２９Ｃおよび２９Ｅ）、或いはｎ−ブチレートで４８時間処理した（図２９Ｂ、２９Ｄおよび２９Ｆ）。ＫＳを伴う二人の患者由来の血清０４−１８（図２９Ａおよび２９Ｂ）および０４−３８（２９Ｅおよび２９Ｆ）、並びにＫＳを伴わない患者由来の血清０４−３７（図２９Ｃおよび２９Ｄ）の１：１０希釈液を用いた間接免疫蛍光法。〔発明の詳細な説明〕定義この明細書を通して、特定のヌクレオチドを示すために次の標準の略語を用いる。Ｃ＝シトシン、Ａ＝アデノシンＴ＝チミジン、Ｇ＝グアノシンここで用いる「核酸」の用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れかを言う。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、５´末端から３´末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを言う。これには、自己複製可能なプラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能性のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「相同性の」または「相補的な」核酸とは、ウイルスタンパクをコードするＤＮＡ配列がヒトゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに存在するときに、前記タンパクまたはその一部をコードするウイルスＤＮＡ配列に対して選択的にハイブリダイズし、二本鎖を形成し、または結合する核酸を意味する。標的配列に対して相同的なＤＮＡ配列には、上記の機能的基準に合致する限り、標的配列よりも短い配列または長い配列が含まれ得る。ハイブリダイゼーション条件は、ｃＤＮＡライブラリーの供給源と共に特定される。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、0.2×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、６５℃での洗浄を用いたサザンブロットプロトコールで行われる。「ＳＳＣ」の用語は、0.15Ｍ塩化ナトリウムおよび20Ｍｍクエン酸ナトリウムの、クエン酸／生理食塩水溶液を意味する。溶液はしばしば、この濃度の倍数または分数として表現される。例えば、６×ＳＳＣとは、この濃度の６倍濃度の塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム、即ち、0.9Ｍ塩化ナトリウムおよび120ｍＭクエン酸ナトリウムを有する溶液を言う。0.2×ＳＳＣとは、ＳＳＣ濃度の0.2倍濃度、即ち0. 03Ｍの塩化ナトリウムおよび４ｍＭクエン酸ナトリウムの濃度の溶液を言う。「何かをコードする核酸分子」とは、特定のタンパクまたはペプチドの発現を指令する核酸分子を言う。核酸配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖の配列およびタンパクに翻訳されるＲＮＡ配列の両者が含まれる。核酸分子には、完全な長さのタンパクから誘導される完全な長さの核酸配列、並びに不完全な長さの配列の両者が含まれる。更に、この配列には、天然の配列の縮重コドンが含まれ、これは特定のホスト細胞におけるコドンの選択性を与えるために導入され得るものと理解される。「発現カセット」の用語は、このような配列に適合したホストでの構造遺伝子の発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を言う。このようなカセットには、少なくともプロモータが含まれ、任意には転写終止シグナルが含まれる。また、ここで説明するような、発現に影響を与える上で必要または補助的である追加の因子を用いてもよい。ここで用いる「機能可能にリンクした」の用語は、プロモータがＤＮＡ配列の転写を媒介するような、ＤＮＡ配列の上流のプロモータのリンクをいう。「ベクター」の用語は、ウイルス発現系、自己複製する環状ＤＮＡ（プラスミド）を言い、また発現および非発現プラスミドの両者を言う。組み換え微生物または組み換え細胞培養物が「発現ベクター」を含んでいると記載する場合、これには染色体外の環状ＤＮＡおよびホスト染色体に組み込まれたＤＮＡの両者が含まれる。ベクターがホスト細胞に保持される場合、ベクターは有糸分裂の際に自立性構造として安定に複製され、またはホストのゲノム内に組み込まれ得る。「プラスミド」の用語は、細胞内で複製できる自律性の環状ＤＮＡを意味し、これには発現性および非発現性の両者が含まれる。組み換え微生物または細胞が「発現プラスミド」を含んでいると記載する場合、プラスミドは、有糸分裂の際に自立的な構造物としてホスト細胞により安定に複製され、或いはホストゲノム中に組み込まれる。「組み換えタンパク」または「組み換えにより産生されたタンパク」の用語は、当該タンパクを発現できる内因性のＤＮＡ複製物をもたない非天然の細胞を用いて産生された、ペプチドまたはタンパクを意味する。この細胞は、適切な核酸配列の導入によって遺伝子的に改変されているから、当該タンパクを産生する。この組み換えタンパクは、該タンパクを産生する細胞と正常に関連したタンパクおよび他の細胞成分と共に存在することはないであろう。「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセント」および「実質的同一性」の用語は、二つ以上の核酸分子またはポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために用いられる。「参照配列」は、配列比較のためのベースとして用いられる定義された配列である。参照配列は、例えば、配列表に挙げた完全な長さのｃＤＮＡ配列の断片のように、大きな配列のサブセットであってもよく、或いは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含むものであってもよい。比較ウインドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、「Smith a nd Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482」の局部相同性アルゴリズムによって、「Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443」の相同性アラインメントアルゴリズムによって、「Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85: 2444」またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって行われる（ウィスコンシン遺伝子ソフトウエア・パッケージ・リリース 7.0におけるGA P,BESTFIT,FASTA,and TFASTA、遺伝子コンピュータグループ、575 Science Dr., Madison,WI）。ポリペプチドに対して適用されるとき、「実質的同一性」または「実質的な配列同一性」の用語は、デフォルトギャップを用いたGAPまたはBESTFITプログラムによって最適に整列されたときに、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を共有する二つのポリペプチド配列を意味する。「パーセントアミノ酸同一性」または「パーセントアミノ酸配列同一性」とは、最適に整列されたときに略指定されたパーセントのアミノ酸を有する、二つのポリペプチドの比較を言う。例えば、「９５％アミノ酸同一性」とは、最適に整列されたときに９５％のアミノ酸同一性を有する二つのポリペプチドの比較をいう。好ましくは、保存されたアミノ酸置換によって、同一でない残基位置の数は異なる。例えば、電荷または極性のような類似した化学的性質を有するアミノ酸の置換は、タンパクの特性に影響するようには思えない。その例は、アスパラギンに対するグルタミン、またはアスパラギン酸に対するグルタミン酸である。ヘルペスウイルスのペプチドまたはタンパクを言うときに、「実質的に精製された」または「単離された」の用語は、他の細胞成分を実質的に含まない化学組成物を意味する。これは乾燥した溶液または水性の溶液であってもよいが、好ましくは均質な状態である。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学の技術を用いて測定される。調製品に存在する優勢な種であるタンパクは、実質的に精製される。一般に、実質的に精製または単離されたタンパクは、調製品に存在している全マクロ分子種の８０％超を含んでいる。当該タンパクは、好ましくは、存在する全マクロ分子種の９０％超に対応するように精製される。より好ましくは、当該タンパクは９５％超まで精製され、より好ましくは、当該タンパクは実質的に均質になるまで、即ち、従来の技術によっては他のマクロ分子種が検出されなくなるまで精製される。「抗体に対して特異的に結合する」または「特異的に免疫反応する」の用語は、タンパクまたはペプチドについて言う場合は、タンパク類の不均一な集合、およびヘルペスウイルス以外の他のウイルスを含む他の生物体の存在下で、本発明のヘルペスウイルスを測定する結合反応をいう。従って、指定された免疫検定条件下において、特定の抗体はヘルペスウイルス抗原に結合し、またサンプル中に存在する他の抗原に対しては有意な量では結合しない。このような条件下において、抗体に対する特異的な結合には、特定のタンパクについての特異性に関して選択された抗体を必要とする。例えば、ここに記載するヒトヘルペスウイルス免疫原に対して生じた抗体を選択して、ヘルペスウイルスタンパクと特異的に免疫反応し且つ他のタンパクとは反応しない抗体を得ることができる。これらの抗体は、ヒトヘルペスウイルスタンパクに対して相同的なタンパクを認識する。種々の免疫検定フォーマットを使用して、特定のタンパクと特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、特定のタンパクと特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫検定が日常的に用いられる。特定の免疫反応性を測定するために使用できる免疫検定フォーマットおよび条件の説明については、ハーロウおよびレイン(Harlow and Lane)[３２]を参照されたい。ここで使用する「生物学的サンプル」の語は、生きた生物または死んだ生物から得た何れかのサンプルを言う。生物学的サンプルの例には、体液および組織の検体が含まれる。Ｉ．カポシ肉腫（ＫＳ）関連のヘルペスウイルス本発明は、少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、且つカポシ肉腫に関連したヘルペスウイルスを独特に定義する単離されたＤＮＡ分子を提供する。一つの態様において、前記単離された分子は、図３Ａに示す核酸配列（配列ＩＤ番号１）の少なくとも一部を含んでいる。他の態様において、前記単離されたＤＮＡ分子は、３３０塩基対（ｂｐ）の配列である。他の態様おいて、単離されたＤＮＡ分子は１２〜５０ｂｐの配列である。他の態様において、単離されたＤＮＡ分子は３０〜３７ｂｐの配列である。他の態様において、前記単離されたＤＮＡ分子はｃＤＮＡである。他の態様において、ＲＮＡは単離された核酸分子から誘導され、または単離されたＤＮＡ分子とハイブリダイズすることができる。ここで用いる「ゲノム」の語は、単離された核酸分子のコーディング領域および非コーディング領域を意味する。更に、上記のＤＮＡ分子は、特に限定されるものではないが、ホジキン氏病、非ホジキン氏リンパ腫、リンパ性白血病、リンパ肉腫、巨脾腫、網状細胞肉腫、セザリー氏症候群、菌状息肉腫、中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連の中枢神経系リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、およびバーキット氏リンパ腫に関連したものでよい。リンパ増殖性疾患は、リンパ節、リンパ器官および他の器官を含む、リンパ球の制御されないクローナルもしくはポリクローナル発現として特徴付けられる。本発明は、ＯＲＦ２０（配列ＩＤ番号２２および２３）、ＯＲＦ２１（配列ＩＤ番号１４および１５）、ＯＲＦ２２（配列ＩＤ番号１６および１７）、ＯＲＦ２３（配列ＩＤ番号１８および１９）、ＯＲＦ２４（配列ＩＤ番号２０および２１）、ＯＲＦ２５（配列ＩＤ番号２および３）、ＯＲＦ２６（配列ＩＤ番号２４および２５）、ＯＲＦ２７（配列ＩＤ番号２６および２７）、ＯＲＦ２８（配列ＩＤ番号２８および２９）、ＯＲＦ２９Ａ（配列ＩＤ番号３０および３１）、ＯＲＦ２９Ｂ（配列ＩＤ番号４および５）、ＯＲＦ３０（配列ＩＤ番号６および７）、ＯＲＦ３１（配列ＩＤ番号８および９）、ＯＲＦ３２（配列ＩＤ番号３２および３３）、ＯＲＦ３３（配列ＩＤ番号１０および１１）、ＯＲＦ３４（配列ＩＤ番号３４および３５）、またはＯＲＦ３６（配列ＩＤ番号１２および１３）をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、ＯＲＦ２０（配列ＩＤ番号２２および２３）、ＯＲＦ２１（配列ＩＤ番号１４および１５）、ＯＲＦ２２（配列ＩＤ番号１６および１７）、ＯＲＦ２３（配列ＩＤ番号１８および１９）、ＯＲＦ２４（配列ＩＤ番号２０および２１）、ＯＲＦ２５（配列ＩＤ番号２および３）、ＯＲＦ２６（配列ＩＤ番号２４および２５）、ＯＲＦ２７（配列ＩＤ番号２６および２７）、ＯＲＦ２８（配列ＩＤ番号２８および２９）、ＯＲＦ２９Ａ（配列ＩＤ番号３０および３１）、ＯＲＦ２９Ｂ（配列ＩＤ番号４および５）、ＯＲＦ３０（配列ＩＤ番号６および７）、ＯＲＦ３１（配列ＩＤ番号８および９）、ＯＲＦ３２（配列ＩＤ番号３２および３３）、ＯＲＦ３３（配列ＩＤ番号１０および１１）、またはＯＲＦ３４（配列ＩＤ番号３４および３５）によってコードされる単離されたポリペプチドを提供する。例えば、ＴＫはＯＲＦ２１によってコードされ；糖タンパクＨ（ｇＨ）はＯＲＦ２２によってコードされ；主キャプシドタンパク（ＭＣＰ）はＯＲＦ２５によってコードされ；ビリオンポリペプチド（ＶＰ２３）はＯＲＦ２６によってコードされ；マイナーキャプシドタンパクはＯＲＦ２７によってコードされる。本発明は、ＤＮＡウイルスの単離されたＤＮＡ分子を含む複製可能なベクターを提供する。このベクターには、単離された核酸分子の少なくとも一部を含むプラスミド、コスミド、λファージまたは酵母の人工染色体（ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのベクターを得る方法の一例としては、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの両者を制限酵素に晒して、両方の分子に、相互に塩基対を形成する相補的な末端を生じさせ、次いでＤＮＡリガーゼを用いてライゲートする方法を用いることができる。或いは、リンカーをベクターＤＮＡの制限部位に対応する挿入ＤＮＡにライゲートし、次いで当該部位で切断する制限酵素で消化する方法を用いることができる。当業者に公知の他の手段を利用することも可能である。発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボソーム結合のための転写開始配列に結合するための、プロモータ配列またはエンハンサ配列が含まれる。例えば、バクテリア発現ベクターには、ｌａｃプロモータのようなプロモータ配列、転写開始のためのシャイン・ダルガノ配列、および開始コドンＡＵＧが含まれる。同様に、真核発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための同種または異種プロモータ、下流ポリアデニル化信号、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの離脱のための終止コドンが含まれる。このようなベクターは商業的に入手してもよく、または記載された配列に基づいて、当該技術で周知の方法、例えばベクターを構築するための上記の一般的な方法によって組み立ててもよい。本発明は、上記ベクターを含んだホスト細胞を提供する。このホスト細胞は、人工的にホスト細胞に導入された、単離されたＤＮＡ分子を含んでいてもよい。ホスト細胞は、真核細胞またはバクテリア細胞（例えばE.coli）、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および動物細胞であってもよい。適切な動物細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞および種々の哺乳類初代細胞が含まれる。本発明は、カポシ肉腫関連の単離されたヘルペスウイルスを提供する。一つの態様において、ヘルペスウイルスは図３Ａに示したヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号１）の少なくとも一部を含んでいる。一つの態様において、ヘルペスウイルスはＤＮＡウイルスである。他の態様において、ヘルペスウイルスはヘルペスビリダエ(Herpesviridae)である。他の態様において、ヘルペスウイルスはガンマヘルペスビリナエ(gammaherpesvirinae) である。ヘルペスウイルスの分類は、当業者に公知のフェノタイプまたは分子的特徴に基づいて変化し得る。本発明は、単離されたＤＮＡウイルスであって、該ウイルスＤＮＡはチミジンキナーゼをコードし、また該ウイルスＤＮＡは配列ＩＤ番号３８−４０からなる群から選択される核酸プローブに対して選択的にハイブリダイズできるウイルスを提供する。本発明のＫＳ関連ヒト・ヘルペスウイルスはＫＳに関連しており、また疾病の疫学に関係している。このウイルスの分類学的な分類は未だ行われいないが、当業者に公知のフェノタイプまたは分子的特徴に基づくであろう。しかし、この新規なＫＳ関連ウイルスは、核酸の相同性の基礎に基づけば、ヘルペスビリダエ科およびガンマヘルペスビリナエ副科に関連すると思われるＤＮＡウイルスである。Ａ．ウイルスＤＮＡおよびそのタンパクの配列同一性本発明のヒトヘルペスウイルスは、ここに記載する特定のＤＮＡ配列に限定されるものではない。ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスＤＮＡは、上記で定義したように、ここに記載するウイルスＤＮＡ配列に対して実質的な配列同一性を示している。ヒトヘルペスウイルス由来のＤＮＡは、典型的には次の三つの核酸プローブの一以上と特異的にハイブリダイズする。上記に列挙した核酸プローブに対するウイルスＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ここに記載する標準の核酸ハイブリダイゼーション技術によって決定される。特に、ＰＣＲ増幅は次の三つのＰＣＲプライマーセットを用いて行うことができる。ＰＣＲ技術においては、上記に列記したように、増幅すべきＤＮＡ領域の二つの３´境界に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。次いで、この二つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応が行われる。「ＰＣＲプロトコール：方法および増幅へのガイド」［７４］を参照されたい。ＰＣＲ増幅に続いて、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅された領域は、上記三つの特異的な核酸プローブとハイブリダイズする能力について試験される。或いは、上記核酸プローブに対するウイルスＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ウイルスＤＮＡ増幅を用いることなく、厳格なハイブリダイゼーション条件下でのサザンブロット法によって行うことができる。プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、「Needha-VanDevanter」［６９］に記載されているように、「Beaucage and C arruthers」［１９］によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法(solid phase phosphoramidite triester method)に従って、自動合成器により化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、本来のアクリルアミドゲル電気泳動または「Pearson,J.D.and Regnier,F.E.」[７５Ａ]に記載されたアニオン交換ＨＰＬＣによって行う。合成オリゴヌクレオチドの配列は、「Maxam ,A.M.and Gilbert,W.]［６３］の化学的分解法によって確認することができる。Ｂ．ヒト・ヘルペスウイルスのＫＳ誘導株の単離および増殖従来の方法を用いて、ヒト・ヘルペスウイルスはイン・ビトロで増殖することができる。例えば、ヘルペスウイルスを増殖させるための標準的な技術は「Ab lashi,D.V.」［1］に記載されている。手短かに説明すると、ＰＨＡ刺激された臍帯血単核細胞、マクロファージ、神経細胞またはグリア細胞の細胞ラインを、ウイルス感染細胞または精製ウイルスを含む脳脊髄液、血漿、末梢血白血球、または組織抽出物と共に共培養する。感染に先立って、３７℃で２時間、５μｇ／ｍｌのポリブレン(polybrene)を用いてレシピエント細胞を処理する。感染させた細胞は、形態学的な変化、並びにヒト・ヘルペスウイルスと免疫反応するモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光試験においてヒト・ヘルペスウイルス由来の抗原について陽性であることを示すことによって観察される。ウイルスを単離するために、直接の遠心分離によってウイルスを培養液から直接回収するか、或いは感染細胞を回収し、ホモジェナイズまたは溶菌し、細胞断片からウイルスを分離し、標準の蔗糖濃度勾配遠心分離法により精製することによって回収される。当業者は、次のプロトコールを用いてカポシ肉腫に関連したＤＮＡヘルペスウイルスを単離および増殖してもよい。体腔ベースの」リンパ腫（ＲＣＣ−１またはＢＨＬ−６）からの、ＫＳＨＶに感染したＢリンパ球細胞ラインの長期に亘る樹立は、標準的な技術を用いてリンパ腫組織からＤＮＡを抽出することにより準備される［２７，４９，６６］。ＫＳ関連ヘルペスウイルスは、次のようにして細胞ＤＮＡから単離すればよい。ハイポソマティックショック(hyposomatic shocking)およびダンスホモジェナイゼーション(Dounce homogenization)のような標準的な方法を用いて溶解できる感染細胞系（ＢＨＬ−６・ＲＣＣ−１）を、先ず１０分間の2000×Ｇでペレット化し、上清を除去し、10,000×Ｇで再度１５分間遠心分離することによって、核およびオルガネラを除去する。この上清を0.45μのフィルターを通して濾過し、10,000×Ｇで再度１時間遠心分離してウイルスをペレット化する。次いで、このウイルスを洗浄し、再度100,000×Ｇで１時間遠心分離する。このＤＮＡは、サザンブロッティングおよび後述する特異的なプローブを用いたＰＣＲによって、ＫＳＨＶの存在について試験される。生きた感染細胞を含む新鮮なリンパ腫組織を同時に濾過して、標準技術により単一の細胞懸濁液を形成する［４９，６６］。標準のフィコール−プラーク(Ficoll-Plaque)遠心分離により細胞を分離し、リンパ球層を除去する。次いで、＞１×１０⁶細胞／ｍｌで、このリンパ球を１０％ウシ胎児血清を補充したＲＭＰ 1640のような標準的なリンパ球組織培養培地の中に置く。ＫＳＨＶウイルスを含む不死化したリンパ球はこの培地の中で無制限に増殖する一方、不死化しない細胞は長期の培養の間に死滅する。更に、＞１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で連続的に感染させた細胞からウイルスを含む培地上清を除去することにより、ウイルスを新しい細胞ラインの中で増殖させてもよい。培地を2000×Ｇで１０分間遠心分離し、0.45μのフィルターを通して濾過し、細胞を除去する。培地を１：１の容量で適用して、＞１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で４８時間増殖させる。細胞を洗浄し、ペレット化して新鮮な培養培地の中に置き、１４日増殖させた後に試験する。ＲＣＣ−１およびＲＣＣ−１_2F5は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、1994年10月19日に、それぞれＡＴＣＣ受け付番号ＣＲＬ 11735号およびＣＲＬ 11735号の下に、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロックウイル市パークローンドライブ122301のアメリカン・タイプ・アンド・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。ＢＨＬ−６は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、1994年11月18日に、ＡＴＣＣ受け付番号ＣＲＬ 11762号の下に、アメリカ合衆国 20852 メリーランド州ロックウイル市パークローンドライブ12230 1のアメリカン・タイプ・アンド・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。Ｃ．ウイルスの免疫学的同一性ＫＳ関連のヒト・ヘルペスウイルスは、免疫学的にも説明することができる。ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスは、配列ＩＤ番号１２に記載したウイルスの主要キャプシドタンパクのような、定義された免疫原に対して生じた抗血清と選択的に免疫反応する。免疫反応性は、配列ＩＤ番号１８−２０のアミノ酸配列または核酸配列によってコードされるタンパクに対して生じたポリクローナル血清を用いた免疫検定において定義される。この抗血清は、他のヘルペスウイルスに対する低い交差反応性を有するように選択され、また何らかの斯かる交差反応性は免疫件検定に使用する前の免疫吸着によって除去される。免疫検定に使用するための抗血清を産生するために、配列ＩＤ番号１８−２０のアミノ酸配列または核酸配列によってコードされるタンパクは、ここに記載するようにして単離される。例えば、組み換えタンパクは哺乳類細胞ラインにおいて産生することができる。フロイントのアジュバントのような標準的なアジュバントおよび標準のマウス免疫感作プロトコール（上記の［３２］参照）を用いて、ｂａｌｂ／ｃのような同一血統種のマウスを、配列ＩＤ番号２〜３７のアミノ酸配列または核酸によってコードされるタンパクで免疫感作する。或いは、ここに開示された配列から誘導され、且つキャリアタンパクに結合された合成ペプチドを、免疫源として使用することができる。ポリクローナル血清を採集し、免疫検定、例えば個体支持体上に固定化した免疫源を用いる固相免疫検定において、免疫原タンパクに対して滴定する。１０⁴以上の力価をもったポリクローナル抗血清が選択され、上記［３２］に記載の標準的な免疫検定を用いて、他のガンマ・ヘルペスビリナエ副科のウイルス、特に、ヒトヘルペスウイルス１〜７型に対する交差反応性について試験される。これらの他のガンマ・ヘルペスビリナエウイルスは、ここに記載するヘルペスウイルス単離のための標準的な技術によって単離することができる。抗血清の免疫原タンパクへの結合と競合する上記ウイルス類の能力が測定される。他のウイルスについてのパーセント交差反応性が、標準的な計算を用いて計算される。上記に挙げた他のウイルスの夫々と１０％未満の交差反応性を有する抗血清が選択され、プールされる。交差反応性抗体は、次いで、上記に列記したウイルスとの免疫吸着によって、プールされた抗血清から除去される。次いで、免疫吸着されてプールされた抗血清は、未知のウイルス調製品を、配列ＩＤ番号２〜３７に記載の核酸配列を含んだここに記載の特定のＫＳヘルペスウイルス調製品と比較するために、上記で述べた競争結合免疫検定に用いられる。この比較を行うために、配列ＩＤ番号２〜３７のアミノ酸配列または核酸によってコードされる免疫原タンパクはラベルされた抗原であり、またウイルス調製品は広範囲の濃度で夫々検定される。抗血清のラベルされた免疫原タンパクへの結合を５０％阻害するのに必要な夫々のウイルス調製品の量が測定される。配列ＩＤ番号２〜３７のタンパクからなる免疫原に対して生じた抗体に特異的に結合するウイルスは、当該タンパクへの結合の５０％を阻害するために必要なウイルスの量が所定の量を超えないウイルスである。この量は、配列ＩＤ番号１のＤＮＡ配列を含むＫＳ関連ヘルペスウイルスについて５０％阻害のために必要とされるウイルス量の１０倍以下である。従って、本発明のＫＳ関連ヘルペスウイルスは、その核酸配列がここに与えられている、ＫＳ関連ヘルペスウイルスの特定の株との免疫学的比較によって定義することができる。本発明は、上記の単離されたＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子を提供する。一つの態様において、該分子はＤＮＡである。他の態様において、該分子はＲＮＡである。他の態様において、核酸分子は１４〜２０ヌクレオチドの長さである。他の態様において、核酸分子は１６ヌクレオチドの長さである。本発明は、前記単離されたＤＮＡ分子に対して相補的な核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子を提供する。一つの態様において、該分子はＤＮＡである。他の態様において、該分子はＲＮＡである。この少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子は、中程度の厳格さの条件で、図３Ａ〜３Ｆ（配列ＩＤ番号１、１０〜１７、および３８〜４０）に示した配列を有する核酸分子の少なくとも一部にハイブリダイズし得る。特定の配列の定義されたイオン強度およびｐＨでの熱溶融点（Ｔｍ）よりも低い約５℃において、厳格さの高いハイブリダイゼーション条件が選択される。このＴｍは、完全にマッチしたプローブに対して標的配列の５０％がハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨの下での）温度である。典型的には、厳格な条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも約0.02モルであり、温度が少なくとも約６０℃であるような条件である。他の因子、就中、相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒の存在（即ち、塩またはホルムアミド濃度）、および塩基のミスマッチはハイブリダイゼーションの厳格性に顕著に影響するので、パラメータの組合せは、何れか一つの手段自体(absolute measure)よりも重要である。例えば、６×ＳＳＣ溶液中において約６８℃での一晩のハイブリダイゼーション、６ ×ＳＳＣ溶液を用いた室温での洗浄、これに続く６×ＳＳＣ中0.6×ＳＳＣ中における約６８℃での洗浄によって達成される。中程度の厳格性でのハイブリダイゼーションは、例えば次の方法によって達成される。１）３×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド、ｐＨ7.5の0.1Ｍトリス緩衝液、５×デンハーツ溶液を用いた、フィルター予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション；２）３７℃で４時間の予備ハイブリダイゼーション；３）3,000,000ｃｐｍに等しい量のラベルされたプローブとの、３７℃１６時間のハイブリダイゼーション；４）２×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ溶液中での洗浄；５）それぞれ室温で１分間の洗浄を４回、それぞれ６０℃で３０分の洗浄を４回；６）乾燥してフィルムに露出する。「選択的にハイブリダイズする」の用語は、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ調製品の中に標的配列が存在するときに、特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列にのみハイブリダイズし、二本鎖化しまたは結合する核酸プローブについて用いられる。選択的にハイブリダイズすることは、プローブは、高い厳格性のハイブリダイゼーション条件下に異なった方法で検出可能なように、所定の標的に結合することを意味する。「相補的」核酸配列または「標的」核酸配列とは、核酸プローブに対して選択的にハイブリダイズする核酸配列をいう。適切なアニール条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成、並びにミスマッチの数およびそのプローブ上での位置に依存し、実験的に決定しなければならないことが多い。核酸プローブの設計およびアニール条件の議論については、例えばSambrook et al.,［８１］またはAusubel,F.,et al.,［８］を参照されたい。当業者が容易に理解するように、特定の配列表に言及するときは、このような言及はその相補的配列に実質的に対応する配列、並びに僅かな配列エラー、一つの塩基の変化、欠失、置換などの許容を含んだ配列を含むことを意図しており、その結果、何れかの配列変化が、関連の配列表が関連している病原性微生物または疾病マーカの核酸配列に対応する。核酸プローブ技術は当業者に周知であり、かかる当業者は、このようなプローブの長さが非常に大きく変化し得、また該プローブの検出を容易にするために、放射性アイソトープまたは蛍光色素のような検出ラベルで標識し得ることを容易に承認するであろう。ＤＮＡプローブ分子は、当該技術で周知の方法を用いて、前記ＤＮＡウイルスの完全長の前記単離されたＤＮＡ分子またはそのフラグメントを有するＤＮＡ分子を、プラスミドまたはバクテリオファージのような適切なベクターに挿入し、続いてこれを適切な細菌ホスト細胞に形質転換し、該形質転換されたホスト細胞内で複製し、ＤＮＡプローブを回収することによって製造すればよい。或いは、プローブはＤＮＡ合成器で化学的に作成してもよい。ＤＮＡウイルス核酸の再構成／突然変異は、サザンブロッティング、一本鎖コンホメーション多形ゲル電気泳動（ＳＳＣＰ）、ＰＣＲまたは他のＤＮＡに基づく技術によって検出することができ、或いはＲＮＡ種についてはノーザンブロッティング、ＰＣＲまたは他のＲＮＡに基づく技術によって検出することができる。ＲＮＡプローブは、前記ＤＮＡウイルスの完全長の前記単離された核酸分子またはそのフラグメントを、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のようなバクテリオファージプロモータの下流に挿入することによって生じさせることができる。大量のＲＮＡプローブは、このラベルされたヌクレオチドを、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＤＮＡウイルスの線形化された単離核酸分子またはそのフラグメントと共にインキュベートすることによって製造することができる。ここに定義するように、核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントであり得る。ＤＮＡフラグメントは、例えば、プラスミドＤＮＡを消化することによって、またはＰＣＲを用いることによって調製することができ、或いはBeaucage およびCarruthersによって記載されたホスホロアミダイト法［１９］もしくはMa tteucci et al.に従うトリエステル法［６２］の何れかによって合成することができる。次いで、所望のときは、化学的に合成された複数の一本鎖を適切な条件下で共にアニールすることによって、或いは適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成することによって、二本鎖フラグメントを得ることができる。核酸プローブの特定の配列が与えられる場合、相補鎖もまた特定され且つ含まれることが理解される。相補鎖は、標的が二本鎖核酸である場合には、同等に良好に作用するであろう。また、特定の配列が使用のために同定されるときは、核酸プローブ、２５塩基対以上の長さの列記した配列のサブ配列もまた、プローブとしての使用に包含される。本発明のＤＮＡ分子はまた、天然に存在する形態のものと幾つかまたは全ての性質を共有し、且つ一以上のアミノ酸残基の同一性または位置の点で天然に存在する形とは異なる抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、フラグメントまたは誘導体（該タンパクについて特定された全ての残基よりも少ない残基を含む欠失類縁体、特定された一以上の残基が他の残基で置き換わった置換類縁体、および当該ポリペプチドの末端部分または中間部分に一以上のアミノ酸残基が追加された付加類縁体）をコードするＤＮＡをも含むものである。これら分子には、選択された非哺乳類ホストによる発現のための「好ましい」コドンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の付与；および容易に発現されるベクターの構築を容易にする追加の開始ＤＮＡ配列、末端ＤＮＡ配列および中間ＤＮＡ配列の付与が含まれる。本発明は、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルスの少なくとも一部、即ち、ビリオンポリペプチド２３、キャプシドタンパク類、チミジンキナーゼ、またはテグメントタンパクをコードする単離されたＤＮＡ分子提供する。本発明はまた、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを製造する方法であって、上記ポリペプチドを産生するための適切な条件下で上記ホスト・ベクター系を増殖させることと、こうして産生されたポリペプチドを回収することとを具備した方法を提供する。本発明は、カポシ肉腫関連の単離されたＤＮＡ分子によってコードされる単離されたペプチドを提供する。一つの態様において、該ペプチドはポリペプチドであり得る。更に、本発明は、単離されたＤＮＡ分子のポリペプチドを発現するホスト細胞を提供する。一つの態様において、上記の単離されたペプチドまたはポリペプチドは、単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一部によってコードされる。他の態様において、上記の単離されたペプチドまたはポリペプチドは、ここに列記する配列（配列ＩＤ番号２〜３７）をもった核酸分子の少なくとも一部によってコードされる。更に、上記単離されたＤＮＡ分子によってコードされる上記単離されたペプチドまたはポリペプチドは、適切なホスト細胞内での発現により融合タンパクを形成するように、第二の核酸分子に結合されてもよい。一つの態様において、この第二の核酸分子はベータ・ガラクトシダーゼをコードする。融合タンパクの形成に用いられる他の核酸分子は、当業者に公知である。本発明は、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を提供する。一つの態様において、この抗体はモノクローナル抗体である。他の態様において、この抗体はポリクローナル抗体である。上記の抗体またはＤＮＡ分子は、検出マーカでラベルされ得る。この検出マーカには放射性ラベル、または発色性、発光性もしくは蛍光性のマーカ、或いは金が含まれるが、これらに限定されるものではない。この放射性ラベルには、³Ｈ，¹⁴Ｃ，³²Ｐ，³³Ｐ，³⁵Ｓ，³⁶Ｃｌ，⁵¹Ｃｒ，⁵⁷Ｃｏ，⁵⁹Ｃｏ，⁵⁹Ｆｅ，⁹⁰Ｙ，¹²⁵ Ｉ，¹³¹Ｉおよび¹⁸⁶Ｒｅが含まれるが、これらに限定されるものではない。蛍光性マーカにはフルオレセイン、ローダミンおよびオーラミンが含まれるが、これらに限定されるものではない。発色性マーカにはビオチン、およびジゴキシゲニンが含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法は、当業者に公知である。更に、抗体または核酸複合体は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼのような酵素に結合された二次抗体によって検出してもよい。使用し得る他の酵素は当業者に公知である。本発明は、上記ＤＮＡウイルスの上記単離されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド上の特定の領域を選択して、抗体を発生させる方法を提供する。タンパク配列は、ｃＤＮＡ配列から決定してもよい。アミノ酸配列は、それが構築される際に疎水性領域または親水性領域を生じるか否かを決定するための、当業者に周知の方法によって分析してもよい。細胞膜タンパクの場合、水生環境において、疎水性領域は細胞悪の脂質二重層の中に挿入されるタンパク部分を形成する一方、親水性領域は細胞表面に位置することが周知である。通常、親水性領域は疎水性領域よりも免疫原性が高い。従って、上記ＤＮＡウイルスをコード化した上記単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドに対して特異的な抗体を生じさせるために、この親水性のアミノ酸配列が選択される。この選択されたペプチドは、商業的に入手可能な機械を用いて調製される。別の方法として、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントのようなＤＮＡをクローニングおよび発現させ、得られたポリペプチドを回収して、これを免疫原として用いてもよい。これらポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、選択されたペプチド類を用いて動物を免疫感作することによって製造すればよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて、免疫感作した動物由来の抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合し、所望の抗体を産生する得られたハイブリドーマ細胞ラインを選択することにより調製すればよい。或いは、モノクローナル抗体は、当業者に公知のイン・ビトロ技術によって製造してもよい。これらの抗体は、生きた動物、もしくはヒト、或いは動物もしくはヒトから単離された生物学的組織もしくは体液中において、上記ＤＮＡウイルスの上記単離されたＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの発現を検出するために有用である。 II．免疫検定ウイルス株またはペプチドに対して出現させた抗体は、当分野で周知の従来の標識技術を用いて検出可能に標識される。従って、抗体は例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹ Ｉ、および³⁵Ｓのような放射性同位体を用いて放射性標識される。抗体はまた、当分野で公知の技術を使用し、蛍光標識、酵素標識、遊離基標識、またはバクテリオファージ標識を用いて、標識されうる。典型的な蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびテキサスレッドが含まれる。特異的な酵素が共有結合によって他の分子にカップリングし得るので、これらをトレーサー物質の産生に対する標識として使用する可能性も存在する。適切な酵素には、アルカリホスファターゼ、ベーターガラクトシダーゼ、グルコース− ６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼが含まれる。２つの主要なタイプの酵素免疫検定は、酵素リンク免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、および酵素増幅免疫測定法（EMIT,Syva Corporatio n,Palo Alto,CA）としても知られるホモジニアス酵素免疫検定である。ＥＬＩＳＡシステムでは、分離は、例えば固相にカップリングされた抗体を使用することによって達成されうる。ＥＭＩＴシステムは、トレーサー−抗体複合体の酵素の不活性化に依存する。従って活性は分離段階を必要とせずに測定される。更に、化学ルミネッセンス化合物を標識として使用しうる。化学ルミネッセンス化合物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、および蓚酸エステルが含まれる。同様に、バイオルミネッセンス化合物を標識に使用しうる。バイオルミネッセンス化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。一度標識されると、抗体は当分野で周知の技術を用いて免疫学的対照物（抗体または抗原性ポリペプチド）を同定および定量するのに使用されうる。ラジオ免疫検定（ＲＩＡ）の説明は、Laboratory Techniques in Biochemistr y and Molecular Biology[52]内の、特にChard,T.による「標識免疫測定法および関連技術への導入（An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techn iques）」と題された章に関連して見出されうる。この文献は、参照文献として本明細書の一部をなす。種々のタイプの一般的な免疫検定の説明は、以下の米国特許第4,376,110号（D avid等）または4,098,876号（Piasio）に見られる。Ａ．ウイルス抗原のアッセイ核酸ハイブリダイゼイション技術を使用する原因物質の検出に加えて、ウイルス、特異的なペプチド、またはウイルス若しくはペプチドに対する抗体を検出するための免疫検定を使用することができる。適用しうる技術の一般的な概要は、 HarlowおよびLane[32]にあり、これは参照文献として本明細書の一部をなす。一態様では、ヒトヘルペスウイルスに対する抗体は、サンプル内の該物質を検出するのに使用されうる。手短に説明すると、該物質またはペプチドに対する抗体を産生するために、標的にされる配列を形質導入された細胞、好ましくはバクテリア細胞内で発現させ、生成する。この生成物を抗体を産生することができる動物に注入する。遺伝子産物に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体（並びに何れかの組換え抗体）を種々の免疫検定に使用しうる。このようなアッセイには、競争免疫検定、放射免疫検定、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、間接的免疫蛍光検定法等が含まれる。競争免疫検定に対しては、HarlowおよびLane [32]の５６７頁〜５７３頁および５８４頁〜５８９頁を参照されたい。モノクローナル抗体または組換え抗体は、当業者によく知られた種々の技術で得ることができる。手短に説明すれば、所望の抗原で免疫された動物から得た脾臓細胞または他のリンパ球を、一般的には、ミエローマ細胞と融合することによって不死化する（KohlerおよびMilstein[50]。これは参照文献として本明細書の一部をなす）。不滅化の他の方法には、エプスタイン−バーウイルス、腫瘍形成ウイルス、またはレトロウイルスでの形質転換、或いは当業者に周知の他の方法が含まれる。単一の不滅化された細胞から生じたコロニーを所望の特異性の抗体の産生および抗原に対する親和性についてスクリーニングし、このような細胞によって産生されたモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔に注射することを含む種々の技術によって増加させることができる。組換えファージ抗体発現システムを用いる新たな技術もまた、モノクローナル抗体を生じさせるのに使用することができる。例えば、McCafferty,J等[64];Hoogenboom,H.R.等[39];およびMarks,J.D.等[60]を参照されたい。このようなペプチドは、バクテリア、酵母、繊維状菌、昆虫（特にバキュロウイルスベクターに使用する。）、および動物細胞のような組換えにより操作された細胞内の特異的配列を発現することによって産生されうる。当業者は、ヘルペスウイルスタンパクの発現に有用な多くの発現系に関する知識を有している。手短かに説明すると、ウイルス性タンパク質をコードする天然若しくは合成核酸の発現は、典型的には、所望の配列またはこれらの一部にプロモーター（これは構造的または誘導可能である。）を機能的に結合し、これを発現ベクターに導入することによって達成されるであろう。ベクターは、原核生物または真核生物内での複製または形成に適したものである。典型的なクローニングベクターは、抗生物質耐性マーカー、形質転換物の選別のための遺伝子、誘導若しくは調節プロモーター領域、およびウイルス遺伝子の発現に有用な翻訳ターミネータを含む。バクテリア内でのクローニングされた遺伝子の発現の方法も公知である。一般には、原核生物系でのクローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るためには、ｍＲＮＡの転写を指令する強力なプロモータを含む発現ベクターを構築することが望ましい。E.coliを形質転換するＤＮＡベクターに選択マーカーを含めることも有効である。このようなマーカーの例には、抗生物質に対する耐性を特徴づける遺伝子が含まれる。E.coliで使用する選択マーカーおよびプロモータに関する詳細については、上記[81]を参照されたい。適切な真核生物宿主には、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、および繊維状菌が含まれる。ＭＨＣ（主組織適合性複合体）Ｉ分子に結合された天然にプロセッシングされたペプチドを特徴づける方法が開発されている。Flak等[24]、および1992年11月 26日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９２／２１０３３を参照されたい。両文献は、参照文献として本明細書の一部をなす。典型的には、これらの方法には、適切な細胞または細胞系からの免疫沈降またはアフィニティクロマトグラフィーによるＭＨＣクラスＩ分子の単離が含まれる。他の方法には、Ｂ細胞タイプのクラスＩ分子から溶出されたペプチドの公知の自動シーケンシングによる種々のＨＰＬＣフラクション内のより豊富なペプチドの直接のアミノ酸シーケンシング（参照文献として本明細書の一部をなすJardetzkey等[45]）、および質量スペクトルによるヒトＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡ−Ａ２．１タイプの直接のアミノ酸シーケンシング（参照文献として本明細書の一部をなす Hunt等[40]）が含まれる。Rot zschkeおよびFalk[79]も参照されたい。これは、ＭＨＣクラスＩ内の天然にプロセッシングされたペプチドの特徴付けの一般的概要であり、参照文献として本明細書の一部をなす。更に、Marloes等[61](これは、参照文献として本明細書の一部をなす。)には、クラスＩ結合部分が、in vitroで、可能なウイルス性免疫原生ペプチドの同定にどのように適用されるかが開示されている。組換え技術で産生されるここで開示されたペプチドは、当業者に周知の標準の技術で精製することができる。組換えで産生されたウイルス性の配列は、直接に発現されるか、または融合タンパク質として発現される。次に、該タンパク質は、細胞溶解（例えば、超音波）およびアフィニティークロマトグラフィーの組合せによって精製される。融合生成物に対しては、適切な蛋白質分解酵素を用いた融合タンパク質の引き続く消化により、所望のペプチドが遊離される。タンパク質は、硫酸アルミニウムのような物質を用いた選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、および他の方法を含めた当業者に周知の標準的な技術で十分な純度に精製されうる。例えば、Scopes,R.[84]を参照されたい。これは参照文献として本明細書の一部をなす。Ｂ．ヒトヘルペスウイルスに対する抗体の存在についての血清学的試験本発明は更に、血清または固体組織サンプルのような生物学的サンプル内のＫＳ物質の存在を検出するための診断キットであって、ヒトヘルペスウイルスに対する抗体を含有する容器、および試験を行うための指示資料を具備するキットを包含する。或いは、ヒトヘルペスウイルスから誘導された不活化されたウイルス粒子またはペプチドまたはウイルス性タンパク質を診断キットで使用して、ヒトヘルペスウイルスに関連したＫＳに特異的な抗体を検出してもよい。皮膚サンプルまたは他の冒された組織のような組織サンプル内のＫＳ物質の存在を検出するための診断キットであって、ＫＳ関連ヘルペスウイルスを検出するためのヒトヘルペスウイルスに特異的な核酸配列を含有する容器および指示資料を具備した診断キットも含まれる。ここで開示されたヒトヘルペスウイルスに対する抗体と同様に、このような配列の何れか１つに対する核酸プライマーを含有する容器が任意に含まれる。ヒトヘルペスウイルスの抗原と反応する抗体は、抗原の測定について先に説明した手順と同様な種々の免疫測定法によっても測定されうる。免疫測定技術による抗体の測定に適用しうる免疫学的手段および免疫測定手段の概要については、基礎および臨床免疫学（Basic and Clincal Immunology）第７版[12]、および上記の[32]を参照されたい。手短に説明すると、ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスの抗原と反応する抗体を測定する免疫測定法は、競争または非競争結合アッセイであり得る。競争結合アッセイでは、サンプル分析物は、固体表面に結合された捕捉剤上の特異的結合部位に対して、標識された分析物と競争する。好ましくは、捕捉剤は、上記のように産生された精製された組換えヒトヘルペスウイルスタンパク質である。単離され、または部分的に精製された天然に存在するタンパク質を含めた他の起源のヒトヘルペスウイルスタンパク質も使用しうる。非競争的アッセイは、典型的にはサンドイッチアッセイである。この方法では、サンプルの被分析物質を、これに対して特異的な２つの結合剤の間で結合する。結合剤の一方を捕捉剤として使用し、固体表面に結合させる。第二の結合剤を標識し、得られた複合体を視覚的または器械的手段で測定または検出するのに使用する。多くの組合せの捕捉剤および標識された結合剤を使用しうる。種々の異なった免疫測定フォーマット、分離技術および標識を、ヒトヘルペスウイルス抗原の測定に関して先に説明したのと同様に使用しうる。血球凝集抑制（ＨＩ）および補体結合（ＣＦ）（これは２種類の実験室的試験である）は、ウイルス又はウイルス抗原に対する抗体の存在を試験することによってヒトヘルペスウイルスでの感染を検出するのに使用されうる。特別な変異体に対する抗体を検出したい場合には、血清学的方法も使用しうる。例えば、ワクチン接種者が新たな変異体にどの程度うまく応答するかを見たい場合がある。或いは、患者が最もよく応答する変異体を見るために、患者から血清を採取してもよい。本発明は、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるペプチド又はポリペプチドの発現をブロックできる拮抗剤を提供する。一態様において、拮抗剤は、二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリダイズできる。他の態様では、拮抗剤は、ＤＮＡ分子とハイブリダイズできる三重螺旋オリゴヌクレオチドである。他の態様では、該三重螺旋オリゴヌクレオチドは、図３Ａ〜３Ｆ（配列識別番号１〜３７）に示されたヌクレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一部に結合することができる。本発明は、単離されたＤＮＡ分子にハイブリダイズできるアンチセンス分子を提供する。一態様では、アンチセンス分子はＤＮＡである。他の態様では、アンチセンス分子はＲＮＡである。アンチセンス分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの変異体（即ち、タンパク質バックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡ）でありうる。本発明は、特異的なｍＲＮＡの翻訳時に受容体認識タンパク質の発現を、アンチセンス核酸でそのＭＲＮＡをマスキングすることによって、またはリボザイムでこれを開裂することによって妨害するのに使用されうる、アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムの調製に拡大される。アンチセンスヌクレオチドは、特異的なＭＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。細胞内で、これらはそのＭＲＮＡにハイブリダイズし、二本鎖の分子を形成する。該細胞は、この二本鎖型でＭＲＮＡを翻訳しない。従って、アンチセンス核酸はＭＲＮＡのタンパク質への発現を妨害する。ＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする約１５のヌクレオチドおよび分子のオリゴマーは、これらが容易に合成でき、細胞に導入する際により大きな分子よりも多くの問題を提起しないようであるから、特に効果的である。本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物であって、胚段階で哺乳動物に導入された、単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一部を含有するトランスジェニック動物を提供する。ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を産生する方法は当業者に公知である。本発明は、本発明の単離されたＫＳ関連ヘルペスウイルスを含有する細胞系を提供する。一態様において、単離されたＤＮＡ分子は、細胞に人工的に導入される。細胞系には、ＨＦＦ、ＮＩＨ／３Ｔ３のような繊維芽細胞；５６３７のような上皮細胞;ＦＣＢのようなリンパ球;ＣＣＲＦ−ＣＥＭ(ＡＴＣＣＣＣＬ１１９)のようなＴ−細胞；ＢＪＡＢおよびＲａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）のようなＢ細胞；およびＫ５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ２４３）のような骨髄細胞；ベロー細胞およびカルチノーマ細胞が含まれるがこれらに限定されない。このような細胞系を産生する方法は、当業者に公知である。一態様において、単離されたＫＳ関連ヘルペスウイルスはＲＣＣ−１細胞系に導入される。 III．ＫＳの検出のためのin vitroでの診断アッセイ本発明は、患者のカポジ肉腫を診断する方法であって、（ａ）患者の腫瘍領域から核酸分子を得ることと、（ｂ）該核酸分子と、単離されたＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５のヌクレオチドの標識された核酸分子とを、ハイブリダイズする条件下で接触させることと、（ｃ）ハイブリダイズした核酸分子の存在を検出し（該核酸の存在は患者のカポジ肉腫の指標となる。）、これによって患者のカポジ肉腫を診断することとを具備する方法を提供する。一態様では、腫瘍領域から得たＤＮＡ分子は、ステップ（ｂ）の前に増幅される。他の態様では、ＰＣＲを使用して該核酸分子を増幅する。核酸分子を増幅する方法は当業者に公知である。当業者は、患者のカポジ肉腫を診断するための適切なＤＮＡサンプルを得ることができるであろう。上記の方法で得られるＤＮＡサンプルは、制限酵素で開裂されうる。ＤＮＡを開裂する制限酵素の使用およびこのような開裂を行う条件は当分野で周知である。上記の方法では、ポリアクリルアミドゲルで行われるサイズ分別(size fracti onation)を使用しうる。一態様では、サイズ分別はアガロースゲルで行われる。更に、固体マトリクッス中へのＤＮＡフラグメントの移入は、ハイブリダイズ工程の前に行われる。このような固体マトリクッスの一例は、ニトロセルロース紙である。本発明は、患者のカポジ肉腫を診断する方法であって、（ａ）患者の適切な体液から核酸分子を得ることと、（ｂ）この核酸分子を、ハイブリダイズ条件下で、該単離されたＤＮＡと特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５のヌクレオチドの標識された核酸分子と接触させることと、（ｃ）ハイブリダイズした核酸分子の存在を決定し（該核酸分子の存在は患者のカポジ肉腫の指標となる。）、これによって患者のカポジ肉腫を診断することとを具備した方法を提供する。本発明は、患者内のＤＮＡウイルスを診断する方法であって、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）患者の適切な体液を、すでにカポジ肉腫抗体を結合させた支持体に接触させ、これによってカポジ肉腫抗体を特異的なカポジ肉腫抗原に結合させることと、（ｃ）支持体から未結合の体液を除去することと、（ｄ）カポジ肉腫抗原によって結合されたカポジ肉腫抗体のレベルを決定し、これによって患者をカポジ肉腫について診断することとを具備した方法を提供する。本発明は、患者のカポジ肉腫を診断する方法であって、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）患者の適切な体液を、すでにカポジ肉腫抗原を結合させた支持体に接触させ、これによってカポジ肉腫抗原を特異的なカポジ肉腫抗体に結合することと、（ｃ）支持体から未結合の体液を除去することと、（ｄ）カポジ肉腫抗体によって結合されたカポジ肉腫抗原のレベルを決定し、これによりカポジ肉腫を診断することを具備した方法を提供する。本発明は、細胞内のカポジ肉腫に関連したＤＮＡウイルスの発現を検出する方法であって、細胞から全ｃＤＮＡを得ることと、そのようにして得られたｃＤＮＡを、ハイブリダイズ条件下で、標識されたＤＮＡ分子と接触することと、該分子にハイブリダイズされたｃＤＮＡの存在を決定することと、これによってＤＮＡウイルスの発現を検出することとを具備した方法を提供する。一態様においては、ｍＲＮＡを細胞から取得して、ＤＮＡウイルスの発現を検出する。適切な体液サンプルは、カポジ肉腫抗体、抗原またはこれらのフラグメントを含有する何れかの体液サンプルである。適切な体液には、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ球、尿、浸出液、または滲出液が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様では、適切な体液サンプルは血清または血漿である。加えて、体液サンプルは、骨髄から得た細胞、または細胞培養から得た上清でありうる。患者から適切な体液を得る方法は当業者に公知である。抗体または抗原のレベルを決定する方法には、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、およびウエスタンブロッティングが含まれるがこれらに限定されない。他の方法は当業者に公知である。カポジ肉腫に関連したＤＮＡウイルスに感染された患者は、上記方法で診断され得る。ヒトヘルペスウイルスの検出およびウイルス関連ＫＳの検出は、基本的に同一のプロセスである。基本的な方針は、ウイルスに結合するが、ヒト正常細胞またはその周囲の他のタンパクまたは核酸には結合しない特異的なリガンドを使用してウイルスを検出することである。リガンドは、核酸または抗体の何れかでありうる。リガンドは、天然に存在するかまたは非天然部分を有する核酸または抗体誘導体、即ちＦａｂ若しくはキメラ抗体のような遺伝子工学的若しくは物理的に修飾されうる。ウイルスに対する抗体の検出のための血清学的試験は、ヒトヘルペスウイルスから得られたタンパク質抗原を用いても行なうことができ、これは本明細書に開示される。サンプルは、ＡＩＤＳ患者のような、ＫＳを有する患者またはＫＳの危険性のある患者から採取される。典型的には、サンプルは、血液（細胞、血清および／または血漿）から、または皮膚領域のような固体組織サンプルから採取される。ＫＳに対する最も正確な診断は、ウイルスの増加された力価が血液または関連した領域で検出された場合になされる。ＫＳはまた、ウイルスに対する抗体が検出される場合、およびＫＳに対する他の診断因子が存在する場合に指示されうる。Ａ．核酸アッセイ本発明の診断試験は、核酸のハイブリダイゼイションアッセイのような核酸のアッセイ、および特異的な核酸の増幅を検出し、本明細書で開示されたヒトヘルペスウイルスの核酸配列を検出するアッセイであってもよい。ハイブリダイゼイションアッセイを行うために一般に認められた手段は公知であり、該技術の一般的な概略は、Nucleic Acid Hybridization:A Practical App roach[72];Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports[4 1]; Analytical Biochemistry[4]、および既出のinnis等、PCR Protocols[74]の総説にあり、これらの全ては参照文献として本明細書に含まれる。ＰＣＲを核酸のハイブリダイゼイションと組み合わせて使用する場合、プライマーはヘルペスウイルスの核酸の特異的なタンパク質を標的にするようにデザインされる。例えば、配列番号：３０〜４０で示したプライマーは、ＯＦＲ２５相同体−ＯＦＲ３２相同体をコードするヘルペスウイルスゲノムの領域の検出を目標に使用されうる。本明細書で示される情報から、当業者は適切な特異的プライマーを選択することができるであろう。標的に特異的なプローブは、ＫＳの核酸ハイブリダイゼーション診断試験に使用されうる。該プローブは、問題の標的に特異的であるか、またはこれに対して相補的である。厳密な対立分化のためには、プローブは約１４のヌクレオチド長、好ましくは約２０〜３０のヌクレオチドであるべきである。本発明のヒトヘルペスウイルスのより一般的な検出のためには、核酸プローブは約５０から約1000 のヌクレオチド、最も好ましくは約２００から約４００のヌクレオチドである。配列は、これが検出されたときに、タンパク質および他の生物物質の異種集団の存在下で、微生物の存在の確定因子である核酸配列を含む場合に、問題の標的微生物に対して「特異的」である。特異的な核酸プローブは、微生物の確定因子である配列のその部分にターゲッティングされ、他の配列、特に病原体が検出される宿主の配列にハイブリダイズしないであろう。特異的な核酸プローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、またはこれらの類似体である。プローブは、一本鎖または二本鎖のヌクレオチドでありうる。本発明のプローブは、当該分野で周知の方法を用いて酵素的に合成されうるか（例えば、ニックトランスレーション、プライマー伸張、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、その他）、または化学的に合成されうる（例えば、Beau-cageおよびCarruthers[19]により開示されたホスホルアミダイト法、またはMatteucci等[62]に従ったトリエステル法による。両開示は、参照文献として本明細書に含まれる。）。プローブは、サンプル内のその標的核酸と安定な二重螺旋を形成できるような十分な長さ、即ち、少なくとも約１４のヌクレオチドでなければならず、より長く（例えば、約５０または１００塩基の長さ）てもよい。プローブは、しばしば、その長さにおいて約１００以上である。例えば、プローブが、標識されたヌクレオチドの存在下でのＤＮＡのニックトランスレーションにより調製された場合、平均プローブ長は、約１００〜６００塩基になりうる。上記のように、プローブは、ＫＳに関連した特異的なヘルペスウイルスの核酸に特異的にハイブリダイズすることができるであろう。このような「特異的なハイブリダイゼーション」は、プローブが、サンプル中に存在する他の核酸（例えば、動物細胞または他のバクテリアの核酸）にハイブリダイズしない条件下で、標的核酸にハイブリダイズする（これは、検出しうるシグナルによって証明される）ときに起こる。プローブの長さおよび塩基成分、プローブと標的核酸の間の塩基のミスマッチの程度、塩と有機溶媒の存在、プローブの濃度、および最適なハイブリダイゼーション条件を含めた種々のファクターが、しばしば経験に基づいて決定されなければならない。核酸プローブのデザインおよびアニーリングの条件の議論に対しては、例えば、既出の文献[81]、Ausuber,F.等[8]（これ以後サムブルーク（Sambrook）と称する）、酵素学における方法[67]または核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション[42](これらの全ては、参照文献として本明細書に含まれる。)を参照されたい。通常、プローブの少なくとも一部が、標的核酸とかなりの配列同一性を有しているであろう。特異的にハイブリダイズするために必要な配列同一性の程度は、プローブの長さおよびハイブリダイゼーションの条件に依存するが、プローブは通常、標的核酸に対して少なくとも７０％の同一性、より通常には少なくとも８０％の同一性、更に通常では少なくとも９０％の同一性、最も普通には少なくとも９５％若しくは１００％の同一性を有しているであろう。プローブは、本発明のプロトコールに従って処理された、標的ウイルスおよび動物細胞（例えば神経細胞）を含有するサンプルに該プローブをハイブリダイズすることによって、その標的核酸に特異的にハイブリダイズできることが確認されうる。プローブは、該プローブの特性シグナルがサンプル内のヘルペスウイルスＤＮＡに関連し、サンプル内の宿主細胞のＤＮＡおよび非生物学的材料（例えば、基質）に一般的には関連しない場合に特異的になる。以下の厳格なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、特異的でないプローブから特異的プローブ（例えば、蛍光標識されたＤＮＡプローブ）を区別するために適切であろう。該条件は、プローブを、変性させたプローブ、５０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ、および０．１％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸を含む溶液中において３７℃で１２時間サンプルとインキュベートすること、次いで７０℃ で５分間の１ＸＳＳＣ；室温で５分間の２ＸＳＳＣ；室温で５分間のＨ₂Ｏでの洗浄である。当業者は、洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）または他の試薬（例えば、バッファ、Denhardt's溶液、デキストラン硫酸）をハイブリダイゼーションまたは洗浄溶液に含有させることが、核酸のハイブリダイゼーション（即ち、in situ、サザン、または他のもの）にしばしば有利であろうことを承知している。ウイルスに特異的なプローブの特異性を試験するために、該プローブをＫＳに関連するヘルペスウイルスを含有する宿主細胞に関して試験し、ＫＳに関連しないウイルスを含有する細胞での結果と比較した。プローブがＫＳに関連したウイルスの核酸に特異的であるかどうかを決定するための従来の方法が、本発明の１以上のＫＳに関連したヒトヘルペスウイルスから調製されたＤＮＡを使用したサザンブロット（またはドットブロット（Dot Bl ot））を利用できることは当業者にとって明かである。手短に説明すれば、標的特異的プローブＤＮＡをウイルスから単離する。ウイルス性または細胞性の標的ＤＮＡを、固体（例えば、荷電したナイロン）マトリクッスに移す。該プローブを従来の方法に従って標識する。当該分野で公知の変性および／またはプレハイブリダイゼーションに続いて、厳格な条件下で、該プローブを固定化されたＤＮＡにハイブリダイズする。厳格なハイブリダイゼーション条件は使用されるプローブに依存し、ハイブリダイズされたプローブの計算されたＴ_m（融解温度）から見積もられる（例えば、Ｔ_mの計算の説明のためのサムブルークを参照。）。放射性標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブに対するストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、変性されたプローブおよび５ＸＳＳＣを含有する溶液中でのハイブリダイゼーションと、これに続く０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）での５０〜６０℃での洗浄である。一般に、温度および塩濃度は、ハイブリダイゼーション後の洗浄がハイブリッドのＴ_M 以下約５℃の温度で行われるように選択される。従って、個々の塩濃度に対して温度はＴ_M以下５℃に選択されるか、または逆に、個々の温度に対して、塩濃度を洗浄温度よりも５℃暖かいハイブリッドのＴ_Mとなるように選択する。厳格なハイブリダイゼーションおよび洗浄に続いて、ＫＳに関連するウイルスＤＮＡにハイブリダイズするがＫＳに関連しないウイルスＤＮＡにはハイブリダイズしないプローブ（これは、適切な標的核酸に関連するシグナルの存在、および標的でない核酸からのシグナルの非存在により証明される。）を、ＫＳ関連ウイルスに対して特異的なものとして同定する。プローブの特異性を決定すること、およびＫＳに関連するヘルペスウイルスを検出するための本発明の方法を利用することにおいて、一定量のバックグラウンドシグナルは独特であり、当業者により特異的シグナルから容易に識別されうることが、更に認識される。バックグラウンドを越えて２倍のシグナルが条件に合致する。ＫＳ関連ヘルペスウイルスを検出するための好ましい方法は、ＰＣＲおよび／またはドットブロットハイブリダイゼーションを用いることである。検出若しくは予測のためのＫＳ物質の存在若しくは非存在、またはＫＳの危険性の評価には、サザントランスファー、溶液ハイブリダイゼーション、または非放射性検出システムが含まれ、これらは全て当業者に周知である。ハイブリダイゼーションはプローブを用いて行われる。ハイブリダイズした部分の視覚化は、原因物質の存在または非存在の定性的決定を可能にする。同様に、ノーザントランスファーをＲＮＡまたは逆転写酵素ＰＣＲのサンプルのメッセージを検出するために使用し得、ｃＤＮＡを上記方法で検出しうる。この手順も当分野で周知である。[81]を参照されたい。この文献は参照文献として本明細書の一部をなす。ヒトヘルペスウイルスの存在を決定するその他の手段は、in situでのハイブリダイゼーション、または特に最近では、in situでのポリメラーゼ連鎖反応である。in situでのＰＣＲは、Nouvo等[71]、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅されるＣ型肝炎ｃＤＮＡの細胞内局在化；Bagasra等[10]、in situでのポリメラーゼ連鎖反応による単核細胞内のヒト免疫不全ウイルスタイプ１プロウイルスの検出；およびHeniford等[35]、in situでの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により明らかにされた細胞性ＥＧＦ受容体ｍＲＮＡ発現の変異に開示されている。in situでのハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Methods Enzym ol.[67]に一般的に開示されている。この文献は、参照文献として本明細書の一部をなす。in situでのハイブリダイゼーションいおいて、細胞は、固体支持体、典型的にはガラススライドに固定される。次に、細胞を適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触し、標識された標的特異的プローブアニーリングを可能にする。上述のプローブはまた、in-situでのハイブリダイゼーションに、若しくはこの遺伝子を発現する組織を局在化するために、または種々の生物学的組織内のこの遺伝子若しくはそのＭＲＮＡの存在のための他のハイブリダイゼーションアッセイに使用される。in-situでのハイブリダイゼーションは、抗原の発現または自然条件vs.変性条件に依存しない鋭敏な局在化法である。ＫＳＨＶファジミド／プラスミドから作成されるオリゴヌクレオチド（オリゴ）プローブ、合成オリゴヌクレオチドプローブまたはリボプローブは相対的に相同性の試薬であり、組織セクションの好結果をもたらすハイブリダイゼーション条件は、一のプローブから他のプローブへ容易に変更できる。商業的に合成されたオリゴヌクレオチドプローブは、同定された遺伝子に対して調製される。これらのプローブは、長さ（４５〜６５mers）、高いＧ−Ｃ含量（５０〜７０％）で選択され、ジーンバンクの他のウイルス性配列に対する独自性についてスクリーニングされる。オリゴヌクレオチドは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、１×１０¹⁰dpm/ugの範囲で特異的活性に対して［α−³⁵Ｓ］ｄＡＴＰで３ ’末端が標識される。取り込まれなかった標識ヌクレオチドは、セファーデックスＧ−２５カラムを通す遠心分離によって、またはウォータースＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カラムから溶出することによってオリゴプローブから除去される。ＯＣＴ化合物に埋め込まれ、ドライアイスで冷却して凍結させたイソペンタンにスナップ凍結されたＫＳ組織を６μｍの間隔で切断し、３−アミノプロピルトリエトキシシラン処理されたスライド上で解凍し、空気乾燥させた。次にこのスライドを４％の新たに調製したパラホルムアルデヒドに固定し、水で軽く洗浄する。ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれたＫＳ組織であって、６μ ｍに切断し、ガラススライド上でベーキングされたものも使用することができる。次に、セクションをキシレン中で脱パラフィン化し、特級アルコールを通して再水和化した。２０ｍＭトリスＰｈ７．５、０．０２％Denhardt's溶液、１０％デキストラン硫酸内での３７℃で３０分のプレハイブリダイゼーションに続いて、５０％ホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）、１０％デキストラン硫酸（ｗ／ｖ）、２０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｐｈ７．４）、３ＸＳＳＣ、１Ｘ Denhardt's溶液、１００ug/mlサケ精子ＤＮＡ、１２５ug/ml酵母ｔＲＮＡおよびオリゴプローブ(１０⁶cpm/ml)の溶液中、４２℃で一夜ハイブリダイズした。このスライドを２ＸＳＳＣで２回、１ＸＳＳＣで２回室温でそれぞれ１５分間洗浄し、オートラジオグラフィーで視覚化した。手短に説明すると、セクションを０．３Ｍ酢酸アンモニウムを含有する特級アルコールを通して脱水し、空気乾燥した。スライドをコダックＮＴＢ２エマルジョンに軽く浸し、数日から数週間露光し、現像し、ヘマトキシリンおよびエオキシンで対比染色した。この他の当業者に周知の免疫組織化学的プロトコールを使用しうる。ＩＶ．ヒトヘルペスウイルスで誘導されるＫＳの治療本発明は、カポジ肉腫を有する患者を治療する方法であって、患者に対して、上記の単離されたＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができる効果的な量のアンチセンス分子を、該アンチセンス分子が患者の腫瘍細胞に選択的に取り込まれるような条件下で投与し、これによって患者を治療することを具備した方法を提供する。本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）を有する患者を治療するための方法であって、ヒトヘルペスウイルスに関連したＫＳを有する患者に、薬学的に許容しうる担体に含まれる薬学的有効量の抗ウイルス薬（該医薬は、ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスを有する患者を治療するのに効果がある）を投与することを具備した方法を提供する。更に、本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）を予防または治療する方法であって、薬学的に許容しうる担体に含まれるヒトヘルペスウイルスに結合しうる抗体を、ＫＳの危険性のある患者に投与することによる方法を提供する。一態様では、抗ウイルス性医薬は、本発明のＤＮＡヘルペスウイルスを有する患者を治療するのに使用される。抗ウイルス性医薬と、引き続く治療とを組み合わせて使用することは、ヘルペスウイルス感染の治療に有効であり、ヘルペスウイルスで誘導されるＫＳの治療にも有効である。例えば、Snoeck等[88]は、抗ヘルペス薬を組み合わせた場合（例えば、アジドブジン［３’−アジド−３’−デオキシチミジン、ＡＺＴ］とＨＰＭＰＣ、ガンシクロビル、ホスカルネット（foscarnet）またはアシクロビルとの組合せ、またはＨＰＭＰＣと他の抗ウイルス薬の組合せ）に、ＣＭＶに対して相加的または相乗的な効果をそうすることを見出した。同様に、サイトメガロウイルス網膜炎の治療において、ガンシクロビルでの誘導と、これに続くホスカルネットでのメンテナンスは、各々の単独での治療の有害な副作用を最小にしながら効果を最大にする方法として提案されている。アシクロビルおよび例えば２−アセチルピリジン−５−（（２−ピリジルアミノ）チオカルボニル）−チオカルボニルヒドラゾンを含有する抗ヘルペス性組成物は、米国特許第5,175,165号（Bur roughs Wellcome Co.に譲渡されている）に開示されている。抗ヘルペス性医薬において、ＴＳ阻害剤およびウイルス性ＴＫ阻害剤の組合せは、Stichting Rega VZWに譲渡された米国特許第5,137,724号に開示されている。ＨＰＭＰＣとＡＺＴの幾つかの比率の組合せを用いたＥＢＶ複製の共同性阻害効果は、Lin等[56]により報告されている。米国特許第5,164,395号および同第5,021,437号（Blumenkopf, Burroughs Well come）には、アシクロビルと組み合わせたアセチルピリジン誘導体の使用を含めたヘルペス感染の治療のためのリボヌクレオチドリダクターゼ阻害剤（アセチルピリジン誘導体）の使用が開示されている。米国特許第5,137,724号（Balzari等 [11]）には、ウイルス性チミンキナーゼ阻害活性を有する化合物と組み合わせたチミリデート合成阻害剤（例えば、５−フルオロ−ウラシルおよび５−フルオロ −２’−デオキシウリジン）の使用が開示されている。今回同定されたＫＳに対する疾病原因物質の発見を用いて、ヘルペスウイルスに関連したＫＳの症状を緩和または予防するための効果的な治療または予防プロトコールを形成することができる。疾患のウイルス特性によって、インターフェロン、ヌクレオチド類似体、リバビリン、アマンタジン、およびホスホノ酢酸のピロホスフェート類似体（ホスカルネット）等のような抗ウイルス剤は、ここでは治療のために適用される（Gorbach,S.L.等[28]に概説されている。）。免疫学的治療も、多くの場合、ここで開示された疾患物質によって起こる症状を管理および緩和するのに効果的であろう。抗ウイルス薬には、ウイルス産物に直接結合し、疾患のプロセスを妨害する医薬または組成物が含まれるが、ウイルスの増殖またはウイルスのタイターに直接に影響を与えない医薬は除かれる。抗ウイルス薬には、ウイルスタイターに直接影響しないか、またはウイルス産物に結合しない免疫調節薬は含まれない。抗ウイルス薬は、これらがウイルスを不活性化するか、さもなければその感染性または増殖を阻害するか、またはＫＳの症状を緩和する場合に効果的である。Ａ．抗ウイルス薬ウイルスで誘導されたＫＳを治療するのに有効であろう抗ヘルペスウイルス薬は、これらの推定された作用形式に基づいて広範囲の分類にグループ分けされる。これらの分類には、(i)ウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害によって、（ii）他のウイルス性酵素およびタンパク質を標的とすることによって、（iii）多方面の、または不完全に理解されたメカニズムによって、または（iv）標的核酸を結合すること（即ち、阻害性核酸治療）によって夫々作用する医薬が含まれる。抗ウイルス薬はまた、相乗的または相加的な効果、または他の利点を達成するために組み合わせて（即ち一緒にまたは続けて）使用され得る。抗ウイルス薬をこれらの指示された作用メカニズムによって分類することは便利であるが、出願人は抗ウイルス作用の何れかの特定のメカニズムによって束縛されることを意図していない。更に、医薬がウイルスまたはウイルスに感染した細胞内の１以上の標的に対して、１以上のメカニズムを介して作用しうることは当業者によって理解されるであろう。ｉ）ウイルス性ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤臨床的な利用または今日の発展における多くの抗ヘルペスウイルス薬は、ウイルス性ＤＮＡの複製の阻害を介して、特に、ウイルス性ＤＮＡポリメラーゼの阻害を介して作用すると信じられているヌクレオシド類似体である。これらのヌクレオシド類似体はウイルス性ＤＮＡポリメラーゼに対する他の基質として、またはＤＮＡポリメラーゼ基質の競争的阻害剤として作用する。通常、これらの医薬は、もし存在すれば、ウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）によって優先的にホスホリル化され、および／または細胞性ＤＮＡポリメラーゼに対するよりもウイルス性ＤＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有し、選択的な抗ウイルス活性が生じる。ヌクレオシド類似体が、ウイルス性ＤＮＡに取り込まれると、ウイルスの活性または複製が種々の方法で影響を受ける。例えば、類似体は、連鎖ターミネータとして作用し、類似体を含有するＤＮＡの不安定性を増加させる原因となり、および／または転写もしくは複製のテンプレートとして作用する置換されたＤＮＡの能力を減少しうる（例えば、balzarini等[11]参照）。多くの医薬と同様に、ヘルペスウイルス感染の治療に有効な医薬の多くは、宿主、宿主細胞、またはウイルスに感染した宿主細胞代謝酵素によって修飾（即ち、活性化）されることは、当業者に公知であろう。例えば、アシクロビルはその活性型へトリホスホリル化される。この場合、最初のホスホリル化は、存在する場合には、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによって行われる。他の例は、報告されている三段階の代謝経路で化合物ＨＯＥ６０２のガンシクロビルへの変換（Winkler等[95]）、および例えばＣＭＶヌクレオチドキナーゼによるガンシクロビルのその活性型へのホスホリル化である。ウイルスの特異的な代謝能力が特異的な医薬に対するそのウイルスの感受性に影響を与えうること、および抗ウイルス薬の選択の１つのファクターとなることは当業者に明かであろう。幾つかの抗ヘルペスウイルス薬の活性のメカニズムは、De Clercq[22]並びに上記および下記の文献に開示されており、これらの全ては、参照文献として本明細書の一部をなす。ウイルスで誘導されたＫＳを治療するのに適した抗ヘルペスウイルス薬物療法には、非環式ヌクレオシドホスホネート類似体（例えば、ホスホニルメトキシアルキルプリンおよびピジミジン）を含めたヌクレオシド類似体、および環状ヌクレオシド類似体が含まれるが、これらに限定されない。これらには、以下のような医薬が含まれる。ビダラビン（９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン；アデニンアラビノシド、ａｒａ−Ａ、Ｖｉｒａ−Ａ、パーク−デービス）；１−β −Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ａｒａ−Ｕ）；１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−シトシン（ａｒａ−Ｃ）；ＨＰＭＰＣ［（Ｓ）−１−［３−ヒドロキシ −２−（ホスホニルメトキシ）プロピル］シトシン（例えば、ＧＳ５０４ Gilea d Science）］およびその環状型（ｃＨＰＭＰＣ）；ＨＰＭＰＡ［（Ｓ）−９− （３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピル）アデニン］およびその環状型（ｃＨＰＭＰＡ）；（Ｓ）−ＨＰＭＰＤＡＰ［（Ｓ）−９−（３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピル）−２，６−ジアミノプリン］；ＰＭＥＤＡＰ［９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−２，６−ジアミノプリン］；ＨＯＥ６０２［２−アミノ−９−（１，３−ビス（イソプロポキシ）−２−プロポキシメチル）プリン］；ＰＭＥＡ［９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン］；ブロモビニルデオキシウリジン（BurnsおよびSandford.[21]）；１−β− Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−ウリジン又は−２’ −デオキシウリジン；ＢＶａｒａＵ（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５ −（２−ブロモビニル）−ウラシル、ブロバビル、Bristrol-Myers Squibb，Yam sa Shoyu）；ＢＶＤＵ［（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン、ブリブジン、例えばHelpin］およびその炭素環式類似体（このうち、糖部分は、シクロペンタン環によって置き換えられる。）；ＩＶＤＵ［（Ｅ）−５ −（２−ヨードビニル）−２’−デオキシウリジン］およびその炭素環式類似体、Ｃ−ＩＶＤＵ（Balzarini等[11]）］；および２’−デオキシウリジンの５− マーキュチチオ（mercutithio）類似体（Holliday,J.およびWilliams,M.V.[38] ）；アシクロビル［９−（［２−ヒドロキシエトキシ］メチル）グアニン；例えばゾビラックス（Burroughs Wellcome）］；ペンシクロビル（９−［４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ブチル］−グアニン）；ガンシクロビル［（９ −［１，３−ジヒドロキシ−２プロピルメチル］−グアニン）例えばシメベン（Cymevene）、シトベン（Cytovene）（Syntex）、ＤＨＰＧ（Stalsら[89]］；ガンシクロビルのイソプロピルエーテル誘導体（例えばWinkelmannら[94]参照）；シガロビル（Cygalovir）；ファムシクロビル（famciclovir）[２−アミノ− ９−(４−アセトキシ−３−(アセトキシメチル)ブト−１−イル)プリン(Smithkl ine Beecham)]；バラシクロビル（Burroughs Wellcome）；デサイクロビル（des ciclovir）［（２−アミノ−９−（２−エトキシメチル）プリン）］および２− アミノ−９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−９Ｈ−プリン、アシクロビルのプロドラッグ；ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキシグアノシン）；およびペンタフラノシル環がシクロブタン環で置き換えられたプリンヌクレオシド(例えば、シクロブタ−Ａ[(＋−)−９−［１β，２α，３β）２，３−ビス（ヒドロキシメチル）−１−シクロブチル］アデニン]、シクロブタ−Ｇ［（＋−）−９−［１β，２α，３β）−２，３−ビス（ヒドロキシメチル）−１−シクロブチル］グアニン］、ＢＨＣＧ［（Ｒ）−（１α，２β，１α）−９−（２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル］グアニン］、およびラセミＢＨＣＧの活性異性体、ＳＱ３４，５１４[１Ｒ−１α，２β，３α）−２−アミノ−９−［２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル］−６Ｈ−プリン−６−オン（Braitman等(1991)[20]参照]。幾つかのこれらの抗ヘルペスウイルス薬は、Gorach等[28];Saunders等[82] ;Yamanaka等[96];Greenspan等[29]に開示されており、これらは全て参照文献として本明細書の一部をなす。トリシリビン(tricilibine)およびトリシリビンモノホスフェートはヘルペスウイルス（参照文献として本明細書の一部をなすIckes等[43]）、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２（参照文献として本明細書の一部をなすKucera等[51]）に対する強力な阻害剤であり、ＫＳを治療するのに使用できる追加のヌクレオシド類似体である。これらの医薬に対する典型的なプロトコールは、約０．３５mg/m²(０．７mg/kg)を、一週間ごとに１回または一週間おきに少なくなくとも２回の投与量で好ましくは約４から８週まで静脈内注射することである。アシクロビルおよびガンシクロビルは、臨床の設定においてこれらの使用が適切であるので注目される。アシクロビル、即ちグアニンの非環式類似体は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼによりホスホリル化され、更にホスホリル化を受けてウイルスの複製の間にウイルス性ＤＮＡポリメラーゼによってチェーンターミネーターとして取り込まれる。これは、広範囲のヘルペスウイルス、単純疱疹タイプ１および２ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルスに対して治療活性を有し、ヘルペス脳炎、新生児ヘルペスウイルス感染、免疫無防備状態の宿主の水痘、水痘帯状疱疹の再発、ＣＭＶ網膜炎、ＥＢＶ感染、慢性疲労症候群、およびエイズ患者の毛状白斑症のような疾患の治療に使用される。代表的な静脈内投与量および経口投与量は、７日間８時間ごとに２５０mg/kg/m²体表面積であるか、または再発を抑制するためにはＩＶ若しくは経口で一日に２回２００〜４００mgのメンテナンス投与量である。ガンシクロビルは、幾つかのヘルペスウイルスに対してアシクロビルより活性であることが示されている。例えばOrenおよびSoble[73]を参照。ガンシクロビルの治療プロトコールは、１０〜１４日間、ＩＶで、５mg/kgで一日に二回、または２．５mg/kgで一日に三回である。メンテナンス投与量は５〜７日間、５〜６mg/ kgである。また、興味のあるものとしてＨＰＭＰＣがある。ＨＰＭＰＣは、動物モデルにおいて、ウイルス性ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＴＫ−ＨＳＶ、ＶＺＶまたはＣＭＶ感染の化学療法および予防において、アシクロビルまたはガンシクロビルよりも活性であることが報告されている（[22]上記）。ＢＶａｒａＵのようなヌクレオシド類似体は、ＨＳＶ−１、ＥＢＶ、およびＶＺＶのような強力な阻害剤であって、脳炎の動物モデルでアシクロビルよりも高い活性を有する。ＦＩＡＣ（フルオロヨードアラビノシルシトシン（fluroidoar abinosyl cytosine））およびその関連フルオロエチルおよびヨード化合物（例えば、ＦＥＡＵ、ＦＩＡＵ）は、ヘルペスウイルスに対して高い選択的活性を有し、ＨＰＭＰＡ（（Ｓ）−１−（［３−ヒドロキシ−２−ホスホリルメトキシ］プロピル）アデニン）は、アシクロビルまたはガンシクロビルよりもＨＳＶおよびＣＭＶに対して強力であることが示されており、ＫＳの進んだケースで選択される。クラドリビン（cladribine）（２−クロロデオキシアデノシン）は、特異性の高い抗リンパ球薬（即ち、免疫抑制剤）として知られる他のヌクレオシド類似体である。他の有用な抗ウイルス薬には、５−チエン−２−イル−２’−デオキシウリジン誘導体、例えばＢＴＵＢ［５−５（５−ブロモチエン−２−イル）−２’−デオキシウリジン］およびＣＴＤＵ［ｂ−（５−クロロチエン−２−イル）−２’ −デオキシウリジン］；およびＯＸＴ−Ａ[９−(２−デオキシ−２−ヒドロキシメチル−β−Ｄ−エリスロ−オキセタノシル)アデニン]およびＯＸＴ−Ｇ[９− （２−デオキシ−２−ヒドロキシメチル−β−Ｄ−エリスロ−オキセタノシル）グアニン]が含まれる。ＯＸＴ−Ｇは、ウイルス性ＤＮＡ合成を阻害することによって作用すると信じられているが、その作用メカニズムはまだはっきりしていない。これらのおよび他の化合物は、Andrei等[5]に開示されており、これは参照文献として本明細書の一部をなす。ヘルペスウイルス感染を治療するのに有用な追加の抗ウイルス性プリン誘導体は米国特許第５，１０８，９９４（これはBe echam Group P.L.Cに譲渡されている。）に開示されている。６−メトキシプリンアラビノシド（ａｒａ−Ｍ;Burroughs Wellcome）は、水痘帯状疱疹ウイルスの強力な阻害剤であり、ＫＳの治療に有用であろう。いくらかのチミジン類似体［例えば、イドキシウリジン（idoxuridine）（５ −ヨード−２’−デオキシウリジン）（5-ido-2'-deoxyuridine）］およびトリフルオロチミジン）は、抗ヘルペスウイルス活性を有するが、これらの全身性の毒性故に、ＨＳＶ間質角膜炎およびブドウ膜炎を含めた局所的ヘルペスウイルス感染に広く使用されており、他の選択が不可能である場合以外はここでは好ましくない。抗ヘルペスウイルス活性を示す他の有用な抗ウイルス薬には、ホスカルネットナトリウム(ホスホノ蟻酸トリナトリウム、ＰＦＡ、ホスカビル(Foscavir)(Astr a))およびホスホノ酢酸（ＰＡＡ）が含まれる。ホスカルネットは、ＤＮＡポリメラーゼのピロリン酸塩結合部位を競争的にブロックすることによって作用する無機ピロリン酸塩類似体である。これらの医薬は、ウイルス性チミジンキナーゼによってプロセッシングされることなく直接にＤＮＡポリメラーゼをブロックするものである。ホスカルネットはＰＡＡよりも毒性が低いと報告されている。ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ以外のウイルス性タンパク質または他のウイルス性の機能を標的にする医薬出願人は、抗ウイルス作用の特定のメカニズムによって拘束されることを意図しないが、上記の抗ヘルペスウイルス薬がウイルス性ＤＮＡポリメラーゼの阻害を介して作用すると信じている。しかし、ウイルスの複製は、ウイルスの核酸の複製だけでなく、ウイルスのタンパク質または他の必須成分の産生も必要とする。従って、本発明はＤＮＡポリメラーゼ以外のウイルス性タンパク質を標的にしてウイルスの増殖を阻害することにより（例えば、これらの合成若しくは活性の阻害、またはこれらの合成の後にウイルス性タンパク質の破壊によって）、ＫＳを治療することを包含する。例えば、ウイルス性セリンプロテアーゼを阻害する医薬（例えばウイルス性キャプシドの発達に重要なもの）の投与が、ウイルスで誘導されるＫＳの治療には有用であろう。他のウイルス性酵素標的には、ＯＭＰデカルボキシラーゼ阻害剤（例えば、パラゾフリンの標的）、ＣＴＰ合成阻害剤（例えば、シクロペンテニルシトシンの標的）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ、リボヌクレオシドリダクターゼ（米国特許第 5,111,799号（Tolman等、Merck）に開示されたカルボキシル含有Ｎ−アルキルジペプチド）、チミジンキナーゼ（例えば、米国特許第4,863,927号および同第4,7 82,062号（Tolman等Merck）に開示された１−［２−（ヒドロキシメチル）シクロアルキルメチル］−５−置換−ウラシルおよびグアニンの標的）並びに他の酵素が含まれる。特徴づけられたものおよびいままでに発見されている追加のウイルス性タンパク質があり、これらが、抗ウイルス薬の標的となりうることは当業者には明かであろう。ｉｖ）他の医薬および抗ウイルス活性の様式クタプレッシン（kutapressin）は、２５mg/mlの注射可能な形態でミルウオーキー、ウィスコンシンのシュワルツパーマ（Schwarz Parma）から入手可能な肝臓誘導物（liver derivative）である。ヘルペスウイルスに対して推奨される投与量は、１５０ポンドの平均的な成人に対して１日あたり２００から２５mg/ml である。ロックビル、ＭＤのＨＥＭファーマシューティカルズからのアンプリゲン（Am pligen）として知られる一般的に容認された抗ウイルス薬であるポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ₁₂Ｕ）は、ヘルペスウイルスを阻害することが示されており、ＫＳを治療するのに適した他の抗ウイルス薬である。静脈内注射が好ましい投与経路である。約１００から６００mg/m²の投与量が平均１５０ポンドの成人に対して一週間に２から３回投与される。一週間に少なくとも２００mg/m²を投与することが最も好ましい。ヘルペスウイルス（例えば、水痘帯状疱疹および単純疱疹）に対して活性を示すことが報告され、ヘルペスウイルスで誘導されるＫＳの治療に有効であろう他の抗ウイルス薬には、マッピシンケトン（mappicine ketone）(SmithKline Bee- cham);水痘帯状疱疹のための化合物Ａ,７９２９６およびＡ,７３２０９(Abbott) および化合物８８２Ｃ８７(Burroughs Wellcome)が含まれる[The Pink Sheet55( 20)５月１７日、１９９３年参照]。インターフェロンはヘルペスウイルスの複製を阻害することが知られている。既出の[73]を参照されたい。インターフェロンには毒性の問題が知られており、インターフェロンの抗ウイルス特性を維持しているが副作用が減少されている二次生成誘導体が早期に利用可能となることが期待されている。ヘルペスウイルスで誘導されるＫＳを、潜伏性ウイルスの再活性化を誘導するヘルペスウイルス再活性化剤を投与することによって治療しうることも考慮される。好ましくは、再活性化は、抗ヘルペスウイルス薬の同時または引き続きの投与と組み合わされる。抗ウイルス剤の存在下での、短期間の制御された再活性化または再活性化は、いくらかのヘルペスウイルス感染の有害な影響を最小にすると信じられている（例えばＰＣＴ出願ＷＯ９３／０４６８３に開示されている）。再活性化剤には、エストロゲン、ホルボールエステル、ホルスコリンおよびβ −アドレナリン作用ブロック剤のような医薬が含まれる。ヘルペスウイルス感染の治療およびヘルペスウイルスで誘導されるＫＳの治療に有効な医薬は、多くの米国特許に開示されている。例えば、ガンシクロビルは、米国特許第4,355,032号および同第4,603,219号に開示されたタイプの抗ウイルス性グアニン非環式ヌクレオチドの例である。アシクロビルは、９−（２−ヒドロキシエチルメチル）アデニンを含む、米国特許第4,287,288号、同第4,294,831号および同第4,199,574号に開示されたタイプの抗ウイルス性プリン誘導体のクラスの例である。ブリブジンは、米国特許第4,424,211号に開示されたタイプの抗ウイルス性デオキシウリジン誘導体の例である。ビダラビンは、英国特許第1,159,290号に開示されたタイプの抗ウイルス性プリンヌクレオシドの例である。ブロバビルは、米国特許第4,542,210号および同第4,380,076号に開示されたタイプの抗ウイルス性デオキシウリジン誘導体の例である。ＢＨＣＧは、米国特許第5,153,352号、同第5,034,394号および同第5,126,345 号に開示されたタイプの抗ウイルス性炭素環式ヌクレオシド類似体の例である。ＨＰＭＰＣは米国特許第5,142,051号に開示されたタイプの抗ウイルス性ホスホニルメトキシアルキル誘導体の例である。ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキシグアノシン）は、米国特許第4,543,255号、同第4,855,466号、および同第4,894,458号に開示されたタイプの抗ウイルス性炭素環式ヌクレオシド類似体の例である。ホスカルネットは、米国特許第4,339,445号に開示されている。トリフルリジンおよびその対応するリボヌクレオシドは、米国特許第3,201,38 7号に開示されている。米国特許第5,321,030号（Kaddurah-Daouk等；Amira）には、抗ヘルペスウイルス薬としての幾つかの類似体の使用が開示されている。米国特許第5,306,722号（Kim等；Bristol-Meyers Squibb）には、ＨＳＶ感染の治療、およびヘルペスチミジンキナーゼの阻害に有効なチミジンキナーゼ阻害剤が開示されている。他の抗ウイルス組成物は、米国特許第5,286,649号および同第5,098,708号(Konishi等、Bristol-Myeres Squibb)並びに同第5,175,165号(Blumenkopf等、Burroughs We llcome)に開示されている。米国特許第4,880,820号（Ashton等；Merck）には、抗ヘルペスウイルス薬（Ｓ）−９−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシメチル）グアニンが開示されている。米国特許第4,708,935号（Suhadolnik等；Research Corporation）には、ＨＳＶおよびＥＢＶを阻害するのに効果的な３’−デオキシアデノシン化合物が開示されている。米国特許第4,386,076号（Machida等；Yamasa Shoyu Kabushiki kai sha）には、抗ヘルペスウイルス薬としての（Ｅ）−５−（２−ハロゲノビニル）−アラビノフラノシルウラシルが開示されている。米国特許第4,340,599号（L ieb等；Bayer Aktiengesellschaft）には、抗ヘルペス薬として有用なホスホノヒドロキシ酢酸誘導体が開示されている。米国特許第4,093,715号および同第4,0 93,716号（Lin等、Reseach Corporation）には、単純疱疹ウイルスの強力な阻害剤としての５’−アミノ−５’−デオキシチミジンおよび５−ヨード−５’−アミノ−２’，５’−ジデオキシシチジンが開示されている。米国特許第4,069,38 2号(Baker等;Parke,Davis＆Company)には、抗ウイルス薬として有用な９−（５ −Ｏ−アシル−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン化合物が開示されている。米国特許第3,927,216号（Witkowski等）には、ヘルペスウイルス感染を阻害するための１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドおよび１，２，４ −トリアゾール−３−チオカルボキサミドの使用が開示されている。特許第5,17 9,093号（Afonso等；Schering）には、単純疱疹ウイルス１および２、サイトメガロウイルスおよびエプスタインバーウイルスに対して活性なキノリン−２，４ −ジオン誘導体が開示されている。ｖ）阻害性核酸治療本願で計画されているものにはまた、KSに感染した患者でのヘルペスウイルスの活性を阻害することが可能な阻害性核酸治療がある。阻害性核酸は一本鎖の核酸であってもよく、これは相補的な核酸配列に対して特異的に結合することが可能である。適切な標的配列に対して結合することで、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ− ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖、または三重鎖が形成される。上記の核酸は、そのセンス鎖の核酸の利用方法が最近になって開発されたが、遺伝子のセンス鎖、もしくはコ−ディング鎖に対して相補的であるため、しばしば「アンチセンス」と呼ばれる。本願で使用する「阻害性核酸」という用語は、センス、及びアンチセンスの両方を示す。標的核酸に結合することにより、阻害性核酸は標的核酸の機能を阻害することができる。これは例えば、ＤＮＡ転写、mRNAのプロセッシング、もしくはポリＡの付加、ＤＮＡ複製、翻訳、またはＲＮＡ分解を促進するような細胞機序の促進等をブロッキングすることによる結果である。故に阻害性核酸法は、ヘルペスウイルス遺伝子の発現を変化させる、数多くの異なった方法を包含する。これらの異なる阻害性核酸技術は、ヘレン（Helene）とトウルメ（Toulme）（３４）に記載されていているが、これを本願に組み込み、以後「ヘレンとトウルメ」と引用する。簡潔に言うと、阻害核酸治療法は、ＤＮＡ配列を標的とするもの、ＲＮＡ配列（プレ−mRNAとmRNAを含む）を標的とするもの、タンパク質を標的とするもの（センス鎖法）、及び標的核酸の化学的修飾、または開裂を引き起こすものに分類される。ＤＮＡを標的にする方法には、幾つかの範疇がある。二重鎖ＤＮＡの主要溝（ major groove）に結合させて三重鎖、または「三重」構造を形成するように、核酸を設計することも可能である。あるいは、複製または転写中に二重鎖ＤＮＡを開かせて、一本鎖ＤＮＡの領域に結合させるように、阻害核酸を設計することも可能である。ヘレンとトウルメを参照されたし。より一般的には、阻害性核酸はmRNA、または前駆体mRNAに対して結合するように設計されている。阻害性核酸は、ＲＮＡのプロセッシング、スプライシング、または翻訳を干渉するように設計してもよい。阻害性核酸はmRNAを標的とすることが可能である。この方法では、阻害性核．酸は、コ−ドされているタンパク質の翻訳を特異的に阻害するように設計されている。本方法において、この阻害性核酸を、重要なタンパク質をコ−ドするmRNA の翻訳を阻害して特定の細胞機能を抑制するのに使用することが可能である。例えば、c-myc mRNAの領域に対して相補的な阻害性核酸は、ヒト前骨髄球白血病細胞株であるＨＬ６０(c-mycを過剰発現する)でのc-myc発現を阻害する。ウィックストロム（Wickstrom）ら（９３）、及びハレル−ベラン（Harel-Bellan ）ら（３１Ａ）を参照されたし。ヘレンとトウルメに記載されているように、mR NAを標的とする阻害性核酸は、複数の機序により、コ−ドされるタンパク質（群）の翻訳を阻害することが示されている。細胞に導入された阻害性核酸はまた、酵素若しくはmRNAの翻訳に関わる結合性タンパク質と競合するか、これらをトラップする、遺伝子のセンス鎖、もしくは mRNAを包含する。ヘレンとトウルメを参照されたし。最後に、阻害性核酸は、標的遺伝子またはmRNAの開裂、または化学的不活化を誘導するように使用することも可能である。化学的不活化は、阻害性核酸と細胞内の標的核酸との間の、架橋誘導により起こすことができる。適切に誘導した阻害性核酸により派生する標的核酸の、他の化学的修飾もまた、使用することが可能である。標的核酸の開裂、すなわち不活化は、活性化されると開裂反応を阻害する阻害性核酸に置換物を付加することにより影響を受ける可能性がある。置換物は、化学的、または酵素的開裂に影響を与えるものであってもよい。あるいは、開裂はリボザイムや触媒性ＲＮＡの使用により誘導することも可能である。この方法において阻害性核酸は、天然のＲＮＡ（リボザイム）、または触媒活性を有する合成核酸の何れかを具備するであろう。免疫系の細胞の表面にあって、標的部分に結合する受容体と共役することにより行う、免疫系の特異的細胞への阻害性核酸の標的化は、阻害性核酸治療に関して、上記した全てのものに対して使用することが可能である。本発明は、上記、及びヘレンとトウルメの記載の、阻害性核酸治療の全ての形態を包含する。本発明は、KSの治療に使用する、本発明のヒトヘルペスウイルスの配列に対しての阻害性核酸標的化に関する。抗ヘルペスウイルス阻害性核酸の一つの例としては、CMVに対する活性のあるISIS2922(ISIS製薬)がある(Biotechnology News１４（１４）p5を参照のこと)。阻害性核酸治療に関連した問題としては、阻害性核酸を標的細胞へin vivoで効果的に運び、それに続いて該阻害核酸を細胞によってインタ−ナリゼ−ションさせることである。これは阻害性核酸を標的部分へ連結させて、標的の感染細胞表面上の特異的受容体に結合する共役物を形成させて、結合後にインタ−ナリゼ −ションさせることにより可能である。ｉｉｉ）投与治療を受ける患者、または本願で使用するその組織は、哺乳類、またはより特異的にはヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、サル、またはげっ歯類であってもよい。好ましい態様においては患者はヒトである。組成物は、投与製剤に適応するようにして投与され、また治療的に効果的な量で投与される。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、実施者（開業医）の判断とに依存し、またそれぞれの患者に特有である。初期投与、及び追加免疫に関しての適切な措置もまた、定まっていないが、初期投与とそれに続いて行なわれる、注射またはその他の投与方法による１時間、またはそれ以上の間隔での反復投与により、特徴づけられる。本願で使用する投与という用語は、患者への投与方法を示す。このような方法は、当業者にはよく知られ、局所的、非経口的、経口的、経静脈的、筋肉内的、皮下的、またはエアロゾル的な投与方法が含まれるが、これらには限定されない。薬剤の投与は、患者中の治療薬剤が、カポシ肉腫の患者、またはカポシ肉腫に関連したＤＮＡウイルスに感染した患者の治療に有効となるように連続的、または断続的に行なわれる。ヘルペスウイルス誘導性KSの治療用の抗ウイルスの組成は、ヒトの患者に対しては好ましくは、経口的、経静脈的、または非経口的な投与方法、及びその他の全身的様式でもって投与される。当業者らは、医者によって採用されるそれぞれの組成に対する適切なプロトコ−ルを理解するであろう。本発明の薬学的製剤、または組成は、固形、半固形、または懸濁液やアエロゾルなどの液状の投与形態をとることが可能である。好ましくは、この組成は適切な投与量での単一投与に適する単位投与形態で投与される。この組成はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性の担体、または希釈剤であって、動物またはヒトへの投与のための薬学的組成物を製剤化するのによく用いられるヴィークル（vehicle）として定義されているものを含むことが可能である。希釈剤は、その組み合わせ物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンジャ−（Ringer）溶液、ブドウ糖溶液、及びハンク溶液がある。更に、薬学的組成物または製剤には、その他の担体、アジュバント、または非毒性で、非治療性で、非免疫原性の安定化剤などが含まれる。希釈剤、または担体の効果的な量とは、組成の可溶性、または生物学的活性などという点に関して、薬学的に許容できる製剤が得られる量のことである。Ｖ．治療のための免疫学的方法 KSの主要な原因が新規のヒトヘルペスウイルスであると同定されたので、現在では、ウイルスに感染した組織が存在することにより起きる免疫的機能不全を調節する免疫抑制療法がある。特に、ウイルスに感染した細胞に対する免疫学的攻撃を阻止する薬剤は、KSの症状の改善し、及び/または病気の進行を低減させる。このような治療には、ウイルスに感染した細胞の標的化を特異的に阻止する抗体が含まれる。このような薬剤には、免疫系をアップレギュレ−トしてウイルスに感染した細胞の標的化をするサイトカインに結合する抗体が含まれる。このような抗体は、免疫抑制剤、増強剤、及び副作用軽減剤を含むがこれらには限定されない、２以上の抗体、治療薬、または組成物を含んだカクテルで、あるいは単一で患者に対して投与することが可能である。特に興味深いのは、宿主のアレルギ−反応を抑制するのに有益な免疫抑制剤がある。興味深い免疫抑制剤には、プレドニソン（prednison）、プレドニソリン（prednisolon）、DECADRON （Merch,Sharp＆Dohme,West Point,PA）シクロホスファミド（cyclophsphamide ）、シクロスポリン（cyclosporin）、６−メルカプトプリン、メトトレキセ− ト（metotrexate）、アザチオプリン（azathioprine）、及びi.v.ガンマグロブリン、またはこれらの組み合わせが含まれる。興味深い増強剤には、モネンシン(monensi n)、塩化アンモニウム、クロロキン（chloroquine）が含まれる。これらの薬剤全ては、Physician Desk Reference,41st ed.(1987)(Publisher Edward R.Barnh art,New Jersey)の文献などで開示されている、一般的に許容されている効果的な投与量範囲で投与される。ヒトヘルペスウイルス、またはこれに関連したウイルスに感染した患者から得た免疫グロブリンは、標準的な手法により得られる。抗体の適切なタイタ−は、この治療に対して知られていて、またKSの治療にすぐに適用される。免疫グロブリンは非経口的な接種、またはくも膜下腔内の分路（shunt）経由で投与することが可能である。簡潔にまとめると、免疫グロブリン調剤は、KS関連ヒトヘルペスウイルスに対する抗体に関してスクリ−ニングされたドナ−個体から得られ、高タイタ−ドナ−からの血漿がプ−ルされる。あるいは、ドナ−からプ−ルして、本発明のヒトヘルペスウイルスに対しての抗体を検査し、高タイタ−のプ−ルを選択してKS患者で使用する。抗体は、注射可能な調剤へと製剤化することが可能である。非経口的製剤は既知であり、本願での使用に適するが、好ましくはi.m.またはi.v.投与に対してである。治療的に効果的である量の抗体、または免疫毒素を含む製剤は、無菌の溶液、懸濁液、若しくは凍結乾燥したものの何れかであり、適切には安定化剤、または賦形剤を含む。凍結乾燥した組成物は、適切な希釈剤、例えば接種用の水、生理食塩水、0.3％のグリシンなどで、宿主体重kg当たり0.01mgから、適当であればkg当たり10mgのレベルになるように戻される。典型的には、抗体または免疫毒素を含む薬学的組成物は、治療する哺乳類のkgあたり、約0.01mgから約5mgの範囲にある治療的効果のある投薬量で投与される。抗体または免疫毒素を含む薬学的組成物の、治療的効果のある好ましい投薬量は、毎日１時間以上に渡って経静脈注入で数日間から２週間、患者投与量連続的上昇法で投与される場合には、体重kg当たり約0.01mgから約0.5mgである。抗体は、皮下的、腹腔内的、またはKS病変部に直接、i.m.注射して全身的に投与することが可能である。投与量は、医師の技量と同様に、例えば活性や生物学的半減期、製剤中の抗体濃度、投薬場所と投薬率、患者の臨床的耐性、患者を苦しめる疾患などといった、使用する抗体、又は免疫毒素の性質によって依存する。本発明の抗体は、溶液で投与することが可能である。この溶液のpHは５から9. 5の範囲になくてはならなく、好ましくは6.5から7.5の範囲である。抗体、またはその誘導体は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシル）アミノメタン−HCl、またはクエン酸塩などの薬学的に許容できる緩衝液を有する溶液でなくてはならない。緩衝液の濃度は１から100ｍＭの範囲でなくてはならない。抗体の溶液も、50 から150ｍＭの塩化ナトリウム、または塩化カリウムのような塩を含んでいなくてはならない。アルブミン、グロブリン、ゲラチン、プロタミン、またはプロタミン塩のような、効果的な量の安定化剤もまた含まれている必要があり、これは、抗体や免疫毒素を含む溶液や、溶液を調製するための組成物に加えてもよい。抗体の全身的投与は、血管内注入も可能であるが、通常は筋肉内注射で毎日行なわれる。投与は鼻腔内、またはその他の非経口的経路以外の方法であってもよい。抗体、または免疫毒素はまた、微粒子、リポソ−ム、または組織（血液を含む）に置かれたその他の微小粒子デリバリ−システムで投与することができる。治療への適用において、本発明に準じて使用する化合物の投与量は、その化合物のクラスと治療する状態に応じて変化する。治療を受ける患者の年齢、体重、及び臨床的状態、更に治療を行う臨床医または開業医の経験と判断などが、投与量の決定に影響を与えるものである。例えば、免疫グロブリンの投与量は、ポリクロ−ナル抗体の場合は、体重kg当たり、一日当たり約0.1mgから、体重kg当たり、一日当たり約10mgの範囲にあり、またモノクロ−ナル抗体の場合には、上記の約5％から約20％である。このような場合、免疫グロブリンは一日一回、静脈内注入により投与することが可能である。好ましくは、投薬は治療的結果が得られるか、または副作用により治療を取りやめなくてはならなくなるまで毎日繰り返し行なわれる。一般に、投与量は、患者に許容できない毒性を与えることなく KSの症状を処置するか、改善するのに十分でなくてはならない。化合物の効果的な量は、症状の主観的軽減、または臨床医やその他の適任観察者が認める、同定可能な客観的改善の何れかが得られるものでなくてはならない。投与量の範囲は、使用する化合物、投与経路、及び特異的化合物の作用強度により変化する。 VI ．ワクチンとKSに対する予防本発明は、カポシ肉腫に対して患者をワクチン接種する方法であって、効果的な量の、単離したＤＮＡ分子がコ−ドするペプチド、またはポリペプチドと、許容される適切な担体とを具備し、これにより患者をワクチン接種する方法を提供する。一つの態様においては、カポシ肉腫に対してワクチン接種するために効果的な量で、裸のＤＮＡを、患者に投与する。この発明は、カポシ肉腫に関連したＤＮＡヘルペスウイルスによっておこる疾患に対して患者を免疫する方法であって、患者に単離したヘルペスウイルスワクチンの効果的な免疫量を投与することを具備した方法を提供する。Ａ．ワクチン本発明は更に、KSの予防用のワクチンとして使用するのに適切な物質、及びこれを投与する方法を提供する。このワクチンは本発明のヘルペスウイルスに向けられていて、最も好ましくは、KS関連ヒトヘルペスウイルスより得た抗原を具備している。ワクチンは、組み換えにより作成することが可能である。典型的には、ワクチンは、約１から50μｇの抗原、または、抗原性タンパク、若しくはペプチドを含むものである。より好ましくは、タンパク質の量は、約15から45μｇである。典型的にはこのワクチンは、一回の投薬量中に0.5mlが含まれるように製剤されている。このワクチンは、当該技術分野で知られる如何なる経路によっても投与することが可能である。好ましくは、経路は非経口的なものである。より好ましくは、皮下的、または筋肉内的なものである。抗原の効果を増幅する数多くの方法、特にワクチン技術に関連したものがある。例えば、ペプチドの環化やサ−キュラリゼ−ション（corcularization）は、そのペプチドの抗原性や免疫原性を増加させる。参照することで本願に組み込む、U.S.Pat.No.5,001,049を参照されたし。より通常には、抗原は適切な担体（通常はタンパク質）、に共役させることが可能である。この方法には複数の面がある。この方法は、ペプチドを単一のより大きい担体へ共役させるといった、抗原の多コピ−化を許容する。更に、この担体は輸送、結合、吸着、または抗原のトランスファ−を容易にする性質を有することも可能である。皮下注入などの非経口的投与をする場合の、適切な担体の例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、血漿アルブミン、及びヤツメウナギ、もしくはキ −ホ−ル（keyhole）カサガイのヘモシアニンであるが、なぜなら、これらは最小限の遺伝的制限で共役物を得られるからである。これらのユニバ−ザルな共役物は、非常に異なった遺伝子セットを有する個体内で、Ｔ細胞クロ−ン活性化剤として機能することが可能である。ペプチドと担体との間の共役は、当該技術分野で知られる方法により行うことが可能である。特に、共役には二機能性のクロスリンク剤を結合剤として、例えばミ−ンズ（Means）とフィ−ニ−（Feeney）の記載（A recent review of prot ein modification techniques,Bioconjugate Chem.1:2-12,(1990)）されるようにして使用することが可能である。数多くのヘルペスウイルスに対するワクチンがうまく開発されている。生の弱毒化Oka株を使用した、水痘帯状疱疹ウイルスに対するワクチンは、高齢者における帯状疱疹の予防、及び免疫無防備状態、及び正常な子供に置ける水痘の予防の両方に効果的である（Hardy,I.,et al.,[30];Hardy,I.,et al.,[31];Levin,M. J.,et al.,[54];Gershon,A.A.,[26]）。単純ヘルペスウイルス１型及び２型はまた、商業的に入手可能であり、初期的疾患の対する予防で成功を収めているが、知覚性神経節での潜伏感染を予防することにおいては成功していない（Roizman ，B,[78];Skinner,G.R.,et al.,[87]）。細胞外ウイルス粒子を、培養した感染細胞より単離し、ホルムアルデヒドで不活化し、次いで超遠心でウイルス量子を濃縮してホルムアルデヒドを除去し、個体を１Ｘ109のウイルス粒子を含む用量で２または３回免疫することで、ヒトヘルペスウイルスに対するワクチンが、調製される（Skinner,G.R.,et al.,[86]）。あるいは、エンベロ−プ糖タンパク質を大腸菌（E.coli）内で発現するか、または安定な哺乳類細胞株へ形質移入し、そのタンパク質を精製してワクチンに使用することも可能である（Laskey,L.A.,[53]）。ヒトヘルペスウイルスに感染した細胞からの、MHC結合性ペプチドは、[61]（上記）の方法でワクチン候補として同定することも可能である。当該技術分野で知られているように、抗原は組み合わせるか、または種々の溶液、及びその他の化合物と混合してもよい。例えば、種々のアジュバントまたは免疫希釈剤を含むか、または含まない、水、生理食塩水、または緩衝液運搬体中に含ませて投与することができる。このようなアジュバント、または薬剤の例としては、水酸化アルミニウム、リン酸塩、硫酸カリウムアルミニウム（alum）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、ムラミルジペプチド、細菌性内毒素、脂質Ｘ、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）（Propionibacterium acnes）、ボルデテラ・ペルチュシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン（lysolecithin）、ビタミンＡ、サポニン、リポソ−ム、レバミソ−ル（levamisole）、DEAE−デキストン、ブロック化コポリマ−や、その他の合成アジュバントがある。このようなアジュバントは種々の入手先より商業的に得られるが、例えば、メルクアジュバント65（Merck and Company,inc.,Rahway,N.J.）、フロイントの不完全、及び完全アジュバント（Di fco Laboratories,Detroit,Michigan）などである。その他の適切なアジュバントはアンフィジェン（Amphigen）（水中油）、アルヒドロゲル（Alhydrogel）（水酸化アルミニウム）、またはアンフィジェンとアルヒドロゲルの混合物である。ヒトへの使用には、アルミニウムのみが承認されている。抗原とアジュバントとの比率は、その両方が効果的な量で存在するかぎり、広い範囲内で変化させることが可能である。例えば、水酸化アルミニウム、及びホルムアルデヒドは、ワクチン混合物の約0.5％（Al2O3に基づく）の量で存在することが可能である。投薬量当たりに基づくと、抗原の量は、患者当たり約0.1μ ｇから約100μｇのタンパク質の範囲である。好ましい範囲は、投薬量当たり約１μｇから約50μｇである。より好ましい投薬量は、15から45μｇである。適切な投薬の容量は、0.5mlである。すなわち、筋肉内注入での投薬量は例えば、0.5 ％の水酸化アルミニウム混合物中の45μｇの抗原を含む0.5mlのものであろう。製剤化後は、ワクチンは、密封して例えば４℃といった低温で保存ができるか、または凍結乾燥ができる無菌の容器にいれてもよい。凍結乾燥により、安定な形で長期間の保存がきく。ワクチンは、経口投与、及び非経口注入（例：皮下、または筋肉内）を含む、ワクチン投与方法により投与することが可能である。筋肉内投与が好ましい。処置は、ある期間にわたって単一投与量のワクチン、または複数投与量のワクチンの投与からなる。ヒトの患者に対しては、生後８ケ月以内に投与することが好ましい。本発明の抗原は、Ａ型インフルエンザ抗原のようなインフルエンザ抗原を含んだ、適切な量の化合物とともに組み合わせることができる。また抗原は、経口投与に適応可能な組み換えワクチンの組成物であってもよい。本発明のワクチンは、多価のワクチンを産生するために、その他の疾患に対するワクチンと組み合わせてもよい。薬学的に効果のある量の抗原は、哺乳類、特にヒトのワクチン接種に有益な、タンパク質や希釈剤といった薬学的に許容される担体とともに用いられる。その他のワクチンは、当該技術分野でよく知られる方法により作成される。当業者は、効果的な免疫保護を惹起するには、適切なエピト−プに対して哺乳類を露出することのみが必要であることをすぐに認めるであろう。エピト−プは、典型的には全タンパク質の小さい部分であるアミノ酸断片である。組み換え技術を利用すれば、天然タンパク質の一次構造を改変して、天然のエピト−プと同じか、または実質的に同等（免疫学的に同等）の誘導体を作成するのは極通常のことである。このような誘導体には、ヒトヘルペスウイルス由来のウイルスタンパク質の、ペプチド断片、アミノ酸置換体、アミノ酸欠失体、及びアミノ酸付加体がある。例えばタンパク質技術においては、ある種のアミノ酸残基は、タンパク質の生物学的活性に不当な影響を与えずに、同様のサイズと極性を有する他のアミノ酸と置換することが可能である。ヒトヘルペスウイルスのタンパク質は、重要な三次構造を有しておりエピト−プは通常立体配座をとる。故に、修飾は一般的に、立体配座を保存して保護免疫反応を起こすようにする。Ｂ．抗体予防法出生児の水痘、及びCMVを含むヘルペスウイルス疾患の受動的免疫治療の方法として、治療的、静脈内の、ポリクロ−ナル、またはモノクロ−ナル抗体を使用することが可能である。ヒトヘルペスウイルスに感染して、該ウイルスに対しての適度に高い抗体力価を有する患者から得た免疫グロブリンは、抗ウイルス剤（ガンシクロビル）と組み合わせて行うか、または現在KSの治療に対しての評価がなされているその他の免疫治療方法と組み合わせて行うことができるが、後者は、免疫反応（すなわちコポリマ−１、抗イディオタイプモノクロ−ナルタイプ、Ｔ細胞「免疫」）を修飾することを標的としている。ヒトヘルペスウイルスに対する抗体は、本願で記載されるようにして患者に投与することが可能である。ヒトヘルペスウイルスに感染した細胞上で発現しているエピト−プに特異的な抗体が好ましく、また上記したようにして得ることができる。ポリペプチド、類縁体、または活性断片は、中和された、薬学的許容性塩の形で治療用組成物内へ製剤することが可能である。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ポリペプチド、または抗体分子の遊離アミノ酸とともに形成）、及び塩酸やリン酸のような無機塩、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成されたものが含まれる。遊離カルボキシル基より形成された塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄（３価）のような無機塩、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノ−ル、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基より由来することも可能である。Ｃ．治療効果のモニタ− 本発明は、カポシ肉腫の治療効果をモニタ−する方法において、カポシ肉腫患者からの一次試料中に単離ＤＮＡ分子が存在するかを決定し、該患者へ治療効果のある量で薬剤を投与して試料中の細胞に接触するようにし、適度な時間経過後に、治療を受けた患者からの二次試料中の、単離ＤＮＡ分子の量を決定し、一次試料中、及び二次試料中で決定した、単離ＤＮＡ分子の量を比較することを具備した方法であって、薬剤効果を示す差によりカポシ肉腫の治療における治療効果をモニタ−する方法を提供する。本願においては、「量」をウイルス負荷、またはコピ−数として定義する。ウイルス負荷、またはコピ−数の決定方法は、当業者には知られている。 VII ．KSの症状を軽減する、注目している薬剤のスクリ−ニングアッセイ KSの発症または進行に関わる因子が同定されて記載されたので、この因子の生物学的活性を阻害する潜在的薬剤を同定するためのアッセイが可能になった。本願で記載したような抗ウイルス活性を有するかどうかを決定する、KS薬剤スクリ −ニングは、本願発明の目的である。このようなアッセイは、KSの治療での使用に関して評価しようとしている化合物を、KS関連ヒトヘルペスウイルスのタンパク質、またはそのペプチドを発現している細胞とインキュベーションする工程と、該化合物の、該因子の活性への影響を決定する工程とを具備している。in viv oでの動物モデルもまた効果的であろうが、適切な細胞培養系でウイルスが維持されるin vitroアッセイが好ましい。注目している因子、またはその因子由来のペプチドに対しての活性を有する化合物は、in vivoと同様、in vitroのアッセイ系でもスクリ−ニングできる。in vitroアッセイでは、ヌクレオシド類縁体、鎖終結剤（chain terminator）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びランダムポリペプチドを含む、ウイルス複製を標的とする化合物を、濃度を変えて存在させた状態で、末梢血白血球、またはMT-4のような感受性Ｔ細胞株を、注目している因子に感染させることを含んでいる（Asada,H.et al.,[7];Kikuta et al.,[48];これらはともに参照することで本願に組み込む）。感染した培養物とその上清は、全ウイルス量に関してアッセイすることができるが、これには定量性ＰＣＲ、ドットブロットアッセイ、または免疫法を使用した、ウイルスゲノムの存在確認が含まれる。例えば、感受性の細胞は、種々の濃度の薬剤存在下でヒトヘルペスウイルスに感染させ、数日後にスライド上で固定化し、ウイルスペプチドに対するモノクロ−ナル抗体を使用した間接的免疫蛍光法により、ウイルス抗原について調べる（[48]、上記）。あるいは、化学的に付着した、単層のMT-4細胞を使用して、間接的免疫抗体染色を使用した感染性因子アッセイにかけ、細胞増殖巣の縮小を調べる（Higashi,K.et a l.,[36]; これを参照することで本願に組み込む）。全細胞のin vitroアッセイに関しての別法としては、ヒトヘルペスウイルスより精製した酵素を、合理的薬剤設計の標的として使用して、チミジンホスホトランスフェラ−ゼやＤＮＡポリメラ−ゼなどの酵素活性に与える潜在的効果を決定するものが可能である。これらの二つの酵素の遺伝子が、本願で提供されている。酵素活性の測定は、該因子自体への効果を示す。ヘルペスウイルス産物を使用した薬剤スクリ−ニングが知られていて、EP0514 830(ヘルペスプロテア−ゼ)、及びWO 94/04920(UL13遺伝子産物)に記載されている。本発明は、抗−KS化学療法剤のスクリ−ニングアッセイを提供する。感染細胞は、KSに対して化学的治療性の可能性のある化学薬剤（例：アシクロ-グアノシン）の存在下でインキュベーションすることが可能である。次いで対照細胞と比較したときの細胞中のウイルスレベルを、抗原に関してのIFAにより数日後に決定するか、またはウイルスゲノムに対するサザンブロット、またはMRNAに対するノ−ザンブロットにより決定する。更に本発明は、細胞質中、または核内のＤＮＡ分子、またはタンパク質に結合することができる、それによって転写活性を阻害、または増強する薬剤、またはその他の分子を同定するのに使うことができるアッセイ系を提供する。このようなアッセイは、特定の細胞活性に特異的であるか、またはそのような活性を、時間、または活性レベルにおいて増強する薬剤の開発において有益であろう。本発明は更に、以下の実験の詳細の項で例示される。この項は、本発明の理解を助けるためのものであり、その後に続く請求の範囲に記載の発明を、如何なるようにしても限定するものではなく、またそのように解釈するべきものでもない。実験の詳細セクションＩ：実験１：ＫＳ組織中のユニークなＤＮＡ配列を同定し性状解析するための表現差解析（ＲＤＡ）ＡＩＤＳ−ＫＳ中の感染性物質に属する外来のＤＮＡ配列を探索するために、表現差解析（ＲＤＡ）を行って、同じ患者から得られた非罹患組織中に存在しないかまたは低いコピー数で存在するＫＳ組織中のユニークなＤＮＡ配列を同定し性状解析した［５８］。この方法は、ヒトＤＮＡに単一コピーとして付加されたアデノウイルスゲノムを検出することができるが、培養していない感染性物質を同定するためにこれまで使用されることはなかった。ＲＤＡは、短い制限断片のＰＣＲ増幅により、同じ個人の罹患した組織および正常組織からのゲノムの単純化された「表現」を作成して行う。次に罹患した組織からのＤＮＡ表現をプライミング配列に連結し、過剰の連結していない正常組織のＤＮＡ表現にハイブリダイズさせる。罹患した組織に見い出されるユニークな配列のみが、両方のＤＮＡ鎖にプライミング配列を有し、その後のＰＣＲ増幅において優先的に増幅される。異なる連結したプライミング配列を使用してこのプロセスを繰り返して、試料中の興味ある組織のみに存在するユニークなＤＮＡ配列を増加させることができる。ＫＳ患部組織と非患部組織両方から抽出したＤＮＡ（１０μｇ）を、別々にＢａｍＨＩ（２０単位/μｇ）で３７℃で２時間完全に消化して、２μｇの消化断片をＮＢａｍ１２およびＮＢａｍ２４プライミング配列に連結した［５８に記載されるプライマー配列］。ＰＣＲ増幅を３０サイクル行って、両方のゲノムの「表現」を増幅した。ゲノム表現の作成後、１５０〜１５００塩基対のＫＳテスターアンプリコン（tester amplicon）をアガロースゲルから単離して、ＮＢａｍプライミング配列をＢａｍＨＩで消化して除去した。非ＫＳドライバーＤＮＡには存在しないユニークなＤＮＡ配列を探索するために、第２のセットのプライミング配列（ＪＢａｍ１２およびＪＢａｍ２４）をＫＳテスターＤＮＡアンプリコンだけに連結した（図１、レーン１）。０．２μｇの連結したＫＳ患部組織アンプリコンを、２０μｇの連結していない正常組織の表現のアンプリコンにハイブリダイズさせた。次にハイブリダイゼーション産物の一定分割量に、ＪＢａｍ２４を使用して１０サイクルのＰＣＲ増幅を行い、次いでヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼで消化した。次にヤエナリで処理した異なる産物のアリコートに、ＪＢａｍ２４プライマーでさらに１５サイクルのＰＣＲを行った（図１、レーン２）。増幅産物を再度ＢａｍＨＩで消化し、第２回目のハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅のために、２００ngの消化産物をＲＢａｍ１２およびＲＢａｍ２４プライマーセットに連結した（図１、レーン３）。ＪＢａｍプライマーセットを使用してこの濃縮工程の３回目を繰り返した（図１、レーン４）。続いて両方の元のドライバーおよびテスターＤＮＡ試料（表２、患者Ａ）には、ＡＩＤＳ−ＫＳに特異的な配列であるＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６３１Ｂａｍ（以前にはＫＳ６２７Ｂａｍとして同定されていた）を含有することが見い出され、このことは、両組織に異なるコピー数の標的配列が存在するときにＲＤＡをうまく利用できることを示している。ＫＳおよび正常組織からのＤＮＡ増幅−ハイブリダイゼーションの最初のラウンドでは、拡散したバンドのパターンが得られた（図１、レーン２）が、約３８０、４５０、５４０および６８０塩基対の４つのバンドは２回目の増幅−ハイブリダイゼーション後に同定可能であった（図１、レーン３）。これらのバンドは、第３ラウンドの増幅−ハイブリダイゼーション後に分離した（図１、レーン４）。ＡＩＤＳ−ＫＳ組織から抽出したＤＮＡ自身に対してハイブリダイズさせることにより、コントロールＲＤＡから約５４０塩基対の単一のバンドが得られた（図１、レーン５）。４つのＫＳ関連バンド（２つの隣接する２８塩基対の連結したプライミング配列をＢａｍＨＩで消化後、ＫＳ３３０Ｂａｍ、ＫＳ３９０Ｂａｍ、ＫＳ４８０Ｂａｍ、ＫＳ６２７Ｂａｍと命名した）をゲル精製し、ｐＣＲＩＩベクターに挿入することによりクローン化した。ＰＣＲ産物を。ＴＡクローニングシステム（Invitrogen Corporation、サンジエゴ、カリホルニア州）を使用してｐＣＲIIベクターにクローン化した。実験２：ＡＩＤＳ−ＫＳにユニークな配列の特異性の測定これらの配列のＡＩＤＳ−ＫＳに対する特異性を測定するために、ランダムプライムした³²Ｐ−標識挿入断片を、ＡＩＤＳ患者および非ＡＩＤＳ患者から得た低温保存組織から抽出したＤＮＡのサザーンブロットにハイブリダイズさせた。全てのＡＩＤＳ−ＫＳ試料を、ＫＳの形態的な確認のために顕微鏡で検査して、血液凝固第VIII因子、ウレックス・ユーロパエウス（Ulex europaeus）およびＣＤ３４抗原発現について免疫組織化学的に検査した。ＡＩＤＳ−ＫＳ試料の１つは、ＫＳ組織が顕微鏡検査で検出されなかったため、明らかにラベルが違っていたが、統計解析の目的でＫＳ試料群に含まれていた。ＫＳ患部組織との比較に使用されたコントロール組織は、ＡＩＤＳの患者および非ＡＩＤＳ患者からの５６のリンパ腫、ＡＩＤＳの患者および非ＡＩＤＳ患者からの１９の過形成性リンパ節、非ＡＩＤＳ患者からの５つの血管腫瘍、およびＡＩＤＳ患者で一般的に起きる日和見感染で感染した１３の組織を含んでいた。コントロールＤＮＡはまた、非ＡＩＤＳ患者からの一連の４９の外科的生検試料からも抽出した。試料に関するさらなる臨床的および患者統計学的情報は、患者の秘密を守るために集めなかった。１９８３〜１９９３年に、表１にリストした組織を診断のための生検および剖検から集めて−７０℃で保存した。各組織試料は、表１に注記されているものを除いて、異なる患者からのものであった。２７のＫＳ試料の大部分は、普通の皮膚の微生物叢による汚染の可能性の少ない外科的条件下で切開されたリンパ節からのものであった。全ての試料は、ハイブリダイゼーションの前にＢａｍＨＩで消化した。ＫＳ３９０ＢａｍおよびＫＳ４８０Ｂａｍは、ＫＳおよび非ＫＳ組織の両方に非特異的にハイブリダイズしたが、さらには性状解析しなかった。２７のＡＩＤＳ−ＫＳＤＮＡの内の２０（７４％）は、種々の強度で、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍの両方にハイブリダイズし、別の１つのＫＳ試料は、サザーンブロッティングによりＫＳ６２７Ｂａｍのみにハイブリダイズした（図２および表１）。ＡＩＤＳ−ＫＳ患部組織とは対照的に、ＡＩＤＳ患者からの３９の非ＫＳ組織の内のわずか６つ（１５％）がＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍ挿入断片にハイブリダイズした（表１）。非ＡＩＤＳ患者３６名からのリンパ腫またはリンパ節ＤＮＡ、あるいは一連の患者から得られた４９の生検組織試料からのコントロールＤＮＡでは、特異的なハイブリダイゼーションは起きなかった。いくつかの血管腫瘍(血管周皮細胞腫、血管肉腫（２）およびリンパ管腫を含む)から抽出したＤＮＡも、サザーンブロットハイブリダイゼーションにより陰性であった。ＡＩＤＳ患者に一般的な日和見感染した組識（抗酸性菌（種が特定されていない）７つ、サイトメガロウイルス１つ、ネコひっかき菌（cat-scratch bacillus）１つ、クリプトコックス２つおよびトキソプラズマ症感染組識を含む）から抽出したＤＮＡは、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍのサザーンブロットハイブリダイゼーションにより陰性であった。表１の凡例：ａ：ｐ５３エクソン６について増幅できない１つのＡＩＤＳ−ＫＳ試料、および顕微鏡検査でＫＳ組識の存在を検出できない１つの組識を含む。これらの試料は両方ともＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍへのサザーンブロットハイブリダイゼーション、ならびにＫＳ３３０₂₃₄アンプリコンについてのＰＣＲ増幅により陰性であった。ｂ：７つの非切れ込み小細胞型（small non-cleaved cell）リンパ腫、２０のびまん性大細胞型および免疫芽球性リンパ腫を含む。免疫芽球性の形態を有する３つのリンパ腫は、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍに陽性であった。ｃ：１３の未分化大細胞型リンパ腫、４つのびまん性大細胞型リンパ腫、４つの小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、３つのヘアリーセル白血病、２つの単球様Ｂ細胞性リンパ腫、１つの瀘胞性切れ込み小細胞型リンパ腫、１つのバーキットリンパ腫、１つの形質細胞腫を含む。ｄ：２つの血管肉腫、１つの血管周皮細胞腫および１つのリンパ管腫を含む。ｅ：２つのクリプトコックス、１つのトキソプラズマ、１つのネコひっかき菌（cat-scratch bacillus）、１つのエプスタインバーウイルス、および７つの抗酸菌に感染した組識を含む。さらに、マイコバクテリウムアビウム複合体の純粋培養物は、サザーンハイブリダイゼーションおよびＰＣＲにより陰性であり、マイコプラズマペネトランス（Mycoplasma penetrans）の純粋培養物はＰＣＲにより陰性であった。ｆ：組識は、皮膚、虫垂、腎臓、前立腺、ヘルニア嚢、肺、線維組識、胆嚢、結腸、包皮、甲状腺、小腸、アデノイド、静脈、腋窩組識、脂肪腫、心臓、口、痔核、偽性動脈瘤および瘻管を含んでいた。組識は、ＡＩＤＳではないが未知のＨＩＶ血清状態の患者の一連の生検から集めた。ｇ：４つの一連の外科的生検のＤＮＡ試料で約２０Kbで明白な非特異的ハイブリダイゼーションが起こった：１つの結腸ＤＮＡ試料および１つのヘルニア嚢ＤＮＡ試料は、ＫＳ３３０Ｂａｍのみにハイブリダイズし、別のヘルニア嚢ＤＮＡ試料は、ＫＳ６２７Ｂａｍのみにハイブリダイズし、そして１つの虫垂ＤＮＡ試料は、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍの両方にハイブリダイズした。これらの試料は、これらの配列に予測される３３０〜６３０塩基対範囲でハイブリダイズしなかったが、ＫＳ３３０₂₃₄にはＰＣＲ陰性であった。さらに、エプスタインバーウイルスに感染した末梢血リンパ球およびマイコバクテリウムアビウム(Mycobacterium avium)複合体の純粋培養物からのＤＮＡも、サザーンハイブリダイゼーションにより陰性であった。全体として、２７のＡＩＤＳ−ＫＳ試料の内の２０（７４％）は、ＫＳ３３０Ｂａｍにハイブリダイズし、２７のＡＩＤＳ−ＫＳ試料の内の２１（７８％）は、ＫＳ６２７Ｂａｍにハイブリダイズしたが、これに比較して、１４２の非ＫＳヒトＤＮＡコントロール試料ではわずか６つ（４％）がハイブリダイズしたのみであった（それぞれχ² ＝８５．０２、ｐ＜１０^-7およびχ²＝９２．４、ｐ＜１０^-7）。ＡＩＤＳ−ＫＳ組識中の配列のコピー数は、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＴ細胞受容体β遺伝子の定常部について４４０塩基対プローブで同時ハイブリダイゼーションして推定した［７６］。図２Ａ〜２Ｂのレーン５および６の試料は、２つのプローブに同程度の強度を示し、このことは、細胞あたり約２つのＫＳ３３０Ｂａｍ配列の平均コピー数を示しており、一方残りの組識は、ＫＳ３３０Ｂａｍプローブによるハイブリダイゼーションシグナルは弱かった。実験３：ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍの性状解析ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍをさらに性状解析するために、各挿入断片の６つのクローンを配列決定した。シーケナーゼバージョン２．０（Unit ed States Biochemical、クリーブランド、オハイオ州）システムを使用して、製造業者の指示により配列決定を行った。コロンビア大学のＤＮＡ配列決定施設内のアプライドバイオシステム３７３Ａシーケンサー(Applied Biosystems 373A Sequencer)でヌクレオチド配列を確認した。ＫＳ３３０Ｂａｍは、５１％のＧ：Ｃ含量を有する３３０塩基対の配列（図３Ｂ）であり、ＫＳ６２７Ｂａｍは、６３％のＧ：Ｃ含量を有する６２７塩基対の配列（図３Ｃ）である。ＫＳ３３０Ｂａｍは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のＢＬＤＦ１読み取り枠（ＯＲＦ）と５４％のヌクレオチド同一性を有する。さらなる分析により、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＫＳ６２７Ｂａｍがウイルス由来のポリペプチドと相同なアミノ酸配列をコードすることが判った。ＢＬＡＳＴＸを使用して相同性のあるＯＲＦについてスイスプロット（SwissProt）およびＰＩＲタンパク質データベースを探索した［３］。ＫＳ３３０Ｂａｍは、広鼻猿類の劇症リンパ腫を引き起こすガンマヘルペスウイルスであるヘルペスウイルス・サイミリ（herpesvirus saimiri）［２］のキャプシドタンパク質ＶＰ２３をコードするＯＲＦ２６読み取り枠の部分（ＮＣＢＩｇ．ｉ. ６０３４８、塩基対４６０２４−４６９３５）とアミノ酸相同性により５１％同一である。この断片はまた、ＥＢＶの相同的な読み取り枠のＢＤＬＦ１により理論的にコードされるタンパク質に３９％の同一なアミノ酸配列を有する（ＮＣＢＩｇ．i. ５９１４０、塩基対１３２４０３−１３３３０７）［９］。ＫＳ６２７Ｂａｍによりコードされるアミノ酸配列は、ヘルペスウイルス・サイミリ（herpesvirus saimiri）の外被タンパク質のｇｐ１４０（ＯＲＦ２９、ＮＣＢＩｇ．i. ６０３９６、塩基対１０８７８２−１１２６８１）に弱い同一性(３１％)で相同である。ＫＳ３３０Ｂａｍからの配列データを使用してＫＳ３３０₂₃₄と呼ばれる２３４塩基対断片を増幅するためのＰＣＲプライマーを作成した（図３Ｂ）。ＰＣＲ分析の条件は以下のとおりであった：９４℃で２分（１サイクル）；９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分（３５サイクル）；７２℃で伸長５分（１サイクル）。各ＰＣＲ反応では、０．１μｇのゲノムＤＮＡ、５０pmolの各プライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼ、１０μＭの各三リン酸デオキシヌクレオチド、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、および０．１％トリトン−Ｘ−１００を最終容量２５μｌで使用した。工程間の１秒の変化（ra mp）時間でパーキン−エルマー４８０サーモサイクラー（Perkin Elmer 480 The rmocycler）で増幅を実施した。サザーンブロットハイブリダイゼーションでは２７のＫＳ組識の中のわずか２０にＫＳ３３０Ｂａｍ配列を検出したが、ＫＳ３３０₂₃₄のＰＣＲ増幅では２７の組識中２５が陽性であり（図４Ａ〜４Ｂ）、このことは、ＫＳ３３０ＢａｍがいくつかのＫＳ患部組識で、サザーンブロットハイブリダイゼーションによる検出での閾値未満のレベルで存在することを示している。すべてのＫＳ３３０₂₃₄ のＰＣＲ産物は、³²Ｐ末端標識した２５塩基対内部オリゴマーにハイブリダイズし、ＰＣＲの特異性を確認している（図４Ｂ）。ＫＳ３３０₂₃₄が陰性の２つのＡＩＤＳ−ＫＳ試料について、両方の試料は技術的な問題のために陰性であるようであった：１つは凍結試料中に顕微鏡で検出できるＫＳ組識がなく（図４Ａ〜４Ｂ、レーン３）、そしてもう１つ（図４Ａ〜４Ｂ、レーン５）は、ｐ５３遺伝子の対照ＰＣＲ増幅で陰性であり、ＤＮＡ分解または試料中のＰＣＲインヒビターの存在を示唆していた。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子のＰＣＲ増幅物を、ＤＮＡ性の対照として使用した。Ｐ６−５からのｐ５３プライマーの配列は、５’−ＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号４４）、およびＰ６−３では、５’−ＡＧＴＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４５）であった［２５］。サザンブロットハイブリダイゼーションでも陽性であったＡＩＤＳ患者からの６つの対照試料を除いて、他の１３６対照試料はＫＳ３３０₂₃₄についてＰＣＲで陽性であった。これらの試料のすべてはｐ５３遺伝子について増幅可能であり、不十分なＰＣＲ増幅は、対照組識中のＫＳ３３０₂₃₄の検出の欠如の理由ではないことを示していた。２つの候補ＫＳ物質、ＥＢＶおよびマイコプラズマペネトランス（Mycoplasma penetrans）（ＡＴＣＣ受託番号５５２５２）（ＡＩＤＳ −ＫＳ患者の生殖器に通常存在する病原体［５９］）からのＤＮＡを含有する試料もまた、ＫＳ３３０₂₃₄の増幅は陰性であった。さらに、いくつかのＫＳ試料は、マイコプラズマについて特異的な市販のＰＣＲプライマー（Stratagene、ラホイア（LaJolla）、カリホルニア州）およびＥＢＶのＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ −３ＣおよびＥＢＥＲ領域について特異的なプライマーを用いて検査し、陰性であった。全体に、２７のＫＳ組識の内の２５（９３％）からのＤＮＡはＰＣＲで陽性であり、これに対して１４２対照試料の６つ（４％）が陽性であり、この中には３９のＡＩＤＳ患者の非ＫＳリンパ節およびリンパ種のうちの６つ（１５％）（χ² ＝３８．２、ｐ＜１０^-6）、３６の非ＡＩＤＳ患者のリンパ節およびリンパ種のうちの０個（χ²＝５５．２、ｐ＜１０^-7）、および４９の連続生検試料のうちの０個（χ²＝６７．７、ｐ＜１０^-7）が含まれていた。すなわち、ＫＳ３３０₂₃₄は、顕微鏡で検出できるＡＩＤＳ−ＫＳですべての２５の増幅可能な組識に見られるが、ＡＩＤＳ患者の組識を含む非ＫＳ組識にはほとんど存在しなかった。ＰＣＲとサザンハイブリダイゼーションの両方で陽性のＡＩＤＳ患者の６つの対照組識のうち、２人の患者は別のところでＫＳを有し、２人はＫＳを発症せず、残りの２人の患者については、完全な病歴は得ることができなかった。６つの陽性の非ＫＳ組識のうち３つは、ＡＩＤＳの患者から得られた濾胞過形成を有するリンパ節であった。ＡＩＤＳ患者の間でＫＳの罹患率が高いため、検出されないＫＳの顕微鏡的増殖巣がリンパ節に存在した可能性がある。他の３つの陽性組識は、ＡＩＤＳ患者からのＢ細胞免疫芽球リンパ種であった。推定のＫＳ物質がＡＩＤＳ関連リンパ腫のサブセットの補助因子でもある可能性がある[１６，１７，８０]。ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍが大きなゲノムの部分であり、２つの配列が互いに近接しているか否かを測定するために、ＫＳＤＮＡの試料をＰｖｕI I制限酵素で消化した。３つのＡＩＤＳ−ＫＳ試料からの消化したゲノムＤＮＡを、サザンブロットによりＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍにハイブリダイズさせた（図５）。これらの配列は、消化したＫＳＤＮＡの種々のサイズの断片にハイブリダイズし、両方の配列が大きなゲノムの断片であることを示していた。３つのＡＩＤＳ−ＫＳ試料のＰｖｕII消化物に対してＫＳ３３０Ｂａｍのハイブリダイゼーションパターンの差は、大きなゲノム中に多型現象が存在することを示している。消化物の各断片は、ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍの両方にハイブリダイズはせず、これらの２つのＢａｍＨＩ制限断片は互いに隣接しないことを示している。ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７ＢａｍがＫＳの遺伝する多型ＤＮＡマーカーであるなら、これらの配列はＡＩＤＳ−ＫＳ患者の非ＫＳ組識部位で均一に検出するはずである。あるいは、ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍが外因性感染性物質に特異的な配列であるなら、ある組識は感染されていなく、検出できるＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍ配列を欠失する可能性がある。これらのＡＩＤＳ−ＫＳ患者の多種の関係のない組識から抽出されたＤＮＡを³²Ｐ標識ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍプローブとハイブリダイズさせ、ＫＳ３３０₂₃₄プライマーを用いてＰＣＲで解析した（表２）。ＫＳ患部組識ＤＮＡ試料は両方のバンドについて陽性であり、非患部組識はこれらの配列についてしばしば陰性であった。患者Ａ、Ｂ、およびＣからのＫＳ患部組識、および患者Ａの関係のない皮膚や筋肉は、ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍについて陽性であったが、患者Ｂの筋肉や脳組識、ならびに患者Ｃの筋肉、脳、大腸、心臓および肺門リンパ節組識はこれらの配列について陰性であった。患者ＣのＫＳ患部組識に隣接する関係のない胃内膜はＰＣＲで陽性であったが、サザンブロッティングでは陰性であり、この組識にサザンブロッティングの検出閾値以下のレベルで存在することを示唆している。実験４：ＫＳＨＶのサブクローニングと配列決定ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６２７Ｂａｍは、ＡＩＤＳ−ＫＳに関係のある新規の感染性物質のゲノム断片である。ＫＳ患部組識のゲノムライブラリーを作成し、ＫＳ３３０Ｂａｍ配列を含有する２０kb挿入体を有するファージクローンを同定した。ＰｖｕIIで消化したこの２０kbクローン（ＫＳ３３０Ｂａｍ配列の中間で切断される）は、ＫＳ３３０Ｂａｍにハイブリダイズする１．１kbと３kbの断片を産生した。１.１kbのサブクローニングした挿入体と９４０４塩基対の隣接配列となる３kbのサブクローニングした挿入体からの約９００塩基対を完全に配列決定した。この配列は、ガンマヘルペスウイルス中の相同性のある部分的および完全な読みとり枠を含有する。ＫＳ３３０Ｂａｍ配列は、ＨＳＶＳＡとＥＢＶのそれぞれＯＲＦ２６とＢＤＬＦ１遺伝子と５５〜５６％のヌクレオチド同一性を有するＯＲＦである。これらのＯＲＦのＥＢＶおよびＨＳＶＳＡ翻訳アミノ酸配列は、ＫＳ関連の９１８塩基対のＯＲＦにコードされるアミノ酸配列と広範な相同性を示す（図６）。ＨＳＶＳＡにおいては、ＶＰ２３タンパク質は、カプシッド作製に関与する後期構造タンパク質である。ＫＳ患部組識からのｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲは、転写されたＫＳ３３０ＢａｍｍＲＮＡについて陽性であり、これはこのＯＲＦがＫＳ患部組識で転写されることを示す。ＫＳ媒体とヘルペスウイルスの間の相同性を示す追加の証拠は、９４０４塩基対配列上の他の可能性のあるＯＲＦのゲノム構成の比較から得られる（図３Ａ）。配列の５’末端は、ＥＢＶとＨＳＶＳＡの両方の主要カプシッドタンパク質（ＭＣＰ）ＯＲＦの６６〜６７％のヌクレオチド同一性と６８〜７１％のアミノ酸の同一性を有するヌクレオチドとより構成される。ＫＳ物質のこの推定のＭＣＰＯＲＦは、これらの２つの遺伝子のヘルペスウイルスのサブファミリーの間の保存された配向であるＢＤＬＦ１／ＯＲＦ２６同族体のすぐ５’に存在する。この配列の３’で、読み枠はＨＳＶＳＡＯＲＦ２７と高いアミノ酸相同性とヌクレオチド相同性を有する。すなわち、ガンマヘルペスウイルスゲノムに相同性を有する２つの別の領域に少なくとも４つの座におけるＫＳ関連ＤＮＡ配列が同定されている。前述の２１kbのファージ挿入体のＰｖｕII消化物から得られる断片以外に、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ消化物から得られる断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにもサブクローニングした（Stratagene、ラホイア、カリホルニア州）。これらのサブクローニングした断片の末端を配列決定し、核酸配列ＥＢＶおよびＨＳＶＳＶ遺伝子と相同性を有することが見いだされた。これらの同族体は、サブクローニングした断片の予備的地図を作製するために使用される（図９）。すなわち、配列決定により、ＫＳ媒体は、２１kbのファージ挿入体の長さにわたってガンマヘルペスウイルスと共線状（co-linear）相同性を維持することが明らかになった。実験５：ＫＳＨＶの系統の決定ＫＳ３３０Ｂａｍに隣接する領域を配列決定し、指向性歩行(directional wal king)により性状解析した。これは以下の方策を用いて行なった：１）ＫＳゲノムライブラリーを作成し、ハイブリダイズプローブとしてＫＳ３３０Ｂａｍ断片を用いてスクリーニングし、２）ＫＳ３３０Ｂａｍプローブについて陽性のファージクローンからＤＮＡ挿入体を単離し、適当な制限酵素で消化し、３）消化した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene、ラホイア、カリホルニア州）にサブクローニングし、４）サブクローンを配列決定した。この方策を用いると、主要なカプシッドタンパク質（ＭＣＰ）ＯＲＦ同族体は、同定された最初の重要な遺伝子座であった。陽性ファージクローンからの配列決定したユニークな３’ および５’末端断片をプローブとして用いて、上記の方策に従って、追加の隣接配列について標準的方法によりＫＳゲノムライブラリーをスクリーニングした。配列決定のために制限断片をファージミッドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−、ｐＢＳ＋、またはｐＢＳ−（Stratagene）またはまたはプラスミドｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９中にサブクローニングした。組換えＤＮＡを、ＣｓＣｌ密度勾配または陰イオン性交換クロマトグラフィー（ Qiagen）により精製した。ＫＳＨＶのクローン化断片の標準的スクリーニング方法によるヌクレオチドの配列決定は、合成された市販のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてジデオキシヌクレオチド鎖停止法により、断片に沿って「歩行」して２本鎖ＤＮＡの直接配列決定することにより行なった。クローン間の結合部分は、重複クローンを配列決定して確認した。ＫＳ３３０Ｂａｍに隣接する領域のターゲティングされた相同的遺伝子には、１１−１０同族体、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｇ８５、ｇ３５、ｇＨ、カプシッドタンパク質およびＭＣＰがあるが、これらに限定されない。ＴＫはＤＮＡ複製に機能的に結合したヘルペスウイルスの初期タンパク質であり、抗−ヘルペスウイルスヌクレオシドの標的酵素である。ＴＫは、アシクロビルのような非環状ヌクレオシドをリン酸化し、アシクロビルは次に、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ鎖伸長を阻害する。この遺伝子の配列を決定すると、ＫＳＨＶに対して有用な化学療法剤の予測が促進される。ＴＫは、ＢＤＬＦ１の約９７００塩基対右側のＥＢＶＢＸＬＦ１ＯＲＦ、およびＯＲＦ２６の約９２００塩基対右側のＨＳＶＳＡＯＲＦ２１によりコードされる。ＫＳ５のサブクローン化断片は、ＥＢＶおよびＨＳＶＳＡＴＫ読みとり枠と強い相同性を有することが同定された。ｇ８５は、ＨＳＶ１内のｇＨに相同性の膜融合に関与する後期糖タンパク質である。ＥＢＶではこのタンパク質は、ＢＤＬＦ１の約７６００塩基対右側のＢＬＸＦ２ＯＲＦにコードされ、ＨＳＶＳＡではこれはＯＲＦ２６の約７１００塩基対右側のＯＲＦ２２によりコードされる。ｇ３５は、ウイルス粒子と原形質膜に存在する後期ＥＢＶ糖タンパク質である。これは、ＥＢＶ中のＢＤＬＦ１の１３００塩基対左側のＢＤＬＦ３ＯＲＦによりコードされる。ＨＳＶＳＡにはＢＤＬＦ３同族体はない。サブクローン化断片は、すでにＥＢＶｇｐ３５読みとり枠と高い相同性を有することが同定されている。主要キャップタンパク質（ＭＣＰ）は、ヘルペスウイルスカプシッドの主要な成分である保存された１５０kDaタンパク質である。抗体は、ほとんどのヘルペスウイルスによる自然の感染の間にＭＣＰに対して作成される。ＫＳＨＶ中のこの主要カプシッド遺伝子同族体の末端１０２６塩基対が配列決定されている。ＫＳ６２７Ｂａｍに隣接する領域中の標的された相同的遺伝子／座には、末端繰り返し、ＬＭＰＩ、ＥＢＥＲｓおよびＯｒｉＰがあるが、これらに限定されない。末端繰り返し配列はすべてのヘルペスウイルスに存在する。ＥＢＶでは、縦列繰り返しの０．５kbの長い末端反復配列が、線状ゲノムの末端に隣接して、環状に結合される。末端繰り返し領域は、ＥＢＶのＢＮＲＦ１およびＨＳＶＳＡのＯＲＦ７５に隣接している。末端繰り返しの数はウイルス株により異なるため、末端繰り返し領域の同定により、ＫＳ患部組識中のＫＳＨＶのタイピングとクローン性研究が可能になる。末端繰り返し領域を用いて配列決定により、このウイルスがＫＳのヒトゲノム中に組み込まれるか否かを測定することができる。ＬＭＰＩは、バーキットリンパ腫のＥＢＶの形質転換作用に重要な潜伏性のタンパク質である。この遺伝子は、環状ゲノム中の被蓋タンパク質ＯＲＦＢＮＲＦ１の約２０００塩基対右側に位置するＥＢＶＢＮＲＦ１ＯＲＦによりコードされる。ＨＳＶＳＡにはＬＭＰ１の同族体はない。ＥＢＥＲｓは、潜伏性にＥＢＶで感染された細胞中に最も豊富に存在するＲＮＡであり、Ｏｒｉ−Ｐは潜伏性のＥＢＶゲノムの複製開始点である。この領域は、ＥＢＶのＢＮＲＦ１ＯＲＦの約４０００〜９０００塩基対左側に存在する。ＨＳＶＳＡには対応する領域はない。このデータは、ＫＳ物質は、ガンマヘルペスウイルスＥＢＶおよびＨＳＶＳＡに関連した新しいヒトＨＳＶであることを示している。この配列はすべての配列決定されたヘルペスウイルスゲノム（ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ６およびＨＳＶＳＡを含む）とは異なり、３つの独立の比較試験でＫＳに特異的に関連しているため、この結果は汚染が原因ではないし、既知のヘルペスウイルスが偶然同時感染したものでもない。さらに、ＥＢＶ−１とＥＢＶ−２に特異的なプライマーを用いるＫＳＤＮＡのＰＣＲ試験では、これらの組識中にウイルスゲノムは検出されなかった。ＫＳＨＶはＥＢＶ領域に相同的であるが、この配列は他の既知の配列とは一致せず、従ってヘルペスウイルスファミリーの既知のメンバーと関連しているが異なる新しいウイルスゲノムである証拠を提供している。実験６：血清学的試験間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）ウイルス含有細胞を顕微鏡スライドにコーティングした。スライドを有機固定剤で固定し、乾燥し、次に患者血清とともにインキュベートした。血清中の抗体は細胞に結合し、次に過剰の非特異的抗体を洗い流す。次に蛍光性物質（例えば、フルオレセイン）に結合した抗ヒト免疫グロブリンを、スライドとともにインキュベートし、次に過剰の蛍光性免疫グロブリンを洗い流す。スライドを顕微鏡下で観察し、細胞が蛍光を発している場合は、これは血清が、細胞中に存在する抗原（例えば、ウイルス）に対する抗体を含有することを意味する。天然の形質転換されたＥＢＶ感染（非産生性）Ｂ細胞株である体腔ベースのリンパ腫細胞株（ＢＣＢＬ−１）について、４つのＫＳ患者血清と４つの対照血清（ＫＳのないＡＩＤＳ患者）を用いて、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）を行なった。最初に両方セットの血清は、同レベルの抗体結合を示した。ＥＢＶやリンパ球抗原に対する非特異的抗体を除去するために、血清１ml当たり３×１０⁶の１％パラホルムアルデヒド固定Ｒａｊｉ細胞を用いて、１：２５希釈の血清を吸着させた。ＢＣＢＬ１細胞をエタノール／アセトンで固定し、患者血清希釈物でインキュベートし、洗浄し、フルロレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧでインキュベートした。間接免疫蛍光染色を測定した。表３は、非吸収血清と対照血清は、ＢＣＢＬ１細胞株に対して同様の終点希釈間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）力価を有することを示す。Ｒａｊｉ吸着後、患者血清はＢＣＢＬ１細胞に対して対照血清より４倍高いＩＦＡ力価を有する。結果は、パラホルムアルデヒド固定Ｒａｊｉ細胞に対してあらかじめ吸着することにより、対照血清の蛍光抗体結合が低下するが、ＫＳ患者血清に対する抗体結合は排除しないことを示した。これらの結果は、ＫＳ患者が、ＩＦＡ、ウェスタンブロットおよび酵素免疫測定法で検出されるＫＳ物質に対して特異的な抗体を有することを示す（表３）。免疫ブロッティング（「ウェスタンブロット」）ウイルス含有細胞または精製ウイルス（または、ウイルスの部分、例えば融合蛋白）をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分子量によりタンパク質抗原を分離した。タンパク質をニトロセルロース膜またはナイロン膜にブロットし、次に膜を患者血清中でインキュベートした。レポーター酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）に結合した抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートして、特異的抗原に対する抗体を発色させた。膜を発色させた後、患者血清中の抗体に対して反応する各抗原は、対応する分子量領域でバンドとして現れる。酵素免疫測定法（「ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ」）ウイルス含有細胞または精製ウイルス（または、ウイルスの部分、例えば融合蛋白）を、種々の方法（一般的には、アルカリ性炭酸緩衝液中でインキュベートして）で９６ウェルのプレートの底にコーティングする。プレートを洗浄し、次にウェルを患者血清とともにインキュベートする。特異的抗原に対する血清中の抗体は、プレートに結合する。再度ウェルを洗浄して非特異抗体を除去し、次にウェルをレポーター酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）に結合した抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートする。プレートを再度洗浄して、非特異的抗体を除去し、次に発色させる。患者血清中の抗体により特異的に認識される抗原を含有するウェルは色が変化し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー(１種の分光光度計) により検出することができる。患者血清を非感染の細胞とプレインキュベートして、細胞または細胞株（例えば、ＥＢＶ）中に存在するかも知れない他のウイルスに対して交差反応する抗体を吸着させることにより、これらの３つのすべての方法をより特異的にすることができる。交差反応する抗体は、偽陽性の結果を与える可能性がある（すなわち、患者が実際にはウイルスで感染されていないが、調製物中に存在する細胞抗原に対する抗体と交差反応するために陽性の結果を与えること）。Ｒａｊｉを用いる感染実験の重要性は、Ｒａｊｉ細胞または他の充分に規定された細胞株が感染することができるなら、患者の血清は非感染の親細胞株に対してあらかじめ吸着して、次にいずれかの方法で測定することができる。調製物中の抗原に結合する前吸着後に残る唯一の抗体は、ウイルスに対するもののはずである。実験７：ＡＩＤＳ患者に存在するまれな浸潤性未分化体腔リンパ腫に属するリンパ腫性組識であるＢＣＢＬ１を連続的に細胞培養し、ＫＳ物質で連続的に感染されることが証明された。この細胞株はまた、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）により自然に感染される。推定のウイルスで感染されたヒトの特異的ＫＳ抗体をウェスタンブロッティング法で検出するために、ＢＣＢＬ細胞株を抗原基質として用いた。３つのリンパ腫性Ｂ細胞株を対照として使用した。これらには、ＥＢＶゲノム陽性細胞株Ｐ３Ｈ３、ＥＢＶゲノム欠陥性細胞株のＲａｊｉおよびＥＢＶゲノム陰性の細胞株Ｂｊａｂがある。後期対数増殖期の細胞を５００ｇで１０分遠心分離してＰＢＳで３回洗浄し、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ（W/V）、１５％グリセロール（v/v）、５％ベーターメルカプトエタノール（v/v）および０．００１％ブロモフェノール（w/v）を含有する試料緩衝液中に、プロテアーゼインヒビター、１００μＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とともに懸濁した。試料を１００℃で５分沸騰させ、１４，０００ｇで１０分遠心分離した。次に上清中のタンパク質を、還元条件下で１５％の分離ゲルと５％の濃縮用ゲルでドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分別した（３）。あらかじめ染色したタンパク質標準物質を含めた：ミオシン、２００kDa；β−ガラクトシダーゼ、１１８kDa；ＢＳＡ、７８kDa；オバルブミン、４７．１kDa；炭酸アンヒドラーゼ、３１．４kDa；大豆トリプシンインヒビター、２５．５kDa；リゾチーム、１８．８kDaおよびアプロチニン、８．３kDa（Bio-Rad）。免疫ブロッティング実験は、Towbinらの方法（４）に従って行なった。簡単に説明すると、タンパク質を２４Ｖで７０分電気泳動してHybon- Cエキストラ膜（Pharmacia）に移した。次に膜を３７℃で３０分乾燥し、５０ｍＭトリス−塩酸および２００ｍＭＮａＣｌ含有トリス緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）中の５％スキムミルクで室温で１時間飽和させた。次に膜を、１％スキムミルク中１：２００希釈のヒト血清で室温で一晩インキュベートし、ＴＢＳ、０．２％トリトンＸ−１００および０．０５％スキムミルクを含有する溶液で３回洗浄し、次にＴＢＳで２回洗浄した。次に膜を、１％スキムミルクで１：５０００希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ（Sigma）で室温で２時間インキュベートした。洗浄を繰り返した後、膜をニトロブルーテトラノリウムクロリドと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩（Gibco BRL）で染色した。ＫＳに感染したＡＩＤＳ同性愛男性患者からの５つの血清中のＢＣＢＬ細胞溶解物のウェスタンブロット上に特異的に、約２２６kDaと２３４kDaの２つのバンドが同定された。これらの２つのバンドは、Ｐ３Ｈ３、ＲａｊｉおよびＢｊａｂ細胞溶解液には存在しなかった。ＫＳのないＡＩＤＳ同性愛男性患者からの５つの血清およびＫＳのないＡＩＤＳ女性患者からの２つの血清、ならびに上咽頭癌患者からの１つの血清では、ＢＣＢＬ１、Ｐ３Ｈ３、ＲａｊｉおよびＢｊａｂ細胞溶解液中にこれらの２つのバンドは検出されなかった。２２６kDaと２３４kDa のマーカーを用いる盲実験では、ＫＳ患者の１６の血清のうち１５が正しく同定された。全体として、ＫＳ患者の２１の血清中の２０に、２２６kDaと２３４kDa のマーカーが検出された。この抗原は、ＢＣＢＬ１の各画分中で濃縮されている。バックグランドの低い濃縮抗原は、標準物質と広く入手できるプロトコールを用いて、出発抗原調製物としてＢＣＢＣから核を調製することにより得られる。例えば、５×１０⁵細胞/ mlの５００〜７００mlのＢＣＢＬは、低速度でペレット化できる。ペレットを１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂（等量）＋１．０％ＮＰ−４０中で氷上に２０分置いて細胞を溶解させる。次に溶解物を１５００rpmで１０分遠心分離して核をペレットにする。このペレットを、ウェスタンブロットのために抗原調製物の出発画分として使用する。これにより、細胞質性抗原との交差反応性が低下する。実験８：感染試験同時トランスフェクション実験０．４５μフィルター挿入体により分離したＲａｊｉ細胞株とともに、ＢＣＢＬ細胞を同時培養した。約１〜２×１０⁵のＢＣＢＬ１および２×１０⁶のＲａｊｉ細胞を、補足したＲＰＭＩ単独、１０μg/ml ５'−ブロモデオキシウリジン( ＢＵｄＲ)および０.６μg/ml ５'−フルオロデオキシウリジンまたは２０ng/ml １２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール(ＴＰＡ)中で２〜２０日間同時培養した。２、８、１２、または２０日間同時培養した後、Ｒａｊｉ細胞を除去し、洗浄し、補足したＲＰＭＩ１６４０培地中に入れた。ＢＣＢＬ１と２０ng/ml ＴＰＡ中で２日間同時培養したＲａｊｉ培養物は、生存し、１０週間以上連続懸濁培養した。ＲＣＣ１（Ｒａｊｉ同時培養物No.1）と命名したこの細胞株は、複数回継代した後もＫＳ３３０₂₃₄配列についてＰＣＲ陽性である。この細胞株は、ＥＭＶ、Ｂ１、Ｂ４およびＢｅｒＨ２リンパ球フローサイトメトリーで陽性であった（約２％）。ＲＣＣ１は、この物質の溶解性複製を示唆する急速な細胞溶解を受ける。すなわち、ＲＣＣ１は、ＫＳＨＶで新たに感染したＲａｊｉ細胞株である。結果は、新しいヒトのウイルス、特にＫＳ患部組識中のヘルペスウイルスの存在を示す。この物質とＡＩＤＳ−ＫＳの高度の相関（＜９０％）および免疫無防備状態のＡＩＤＳ患者からの非ＫＳ組識中のこの物質の低い発生頻度は、この物質がＡＩＤＳ−ＫＳにおいて原因的役割を果たしていることを示している[４７，６８]。実験１０：ＫＳＨＶの単離ＢＣＢＬ１培養物の上清または低速ペレット化細胞画分から、粗ウイルス調製物を作成した。約６５０mlまたはそれ以上の対数期の細胞を使用するべきである（＞５×１０⁶細胞/ml）。上清の全ウイルス粒子を結合するために、細胞を含まない上清をＧＳＡローター中で１０，０００rpmで１０分遠心分離して破片を除去した。ＰＥＧ−８０００を７％になるように加え、溶解し、氷の上に＞２．５時間置いた。次にＰＥＧ上清を１０，０００rpmで３０分遠心分離した。上清を除去してペレットを乾燥し、遠心分離ビンから一緒に掻き取った。次にペレットを少量（１〜２ml）のウイルス緩衝液（ＶＢ、０．１ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス、ｐＨ７．５）に再懸濁した。この方法により裸のゲノムとウイルス粒子全体が沈殿する。次にＶＢで作成した１０〜５０％ショ糖勾配中で２５，０００で遠心分離してウイルス粒子を単離した。次に標準的方法（例えば、分画器）により勾配の１ml画分を得て、各画分を特異的ハイブリダイズ性プライマー配列を用いてドットブロッティングにより試験して、精製されたウイルスを含有する勾配画分を決定する（ウイルスの存在の検出には、標準的ＤＮＡ抽出のように画分の調製が必要なこともある）。ウイルスからエピソーム性ＤＮＡを得るために、細胞のペレットを洗浄し、ＰＢＳ中でペレットにし、次に少量（＜３ml）中で低張ショックおよび／または凍結融解のサイクルを繰り返して溶解させる。１０,０００ｇで１０分遠心分離し、０．４５μフィルターでろ過し、次に１０，０００ｇで１０分遠心分離を繰り返して、核および他の細胞質性破片を除去する。この粗調製物はウイルスゲノムと可溶性細胞成分を含有する。次にゲノム調製物をクロロホルム−フェノールで穏やかに抽出して、結合しているタンパク質を除去するか、または２％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)および１％サルコシルを含有する中性のＤＮＡ緩衝液( １ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．６)に入れても良い。次に、０．１５％サルコシル含有中性ＤＮＡ緩衝液中での１０〜３０％ショ糖勾配で、ＳＷ２７．１ローター中で２０，０００rpmで１２時間遠心分離してゲノムを分画する（ＳＷ４１ローターで４０，０００rpmの場合は２〜３時間）。バンドを前述のように検出する。ＫＳＨＶ感染細胞培養物からＫＳＨＶゲノムを単離する方法の例（９７および９８）。約８００mlのＢＣＢＬ１細胞をペレットにし、食塩水で洗浄し、低速遠心分離でペレットにする。細胞ペレットを、１％ＮＰ−４０を含有する等量のＲＳＢ（１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．８）で氷上で１０分間溶解させる。溶解物を９００×ｇで１０分間遠心分離して核をペレットにする。この工程を繰り返す。上清に０．４％のドデシル硫酸ナトリウムと最終濃度１０ｍＭのＥＤＴＡを加える。上清を、１．０ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５の１０〜３０％ショ糖勾配にのせた。勾配分画を、ＳＷ２７．１ローターで２０，０００rpmで１２時間遠心分離する。図１１において、勾配物の０．５ml一定分割量を分画し（１〜６２）、３０％勾配画分を画分１とし、１０％勾配画分を画分６２とした。各画分をニトロセルロース膜にドットハイブリダイズさせ、次に³²Ｐ−標識ＫＳＨＶＤＮＡ断片を加え、ＫＳ６３１Ｂａｍを標準的方法を用いて膜にハイブリダイズさせる。図１１は、ＫＳＨＶゲノムの主要な可溶化画分が、画分４２〜４４でバンドに分離（すなわち、単離）し、画分４４で最高濃度になることを示す。可溶化ＫＳＨＶＤＮＡの第２のバンドは画分２６〜３２に存在する。実験１１：ＫＳＨＶの精製ＲＣＣ−１またはＲＣＣ−１_2F5細胞株から標準的方法でＤＮＡを抽出する[２７、４９、６６]。サザンブロッティングと、後述する特異的プローブを用いるＰＣＲにより、ＫＳＨＶの存在についてＤＮＡを試験する。生存している感染細胞を含有する新鮮なリンパ腫組識を、同時にろ過して標準的方法により単細胞懸濁液を形成させる［４９、６６］。標準的フィコール−プラーク遠心分離法により細胞を分離し、リンパ球層を取り出す。次にリンパ球を＞１×１０⁶細胞/mlで、標準的リンパ球組識培養培地（例えば、１０％胎児牛血清で補足したＲＭＰ１６４０）中に入れる。ＫＳＨＶウイルスを含有する不死化リンパ球は培地中で永久に増殖し、非不死化細胞は長期の培養中に死滅する。さらに、＞１×１０⁶細胞/mlの濃度で連続的に感染した細胞株からのウイルスを含有する培地上清を除去して、ウイルスを新しい細胞株中で増殖することができる。培地を２０００×ｇで１０分遠心分離し、０．４５μフィルターでろ過して細胞を除去する。培地を、＞１×１０⁶細胞/mlで増殖している細胞と１：１で４８時間添加する。細胞を洗浄し、ペレットにし、新鮮な培地に入れ、１４日間の増殖後試験する。ヘルペスウイルスは、以下の方法で細胞ＤＮＡから単離できる。感染した細胞株（これは、低浸透圧ショックやDounceホモジナイズ化のような標準的方法を用いて溶解することができる）をまず２０００×ｇで１０分遠心分離してペレットにし、１０，０００×ｇで１５分遠心分離して上清を除去して核と小器官を除去する。上清を０．４５μフィルターでろ過して、再び１００，０００×ｇで１時間遠心分離してウイルスをペレットにする。次にウイルスを洗浄し、再び１００，０００×ｇで１時間遠心分離することができる。実験の詳細セクションII：配列決定試験：ＫＳ３３０Ｂａｍとのハイブリダイゼーション陽性により同定されたＫＳ患部組識ゲノムライブラリーからのラムダファージ（ＫＳ５）をＢａｍＨＩとＮｏｔＩ（Boehringer-Mannheim、インディアナポリス、インディアナ州）で消化した。５つの断片をゲルで単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ（ Stratagene、ラホイア、カリホルニア州）中にサブクローニングした。全配列を、プライマー歩行とネスティッド(nested)欠失により７倍の平均重複性で双方向配列決定により決定した。ＤＮＡ配列データを編集し、ＡＬＩＧＮ（IBI-Kodak，ロチェスター、ニューヨーク）を用いて並べて、Wisconsin Sequence Analysis Package Version 8-UN IX（Genetics Computer Group、マジソン、ウィスコンシン州）、GRAIL Sequenc e Analysis、Gene AssemblyおよびSequence Comparison System v.1.2（Informa tics Group、オークリッジ、テネシー州）を用いて解析した。タンパク質部位のモチーフは、Motif（Genetics Computer Group、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて同定した。ヘルペスウイルス遺伝子配列比較の起源：３つのガンマヘルペスウイルスの完全なゲノム配列が利用できた：ヒトのヘルペスウイルスであるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）［４］；ニューワールド（New World）サルであるサイミリ・シウレウス（Saimiri sciureus）のヘルペスウイルスである、ヘルペスウイルス・サイミリ(herpesvirus saimiri)(ＨＶＳ)[１]；およびウマのヘルペスウイルス２(ＥＨＶ２[４９])。アルセラフィン( alcelaphine)ヘルペスウイルス１（ＡＨＶ１［２２］）およびウシのヘルペスウイルス４（ＢＨＶ４［３１］）について、追加のチミジンキナーゼ遺伝子を得た。ヒトヘルペスウイルス６Ｂとヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）の主要カプシッドタンパク質遺伝子の配列は、Mukaiらからのものである［３４］。使用したすべての他の配列の供給源は、すでにMcGeioch and Cook［３１］とMcGeioch ら［３２］に記載されている。系統学的推定：系統樹作成のために使用した予測されるアミノ酸配列は、ヘルペスウイルスの系統学的解析を用いた以前の経験に基づく［３１］。アミノ酸配列の相同的セットを、ＡＭＰＳ［５］とＰｉｌｅｕｐ［１６］プログラムを用いて並べた。顕著な長さの不均一性を有する極端な多様性を示す整列領域（典型的には末端セクション）を切り出した。一般的に、１つまたはそれ以上の配列に挿入されたギャップを含有する整列の位置を除去してから、系統樹作成を作成した。系統樹推定プログラムは、Ｐｈｉｌｉｐセット、バージョン３．５ｃ［１４］およびＧＣＧセット［１６］からのものである。系統樹は、最大倹約（maximum parsimony）（ＭＰ）法、隣接結合（ＮＪ）法により作成した。配列間の対の距離の推定値を使用するＮＪ法については、Schwartz＆DayhoffのＰＡＭ２５０置換確率マトリックス（substitution probability matrix）［４６］を用いるＰｒｏｔｄｉｓｔにより、部位当たりの置換の平均数として推定した。各整列について１００のサブ繰り返しを用いてＭＰとＮＪ系統樹についてＢｏｏｔｓｔｒａｐ解析［１５］を行ない、Ｃｏｎｓｅｎｓｅプログラムにより共通系統樹（consensus trees）を得た。さらにＰｒｏｔｍｌプログラムを用いて、最大確率法（ＭＬ）により系統樹を推定した。Ｐｒｏｔｍｌは、The Graduate University of Advanced Stud y（東京１０６、日本）の統計科学部門（Department of Statistical Science）のJ.Adachiから得た。コンピューターの制約から、Ｐｒｏｔｍｌは４−種ＣＳ１配列でのみ使用した。固定均一電界（ＣＨＥＦ）ゲル電気泳動：ＢＣＢＬ−１細胞を１％ＬＭＰアガロース（Biorad、ハーキュリーズ、カリホルニア州）と０．９％ＮａＣｌを４２℃で最終濃度２．５×１０⁷細胞/mlで再懸濁して、アガロースプラグを調製した。固化したアガロースプラグを溶解緩衝液（０．５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％サルコシル、最終濃度１mg/mlのプロテイナーゼＫ）に移し、２４時間インキュベートした。約１０⁷のＢＣＢＬ−１細胞を各レーンにのせた。ゲルを６．０V/cmの勾配で、通電時間２８時間２８分で、ＣＨＥＦＭａｐｐｅｒＸＡパルス電界ゲル電気泳動装置（Biorad、ハーキュリーズ、カリホルニア州）で流し、サザンブロッティングを行い、ＫＳ６２７Ｂａｍ、ＫＳ３３０ＢａｍおよびＥＢＶ末端繰り返し配列にハイブリダイズさせた［４０］。ゲノム複製のＴＰＡ誘導：後期対数期のＢＣＢＬ−１細胞（５×１０⁵細胞/ml）を、異なる量の１２−Ｏ −テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ、Sigma Chemical C o.、セントルイス、ミズーリ州）と４８時間インキュベートし、次に細胞を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、クロロホルム−フェノール抽出によりＤＮＡを単離した。ＤＮＡ濃縮物を紫外線吸収で測定した：５μｇの全細胞ＤＮＡを定量的に３重測定でドットブロットハイブリダイゼーションを行なった（マニフォールドＩ、Schleicher and Schuell、キーン、ニューハンプシャー州）。ＫＳ６３１Ｂａｍ、ＥＢＶ末端繰り返し配列およびベーターアクチン配列を、³²Ｐでランダムプライマー標識した［１３］。特異的ハイブリダイゼーションを、Molecular Dynamics PhosphorImager 425Eで定量した。細胞培養と感染試験：細胞を２０％胎児牛血清（ＦＣＳ、Gibco-BRL、ゲイサーズバイーク（Gaither sburg）、メリーランド州）を補足したＲＰＭＩ１６４０中で５×１０⁵細胞/ml で維持し、ＰＣＲとハイブリダイゼーションによりＫＳＨＶ感染の継続について定期的に観察した。Ｔ細胞株Ｍｏｌｔ−３（疾病管理センター(Centers for Dis ease Control and Prevention)のJodi Black博士からの供与）、Ｒａｊｉ細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）およびＲＣＣ−１細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ヨザル（owl monkey）腎臓細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）を１０％ＦＣＳおよび１％非必須アミノ酸補足ＲＰＭＩ１６４０（Gibco-BRL、ゲイサーズバイーク（Gaithersburg）、メリーランド州）中で培養した。ＲＣＣ−１細胞株を産生するために、２×１０⁶Ｒａｊｉ細胞を、１．４×１０⁶ＢＣＢＬ−１細胞とともに２０ng/mlのＴＰＡの存在下で、ＢＣＢＬ−１によるＲａｊｉの汚染を防ぐためにFalcon ０．４５μｇフィルター組識培養挿入体で分離したチャンバー中で２日間培養した。ＲＣＣ−１がＢＣＢＬ−１に汚染されていないことはＨＬＡ−ＤＲアレレのＰＣＲタイピングにより証明され［２７］（ＲａｊｉとＲＣＣ−１：ＤＲβ１^*０３１０、ＤＲβ３^*０２；ＢＣＢＬ−１：ＤＲβ１０４、^*０７、Ｄｒβ４^*０１）、フローサイトメトリーによりＥＭＡ膜抗原の有無（Ｒａｊｉ、ＲＣＣ１）を測定して確認した。ＲＣＣ−１のクローン性亜株は、９６ウェルプレート中で、２０％ＦＣＳおよび３０％Ｔ−ＳＴＩＭ補足ＲＰＭＩ１６４０培地で０．１細胞/mlに希釈して得られた（Collaborative B iomedical Products、ベッドフォード、マサチューセッツ州）。サブ培養物を観察して、それぞれが増殖細胞の単一の固まりに由来することを確認した。フルオレセインで５’標識したＯＲＦ２６（Operon、アラメダ、カリホルニア州）中に存在するすでに記載されている２５塩基対のオリゴマーを用いて、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行ない、Lunguらの方法［２９］を用いてＢＣＢＬ−１、ＲＣＣ−１およびＲａｊｉ細胞のサイトスピン調製物にハイブリダイズした。スライドを直接紫外線顕微鏡で可視化し、スライドを抗−フルオレセイン−アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）−結合抗体（ベーリンガーマンハイム（oehringer-Mannheim）、インディアナポリス、インディアナ州）でインキュベートし、結合プローブの免疫組識学的検出を行なった。２６塩基対ＴＥＴ−標識ＥＢＶＤＮＡポリメラーゼ遺伝子オリゴマー(Applied Biosystems、アラメダ、カリホルニア州)を用いて、紫外線顕微鏡のみで可視化して陽性の対照ハイブリダイゼーションを行ない、２５塩基対５'−フルオレセイン−標識ＨＳＶ１ α４７遺伝子オリゴマー（Operon、アラメダ、カリホルニア州）を用いて、同様の方法でＫＳＨＶＯＲＦ２６として可視化して陰性の対照ハイブリダイゼーションを行なった。ＢＣＢＬ−１、ＲＣＣ−１およびＲａｊｉのすべての核はＥＢＶハイブリダイゼーションプローブで適当に染色されたが、ＨＳＶ１プローブとのハイブリダイゼーションでは細胞の特異的染色はなかった。感染実験で使用した残りの懸濁細胞株をペレットにし、０．２２または０．４５μフィルターをかけたＢＣＢＬ−１組識培養上清５mlに１６時間再懸濁した。ＢＣＢＬ−１上清は、非刺激培養物または２０ng/mlＴＰＡ刺激培養物由来であった。種々のろ過または刺激条件下の試験でも、受容体細胞株への感染の差は見られなかった。ヘパリン化した新鮮な分娩後臍帯血をフィコール−ペーク（ファルマシア（Pharmacia）ＬＫＢ、ウプサラ、スエーデン）勾配で分離して、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養して、胎児臍帯血リンパ球（ＦＣＢＬ）を得た。粘着性受容体細胞を無菌ハンクス緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ、ギブコ・ビーアールエル（GIBCO BRL）、ゲイサーズバイーク（Gaithersburg）、メリーランド州）で洗浄し、５mlのＢＣＢＬ−１培地上清を重層した。ＢＣＢＬ−１培地上清とインキュベート後、細胞を無菌ＨＢＳＳで３回洗浄し、新鮮な培地に懸濁した。次に細胞を再度１日置きに６日間３回洗浄し、少なくとも２週間増殖させた後、ＤＮＡ抽出と試験を行なった。前述のようにＯＲＦ２６およびＯＲＦ２５からのネスティッド（nested）プライマーまたは非ネスティッド（nested）プライマーを用いて、ＫＳＨＶ感染を検出するためのＰＣＲを行なった［１０、３５］。間接免疫蛍光法：ＡＩＤＳ−ＫＳ血清は、進行中のコホート研究から得た（疾病管理センター（ Centers for Disease Control and Prevention）のScott Holmberg博士、Thomas Spira博士およびHarold Jaffe博士、およびニューヨーク市保健局（New York C ity Department of Health）のIsaac Weisfuse博士により提供された）。最初のＫＳ診断後１〜３１カ月の間でＡＩＤＳ−ＫＳ患者から血清を採取し、静脈薬物使用者および／または同性愛／両性愛対照からの血清は、非ＫＳ−ＡＩＤＳ診断後に、およびＨＩＶ感染血友病患者対照からの血清は、ＨＩＶ感染後種々の時期に採取した。１：１００希釈の等量のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合体（モレキュラープローブ（Molecular Probe）、ユージーン、オレゴン州）およびヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ結合体（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）と患者血清の連続希釈物を用いて、間接免疫蛍光法を行なった。広げた細胞の核内の班状の蛍光パターンの有無により終点力価を評価した。交差反応性抗体を吸着するために、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で１：１０希釈した血清２０μｌを、１〜３×１０⁷パラホルムアルデヒド固定Ｐ３Ｈ３細胞で４〜１０時間２５℃で吸着させ、低速遠心分離により除去した。Ｐ３Ｈ３を誘導後、２０μg/mlのＴＰＡで４８時間固定し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで４℃で２時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄してから吸着させた。結果２０．７kbのＫＳＨＶＤＮＡ配列の配列決定解析：ＫＳ３３０ＢａｍとＫＳ６３１Ｂａｍは、新規でありこれまで性状解析されていないヘルペスウイルスからのゲノム断片であることを証明するために、ＡＩＤＳ−ＫＳゲノムＤＮＡライブラリー由来のラムダファージクローン（ＫＳ５）をＫＳ３３０Ｂａｍ配列へのハイブリダイゼーションにより同定した。ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化後ＫＳ５挿入体を５つのサブ断片にサブクローニングし、各断片の両方の鎖を、プライマー歩行または７倍の平均重複を有するネスティッド(nes ted)欠失により配列決定した。ＫＳ５配列は長さ２０，７０５塩基対であり、Ｇ＋Ｃ含量は５４．０％である。観察された／予想されたＣｐＧジヌクレオチド比は０．９２であり、この領域では全体のＣｐＧ抑制はないことを示している。読みとり枠（ＯＲＦ）解析により、長さが２３１塩基対〜４１２８塩基対の範囲のコード領域を有する１５の完全なＯＲＦと、ＫＳ５クローンの末端の２つの不完全なＯＲＦ（長さは１３５塩基対と５５２塩基対）（図１２）が同定された。各ＯＲＦのコード確率を、ＧＲＡＩＬ２とＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅを用いて解析し、優れた〜良好なタンパク質コード確率を有する１７の領域が同定された。各領域は、既知のヘルペスウイルス遺伝子の同族体をコードするＯＲＦ内にあるが、１つのＯＲＦのみは、ヘルペスウイルスサイミリ（herpesvirus sa imiri）（ＨＶＳ）中のＯＲＦ２８に対応するゲノムに位置する。保存ヘルペスウイルス主要カプシッド（ＭＣＰ）、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、および推定ＤＮＡパッケージングタンパク質（ＯＲＦ２９ａ／ＯＲＦ２９ｂ）遺伝子に対して、ＫＳ５同族体よりなるコドン表を用いた時、予測されるＯＲＦにわたってすべてのＯＲＦについてのコドン優先値(preference valu e)は、非コード領域より高かった。各ＯＲＦの翻訳された配列を用いて、ＢＬＡＳＴＸとＦａｓｔＡアルゴリズムによりＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースを探索した［２、３８］。推定ＫＳ５ＯＲＦのすべて（ただし、１つは除く）は、ガンマ−２ヘルペスウイルス、特にＨＶＳおよびウマヘルペスウイルス２（ＥＨＶ２）と配列相同性および共通線状位置の相同性を有する。ＫＳＨＶとＨＶＳの間の高度の共通線状性とアミノ酸配列類似性のため、ＫＳＨＶＯＲＦはＨＶＳの位置の相同性に従って命名された（すなわち、ＫＳＨＶＯＲＦ２５はＨＶＳＯＲＦ２５から命名された）。ＫＳ５配列は、これらの７つの保存ヘルペスウイルス遺伝子ブロックを含む領域にまたがる（図１４）［１０］。これらのブロック中に存在するＯＲＦは、ヘルペスウイルスのウイルス粒子構造タンパク質、およびＤＮＡ代謝と複製に関与する酵素をコードする遺伝子を含む。ＫＳ５ＯＲＦとＨＶＳＯＲＦのアミノ酸同一性は、３０％〜６０％の範囲であり、保存されたＭＣＰＯＲＦ２５とＯＲＦ２９ｂ遺伝子は他のガンマヘルペスウイルス中の同族体に対して最も高い割合のアミノ酸同一性を有する。ＨＶＳまたはＥＢＶ遺伝子に対して相同性が検出できない配列であるＫＳＨＶＯＲＦ２８は、ＨＶＳＯＲＦ２８とＥＢＶＢＤＬＦ３に対して位置の相同性を有する。ＯＲＦ２８は、２つの遺伝子ブロックの結合部分に存在する（図１４）。これらの結合部分は、ヘルペスウイルスゲノム間のブロック内領域より大きな配列多様性を示す傾向がある［１７］。ＨＶＳ（ＯＲＦ２９ａ／ＯＲＦ２９ｂ）と単純ヘルペスウイルス１型（ＵＬ１５）の推定のスプライスされたタンパク質パッケージング遺伝子に対して配列相同性を有する２つのＯＲＦが同定された。ＫＳ３３０Ｂａｍ配列は、ＫＳＨＶＯＲＦ２６内に存在し、このＨＳＶ−１対応物であるＶＰ２３は、小さなウイルス粒子構造成分である。すべてのＫＳＨＶ同族体について、ＨＶＳアミノ酸類似性は、ＯＲＦ２１（ＴＫ遺伝子）を除いてすべての遺伝子産物にわたる。ＫＳＨＶＴＫ同族体は、そのアミノ末端（ヌクレオチド２０３４３〜１９６３６；アミノ酸１〜２３６）にプロリンの豊富なドメインを含有し、これは他のヘルペスウイルスＴＫ配列では保存されておらず、一方カルボキシ末端（ヌクレオチド１９６３７〜１８６０１；アミノ酸２３７〜５６５）は、ＨＶＳ、ＥＨＶ２、およびウシヘルペスウイルス４（ＢＨＶ４）ＴＫの対応する領域に非常によく似ている。ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子ならびにＴＫ遺伝子中に存在するグリシンの豊富な領域を有するプリン結合モチーフは、ＫＳＨＶＴＫ同族体(ＧＶＭＧＶＧＫＳ；アミノ酸２６０〜２６７)中に存在する。ＫＳ５翻訳アミノ酸配列はコンピュータープログラムＭｏｔｉｆｓを用いて、 PROSITE Dictionary of Protein Sites and Patterns（スイス、ジュネーブ大学のAmos Bairoch博士）に対して探索した。４つの配列モチーフの一致が、ＫＳＨＶ仮説タンパク質配列内に同定された。これらの一致には以下を含む：（ｉ）ＯＲＦ３３（ＣＶＨＣＨＧ；アミノ酸２０９〜２１４）とＯＲＦ３４（ＣＬＬＣＨＩ；アミノ酸２５７〜２６１）内のサイトクロームｃファミリーヘム−結合性モチーフ、（ii）ＯＲＦ２５（ＦＩＣＱＡＫＨ；アミノ酸１０２４〜１０３０）内の免疫グロブリンと主要組識適合遺伝子複合体タンパク質署名（signature）、（iii）ＯＲＦ２６（ＰＤＤＩＴＲＭＲＶ；アミノ酸２６０〜２６８）内のミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質モチーフ、および（iv）ＯＲＦ２１中で同定されるプリンヌクレオチド結合部位。プリン結合モチーフは、明白な機能的意義を有する唯一のモチーフである。ＨＶＳＯＲＦ２７内に存在するシトシン−特異的メチラーゼモチーフは、ＫＳＨＶＯＲＦ２７には存在しない。このモチーフは、ＨＶＳで継続して感染される細胞内のエピソームＤＮＡのメチル化においてある役割を果たす［１］。ＫＳＨＶの系統学的解析：ＫＳ５配列から翻訳されたアミノ酸配列を、他のヘルペスウイルスからの対応する配列と並べた。保存された整列した残基のレベルと導入されたギャップの少なさに基づき、ＯＲＦ２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９ａ、２９ｂ、３１および３４のアミノ酸整列部分は、系統学的解析に適していた。ＫＳＨＶと他のヘルペスウイルスの系統学的関係を証明するために、ＫＳ５とヘルペスウイルス科の１２のメンバーからのＯＲＦ２５（ＭＣＰ）同族体について、単一遺伝子比較を行なった（図１５Ａ〜１５Ｂ）。１３の利用できるＭＣＰアミノ酸配列は大きく（ＫＳＨＶ同族体の１３７６アミノ酸残基）、整列には低レベルのギャッピングのみが必要であった。しかし、ウイルス間の全体の類似性は比較的小さかった［３３］。ＭＣＰセットは、ブートストラップ点数の高い安定な系統樹を与え、ＫＳＨＶ同族体を、ＨＶＳ、ＥＨＶ２およびＢＶＨ４を含有するガンマ−２亜系統（ラディノウイルス(Rhadinovirus）属）に割り当てた［２０、３３、４３］。ＫＳＨＶはＨＶＳに最も密接に関連していた。ＴＫとＵＬ１５／ＯＲＦ２９セットの単一遺伝子整列についても同様の結果が得られたが、ブートストラップ点数は低く、ガンマ−２ヘルペスウイルスメンバーの間でＥＨＶ２、ＨＶＳおよびＫＳＨＶについて分岐の順序をつけることはできなかった。ＫＳＨＶと他のガンマヘルペスウイルスの間の相対的分岐を測定するために、上記の９つの遺伝子について整列したものを連結して、ＥＢＶ、ＥＨＶ２、ＨＶＳおよびＫＳＨＶアミノ酸配列を含有する組合せガンマヘルペスウイルス遺伝子セット（ＣＳ１）を作成した。ＣＳ１の全長は、１つまたはそれ以上の配列内の整列工程により導入されたギャップを含有する位置の除去後４２４７残基であった。ＣＳ１整列をＭＬ法（図１５Ｂに示す系統樹が得られた）、および整列したヘルペスウイルスＭＣＰ配列について用いたＭＰおよびＮＪ法を用いて解析した。すべての３つの方法により、姉妹群としてＫＳＨＶとＨＶＳが同定され、ＫＳＨＶは、ヘルペスウイルスを最も近い親類としてガンマ−２亜系統に属することが確認された。ＨＶＳとＥＨＶ２系統の分岐は、霊長類と有蹄類の宿主系統の分岐と同時代であることはすでに推定されていた［３３］。ＣＳ１セットの結果は、ＨＶＳとＫＳＨＶは霊長類ヘルペスウイルスの系統であり、ＥＨＶ２に対するＫＳＨＶとＨＶＳの間の距離に基づき、ＨＶＳとＫＳＨＶ系統の間の分岐は古いことを示唆する。ＫＳＨＶのゲノム試験：アガロースプラグに包埋したＢＣＢＬ−１細胞について行なったＣＨＥＦ電気泳動は、組み込まれないＫＳＨＶゲノムと高分子量物質の存在を示した（図１６Ａ〜１６Ｂ）。ＫＳ６３１Ｂａｍ（図１６Ａ）とＫＳ３３０Ｂａｍは、２７０キロ塩基（kb）の線状ＤＮＡ標準物質と一緒に泳動する単一のＣＨＥＦゲルバンドに特異的にハイブリダイズした。ハイブリダイズするＤＮＡの大部分は、ウェルの原点の拡散したバンド内に存在し、低強度高分子量（ＨＭＷ）バンドも原点のすぐ下に存在した（図１６Ａ、矢印）。同じフィルターをかけ、ＥＢＶまた繰り返し配列［４０］とプローブ結合させて、線状ＥＢＶＤＮＡに対応する１５０〜１６０kbバンド（図１６Ｂ）を得た［２４］。ＨＭＷＥＢＶバンドは、環状または連結ＥＢＶＤＮＡに対応する［２４］。ホルボールエステルＴＰＡは、複製コンピタントＥＢＶを誘導して、溶解性複製サイクル内に入る［４９］。ＴＰＡがＢＣＢＬ−１細胞中でＫＳＨＶおよびＥＢＶの複製を誘導するかどうかを測定するために、これらの細胞を異なる濃度のＴＰＡと４８時間インキュベートした（図１７）。ＥＢＶの最大刺激は２０ng/m lのＴＰＡで起き、ＥＢＶゲノムのハイブリダイゼーションが８倍増加した。２０〜８０ng/mlのＴＰＡで４８時間インキュベートすると、ＫＳＨＶゲノムはわずかに１．３〜１．４倍の増加が起きたのみである。感染試験：配列解析により媒体がヘルペスウイルス科のメンバーである可能性を測定するために、ＢＣＢＬ−１細胞をＲａｊｉ細胞、非溶解ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株と、０．４５μの組識培養フィルターで分離されたチャンバー内で培養した。受容体Ｒａｊｉ細胞は、一般に急速な細胞溶解を示し、ＢＣＢＬ−１細胞株からの細胞毒性成分の感染を示唆している。１０ng/mlのＴＰＡで２日間培養した１つのＲａｊｉ細胞株は、最初細胞溶解の期間の後回復し対数増殖の再開を示した。この細胞株（ＲＣＣ−１）は、ＨＬＡ−ＤＲ配列のＰＣＲ増幅で測定するとＢＣＢＬ −１により汚染されていないＲａｊｉ由来の単一培養物である。ＲＣＣ−１は連続培養で６カ月以上の間（約７０継代）ＫＳ３３０₂₃₃ＰＣＲ産物について陽性であったが、ＫＳＨＶはドットブロットハイブリダイゼーションでいずれの時期も検出できなかった。しかし２５塩基対のＫＳＨＶＯＲＦ２６由来のオリゴマーを用いるｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＫＳＨＶＤＮＡがＲＣＣ−１核に絶えず局在していることが証明された。図１８Ａ〜１８Ｃに示すように、ＢＣＢＬ−１とＲＣＣ−１細胞の核（約６５継代から）は、ＯＲＦ２６とのハイブリダイゼーションが検出できたが、親のＲａｊｉ細胞とは特異的ハイブリダイゼーションは起きなかった（図１８Ｂ）。これらの条件下でＫＳＨＶ配列はＢＣＢＬ−１の６５％に、そしてＲＣＣ−１細胞の２．６％に検出された。さらに、４５のモノクローナル培養物を継代５０でＲＣＣ−１から連続希釈してサブ培養し、このうち８つ（１８％）のクローンはＫＳ３３０₂₃₃ によりＰＣＲ陽性であった。非ネスティッド（nested）ＫＳ３３０₂₃₃プライマー対を用いるＰＣＲ検出は、クローン培養物のそれぞれの継代１５で喪失したが、２またはそれ以上の感受性の非重複性ネスティッド(nested)ＰＣＲプライマーセット［３３］を用いて５クローンで検出され、ＫＳＨＶゲノムがＲＣＣ−１とそのクローンでは時間とともに喪失されることを示唆していた。０．２〜０．４５μフィルターをかけたＢＣＢＬ−１上清を接種した後の、４つのＲａｊｉ細胞培養物の１つ、４つのＢｊａｂ培養物の１つ、３つのＭｏｌｔ −３培養物の２つ、１つのヨザル（owl monkey）腎臓細胞株培養物の１つ、および８つのヒト胎児臍帯血リンパ球（ＦＣＢＬ）培養物の３つに、低いが継続したレベルのＫＳ３３０₂₃₃ＰＣＲ陽性が見られた。ＰＣＲ陽性培養物の中では、２〜６週間後および複数回の洗浄後ＰＣＲ検出ゲノムが喪失した。５つのＦＣＢＬ培養物は、ＥＢＶ不死化リンパ球に特徴的な細胞集合を示し、ＥＢＥＲプライマーを用いてＰＣＲでＥＢＶについて陽性であった［２３］。これらの培養物の３つも最初ＫＳ３３０₂₃₃は陽性であった。受容体細胞株のいずれもＫＳＨＶゲノムはドットブロットハイブリダイゼーションで検出されなかった。血清学的試験：ＡＩＤＳ−ＫＳ患者およびＨＩＶ感染またはＡＩＤＳ対照患者の血清中のＫＳＨＶ−およびＥＢＶ−感染細胞株ＢＨＬ−６に対する特異的抗体の存在を評価するために、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）を行なった。便宜上、ＢＣＢＬ−１の代わりにＢＨＬ−６を用いた。予備試験では、ＢＨＬ−６とＢＣＢＬ−１の間のＩＦＡの結果に有意差はなかった。ほとんどのＫＳ患者と対照の非吸収血清では、ＢＨＬ−６は拡散した免疫蛍光細胞染色を示し、非特異的抗体結合を示唆していた（図１９Ａ〜１９Ｄ）。ＥＢＶに対して交差反応性の抗体を除去するためにパラホルムアルデヒド固定、ＴＰＡ誘導性Ｐ３Ｈ３（Ｒ３Ｊ−ＨＲ１のＥＢＶ産生亜株、George Miller博士からの供与）で吸着すると、患者血清は一般に高力価で斑状核染色を示し、対照患者血清にはこの染色パターンはなかった（図１９Ｂと１９Ｄ）。染色は、主に核に局在していたが、低血清希釈で弱い細胞質性染色が存在した。非吸着血清では、ＡＩＤＳ−ＫＳ患者の血清についてＢＨＬ−６細胞抗原に対する最初の終点幾何平均力価（ＧＭＴ）（ＢＭＴ＝１：１１５３、範囲１；１５０〜１：１２，１５０）は、対照、非ＫＳＨＶ患者（ＧＭＴ＝１：３４２、範囲１：５０〜１：１２，１５０；ｐ＝０．０４）の血清より高かった（図１３）。ＡＩＤＳ−ＫＳ患者とＨＩＶ感染同性愛／両性愛患者および静脈薬物使用対照患者は、ＢＨＬ−６抗原に対して同様の終点力価を有していた（それぞれ、ＧＭＴ＝１：１２６５およびＧＭＴ＝１：１５７８）が、血友病性ＡＩＤＳ患者では力価は低かった（ＧＭＴ＝１：１０４）。両方の症例と対照患者群は、ＥＢＶ感染細胞株Ｐ３Ｈ３に対して高いＩＦＡ力価を有した。ＢＨＬ−６抗原に対する症例と対照の力価の間の終点ＧＭＴの差は、Ｐ３Ｈ３で吸着すると上昇した。吸着後、症例のＧＭＴは１：７８０に低下し、対照のＧＭＴは１：８１に低下した（ｐ＝０．００００９）。ＢＨＬ−６の代わりにＢＣＢＬ−１を用いて、Ｐ３Ｈ３の代わりにＥＢＶ感染非産生Ｒａｊｉ細胞、そしてＨＩＶ感染のない同性愛男性ＫＳ患者の血清を用いて、９カ月で完全に緩解し、同様の結果が得られた（ＢＨＬ−６力価は１：４５０、Ｐ３Ｈ３力価は１：１５０）。ＫＳ発症の８〜１４カ月前とＫＳ発症後の間の対の血清が３人の患者について利用できた。ＫＳ患者８と１３は、８倍の上昇を示し、患者８は、発症前血清からＫＳ後血清で、Ｐ３Ｈ３吸着ＢＣＢＬ−１力価は３倍低下した。考察これらの試験は、表現差解析によりＫＳ患部組識中に存在する特異的ＤＮＡ配列は、新たに同定されたヒトヘルペスウイルスに属することを示す。本試験は、この物質が、ＡＩＤＳ関連体腔ベースのリンパ腫からの自然に形質転換された、ＥＢＶ同時感染リンパ球中で連続的に培養することができるヒトガンマ−２ヘルペスウイルスであることを規定している。ＫＳ５ラムダファージ挿入体の配列解析は、ＫＳ３３０Ｂａｍ配列が大きなヘルペスウイルスゲノムの一部であることの明白な証拠を提供する。ＫＳ５は５４．０％のＧ＋Ｃ含量を示し、これは対応するＨＶＳ領域（３４．３％Ｇ＋Ｃ）よりかなり高い。ＫＳ５配列ではＣｐＧジヌクレオチド抑制はないが、対応するＨＶＳ領域は０．３３の予測：観察ＣｐＧジヌクレオチド比を有する［１］。ヘルペスウイルス中のＣｐＧジヌクレオチド頻度は、ガンマヘルペスウイルスの球形ＣｐＧ抑制からベータヘルペスウイルスの局在化ＣｐＧ抑制まで変化し、これはＣｐＧ部位の５’−メチルシトシン残基の脱アミノ化によりＴｐＧに置換されることに起因する［２１］。ヘルペスウイルス内のＣｐＧ抑制［２１、３０、４４］は、活発に分裂している宿主細胞の潜在ゲノムの同時複製を反映すると仮定されているが、ＫＳＨＶがインビボで溶解性複製により維持されているか否かは不明である。２０，７０５塩基対のＫＳ５断片は１７のタンパク質コード領域を有し、このうち１５は適当に局在化したＴＡＴＡとポリアデニル化シグナルを有する完全ＯＲＦであり、２つはファージ挿入体末端に存在する不完全ＯＲＦである。これらのＯＲＦのうち１６は、配列相同性と共通線状相同性により、１５のすでに同定されているヘルペスウイルス遺伝子（高度に保存されたスプライス遺伝子を含む）に対応する。この領域のＫＳＨＶ遺伝子の保存された位置相同性と配列相同性は、このウイルスの生物学的挙動は他のガンマヘルペスウイルスの挙動と似ている可能性に一致する。例えば、ＫＳ５上のチミジンキナーゼ様遺伝子の同定は、この物質がＴＫ活性化ＤＮＡポリメラーゼインヒビターに感受性である可能性があり、他のヘルペスウイルスのように、ヌクレオチド代謝とＤＮＡ複製に関与するウイルス遺伝子を含有することを示唆する［４１］。主要カプシッドタンパク質と糖タンパク質Ｈ遺伝子同族体の存在は、複製コンピタントウイルスは他のヘルペスウイルスと同様のカプシッド構造を産生することを示唆する。分子配列の系統学的解析は、ＫＳＨＶがガンマヘルペスウイルスサブファミリーのガンマ−２サブ系統に属することを示し、従って同定された最初のガンマ− ２ヘルペスウイルスであることを示す。利用可能な配列比較に基づくその最も近い既知の親類はＨＶＳであり、これはあるニューワールドサル(New World monke y)種の劇症ポリクローナルＴ細胞リンパ球増殖性疾患を引き起こすリスザル(squ irrel monkey)ガンマ−２ヘルペスウイルスである。ガンマ−２亜系統のデータは少ない：正確には３つのウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＶＳおよびＥＨＶ２）のみが現在この系統樹に存在する（この亜系統はまたマウスヘルペスウイルス６８とＢＨＶ４を含有する[３３]）。この少ない背景情報による分類の制限からは、ＫＳＨＶとＨＶＳは霊長類のガンマ−２ウイルスの系統のようである。すでにMcGeoc hら［３３］は、ガンマ−２ヘルペスウイルス系統は、これらの先祖の共通種分化により得られたと提唱している。この見解をＫＳＨＶとＨＶＳに拡張すると、これらのウイルスは古代（おそらくは旧世界霊長類と新世界霊長類宿主系統の分岐と同時代）に分岐したことを示唆する。ガンマヘルペスウイルスはリンパ親和性［４１］によりサブファミリーとして区別され、この分類は配列データに基づき系統学的解析により支持される［３３］。ＫＳＨＶの生物学的挙動は、ＫＳＨＶはインビトロのリンパ球培養物中およびインビボのリンパ球試料中に見いだされる点で、系統学的命名と一致する。このバンドは、他の「高分子量」バンドが、これらのゲノムの環状型を表すＢＣＢＬ−１中のＥＢＶおよびＫＳＨＶの両方について存在するため、ゲノムの線状型と思われる。複製およびパッケージングされたＤＮＡ［４１］に関連するこのＥＢＶゲノムの線状型は、潜伏性ウイルス複製［２４］に関連する閉鎖環状型よりも実質的に速く泳動する。２７０kbバンドは、線状型と思われるが、またこれは、ＨＶＳのゲノムサイズが約１３５kbであるため、複製する二量体プラスミドに一致する。ゲノムの真のサイズは、進行中のマッピングおよび配列決定によってのみ解決することができるであろう。複製欠損ＥＢＶ変異体は、長期組識培養で継代したＥＢＶ株には一般的である［２３］。Rajiに感染するＥＢＶ株は、例えば、ＢＡＬＦ−２欠損変異体であり［１９］；ウイルス複製は、ＴＰＡで誘導できず、そのゲノムは、潜伏性環状型としてのみ維持される［２３、３３］。ＢＣＢＬ−１に同時に感染するＥＢＶ株は、ＴＰＡがＤＮＡ含量の８倍の増加を誘導するため、複製欠損であるとは考えられず、ＣＨＥＦ電気泳動において見掛けの線状型を有する。しかしＫＳＨＶ複製は、同等のＴＰＡ処理によりわずかしか誘導されないが、このことは、ＴＰＡ誘導への無反応であるかまたはゲノムがＴＰＡ誘導に要する遺伝成分を消失しことのいずれかを示している。しかし、さらなる実験によりＫＳＨＶＤＮＡは、濾過してオルガネラを除去したＤＮａｓｅＩ保護ＢＣＢＬ−１細胞抽出物の高速遠心分離によりペレット化することができることが示され、これはＫＳＨＶキャプシド化に一致する。種々の受容体細胞株へのＢＣＢＬ−１からのＫＳＨＶＤＮＡの伝達が可能であり、ＫＳＨＶＤＮＡは継代７０回までは受容体細胞中で低レベルで維持することができる。しかし受容体細胞株中のウイルスゲノムのＰＣＲによる検出は、真の感染よりはむしろＫＳＨＶＤＮＡ断片の物理的な関与によるものであろう。ＲＣＣ−１中にＯＲＦ２６配列が特異的な核に局在しているため、これは可能性が低いようである。ＢＣＢＬ−１からの感染性ウイルスの伝達が起こるならば、ウイルスゲノムは、次の受容体細胞の継代に伴い大きく低下することは明らかである。これは、ＫＳ患部組識から誘導した紡錘細胞の研究と一致する。紡錘細胞培養は、一般に、最初に外植するときＰＣＲ検出可能なＫＳＨＶゲノムを有するが、初回継代後急速にウイルスゲノムを消失し、確立される紡錘細胞培養物は一般に、検出可能なＫＳＨＶ配列を含まない［３］。ヒトヘルペスウイルスによる感染は、一般に、ほぼ全てのヒトが成人初期までにはすでに同定されているヒトヘルペスウイルス７つの内６つに感染するほど、遍在している［４２］。ＥＢＶによる遍在する感染は、例えば、ＥＢＶ関連ヒト腫瘍においてこのウイルスが原因となることを明白に確立することが困難である主な理由である。血清学的検討により、ＡＩＤＳ−ＫＳ患者の血清により認識されるが、一般にＥＢＶ反応性抗体の除去後のＫＳではない対照ＡＩＤＳ患者の血清では認識されない、ＢＣＢＬ−１およびＢＨＬ−６中の核抗原が同定された。これらのデータは、ＫＳおよび対照患者のリンパ球のＰＣＲ研究と一致しており、このことは、ＫＳＨＶが成人には遍在していないがカポジ肉腫を生じる患者には特異的に関連していることを示唆している。この点で、これは他の既知のヒトヘルペスウイルスよりはむしろＨＳＶ２に疫学的に類似しているようである。別の可能性は、ＢＣＢＬ−１に対するＩＦＡ力価の上昇が、ウイルスによる感染よりもむしろ症状を反映するということである。実験の詳細セクッションＩＩＩＫＳ患者登録：臨床試験情報および適切なＰＢＭＣサンプルの入手可能性に基づき、進行中のコーホート研究から、症例および対照を選択した。予定のコーホート研究参加中にＫＳを発症した２１人のホモセクシャルまたはバイセクシャルの男性エイズ罹患患者が確認された［１４−１６］。これら患者の内１４人は、ＫＳと診断された（中央値＋４月）後、およびＫＳと診断されるの前少なくとも４ヶ月（中央値−１３ヶ月）に、一対のＰＢＭＣサンプルを採集されたが、残りの７人は、ＫＳと診断される直前の調査来訪時（中央値−３ヶ月）およびコーホート研究（中央値：ＫＳ診断前、−５１ヶ月）参入時に、一対のＰＢＭＣを採取された。血友病およびホモセクシャル／バイセクシャル男性エイズ患者対照の登録２グループのエイズ患者対照グループ：２３人のホモセクシャル／バイセクシャル男性エイズ罹患患者で、死ぬまで追跡研究したがKSを発症しなかったマルチセンターエイズコーホート研究［１６］からの患者（高リスク対照群）、および１９人の、国立血友病財団と疾病対照・予防センターの共同プロジェクトから登録された血友病男性（低リスク対照群）について研究した。追跡情報が入手できた血友病対照群の１６人の内、KSを発症した者はおらず、＜２％の血友病エイズ患者が、歴史的にはＫＳを発病している［２］。ＫＳを発症しなかったホモセクシャル／バイセクシャル・エイズ対照患者については、一対のＰＢＭＣ検体が、コーホート研究参入時（中央値：エイズ発症前−３５ヶ月）および非KSエイズと診断される直前の調査来訪時（中央値ＢＨＬ：エイズ発症前−６ヶ月）に入手可能であった。ＤＮＡ抽出および分析各検体において１０⁶―１０⁷ＰＢＭＣからＤＮＡを抽出し、スペクトロホトメトリーによって定量した。サンプルは、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）分析が行なわれる実験室から物理的に隔離された実験室で調製された。すべてのサンプルは、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座（ＧＨ２６／ＧＨ２７）またはb―グロビン［１８］のどちらかに特異的なプライマーを使用して、増幅能力についてのテストを行った。ＫＳＨＶ・ＤＮＡのＰＣＲ検出は、先に述べたように［７］、次の入れ子式プライマーセット：を用いて行なわれた。外側プライマー・セットは、９４℃３０秒、６０℃１分、７２℃１分、３５サイクルで増幅され、最終伸長サイクルを５分,７２℃とした。ＰＣＲ産物の３mlの内１mlを内側ＰＣＲプライマー反応混合物に加え、さらに最終伸長サイクルを５分とする２５サイクルで増幅した。サンプル陽性率の測定は、主にプライマー・セットＮｏ．１を用いて行ない、ＫＳＨＶの主要キャプシド遺伝子であると仮定される部分の非重複領賊を増殖するプライマー・セット２または３の何れかで確認した。ＫＳＨＶゲノムの２領域をサンプリングする事で、実験中に起こり得るＰＣＲ汚染が減少した。これらの入れ子式プライマー・セットは、先に公表されたＫＳ３３０₂₃₃プライマー[６]よりも、ＫＳＨＶ配列を検出する感度が対数で２〜３高く、また至適条件下において、＜１０のＫＳＨＶゲノム複製物を検出できると推定されている。調製物は予めアリコットしておき、汚染の可能性をモニターし制御するために、ＤＮＡの配合されていない代替陰性対照で増幅した。全てのサンプルを目隠しでテストし、コード解明（ブレイキング）をする前に、陽性/陰性を確定した。有意差テストをマンテル・ヘンゼル（ Mantel-Haenszel）カイ二乗評価およびEpi−info ver.６を使用した完全信頼度区間(USD Inc.,Stone Mt．GA)によっておこなった。結果患者および対照ＰＢＭＣサンプルのＫＳＨＶ陽性一対のＰＢＭＣサンプルを、各ＫＳ患者およびホモセクシャル／バイセクシャル対照患者から入手した。単独サンプルを、各血友病対照患者から入手した。エイズ患者の各グループについてＫＳＨＶ陽性率を決定するために、KSに最も近い患者またはエイズによって起こる病に罹患している各参加者より採取した単独サンプル（第二サンプル）を分析した。全体として、KSと診断される６ヶ月前からKSと診断された後２０ヶ月までに、KS患者より採取した２１のＰＢＭＣ検体の内１２（５７％）が、ＫＳＨＶ陽性であった。診断直前および診断後の調査来訪時の検体との間には陽性率に明確な差はなかった（夫々、７のうち４つ（５７％）、１４のうち８（５７％））。ホモセクシャル／バイセクシャル（二回目調査来訪）および血友病患者対照の両方から採取されたＫＳＨＶ陽性対照ＰＢＭＣ検体の数は、顕著に低くなった。血友病ＰＢＭＣサンプルの１９のうち僅か２つ（１１％）が陽性（確率：１１．３，９５％信頼区間1.8 - 118）であり、KSを発症していないホモセクシャル／バイセクシャル男性からのＰＢＭＣサンプル２３のうち僅か２（９％）が陽性であった（確率１４.０，信頼区間2.3- 144）。診断直前または診断直後に採取された全ＫＳ患者のＰＢＭＣサンプルが本当に感染していたときは、ＰＢＭＣサンプル中でＫＳＨＶ感染を検出するにあったてのＰＣＲ分析は、少なくとも５７％の感度をもっておこなわれた。二回目のサンプル評価時（Kruskall-Wallis p=0. 15）（図２１）において、ＫＳ患者およびＫＳに罹患していないホモセクシャル／バイセクシャル患者については、ＣＤ４＋計測において著しい差異は見られなかった。両グループ（血友病患者、ＫＳ患者）は、明らかなＨＩＶに関連した免疫抑制を示していたけれども、血友病エイズ患者から採取された単一サンプルからのＣＤ４＋の計測値は、ＫＳ患者からのＣＤ４＋計測値よりも高かった（Krus kall-Wallis p=0.004）。縦断研究(Longitudinal Studies) ２１ＫＳ患者全員と、ＫＳを発症しない２３のホモセクシャル／バイセクシャル男性エイズ対照患者から、対になった検体を入手した。ＫＳグループについては、ＫＳ発症前4〜87ヶ月（中央値13ヶ月）にわたり、最初のＰＢＭＣサンプルを採取した。対照グループからの最初のＰＢＭＣサンプルは、最初の非ＫＳエイズを定義する病気（１９８７ＣＤＣ監視機構規定）の発症前１３〜１０６ヶ月( 中央値５５ヶ月)にわたって採取した。ＫＳ患者の21人のうち11人（５２％）が、ＫＳ発症前に採取されたＰＢＭＣサンプル中に検出可能なＫＳＨＶ・ＤＮＡを有していたが、これと比較すると、血友病患者対照サンプルでは、19のうち２（１１％、p＝0.005）、一回目および二回目来訪時に採取された23人のホモセクシャル／バイセクシャル対照サンプルでは、夫々1（４％、ｐ＝0.0004）、および２（9％、p＝0.002）であった（図２０Ａ−２０Ｂ）。図は、両来訪時に、ＫＳ患者の対になったサンプルのうちの７サンプルが陽性であり、５ＫＳ患者および２対照患者が陰性から陽性に転換し、２ＫＳ患者および１対照患者が、調査来訪の間に陽性から陰性に再転換した。残りの７ＫＳ患者と２０対照患者が両来訪に陰性であった。最初のＰＢＭＣ陰性の結果から転換して、ＫＳ診断時またはＫＳ診断時近くに陽性結果になった５人のＫＳ患者にとって、最初のサンプルとＫＳと診断されるまでの時間は、中央値で19ヶ月の長さであった。両来訪の際に陰性であった６人のＫＳ患者のうち３人は、病気の発症前2―3ヶ月にその最後のＰＢＭＣサンプルを採取された。これらの患者が、その最後の研究来訪とＫＳ診断日との間に感染したかどうかはわからない。考察アンブロジアック（Ambroziak）とその共同研究者は、３人のＰＢＭＣサブセット研究により、ＫＳＨＶが優先的にＣＤ１９＋Ｂ細胞に感染することの証拠を発見した[１９]。他のガンマヘルペスウイルス、たとえば、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）およびヘルペス・ウイルス・サイミリはまた、リンパ栄養性 (lymphotrophic)ヘルペス・ウイルスであり、霊長類においてリンパ球増殖的疾病を惹起する［１１，２０］。ＫＳＨＶは、多くのヒト・ヘルペス・ウイルスのように、成人に偏在的に感染する菌である。ＥＢＶは、たとえば、血清学的陽性の殆どすべての人から得たＣＤ１９＋Ｂリンパ球においてＰＣＲにより検出することができ［２２］、また約９８％のＭＡＣＳ研究参加者が、コーホート研究に参入する前にＥＢＶ・ＶＣＡ抗体を持っていた［２３］。しかしながら、ＫＳＨＶがその後に起こるＫＳの発症に特別に関係があるという知見は、患者症例よりも低いＫＳＨＶ感染率を持つ対照患者において最も整合性があった。対照患者は、感染していてもＫＳＨＶウイルスＰＢＭＣ量は検出不可能なほど低い可能性があるが、さまざまな条件下のＰＣＲでも対照患者における感染の証拠を見つけることができなかった事は、患者の大半が感染していない事を示唆するものである。それにもかかわらず、これら患者の約１０％はＫＳＨＶに感染しており、且つＫＳを発症しなかった。これが一般の人間集団についてのＫＳＨＶ感染率と同じであるかどうかはわからない。本研究は、ＫＳＨＶ感染がＫＳと強く関連しており、患者の大半において、当該疾患の発症に先行する事を実証している。ＫＳ患者の57％が、二回目の追跡研究来訪の際に、検出可能なＫＳＨＶ感染を示した（ＫＳ発症前５２％）。これと比較すると、ホモセクシャル／バイセクシャルでは僅か9％（ｐ＝0.002）、血友病対照患者では11％（ｐ＝0.005）であった。ホモセクシャル／バイセクシャルＫＳ患者と対照との間において、ＣＤ４＋レベルは同じであっても、ＫＳＨＶ・ＤＮＡ陽性率は、第一回目（ｐ＝0.005）、二回目の来訪の両方で、患者の方が著しく高かった。これは、免疫抑制のみがこれらの検出率の上昇に関係しているのではないことを示している。ＫＳＨＶは、エイズ患者のＫＳ病巣に単純に入り込んで存在しているようではないようだ。というのは、最初のサンプル取得時には、何れの患者グループもＫＳをもっていなかったからである。５人のＫＳ患者および２人のホモセクシャル／バイセクシャル対照患者は、陰性から陽性に転換した。これは多分、該研究期間の間に新たに感染したためであろう。該知見は、アンブロジアック（Ambroziak）等［１９］が、ＫＳ患者から採取した全10ＰＢＭＣサンプル中でＰＣＲによってＫＳＨＶ・ＤＮＡを検出したこととは相反している。ブラインドＰＣＲ分析において、夫々の陽性サンプルは二つの独立したプライマーによって繰り返し陽性を示す事が要求されていたから、この試験はすべてのサンプル中でウイルスを検出するのに十分な感度を持っていなかった可能性がある。しかしながら、これがＰＣＲ入れ子式プライマー・セットの感受性に起因する可能性はないようだ。対になっている両方のサンプルに対して一貫して陰性であった７人のＫＳ患者は、無発病性（aviremic）またはウイルス負荷の低いＫＳ患者のサブ集団を示すのであろう。上記のＰＣＲ条件では、約２ｘ１０³リンパ球と同等のＤＮＡ量を試験している；２ｘ１０³細胞あたり１コピー未満の平均ウイルス負荷では、該分試験は陰性となるであろう。ＫＳＨＶ・ＰＣＲ増幅物に対して初めに陽性であった２ＫＳ患者および１ホモセクシャル／バイセクシャル対照患者は、診断後に採取したサンプルでは陰性に再転換した。感染の自然履歴(natural history)をより詳細に研究する必要はあるけれども、これらの結果は多分、感染が本当になくなったのではなく、ＫＳＨＶ・ＤＮＡが末梢血管では検出できない事を反映しているのであろう。本研究は、ＫＳの表現型が進展するのに先立って、ＫＳＨＶによる感染が起こるのかどうかという根本的な問題に答えるためにデザインされた。ここで得られた知見は、ＫＳＨＶ感染とＫＳとの間には、ＫＳＨＶ感染の方が先行するという強い関連がある事を示している。この時間的な関係が、ＫＳＨＶがＫＳの発症の原因経路の中心にあるということを立証するにあたって絶対条件となる。本研究は、ＫＳの発生における本ウイルスの原因的役割の可能性についての、付加的証拠を示す事に貢献している。実験の詳細セクションＩＶＫＨＶ−ＫＳウイルスが、アフリカ人患者からの地方病的なＫＳ病巣にも、ＨＩＶ関連ＫＳ病巣にも存在しているかどうかを決定するために、ＨＩＶ血清陽性およびＨＩＶ血清陽性のウガンダＫＳ患者からのフォルマリン固定したパラフィン包埋組識と、ＫＳに罹患していない患者からの癌組識とを、症例・対照−盲検査研究で比較した。患者の登録公的に記録されているＫＳ生検標本が、マケレレ大学（Makerere University 、Ｋａｍｐａｌａ，Uganda）で進行中の、癌とＨＩＶ感染の症例・対照研究に登録してあった殆ど同数のＨＩＶ関連ＫＳ患者および風土病性ＨＩＶ陰性ＫＳ患者から選ばれた。対照の組識は、同研究に登録している種々の悪性腫瘍を有する患者から、HIV血清状態の予備知識をもたずに選択された継続的公的生検標本(cons ecutive archival biopsies)である。全ての患者は、ＨＩＶ抗体について試験された（Cambridge Bioscience Recombigen Elisa分析にて測定）。組識調製個々の患者からのサンプルを検査した。各検体につき、約１０組識片（10ミクロン）を、各パラフィンブロックから清浄なナイフ刃で切片とした。組識片を１ｍｌのキシレンで15分にわたり二回抽出した後、１００％エタノールで15分間、二回の抽出を行い、組識切片からパラフィンを除去した。次に残りのペレットを再懸濁し、0.5mlの溶菌緩衝液（25mM KCl,10mM Tris-HCl,pH8.3，1.4mM MgCl2， 0.01% ゼラチン、１mg/ml プロテナーゼＫ）中で、一晩、５０℃でインキーベートした。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、10mMのTris-HCl,0.1mM EDTA,pH8.3で再懸濁した。ＰＣＲ増幅 0.2-0.4μgのＤＮＡを、先に述べたようなＫＳ３３０₂₃₃プライマーと共にＰＣＲ反応に使用した［７］。陰性のサンプルは、入れ子式ＰＣＲ増幅によって再テストした。これは、ＫＳ３３０₂₃₃配列を検出するに際して先に公表されたＫＳ３３０₂₃₃プライマーセット［７］よりも約１０²-１０³倍感度が高い。これらのサンプルを二回テストし、不一致の結果を示したサンプルを三回目に再テストした。最初に検査した７４のサンプルの内５１は、チェスター・ベッテイー(Che ster Beatty)実験所（ロンドン）における別個の抽出およびテストに使用され、ＰＣＲの結果を正確に再生するために、同一の入れ子式ＰＣＲプライマーおよび条件が使用された。両実験室間で８サンプル（各実験所から４つの陽性サンプル）からの結果が不一致であり、解釈不可として分析から外された。統計学的比較がEPI−INFO ver.５(USD,Stone,Mt.GA,USA )を使用して、完全信頼区間をもって行われた。結果検査した66の組識のうち、24はＡＩＤＳ−ＫＳの患者由来であり、２０は風土病性のＨＩＶ血清陰性ＫＳ患者からのもの、２２はＫＳをもたない癌の対照患者のものであった。癌の対照患者７人はHIV血清陽性であり、15人はHIV血清陽性であった(図２２)。対照群で調べられた腫瘍には、胸癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、大腸癌繊維肉腫、リンパ球性リンパ腫、ホジキンス・リンパ腫、絨毛癌、原発部位不明の退性癌があった。AIDS−KS患者の平均年齢は29歳（３才から５０才の範囲）である。これと比較して、風土病性ＫＳ患者は36歳（３才から７９才の範囲）、癌対照患者では、38歳（21歳から73歳の範囲）であった。 KS病巣のうちで、44のうち３９（８９％）はＫＤ３３０₂₃₃PCR産物に対して陽性であり、これには、２４人のＨＩＶ血清陽性患者のうちの２２（９２％）人からのＫＳ組識、20人のＨＩＶ血清陰世患者のうち17（８５％）人のKS組識が含まれる。これと比較して、22の非ＫＳ癌対照組識のうち３（１４％）は陽性であり、これには、７のHIV血清陽性患者の内１(１４％)および１５ＨＩＶ血清陰性・対照患者のうち２人(１３％)が含まれる（図１９）。これら対照患者には、73歳の HIV血清陰性の男性および胸癌を持つ29歳のＨＩＶ血清陰性の女性、および卵巣癌を持つ36歳のHIV血清陽性の女性が含まれる。ＨＩＶ血清陽性およびＨＩＶ血清陰性患者および対照由来の組識において、配列を検出する確率は、夫々、66（ 95％信頼区間（95％、Ｃ．Ｉ.）3.8-3161）および36.8(95% C.I．4.3−428)であった。ＨＩＶ血清状態によって階層分けされた全重量マンテルーヘンゼル確率は、49.2%(95%C.I.9.1-335)であった。ＨＩＶ血清陽性の子供４人（3、5、6、7才）からのKS組識およびＨＩＶ血清陰性の子供４人（3、4、4、12才）は、全員ＫＳ３３０₂₃₃ に対して陽性であった。結果が不一致であったすべてのサンプル（すなわち、ＫＳＨＶ陰性KSまたはＫＳＨＶ陽性非KS癌）は、すべて顕微鏡で調べられた。ＫＳ３３０₂₃₃PCR陰性KSサンプルはすべてKSであると確認された。このように、すべてのKS330₂₃₃PCR陽性の非KS癌で、組識病理学的に見えないKＳをもっていることはないことがわかった。考察これらの結果によって、ＫＳＨＶ・ＤＮＡ配列は、ＡＩＤＳ―ＫＳ［５］、古典的ＫＳ［６］、移植ＫＳ［７］においてのみ見られるのではなく、ＨＩＶ血清陽性および血清陰性患者由来のアフリカのＫＳにおいても見られる事が示される。臨床的特徴と疫学的特徴に差異があるにも拘わらず、ＫＳＨＶ・ＤＮＡ配列は、広範に分散した地理的状況から得られるすべての主要な臨床的ＫＳのサブタイプに存在する。本研究は、サザンハイブリデイゼーションのような特殊な検出法が使用できない、築堤フォルマリン固定の組識を用いて行われた。このような処置の後抽出されたＤＮＡはしばしば断片化されている。断片化されたＤＮＡは、ＰＣＲの検出感度を減少させ、本研究で見られる５ＰＣＲ陰性サンプルもこれによって説明できよう。しかしながら、該結果は、PCR汚染または非特異的増幅によるものとは考えられない。検体はブラインド試験され、サンプルのサブセットを別個に抽出し、物理的に隔離された実験室でテストした。サンプルをブラインドすることは、ＰＣＲ分析にのみ基づく結果の完璧性を確保するために不可欠である。アンプリコン(amplicon)のサブセットを配列決定したところ、公表されているＫＳ３３０₂₃₃のその特異的性質を確定する配列と98％以上同一である事がわかった。配列の変化が少ないので、汚染が起こる可能性は少ない。北アメリカおよびヨーロッパ集団における先の研究とは反対に、22の対照組識のうち３つにＫＳＨＶ感染の証拠が見られた。これらの癌は、さまざまな組識型で表われているので、ＫＳＨＶがこれらの腫瘍において病因的役割を果たす可能性はないようだ。該知見の説明として一つの可能であるのは、ウガンダにおける非ＫＳ集団で、これらの結果がＫＳＨＶ感染率に影響している事である。北アメリカ［５，９］、ヨーロッパ［７］、アジア［８］で別個に対照されて行った４つの研究では、まれに起こるエイズに関連した体腔系のリンパ腫［９］は別にして、200以上の癌対照組識にわたってＫＳＨＶの感染の証拠は検出できなかった。これらの研究を一緒にすると、開発国からの非KS癌組識の殆どにおいて、ＤＮＡに基づいてＫＳＨＶ感染が検出されるのは希である事が示される。ＫＳＨＶ感染は、移植後の皮膚腫瘍において報告されている。けれども、これら知見がＰＣＲ汚染［１０］によるものでない事を確認するためには、十分に対照された研究が必要である。ＨＩＶ陰性ＫＳの確率は、ウガンダでは、米国よりはるかに頻度が高いので、本研究において、癌患者からの対照組識にＫＳＨＶが検出された事には、ウガンダの一般集団に感染が比較的高い率で流行している事が反映されている事になる。開発国では子供のはＫＳが非常に稀であるのに［２］、ウガンダの子供のＫＳ率は、過去30年間にわたって劇的に上昇してきている。０〜14歳の少年の年標準化率は、1964-68には0.25、1992-93には10.1であった。青春期前の子供のＫＳ病巣におけるＫＳＨＶゲノムが検出されたことは、ウガンダの子供の間では、ウイルスは性別を問わず伝播する事が示唆される。これらの子供のうち５人は５歳以下である事から、該ウイルスが周産期に伝染する可能性が生じる。アフリカの子供達に、ＫＳがより爆発的な型で発生する事が、周産期伝染による免疫耐性によって説明されるのかどうかについては、調査が待たれる。実験の詳細セクションＶＫＳＨＶ感染の血清学的マーカー〈方法〉患者：コネチカット、ニュヨーク、カルフォルニアの幾つかの診療所に来院した８９ＨＩＶ感染患者の簡易サンプルから、血清を採集した。人口統計学的、臨床学的情報が、数字コードによってサンプルとリンクされるという標準化された形で記録された。組識学的に診断が確認されるかまたは、主任医師の意見で、ＫＳの診断が臨床学的基盤によって確実とされたら、患者はＫＳを但持すると分類された。８６人(97%)は男性で、８６人の男性中９０(93%)はホモセクシャルまたはバイセクシャルであった。４７人の患者は、すべて男性であり、ＫＳに罹患していた。該研究の集団の特徴は、図２３に見られる。細胞系：ＢＣＢＬ−１系は、エイズ関連の体腔Ｂ細胞非ホジキンス・リンパ腫から樹立された［３０］。ＢＣＢＬ−１細胞も、それから派生した腫瘍も、表面イムノグロブリンまたはＢ細胞特異的表面マーカーを発現しないが、ＢＣＢＬ −１細胞中には、Ｂ細胞に特徴的なイムノグロブィン遺伝子再構成が含まれている［３１］。ＫＳＨＶ・ＤＮＡ配列は、ＤＮＡの表象差異分析(representationa l difference analysis)［２３、３２］によってＢＣＢＬ―１細胞で検出され得る。ＢＣＢＬ―１細胞には、幾つかの異なるＥＢＶ・ＤＮＡプローブで検出できるＥＢＭゲノムも含まれる。Ｂ９５−８は、ＥＢＶ溶菌サイクル遺伝子をフォボールエステル（ＴＰＡ）［３３，３４］で有効に発現誘導できるＥＢＶ産生マルモセット細胞系(marmoset cell line)である。ＨＨ５１４−１６は、バルキット・リンパ腫を起源とするＥＢＶを含む細胞系であり、ｎ―ブチレート[３５，３６]によってＥＢＶ溶菌サイクル遺伝子の発現を至適に誘導できる。Ｂ１４１はＥＢＶ陰性・バルキット・リンパ腫細胞系である［３７］。Ｂ９５−８,ＨＨ５１４−１６およびＢＬ４１は、ＫＳＨＶプローブとハイブリダイズしない。全細胞系を８％牛胎児血清を含むＰＲＭＩ１６４０培地で培養した。免疫ブロテイング分析：非誘導のＢＣＢＬ−１細胞の抽出物、または２０ｎｇ／ｍｌＴＰＡで、３ｍＭのｎ―ブチレートで４８時間処理されたＢＣＢＬ−１細胞の抽出物を、超音波によって調製した。ＨＨ５１４−１６細胞も同様に処理されて、ＥＢＶポリペプチドに対する抗体の反応性を制御するために使用された。標準のプロトコール［３８］にしたがって、１０％または１２％のポリアクリルアミド・ゲルの各々のレーンに、ＳＤＳサンプル緩衝液中の５ｘ１０⁵細胞の抽出物を載せ、電気泳動し、ニトロセルロースに移し、スキムミルクでブロッキングした。血清は、１：１００希釈でスクリーンされた。反応物を、¹²⁵Ｉスタフィロコッカッス蛋白Ａの１．０μＣｉによって現像した。ラジオオートグラフを２４―４８時間フィルムに晒した。イムノブロッテイングを行い、コード化された血清(coded sera)上で解釈した。蛍光免疫分析：３ｍＭｎ―ブチレートで４８時間処理し、あるいは処理しないＢＣＢＬ−１細胞を抗原とした。細胞をスライド上に落とし、アセトンおよびエタノールで固定した。血清を、蛍光染色されたヤギ抗ヒトIgの１：１０希釈、続いて１：３０の希釈で試験した。血清の反応性は、未処理およびｎ―ブチレート処理されたＢＣＢＬ−１細胞上で比較された。化学的処理されたＢＣＢＬ− １細胞の３０〜５０％と反応性があれば、それは陽性反応とみなされた。すべての免疫蛍光測定テストは、コード化された血清上で実施された。二人の測定者(r eader)は、疾病の状態または免疫ブロッティングの結果を知らされていなかった。〈結果〉ＢＣＢＬ細胞における溶菌サイクルＫＳＨＶ蛋白の化学的誘導：ＢＣＢＬ− １細胞が、ＫＳＨＶ感染に特異的であると思われるユニークな抗原ポリペプチドを発現するかどうかを確かめるために、イムノブロテイングテクニックを使用した最初の実験が構築された。ＫＳに罹患またはＫＳ非罹患のＨＩＶ−１に感染した患者からの血清は、ＥＢＶポリペプチドに対する抗体を含んでいると予想され、またＢＣＢＬ−１細胞がＫＳＨＶまたはＥＢＶに二重に感染しているとの理由で、ＥＢＶポリペプチドを、ＫＳＨＶによってコードされ誘導されたＥＢＶポリペプチドから区別することが必要不可欠であった。図２７Ａ−２７Ｂ、すなわち、参照ＥＢＶ抗血清と反応したＢＣＢＬ−１細胞から調製されたイムノブロットは、ＢＣＢＬ−１細胞が、潜在核抗原(latent nuclear antigen)ＥＢＮＡ１およびｐ２１、即ち、後期抗原コンプレックス［３９］に対応した二つのペプチドを発現することを示しており、これらはＥＢＶ産生細胞系、たとえばＢ９５―８（図２７A）およびＨＨ５１４−１６（図２７Ｂおよび図２８Ａ−２８D）の中に存在した。ＫＳに罹患した患者からの血清を抗体供給源として使用したときは、該血清は、未処理のＢＣＢＬ−１細胞からの抽出物中において、該ＥＢＶ産生細胞系においても見られない追加の抗原ペプチドを認識しなかった。しかしながら、抽出物が、フォルボールエステル、ＴＰＡおよびｎ―ブチレートの組み合わせで最初に処理されたＢＣＢＬ−１細胞から調製された場合には、ＫＳ患者の血清は、ＢＣＢＬ−１細胞系に存在するが標準ＥＢＶ産生細胞系（図２７Ｂ）には存在しない多くの新規ペプチドを認識した。これらの多くのポリペプチドの最も代表的な分子量は、１０％のポリアクリルアミド・ゲル上で約２７ＫＤａ、４０ＫＤａ、および６０ＫＤａと推定される。これらのポリペプチドは、化学的誘導剤の添加後２４時間以内に検出されたが、化学処理をしないときには、培地に保持されたＢＣＢＬ−１中において５日の長期間に亘って出現しなかった。更に、ｎ―ブチレートはｐ４０の誘導に主に関係する化学剤であるが、ｐ６０は、ＴＰＡまたはｎ― ブチレート（図２８Ａ−２８Ｄ）によって誘導され得ることが実験からわかった。ｐ２７、ｐ４０、およびｐ６０は未処理細胞中では検出されなかったが、化学処理された後で現れたので、それらは、ＫＳＨＶの潜在サイクルポリペプチド(l atent cycle polypeptide)ではなく、溶菌サイクルポリペプチドを表すようである。ｐ４０およびｐ６０はＫＳＨＶに特異的である：図２７Ａ−２７Ｂは、原子量においてｐ４０に対応する抗原ポリペプチドが、同一の化学剤でＥＢＶ溶菌サイクルへと誘導される二つのＥＢＶ産生系Ｂ９５−８およびＨＨ５１４−１６中で、または同等に処理されたＥＢＶ陰性ＢＬ４１細胞中で観察されなかった事を示す。更に、ｎ―ブチレートは、ＢＣＢＬ−１細胞中でｐ４０の発現を強力に誘導するが、同細胞中でのＥＢＶｐ２１コンプレックスの発現レベルには殆ど影響を与えないか、またはまったく影響を与えない。関連する実験において、ｎ―ブチレートもまた、ＫＳＨＶ・ＤＮＡおよびＫＳＨＶ溶菌サイクルｍＲＮＡ量を増加させる事が分かった。反対に、ＴＰＡは、ＥＢＶ溶菌サイクルを有効に誘導した。ＴＰＡによる処理は、ＥＢＶｐ２１蛋白量の増加を引き起こし、ＫＳＨＶｐ４０の最小限の誘導を引き起こした。これらの知見は、ＢＣＢＬ−１細胞の持つ二つのガンマ・ヘルペス・ウイルスの潜伏期から溶菌サイクルへのスイッチ（移行）が別々の制御下で行われる事、およびｐ４０複合体はＫＳＨＶゲノムに特異的であることを示唆している。ＫＳＨＶの血清学的マーカーとしてのｐ４０：少数の反応性の高い血清、例えばＫＳ０１−０３（図２７Ｂ）は、ｐ２７、ｐ６０およびｐ４０を含む化学的に誘導されたＢＣＢＬ−１細胞に特異的な多数の抗原蛋白を認識するのに対して、ＫＳに罹患している別の患者からの血清はｐ２７またはｐ６０とは反応しないけれども、やはりｐ４０を認識した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。従って、ＫＳＨＶによる感染の血清学的マーカーとして、ｐ４０の認識が研究された。コネチカット、ニューヨーク、およびカルフォルニアからの８９人のＨＩＶ―１感染患者の血清を、ｐ４０に対する抗体の存在について試験した。ＫＳに罹患していない４２人の患者のうち３人（７％）は、ｐ４０に対する抗体をもっていた（カイ二乗でｐ＜0.0001）。これらの３人の患者は、ニューヨーク市からのホモセクシャルまたはバイセクシャルの男性であった。ＫＳの存在についての血清学的マーカーの陽性および陰性の予想値は、夫々８４％、７８％であった。非ホジキンス・リンパ腫にかかってはいるが、ＫＳには罹患していないニュヨークからの３人のＨＩＶ―１感染男性は、ＫＣＨＶ・ｐ４０抗原に対する反応性がなかった。図２５では、その血清がＫＳＨＶ・ｐ４０に対する抗体を含んでいた患者と含んでいなかったＫＳ患者を比較している。ＣＤ４細胞数またはＫＳ疾病の程度の何れからも、ｐ４０に対する血清学的反応の有無は予想できなかった。免疫蛍光測定法：イムノブロットによって、ｎ―ブチレートは、ＥＢＶポリペプチドの発現に著しく影響を与えずに、ＢＣＢＬ−１細胞中でのＫＳＨＶ溶菌サイクルポリペプチドの発現を誘導することが示された（図２８Ａ）。従って、ｎ―ブチレートは、ＥＢＶ溶菌サイクルへと誘導するよりも多くのＢＣＢＬ−１細胞を、ＫＳＨＶ溶菌サイクルへと誘導するのではないかとの推論がなされた。ＫＳＨＶではなくＥＢＶに対する抗体を含む参照ヒト抗血清、即ち、ＲＭ（図２７Ｂ）を用いた間接免疫蛍光測定を使用すると、約２％の抗原陽性の未処理ＢＣＢＬ−１細胞、およびｎ―ブチレートで処理された同数の抗原陽性ＢＣＢＬ細胞が存在した。ＥＢＶ陽性およびＫＳ陽性の血清０１―０３（図２７Ｂ）は、２％の抗原陽性細胞(恐らくは、ＥＢＶ発現細胞であると考えられる)を未処理ＢＣＢＬ細胞集団中で検出する一方、ｎ―ブチレートで処理された５０％の抗原陽性ＢＣＢＬ−１細胞を検出した。これにより、ＫＳＨＶ溶菌サイクル抗原に対する抗体についての免疫蛍光測定スクリーニング分析の基礎としてのｎ―ブチレートで処理した細胞集団のうち、抗原陽性ＢＣＢＬ−１細胞数が増加する（図２９Ａ− ２９Ｆ）。免疫蛍光測定法の結果は、イムノブロット法（図２６）とほぼ同一であった。二つの分析において不一致であったのは、８９血清のうち僅か４つ（３％）であった。ＩＦＡによって陽性と採点された３つの血清は、イムノブロッテングでは陰性であった。イムノブロッテイングで陽性とみなされた一つの血清は、ＩＦＡで陰性であった。ＫＳに罹患した患者の６８％、ＫＳに罹患していないＨＩＶ−１感染患者の１２％は、間接免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）では反応性を示した。このように二つの異なる測定法を用いて、ＫＳＨＶ溶菌サイクル抗原に対する抗体は、ＫＳに罹患していないＨＩＶ−１感染患者間でよりも、ＫＳを罹患している患者間において６〜９倍多い頻度で見られた。別の言い方をすれば、ＫＳＨＶ・ｐ４０・３２／３５（９１％）に対して、血清陽性である人は、ＫＳを保持していた。免疫蛍光測定法で血清陽性であった人の中で、３２／３７（８６％）の人はＫＳを保持していた。これら血清学的マーカーによって規定されるようなＫＳＨＶによる感染は、ＫＳの発生について高い危険率をもっている。考察ＫＳ腫瘍組識における新規ヒト・ヘルペス・ウイルスを表す遺伝子配列の近年における発見と、過去の疫学的的観察とを併せると、ＫＳの病原性において、この新規な因子が強く示唆される。しかしながら、これらの観察だけでは、ＫＳの多くの摩訶不思議な特徴を説明する病原性について統一した学説は構築されない。たとえば、ＨＩＶ−１の相対的寄与、他の免疫抑制型、地理学的要因、性別、サイトカイニンの働き、成長因子、臨床学的に異なる変種の発生はすべて究極的には解明されなければならない。異なる集団における感染率を確認することによって、ＫＳＨＶに感染についての血清学的マーカーは、この複雑なパズルにおける新規ウイルスの重要性を解明するのに多大な助けとなろう。一つの可能性として、ＫＳＨＶ（即ち、推測病因物質）は、他の全てのヒト・ヘルペス・ウイルスのように、偏在するウイルスであるか或いはヒト集団の大部分に感染を起こす少なくとも広範に分布するウイルスである。免疫抑制されている個体は疾病を進展させる可能性が大きいが、免疫能力を有する個体は健康のままでいられる。この病原モデルは、ＥＢＶが非ホジキンス・リンパ腫で果たすと仮定されている役割り、またはエイズに罹患した患者の網膜炎中でサイトメガロ・ウイルスが果たすと仮定されている役割と同じである。もしこのモデルが正しいとすると、かなり高い比率の成人ヒト集団が、ＫＳＨＶに血清陽性となるであろう。免疫欠損の個体に選択的に疾病を起こす偏在ウイルスのモデルでは、免疫無防備状態の古典的なＫＳ罹患患者を説明できないし、またアフリカの風土病的ＫＳがＨＩＶ−１の流行に先んじて起こるという観察が説明できない。多くのアフリカのＫＳ罹患患者はＨＩＶ−１陰性であるから、他の共働因子があるはずであることが示唆される。もう一つ可能性として、ＫＳＨＶ感染がヒト集団で選択的に発生する事があげられる。伝染は性行動によって促進され、ＨＩＶ−１を得る危険性が高くなる。この説では、ＨＩＶ−１血清陽性およびＨＩＶ−１血清陰性のホモセクシャル男性におけるＫＳＨＶの血清罹患率は、他の集団におけるよりも高率であると予想される。もしこのウイルス単独で疾病を誘導することができるならば、ＫＳＨＶの感染への罹患は、抗体の有無でモニターされ、臨床学的に明瞭なＫＳが高率で起こることと関係するであろう。しかしながら、もしＫＨＳＶ感染が疾病を起こすためには他の共因子を伴なう必要があるならば、ＫＳＨＶの抗体の存在率は、ＫＳ罹患患者および非罹患患者の間で同じとなるかも知れない。こと他の共因子は、ＫＳＨＶ抗原に対する抗体についての血清学的テストによっては同定されないであろう。ＫＳＨＶ溶菌サイクル抗原に対する抗体のテストを利用した知見は、ＫＳＨＶによる感染は稀であるが、はっきりした疾病を高率で伴うという一般的モデルに一致する。ＫＳに罹患していないＨＩＶ−１感染患者の若干名のみが、ＫＳＨＶ溶菌サイクル抗原に対する抗体をもっていた。反対に、臨床学的にはっきりしたＫＳに罹患したＨＩＶ−１感染男性は、かなり高い割合で血清陽性であった。この知見によると、ＨＩＶ−１およびＫＳＨＶに二重に感染している個人は、かなり高い割合でＫＳを発症する事が示唆される。しかしながら、このデータの別の解釈も可能である。とはいっても、この解釈は新規であり、ヒト・ヘルペス・ウイルス族間での他の例は知られていない。ＫＳＨＶの感染は広く起こっているかも知れないが、該ウイルスに対する抗体は、健康な個人においては通常検出されないのであろう。抗体は、免疫抑制の進行中に起こるであろうことと同様に、ウイルスが潜伏期から溶菌サイクルへと再活性化された後にのみ現れるのであろう。このように、記載された２つの血清学的テストは、再活性化された感染を示すものであって、該ウイルスの過去における接触を示すものとはならないであろう。もしこの解釈が正しいとすると、ＫＳＨＶ・ＤＮＡ配列を実証しまたはＫＳＨＶ血清陽性である健康な個人から該ウイルスを単離する事は可能であるはずだ。これらの二つの解釈のどちらが正しいにしても、血清学的研究によって、ＫＳＨＶ溶菌サイクル遺伝子産物に対する抗体の存在と臨床学的ＫＳと強く相関している事が分かった。にもかかわらず、更に説明を要する血清学的結果をもたらした患者が２グループある。一つのグループは、臨床的ＫＳ示さず、ＫＳＨＶｐ４０に対して陽性な血清を持つ少数の患者からなるグループである。彼らは、準臨床的または内臓的疾患を持っているかもしれないし、将来ＫＳを発症するかもしれない。もう一つのグループは、血清中にｐ４０に対する抗体を欠く、約３０％のＫＳ罹患患者である。ｐ４０血清陰性であったＫＳ罹患患者は、そのすべてにおいて診断を生検で確認したから、間違って分類分けされることはなかった（図２５）。測定された抗体は変わり易く、感染後に時間と共に盛衰する。ｐ４０に対する抗体の出現は、疾病の異なった段階の間に変化し得る溶菌性ウイルスの複製の程度を反映しているかもしれない。これが本当であるかどうかを確かめるためには、連続的な一連の放血を含めた今後の研究が必要である。ｐ４０は、感染した患者によって認識される多くのＫＳＨＶ抗原の中のうちの一つに過ぎないようだ。イムノブロット上での、他のＫＳＨＶ抗原の抗体認識は不可能であろう。何故なら、その抗原はＥＢＶポリペプチドと共に移動するからか、ＢＣＢＬ−１細胞が抗原を発現するように誘導され得ないからか、或いは、該抗原がイムノブロット上に少ししか存在しないか若しくは変性しているからである。何人かの個体においては、ｐ４０に対する血清抗体は、循環中にｐ４０抗原と免疫複合体を作って消費されてしまうのかも知れない。イムノブロット上でのｐ４０の検出は、最適な感度ではなされない。これに関連して、３つの血清が蛍光免疫テストにおいて抗原を認識したが、ウエスタンブロット上ではｐ４０と反応しなかった。ＢＣＢＬ−１細胞を抗原として採用する血清学的試験は明らかに第一世代の分析であり、ＫＳＨＶ遺伝子産物および組み替え抗原調製物のよりよい特性によって改良されるべきものである。ｐ４０に対する血清学的反応がないことは、体液性免疫が著しく損われている事をも示すことになるであろう。体液性免疫は、ＨＩＶ感染においても通常は比較的無傷であるけれども、抗体反応が損傷を受ける例は記載がある。たとえば、ある人々では、パルボウイルスＢ１９［４０］に対する抗体反応が損われる事が知られており、また、別の人々では、肝炎Ｂ表面抗原［４１］に対する抗体を失う事が観察されている。ＣＤ４細胞数によってモニターされる免疫抑制の程度とＫＳ罹患患者の中での抗体ｐ４０の有無との関係は、見出せなかった（図２５）。更に、ＫＳＨＶ・ｐ４０に対する抗体を但持するまたは但持しないすべての患者が、ＥＢＶ・ｐ２１に対する抗体を持っていた事は、体液免疫反応が無傷であった事を示唆している。これら血清学的研究では、先に報告した遺伝子プローブ研究におけるように、ＫＳＨＶ感染が、ＫＳ罹患患者大半で見られたが全患者に見られたという訳ではなかった。血清陰性患者だけは、方法論的説明では説明できないと仮定すると、ＫＳＨＶによる感染以外の他の経路によっても、ＫＳの発症が導かれるのかもしれない。実際、多くのデータで、ＫＳの病因が多要素からなる過程である事が示唆されている。ＨＩＶ―tat遺伝子の産物がＫＳの組識培養細胞［４２］の成長を刺激する事、およびマウスで［４３］ＫＳ状の病巣を誘導できることが観察されている。これらの知見によって、ＫＳの病因に、少なくともＨＩＶ−１に感染したホストにおいては、ＨＩＶ−１が直接関わっている事が示唆される。他の状況では、他の成長因子が、同じような作用または相補的作用を果たすようである。インターロイキン６および基礎的な繊維芽細胞の成長因子は共に、インビトロにおいてＫＳ細胞の成長を刺激することが知られている［４４］。インターロイキン−６はまた、ＡＩＤＳ−ＫＳ派生細胞培養において産生される。このように、ＫＳ病因には、ある患者においてはＫＳＨＶによる感染と共に、またある患者においてはＨＩＶ−１のある菌株と共に、自己分泌および傍分泌成長因子が、含まれる。もし、ＫＳＨＶによる感染が本プロセスの必要条件であるなら、すべてのＫＳ罹患患者においてＫＳＨＶ感染の証拠が見られると期待される。要約すると、ＫＳＨＶの溶菌サイクル抗原に対する抗体の検出についてのイムノブロッテングおよび免疫蛍光スクリーニング測定法が開示されている。これらの測定法によって、ＫＳＨＶの詳しい血清病因論的調査研究が可能になるに違いない。該知見によって、ＫＳＨＶによる感染とＨＩＶに感染した患者がＫＳを発症する事は、強く関連しているという概念が支持される。血清学的分析によって規定されるようなＫＳＨＶによる感染は、臨床学的ＫＳへと発展する危険性が非常に高いようだ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/03 Ｃ０７Ｋ 14/03 16/08 16/08 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (31)優先権主張番号０８／４２０，２３５ (32)優先日 1995年４月11日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＵＳ (72)発明者ムーア、パトリック・エスアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、ニューヨーク、モーニングサイド・ドライブ 90、アパートメント３ジェイ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、カポシ肉腫に関連したヘルペスウイルスを独特に定義する、単離されたＤＮＡ分子。２．ｃＤＮＡである、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。３．ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。４．請求項１の単離された核酸分子から誘導された単離されたＲＮＡ分子。５．検出マーカでラベルされた請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。６．請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子であって、前記マーカが放射性ラベル、または発色性、発光性もしくは蛍光性のマーカであるＤＮＡ分子。７．請求項１の単離されたＤＮＡ分子を具備した複製可能なベクター。８．請求項１の単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一部を含むプラスミド、コスミド、λファージまたはＹＡＣ。９．請求項７のベクターを含んだホスト細胞。１０．真核細胞である、請求項９に記載のホスト細胞。１１．バクテリア細胞である、請求項９に記載のホスト細胞。１２．カポシ肉腫に関連する単離されたヘルペスウイルス。１３．請求項１の単離されたＤＮＡ分子と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子。１４．請求項１３に記載のＤＮＡ分子。１５．請求項１の単離されたＤＮＡ分子に対して相補的な核酸分子と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子。１６．請求項１５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、中程度の厳格さで、図３Ａに示すヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号１）の少なくとも一部にハイブリダイズできる核酸分子。１７．配列ＩＤ番号１〜３７に示したヌクレオチド配列を有する核酸分子の少なくとも一部によってコードされる単離されたペプチド。１８．請求項１７のペプチドを発現するホスト細胞。１９．請求項１７に記載の単離されたペプチドであって、該ペプチドは第二のペプチドに結合されて融合タンパクを形成している単離されたペプチド。２０．請求項１７に記載の融合タンパクであって、前記第二のペプチドがベータ・ガラクトシダーゼである融合タンパク。２１．請求項１７の単離されたＤＮＡ分子によってコードされるペプチドに対して特異的に結合する抗体。２２．モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体。２３．ポリクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体。２４．検出マーカでラベルされている、請求項２１に記載の抗体。２５．請求項２４に記載のラベルされた抗体であって、前記マーカが放射性ラベル、または発色性、発光性もしくは蛍光性のマーカであるＤＮＡ分子。２６．請求項１の単離されたＤＮＡ分子にハイブリダイズできるアンチセンス分子。２７．ＤＮＡである、請求項２６に記載のアンチセンス分子。２８．ＲＮＡである、請求項２６に記載のアンチセンス分子。２９．請求項１の単離された二本鎖ＤＮＡ分子とハイブリダイズできるトリプレックスオリゴヌクレオチド。３０．胚段階の哺乳動物中に導入された請求項１の単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一部を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。３１．有効な免疫量の請求項１２の単離されたヘルペスウイルスと、適切な薬学的キャリアとを含むワクチン。３２．カポシ肉腫を診断する方法であって：（ａ）患者の腫瘍病巣から核酸分子を得る工程と；（ｂ）ハイブリダイズ条件下で、該核酸分子を請求項１３のラベルされた核酸分子に接触させる工程と；（ｃ）ハイブリダイズした核酸分子の存在（その存在は当該患者におけるカポシ肉腫を示す）を検出し、これによってカポシ肉腫を診断する工程とを具備した方法。３３．請求項３２に記載の方法であって、工程（ｂ）に先立ち、前記腫瘍病巣由来の前記ＤＮＡ分子が増幅される方法。３４．カポシ肉腫を診断する方法であって：（ａ）患者の適切な体液から核酸分子を得る工程と；（ｂ）ハイブリダイズ条件下で、該核酸分子を請求項１３のラベルされた核酸分子に接触させる工程と；（ｃ）ハイブリダイズした核酸分子の存在（その存在は当該患者におけるカポシ肉腫を示す）を検出し、これによってカポシ肉腫を診断する工程とを具備した方法。３５．カポシ肉腫に関連したＤＮＡウイルスを診断する方法であって：（ａ）患者から適切な体液サンプルを得る工程と；（ｂ）該患者の適切な体液を、既にカポシ肉腫抗体が結合されている支持体に接触させて、カポシ肉腫抗体を特異的なカポシ肉腫抗原に結合させる工程と；（ｃ）結合していない体液を前記支持体から除去する工程と；（ｄ）カポシ肉腫抗原によって結合されたカポシ肉腫抗体のレベルを測定し、これによってカポシ肉腫を診断する工程とを具備した方法。３６．カポシ肉腫関連のＤＮＡウイルスを診断する方法であって、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得る工程と；（ｂ）該患者の適切な体液を、既にカポシ肉腫抗体が結合されている支持体に接触させて、カポシ肉腫抗原を特異的なカポシ肉腫抗体に結合させる工程と；（ｃ）結合していない体液を前記支持体から除去する工程と；（ｄ）カポシ肉腫抗体によって結合されたカポシ肉腫抗原のレベルを測定し、これによってカポシ肉腫を診断する工程とを具備した方法。３７．カポシ肉腫の患者を治療する方法であって、該患者に対して有効量の請求項２６のアンチセンス分子を、該アンチセンス分子が選択的に患者の腫瘍細胞中に導入されて患者を治療する条件下で投与することを具備した方法。３８．カポシ肉腫（ＫＳ）の患者を治療する方法であって、ヒト・ヘルペスウイルス関連のＫＳを有する患者に対して、薬学的に許容可能なキャリア中の薬学的有効量の抗ウイルス剤を投与することを具備し、該抗ウイルス剤は請求項１２のＫＳ関連ヒト・ヘルペスウイルスをもった患者を治療するのに有効である方法。３９．カポシ肉腫（ＫＳ）を予防または治療する方法であって、ＫＳの危険をもった患者に、薬学的に許容可能なキャリア中の請求項１２のヒトヘルペスウイルスに結合する抗体を投与することによる方法。４０．患者をカポシ肉腫に対して予防接種する方法であって、有効量の請求項１７のペプチドおよび適切な許容可能なキャリアを患者に投与し、これによって該患者を予防接種する方法。４１．カポシ肉腫に関連したヘルペスウイルスにより引き起こされる疾病に対して患者を免疫化する方法であって、該患者に対して、有効免疫量の請求項１２のワクチンを投与することを具備した方法。４２．患者におけるヘルペスウイルス関連カポシ肉腫（ＫＳ）の発生または伝染を防止する方法であって、ヒト・ヘルペスウイルス関連ＫＳを有する患者に対して、薬学的に許容可能なキャリア中の薬学的有効量の抗ウイルス剤を投与することを具備し、該抗ウイルス剤は請求項１２のＫＳ関連ヒト・ヘルペスウイルスの発生または伝染の防止に有効である方法。