ES2687468T3 - Método de amplificación de ADN basado en invasión de cadena - Google Patents

Método de amplificación de ADN basado en invasión de cadena Download PDF

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Abstract

Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana de C. difficile toxígeno en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador cadena arriba, al menos un cebador cadena abajo y al menos un oligonucleótido de invasión de cadena en condiciones que promueven la amplificación de dicha secuencia de ácido nucleico diana, en el que cada uno de dicho cebador y dicho oligonucleótido de invasión de cadena comprende una región complementaria de dicha secuencia de ácido nucleico diana; en el que dicho oligonucleótido de invasión de cadena hace al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico diana monocatenaria para permitir la unión de dicho cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo; y en el que dicho cebador cadena arriba es un oligonucleótido de menos de 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, en el que dicho cebador cadena abajo es un oligonucleótido de menos de 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y en el que dicho oligonucleótido de invasión de cadena es un oligonucleótido de más de 30 nucleótidos de longitud, en el que dicho oligonucleótido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o es una variante que comprende una región complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, o que comprende una región complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, y en el que dicho oligonucleótido de invasión de cadena comprende además uno o más nucleótidos modificados en su región 3' que lo hacen no extensible.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de amplificacion de ADN basado en invasion de cadena Campo de la invencion
La invencion se refiere a un metodo para detectar Clostridium difficile (C. difficile) toxfgeno mediante amplificacion de ADN basada en invasion de cadena. La invencion tambien se refiere a oligonucleotidos, composiciones y kits adecuados para su uso en este metodo, y su uso para deteccion de C. difficile toxfgeno.
Antecedentes de la invencion
Los clostridios son bacterias anaerobias, grampositivas, formadoras de esporas. Las especies patogenas de clostridios producen toxinas proteicas de las que el grupo de citotoxinas clostridiales grandes (LCT) consiste en toxinas muy grandes con alta toxicidad in vivo asf como alta homologfa estructural y de secuencia (von Eichel- Streiber et al., 1996). Las toxinas A y B de C. difficile son la causa principal de patogenia de C. difficile. Durante mucho tiempo la toxina A se ha considerado el principal factor de virulencia, pero cada vez mas pruebas muestran que de hecho la toxina B desempena un papel principal en infecciones por C. difficile (Lyras et al., 2009; Carter et al., 2012).
Las toxinas A y B de C. difficile estan codificadas por los genes tcdA y tcdB, respectivamente, y los genes estan localizados en un locus de patogenia de ~19,6 kb (PaLoc). El PaLoc contiene tambien dos genes reguladores, concretamente tcdC y tcdR, que actuan como reguladores negativos y positivos, respectivamente, de expresion de toxina. tcdE, tambien incluido en el PaLoc, codifica una protefna de tipo holina necesaria para secrecion de toxina A y B. En cepas no toxfgenas el PaLoc se reemplaza con una secuencia de 115 pb (Braun et al., 1996). Se ha usado amplificacion de ADN para la deteccion de cepas de C. difficile toxfgenas (Wren et al., 1990; McMillin et al., 1991; McMillin et al., 1992).
Un proceso de amplificacion de ADN isotermico que se basa en un cebador cadena arriba, un cebador cadena abajo y un sistema de invasion de cadena se describe en el documento WO 2009/150467.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a la deteccion de una secuencia de acido nucleico de C. difficile toxfgeno, para permitir determinar la presencia de C. difficile toxfgeno en una muestra. Los metodos de la invencion usan un cebador cadena arriba, un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena, comprendiendo cada uno una region complementaria de dicha secuencia de acido nucleico diana. En combinacion, los cebadores y oligonucleotido de invasion de cadena posibilitan la amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana. El oligonucleotido de invasion de cadena hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union del cebador cadena arriba y cebador cadena abajo, permitiendo de este modo la amplificacion de ADN. Normalmente, la amplificacion se realiza en condiciones isotermicas, sin una necesidad de desnaturalizacion termica de ADN bicatenario.
Si se detecta amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana, esto es indicativo de que una cepa toxfgena del patogeno diana C. difficile esta presente en la muestra, y no una cepa no toxfgena, no patogena de C. difficile, u otra especie de clostridio. Los inventores han mostrado que el metodo de la invencion permite la deteccion altamente especffica y sensible de diferentes secuencias de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno.
La invencion proporciona un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno en una muestra, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador cadena arriba, al menos un cebador cadena abajo y al menos un oligonucleotido de invasion de cadena en condiciones que promueven la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico diana, en el que cada uno de dicho cebador y dicho oligonucleotido comprende una region complementaria de dicha secuencia de acido nucleico diana; en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union de dicho cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo, y en el que dicho cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, en el que dicho cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
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La invencion proporciona ademas un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno en una muestra, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador cadena arriba, al menos un cebador cadena abajo y al menos un oligonucleotido de invasion de cadena en condiciones que promueven la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico diana,
en el que cada uno de dicho cebador y dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende una region complementaria de dicha secuencia de acido nucleico diana;
en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union de dicho cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo; y en el que dicho cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, en el que dicho cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9, o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
La invencion proporciona ademas una composicion y un kit, comprendiendo cada uno un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 4, o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4 y que comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
La invencion proporciona ademas una composicion y un kit comprendiendo cada uno un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9 y que comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
La invencion proporciona ademas uso de un cebador cadena arriba, un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena, cada uno como se define en un metodo de la invencion descrito anteriormente, en un metodo para deteccion de C. difficile.
La invencion proporciona adicionalmente un metodo para diagnostico de una infeccion por C. difficile en un sujeto, que comprende llevar a cabo un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico de C. difficile toxfgeno segun la invencion en una muestra de dicho sujeto.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra: (A) una representacion de amplificacion de ensayo de tcdB. Se uso SybrGreen I para deteccion y se midio la fluorescencia con instrumento de PCR en tiempo real. Eje X: tiempo (minutos), eje Y: fluorescencia de SybrGreen I (intensidad de fluorescencia, unidades arbitrarias). Traza superior: 10 000 copias genomicas (cp) de ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) usado como molde en ensayo de SIBA de tcdB. Traza inferior = El control sin molde (NTC) no se amplifico. (B) Analisis de curva de fusion de reaccion de tcdB. Eje X: Temperatura (grados centfgrados), eje Y: (-d(fluorescencia)/d(temperatura), unidades arbitrarias). El analisis de curva de fusion postamplificacion con SybrGreen I mostro amplificacion de un unico amplicon especffico en reaccion de tcdB con ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) como molde. El control sin molde (NTC) no muestra ninguna amplificacion. (C) Electroferograma de reaccion de tcdB positiva y negativa. Eje X: fndice de migracion (%, donde el marcador inferior es 0 % y el marcador superior es 100 %), eje Y (intensidad de fluorescencia, unidades arbitrarias). Traza inferior = 10 000 cp de ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) usado como molde en ensayo de tcdB. Traza superior = sin molde de control (NTC). Las reacciones de tcdB se analizaron con sistema de electroforesis de microchip MultiNA. Solamente se detectaron oligonucleotidos de reaccion (cebadores inv y dir y oligo invasor) de reaccion de NTC mientras que un producto de amplificacion especffico se detecto de reaccion de tcdB en la que se usaron 10 000 cp de ADNg de C. difficile como molde.
La Figura 2 muestra: (A) Especificidad de ensayo de tcdB. Eje X: tiempo (minutos), eje Y: fluorescencia de
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SybrGreen I (intensidad de fluorescencia, milivoltios, mV). Se usaron 10 000 cp de ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) y 10 000 cp de ADNg de C. sordellii ATCC 9714 como moldes para reaccion de tcdB. Solamente se amplified y detecto ADNg de C. difficile. El control sin molde (NTC) no muestra ninguna amplificacion. (B) Sensibilidad de ensayo de tcdB. Eje X: tiempo (minutos), eje Y: fluorescencia de SybrGreen I (intensidad de fluorescencia, unidades arbitrarias). Se determino la sensibilidad de ensayo de tcdB usando una serie de diluciones de ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) como molde. 10 - 10 000 cp de ADNg de C. difficile mostraron amplificacion medida por aumento de la fluorescencia de SybrGreen I mientras que reacciones de control sin
molde (NTC) y de control negativo no se amplificaron. Todas las reacciones se realizaron en presencia de 0,5
ng/pl de ADN de esperma de arenque.
La Figura 3 muestra: (A) Inclusividad de ensayo de tcdB. Eje X: tiempo (minutos), eje Y: fluorescencia de SybrGreen I (intensidad de fluorescencia, unidades arbitrarias)]. Se usaron 2 ng de ADNg aislado de cultivos puros de C. difficile de toxinotipos 0, III, VIII y X como molde para ensayo de tcdB. NTC (Control sin molde). Todos los toxinotipos ensayados proporcionaron un resultado de amplificacion positivo. (B) Inclusividad de ensayo de tcdB para un panel de toxinotipos, detalles como en (A) anterior, pero usando 2 ng de ADNg aislado de cultivos puros de C. difficile de toxinotipos 0, I, II, IIIa, IIIb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, XIb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII y XXXIII. Solamente dos toxinotipos, concretamente XIa y XIb, proporcionaron un resultado de amplificacion negativo. (C) Analisis de curva de fusion de reacciones de tcdB con molde de ADNg aislado de diferentes toxinotipos de C. difficile como en (A). Eje X: Temperatura (grados centfgrados), eje Y: (-d(fluorescencia)/d(temperatura), unidades arbitrarias). Todos los toxinotipos de C. difficile mostraron amplificacion de un unico amplicon. El control sin molde (NTC) no muestra ninguna amplificacion. (D) Analisis de curva de fusion, detalles como en (C) anterior,
para el panel de toxinotipos de (B). El analisis de curva de fusion tambien mostro ausencia de amplificacion para
toxinotipos XIa y XIb.
La Figura 4 muestra: (A) Representacion de amplificacion de ensayo de tcdA. Se uso SybrGreen I para deteccion y se midio la fluorescencia con instrumento de PCR en tiempo real. Eje X: tiempo (minutos), eje Y: fluorescencia de SybrGreen I (intensidad de fluorescencia, unidades arbitrarias). Se observo amplificacion con 100 - 10 000 cp/reaccion de ADNg de C. difficile BAA-1382 (630) y ausencia de amplificacion observada en presencia de 0-10 cp/reaccion de ADNg de C. difficile y con control sin molde (NTC). (B) Analisis de curva de fusion de ensayo de tcdA. Eje X: Temperatura (grados centfgrados), eje Y: (-d(fluorescencia)/d(temperatura)), unidades arbitrarias). El analisis de curva de fusion muestra amplificacion de un unico amplicon especffico. El control sin molde (NTC) no muestra ninguna amplificacion.
Descripcion de las secuencias
SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO
1 es la secuencia de nucleotidos de una region diana de tcdB.
2 es la secuencia de nucleotidos de un cebador directo de tcdB.
3 es la secuencia de nucleotidos de un cebador inverso de tcdB.
4 es la secuencia de nucleotidos de un oligonucleotido invasor de cadena de tcdB.
5 es la secuencia de nucleotidos de un oligonucleotido invasor de cadena de tcdB modificado.
6 es la secuencia de nucleotidos de una region diana de tcdA.
7 es la secuencia de nucleotidos de un cebador directo de tcdA.
8 es la secuencia de nucleotidos de un cebador inverso de tcdA.
9 es la secuencia de nucleotidos de un oligonucleotido invasor de cadena de tcdA.
10 es la secuencia de nucleotidos de un oligonucleotido invasor de cadena de tcdA modificado.
Descripcion detallada de la invencion
Debe entenderse que diferentes solicitudes de los metodos desvelados pueden adaptarse a las necesidades especfficas en la tecnica. Tambien debe entenderse que la terminologfa utilizada en el presente documento es unicamente con el fin de describir realizaciones particulares de la invencion, y no se pretende que sea limitante.
Metodo de deteccion de C. difficile toxfgeno en una muestra
Muestra
Habitualmente, la muestra es una muestra clfnica, por ejemplo una muestra obtenida de un paciente que se sospecha que tiene, o que tiene una infeccion por C. difficile. Sin embargo, se puede usar cualquier muestra, siempre que pueda obtenerse o extraerse acido nucleico de la muestra. Por lo tanto, pueden usarse muestras de referencia de cepas de C. difficile particulares, o pueden usarse muestras ambientales en la presente invencion. Los tipos adecuados de muestra clfnica varfan segun el tipo particular de infeccion que esta presente, o se sospecha que esta presente, en un sujeto. La muestra puede ser sangre, plasma, suero, orina o una muestra de heces. En una realizacion preferida, la muestra es una muestra de heces. La muestra de heces puede tomarse de un sujeto que tiene una infeccion del tracto gastrointestinal. La infeccion puede estar presente en un paciente que tiene diarrea.
En realizaciones preferidas, las muestras se toman de sujetos animales, tales como sujetos mamfferos. Las muestras se tomaran habitualmente de sujetos humanos, pero la presente invencion tambien es aplicable en general
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a animales domesticos, ganado, aves y peces. Por ejemplo, la invencion puede aplicarse en una situacion veterinaria o agrfcola.
La muestra comprende acido nucleico que puede ser ADN o ARN. Si el acido nucleico esta presente en la muestra en una forma adecuada que permite la deteccion segun la invencion, la muestra puede usarse directamente. Sin embargo, normalmente, el acido nucleico procede, se obtiene o se extrae de la muestra. Se conocen bien en la tecnica metodos para procesar muestras que contienen acidos nucleicos, extraer acidos nucleicos y/o purificar acidos nucleicos para su uso en metodos de deteccion. Puede aislarse acido nucleico total o puede aislarse ADN o ARN por separado.
Normalmente, una muestra se procesa de una manera apropiada de modo que se proporcione acido nucleico en una forma conveniente para poner en contacto con los cebadores y el oligonucleotido de invasion de cadena. Cuando el acido nucleico es ADN, el ADN se proporciona normalmente en forma bicatenaria. Cuando el acido nucleico es un RNA, este se convierte normalmente a ADNc usando transcriptasa inversa o una polimerasa con actividad transcriptasa inversa. El ARN puede ser util para deteccion bacteriana, debido al numero muy grande de ribosomas presentes en celulas bacterianas que amplifican eficazmente la concentracion de secuencias diana.
Secuencia de acido nucleico diana
La secuencia de acido nucleico diana es una region del genoma de C. difficile (o amplicon) adecuado para su uso en deteccion especffica de C. difficile toxfgeno. Esto permite una determinacion inequfvoca, altamente cualitativa, de la presencia de C. difficile toxfgeno en la muestra, incluso si existen organismos estrechamente relacionados. La seleccion de secuencias de acido nucleico diana especfficas en cepas toxfgenas de un patogeno especffico y el diseno posterior de cebador y oligonucleotidos de invasion de cadena para deteccion de esas secuencias es una consideracion importante. Se proporcionan en el presente documento ejemplos de secuencias apropiadas.
Normalmente, la secuencia de acido nucleico diana sera unica del genoma de C. difficile. La secuencia de acido nucleico diana diferira por lo tanto normalmente de cualquier secuencia de acido nucleico homologa en una especie relacionada, por ejemplo en una especie de Clostridium homologa. Normalmente, la secuencia de acido nucleico diana comprendera varios desapareamientos con una secuencia de acido nucleico homologa en una especie relacionada. Preferentemente, la secuencia de acido nucleico diana no esta presente en una especie de clostridio distinta de C. difficile que alberga genes para toxinas clostridiales grandes. La secuencia de acido nucleico diana preferentemente no esta presente en C. sordellii y/o C. novyi. La secuencia de acido nucleico diana normalmente permite la deteccion especffica de C. difficile de una muestra que contiene C. difficile y C. sordellii y/o C. novyi.
La secuencia de acido nucleico diana normalmente tiene buena inclusividad para diferentes toxinotipos de C. difficile y por lo tanto esta normalmente presente y puede detectarse en mas de un toxinotipo de C. difficile. Preferentemente, la secuencia de acido nucleico diana es inclusiva para al menos tres, mas preferentemente al menos cinco, al menos siete, al menos diez, al menos quince, al menos veinte, al menos veinticinco, al menos treinta, al menos treinta y cinco, de forma mas optima para todos los toxinotipos de C. difficile. Los toxinotipos de C. difficile incluyen toxinotipos 0, I, II, Ilia, Illb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, Xlb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII y XXXIII, y cualquier otro toxinotipo descrito en la tecnica o existente en la naturaleza. Normalmente, la secuencia de acido nucleico diana es inclusiva para toxinotipos de C. difficile que se ha descubierto que son clfnicamente relevantes en trastornos asociados con infeccion por C. difficile.
La secuencia de acido nucleico diana normalmente tiene un mayor contenido de GC que el contenido promedio de GC del genoma de C. difficile, que es de 29,1 % para la cepa de referencia de C. difficile 630. La secuencia de acido nucleico diana puede tener un contenido de GC de al menos 30 %, mas preferentemente al menos 31 %, al menos 32 % o al menos 33 %. Cuando la secuencia de acido nucleico diana esta presente en el gen tcdA o tcdB, el contenido promedio de GC de estos genes es de 27 % y por lo tanto los contenidos de GC preferidos anteriores tambien son mayores en comparacion con el promedio para estos genes. El contenido de GC de la secuencia de acido nucleico diana tambien se selecciona con respecto a la necesidad de union de cebadores y fusion de la secuencia diana en las condiciones de temperatura isotermica usadas.
La secuencia de acido nucleico diana o amplicon es de una longitud suficiente para posibilitar la deteccion especffica de C. difficile toxfgeno y para hibridacion de los cebadores cadena arriba y cadena abajo y el oligonucleotido de invasion de cadena de una manera adecuada para diferentes partes de la secuencia diana. Preferentemente, el amplicon es de al menos 45 nucleotidos de longitud, mas preferentemente de al menos 50, al menos 55 o al menos 60 nucleotidos de longitud, como se mide del sitio 5' de union del cebador cadena arriba al sitio 5' de union del cebador cadena abajo.
La secuencia de acido nucleico diana puede estar presente en cualquier region del genoma de C. difficile, siempre que tenga las caracterfsticas necesarias para deteccion especffica de C. difficile como se ha analizado anteriormente. La secuencia de acido nucleico diana puede estar presente en una region de ADN no codificante especffica de C. difficile toxfgeno o una region codificante especffica de C. difficile toxfgeno. La secuencia nucleica
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diana puede estar presente en el locus de patogenia de C. difficile. Preferentemente, la secuencia de acido nucleico diana esta presente en el gen tcdA o el gen tcdB de C. difficile. Otros genes diana adecuados pueden incluir los genes tcdC, tcdE, tcdR en PaLoc o genes de toxina binarios de C. difficile. Estan disponibles secuencias en los numeros de referencia enumerados para el genoma completo de Clostridium difficile 630 (GenBank: AM180355.1), gen tcdA (AM180355.1: 795843-803975, gen tcdB (AM180355.1: 787393-794493).
La secuencia de acido nucleico diana comprende preferentemente la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma (para deteccion de tcdA) o la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma (para deteccion de tcdB). Deberfa entenderse que la secuencia de acido nucleico diana es una doble cadena que comprende una cadena con sentido que representa la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma o la SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma y una cadena antisentido complementaria. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo usados para amplificar la secuencia de acido nucleico diana se unen con cadenas opuestas de esta doble cadena.
La secuencia de acido nucleico diana puede comprender una secuencia variante de origen natural de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6 que esta presente en un toxinotipo diferente para la cepa de referencia de C. difficile 630. Se encuentran variantes de origen natural de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6 en las secuencias conocidas de toxinotipos de C. difficile diferentes y, por ejemplo, la secuencia correspondiente en algunos toxinotipos conocidos comprende 1, 2 o 3 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Los toxinotipos aun no secuenciados tambien pueden comprender desapareamientos con respecto a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6. Los inventores han mostrado sorprendentemente que el metodo de la invencion es inclusivo para la deteccion de una amplia serie de toxinotipos incluso en la existencia de dichos desapareamientos.
Variantes de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6 pueden comprender una region que es parcial o completamente complementaria de al menos 35 nucleotidos contiguos, mas normalmente al menos 40, preferentemente al menos 45 o al menos 50 nucleotidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6. Las variantes pueden comprender una region que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas desapareamientos (sustituciones) con respecto a una region de la secuencia diana original correspondiente de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6. Por lo tanto, por ejemplo las variantes pueden comprender una region de al menos 35 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 desapareamientos, tal como de 1-3 o 1-5 desapareamientos, con una region correspondiente de al menos 35 nucleotidos contiguos de la secuencia diana original correspondiente. Las variantes pueden comprender una region de al menos 40, 45 o 50 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, tal como 1-5 o 1-8 desapareamientos con una region correspondiente de una longitud equivalente en la secuencia diana original correspondiente. Cualquier desapareamiento en la secuencia variante puede ser a al menos 2, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 nucleotidos de distancia.
Como alternativa, Las variantes pueden comprender una region de al menos 35, 40 o 45 nucleotidos de longitud que es completamente complementaria de la secuencia diana original.
Mas preferentemente, la secuencia de acido nucleico diana comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6 o consiste en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 6 y una cadena antisentido complementaria.
Puede detectarse mas de una secuencia de acido nucleico diana en un metodo de la invencion, proporcionando dos o mas conjuntos de cebador cadena arriba, cebador cadena abajo y oligonucleotido de invasion de cadena, cada conjunto adaptado para deteccion de una secuencia de acido nucleico diana diferente. Por ejemplo, un metodo de la invencion puede detectar tanto tcdB como tcdA.
Cebadores cadena arriba y cadena abajo
Los cebadores cadena arriba y cadena abajo adecuados se seleccionan basandose en la secuencia de acido nucleico diana de interes y teniendo en cuenta el sitio de union del oligonucleotido de invasion de cadena que hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union del cebador cadena arriba y el cebador cadena abajo.
Los cebadores cadena arriba y cadena abajo comprenden una secuencia que es parcial o completamente complementaria de la diana y opcionalmente una secuencia no complementaria 5' y/o 3' flanqueante. Como alternativa, los cebadores cadena arriba y cadena abajo pueden consistir totalmente en secuencia parcial o completamente complementaria de la diana. La longitud de la secuencia de cebador que es complementaria de la diana es suficiente para proporcionar hibridacion especffica con la secuencia de acido nucleico diana. La longitud de secuencia complementaria es normalmente al menos 10 nucleotidos, mas preferentemente al menos 15, al menos 16 o al menos 17 nucleotidos. La longitud de secuencia complementaria puede ser 10-25, 15-25, 10-30 o 15-30 nucleotidos.
Deberfa entenderse que las longitudes de secuencia anteriores se refieren a partes de los cebadores que pueden ser parcial o completamente complementarias de la secuencia de acido nucleico diana. Pueden estar presentes desapareamientos entre los cebadores y la secuencia diana en posiciones particulares permitiendo aun al mismo tiempo la amplificacion y deteccion especffica de la secuencia diana, en particular teniendo en cuenta el uso
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combinado de cebadores cadena arriba y cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena para conseguir la amplificacion. Puede haber 1, 2, 3, 4 o 5 desapareamientos entre la region complementaria del cebador y la region correspondiente de la secuencia diana.
Preferentemente, el cebador se disena para permitir la deteccion especffica de C. difficile toxfgeno. Por lo tanto, el cebador normalmente hibrida de forma especffica o selectiva con una secuencia complementaria hallada solamente en C. difficile toxfgeno. Sin embargo, el cebador tambien puede hibridar con otras secuencias, tales como secuencias halladas en otras especies de clostridio, siempre que cuando se usen en combinacion con el segundo cebador y oligonucleotido de invasion de cadena, se obtenga amplificacion especffica de una secuencia hallada solamente en C. difficile toxfgeno.
La hibridacion especffica o selectiva se refiere a la union de un cebador solamente con una secuencia de nucleotidos particular en condiciones dadas, cuando esa secuencia esta presente en un acido nucleico en una muestra, tal como una mezcla biologica compleja que incluya ADN o ARN total celular y ajeno. Se conocen en la tecnica condiciones de hibridacion apropiadas. Vease, por ejemplo, Sambrook, Fritsche y Maniatis "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Ed. Cold Spring Harbor Press (1989). Tambien se proporcionan condiciones de hibridacion apropiadas en los ejemplos posteriores. Como es conocido por los expertos, las condiciones de hibridacion apropiadas pueden variar dependiendo de la longitud de una sonda y su composicion basica. Se realiza hibridacion normalmente a la misma temperatura que amplificacion y, por lo tanto, tambien depende del perfil de actividad de las enzimas polimerasa y recombinasa empleadas.
El cebador cadena arriba y cadena abajo sera de menos de 30 nucleotidos de longitud en total, mas preferentemente menos de 25 nucleotidos de longitud, tal como de 15 a 25 o de 15 a 23 nucleotidos de longitud. Se usan cebadores de menos de 30 nucleotidos de longitud cuando se use una recombinasa para invasion de cadena. Los cebadores no son capaces de actuar como sustratos para recombinasas.
El cebador cadena arriba (o directo) se une con la region 5' de una cadena de la secuencia de acido nucleico diana de doble cadena, en una posicion proxima o solapante con el sitio de union 5' del oligonucleotido de invasion de cadena. El cebador cadena abajo (o inverso) se une con la region 5' de la cadena opuesta de la secuencia de acido nucleico diana de doble cadena para el cebador cadena arriba, en una posicion proxima o solapante con el sitio de union 3' del oligonucleotido de invasion de cadena. Los sitios de union 5' de los cebadores cadena arriba y cadena abajo estan normalmente a al menos 45 nucleotidos, mas preferentemente de al menos 50, al menos 55 o al menos 60 nucleotidos de distancia en la secuencia diana de doble cadena.
El cebador de cadena arriba y/o cadena abajo puede tener una region de solapamiento de secuencias con la secuencia del oligonucleotido de invasion de cadena. La region de solapamiento de secuencias es normalmente de 1-8 nucleotidos de longitud y puede ser de al menos 5 o al menos 6 nucleotidos de longitud. El cebador cadena abajo tambien puede tener una region de solapamiento de secuencias de 1-8 nucleotidos de longitud con la secuencia del oligonucleotido de invasion de cadena.
Como alternativa, puede no haber solapamiento de secuencias entre el cebador cadena arriba y/o cadena abajo y el oligonucleotido de invasion de cadena, con la union de cebador en cambio en una posicion que esta proxima en la secuencia diana al sitio de union del oligonucleotido de invasion de cadena.
Cuando un cebador se une proximo al oligonucleotido de invasion de cadena, normalmente hay 25 nucleotidos o menos, mas preferentemente 20 nucleotidos o menos, 15 nucleotidos o menos o 10 nucleotidos o menos entre el sitio de union relevante del oligonucleotido de invasion de cadena y el extremo 5' del cebador. Esto asegura que el cebador sea capaz de hibridar con la region monocatenaria creada por union del oligonucleotido de invasion de cadena.
Se proporcionan en el presente documento ejemplos especfficos de cebadores cadena arriba y cadena abajo adecuados para union de secuencias de acido nucleico diana en los genes tcdA y tcdB de C. difficile. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo para deteccion de la secuencia diana de tcdB de la SEQ ID NO: 1 son los cebadores de las SEQ ID NO: 2 y 3, o variantes de las mismas. Son cebadores cadena arriba y cadena abajo preferidos para deteccion de la secuencia diana de tcdE de la SEQ ID NO: 6 los cebadores de las sEq ID NO: 7 y 8, o variantes de las mismas.
Las variantes de las SEQ ID NO: 2, 3, 7 y 8 pueden ser oligonucleotidos de hasta 30 nucleotidos de longitud que comprenden una region que es parcial o completamente complementaria de al menos 10 nucleotidos contiguos de la secuencia de cebador original correspondiente de las SEQ ID NO: 2, 3, 7 u 8. Preferentemente, dichas variantes comprenderan al menos una region que es parcial o completamente complementaria de al menos 11, 12, 13, 14 o 15 nucleotidos contiguos de la secuencia de cebador original correspondiente de las SEQ ID NO: 2, 3, 7 u 8. Cuando la secuencia de cebador original sea mayor de 16 nucleotidos de longitud, tal como hasta 21 nucleotidos de longitud (SEQ ID NO: 2) las variantes pueden comprender de forma correspondiente una region que es parcial o completamente complementaria de 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos contiguos de la misma.
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Las variantes anteriores pueden comprender una region que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 desapareamientos (sustituciones) con respecto a la region correspondiente de la secuencia de cebador original (y por lo tanto la secuencia diana) y por lo tanto es parcialmente complementaria de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, las variantes pueden comprender una region de al menos 10 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2 o 3 desapareamientos, tal como 1 o 2 desapareamientos con una region correspondiente de al menos diez nucleotidos contiguos de la secuencia de cebador original correspondiente. Las variantes pueden comprender una region de al menos 13, 14 o 15 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 desapareamientos, tal como 1-3 desapareamientos con una region correspondiente de una longitud equivalente en la secuencia de cebador original correspondiente. Cualquier desapareamiento en la secuencia de cebador variante puede ser a al menos 2, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 nucleotidos de distancia.
Como alternativa, Las variantes pueden comprender una region de al menos 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleotidos de longitud que es completamente complementaria de la secuencia de cebador original.
Las variantes de las SEQ ID NO: 2, 3, 7 y 8 tambien pueden ser oligonucleotidos de hasta 30 nucleotidos de longitud que tienen al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la secuencia de cebador original correspondiente, preferentemente al menos 75 %, al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % de identidad de secuencia.
Ademas, los cebadores variantes pueden comprender una secuencia de nucleotidos 5' o 3' flanqueante del gen tcdA o tcdB con respecto a la region de union de los cebadores originales, tal como 5-10 nucleotidos de la region 5' flanqueante y/o region 3. Los cebadores variantes pueden comprender ademas una secuencia no relacionada con la secuencia diana.
Cualquier cebador cadena arriba o cadena abajo usado en la invencion puede comprender uno o mas nucleotidos modificados y/o un marcador detectable, por ejemplo un colorante fluorescente.
Oligonucledtido de invasion de cadena
Un oligonucleotido de invasion de cadena adecuado se selecciona basandose en la secuencia de acido nucleico diana de interes y teniendo en cuenta el sitio de union de los cebadores cadena arriba y cadena abajo y la necesidad de que el oligonucleotido de invasion de cadena haga la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria en las regiones relevantes para permitir la union del cebador cadena arriba y el cebador cadena abajo.
El oligonucleotido de invasion de cadena comprende una secuencia que es complementaria de la diana y opcionalmente secuencia o secuencias no complementarias flanqueantes adicionales. La longitud de la secuencia que es complementaria de la diana puede ser determinada por el experto en la materia de forma empfrica y es suficiente para posibilitar una invasion de cadena eficaz de la secuencia de acido nucleico diana, opcionalmente en condiciones isotermicas. La secuencia complementaria puede comprender pares de bases complementarios de ARN-ADN y nucleotidos modificados. Normalmente, la longitud de secuencia complementaria es de al menos 25 o al menos 27 nucleotidos, normalmente al menos 30 nucleotidos, tal como al menos 32, al menos 33 o al menos 35 nucleotidos, mas preferentemente al menos 36, 37, 38, 39 o 40 nucleotidos de longitud o mayor. La longitud de secuencia complementaria puede ser de 30-50, 32-50, 35-50, 40-50, de 35 a 48, de 35 a 46, de 38 a 45 o de 40 a 45 nucleotidos de longitud.
Deberfa entenderse que las longitudes de secuencia anteriores se refieren a una parte del oligonucleotido de invasion de cadena que puede ser parcial o completamente complementaria de la secuencia de acido nucleico diana. Pueden estar presentes desapareamientos entre el oligonucleotido de invasion de cadena y la secuencia diana en posiciones particulares permitiendo aun al mismo tiempo la amplificacion y deteccion especffica de la secuencia diana, en particular teniendo en cuenta el uso combinado de cebadores cadena arriba y cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena para conseguir la amplificacion. Puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 desapareamientos entre la region complementaria del oligonucleotido de invasion de cadena y la region correspondiente de la secuencia diana, dependiendo de la longitud total de la secuencia complementaria.
Preferentemente, la secuencia complementaria del oligonucleotido de invasion de cadena se disena para permitir la deteccion especffica de C. difficile toxfgeno. Por lo tanto, el oligonucleotido de invasion de cadena preferentemente hibrida de forma especffica o selectiva con una secuencia complementaria hallada solamente en C. difficile toxfgeno. Sin embargo, el oligonucleotido de invasion de cadena tambien puede hibridar con otras secuencias, tales como secuencias halladas en otras especies de clostridio, siempre que, cuando se usen en combinacion con los cebadores, se obtenga amplificacion especffica de una secuencia hallada solamente en C. difficile toxfgeno.
La secuencia complementaria del oligonucleotido de invasion de cadena hibrida con una parte de la secuencia diana intermedia en las regiones de union para los cebadores cadena arriba y cadena abajo (y normalmente solapantes con una o mas de las mismas). El oligonucleotido de invasion de cadena puede tener una region de solapamiento de 1-8 nucleotidos, tal como una region de al menos 5 o al menos 6 nucleotidos de longitud, con los cebadores cadena arriba y/o cadena abajo.
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La parte 5' de la secuencia complementaria del oligonucleotido de invasion de cadena normalmente se une a una distancia de 25 nucleotidos o menos, mas preferentemente 20 nucleotidos o menos del lfmite 5' de la secuencia de nucleotidos diana de doble cadena para fundir (el amplicon).
El oligonucleotido de invasion de cadena comprende opcionalmente ademas region o regiones de secuencia no complementaria para la diana que flanquean la region de secuencia complementaria. El oligonucleotido de invasion de cadena puede comprender una region 5' no complementaria que puede ser de cualquier secuencia de nucleotidos. La region no complementaria 5' es normalmente de al menos 3 nucleotidos de longitud, mas normalmente al menos 6, al menos 8, preferentemente al menos 10, al menos 12 o al menos 14 nucleotidos de longitud. La region 5' no complementaria puede ayudar a la union de recombinasa. El oligonucleotido de invasion de cadena puede comprender una region 3' no complementaria normalmente de 1-3 nucleotidos de longitud que bloquea la extension por polimerasa tal como invdT.
El oligonucleotido de invasion de cadena es normalmente de al menos 30 nucleotidos de longitud cuando se use una recombinasa junto con el oligonucleotido. El oligonucleotido de invasion de cadena es preferentemente de al menos 35, al menos 40 o al menos 45 nucleotidos de longitud, mas preferentemente al menos 50 y puede ser de al menos 55 nucleotidos de longitud o mayor. El oligonucleotido de invasion de cadena puede ser de 40-70, 45-70, 45-70, 5070, 55-70, 45-65, 50-65, 50-60 o 55-65 nucleotidos de longitud.
El oligonucleotido de invasion de cadena tiene un extremo 3' no extensible, de modo que no puede actuar como un sustrato para amplificacion de ADN y la secuencia diana se amplifica entonces solamente tras la union posterior de los cebadores cadena arriba y cadena abajo especfficos. Esto evita la formacion de productos de amplificacion no especfficos. El oligonucleotido de invasion de cadena puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas nucleotidos modificados en su region 3', tal como en los 10-15 o 10-20 nucleotidos del extremo 3'. El oligonucleotido de invasion de cadena puede comprender una modificacion 3' del nucleotido 3' terminal y puede ser un didesoxinucleotido o comprender un grupo 3'amino-alilo, un espaciador 3'carbono, 3'fosfato, 3'biotina, 3'sialilo o 3'tiol. El nucleotido 3' puede ser un nucleotido incorporado en una orientacion inversa por un enlace 3'3'. Como alternativa o ademas, la region 3' del oligonucleotido de invasion de cadena puede comprender nucleotidos con poca capacidad de sustrato para ADN polimerasas, tales como nucleotidos de PNA (acido nucleico peptfdico), LNA (acido nucleico bloqueado), ADN con enlaces 2'-5' o 2'-O-metil ARN, o combinaciones de los mismos.
Cuando el oligonucleotido de invasion de cadena sea un oligomero de PNA compuesto completamente por PNA, dicho oligonucleotido puede desestabilizar e invadir ADN de doble cadena en ausencia de una enzima recombinasa. Por lo tanto, cuando se usa un oligonucleotido de PNA, los metodos de la invencion pueden realizarse sin presencia de una enzima recombinasa.
Se proporcionan en el presente documento ejemplos especfficos de oligonucleotidos de invasion de cadena adecuados para secuencias de nucleotidos diana en los genes tcdA y tcdB de C. difficile. Un oligonucleotido de invasion de cadena preferido para deteccion de la secuencia diana de tcdB de SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 4. Un oligonucleotido de invasion de cadena particularmente preferido es un derivado modificado de SEQ ID NO: 4, mas preferentemente SEQ ID NO: 5. Un oligonucleotido de invasion de cadena preferido para deteccion de la secuencia diana de tcdA de SEQ ID NO: 6 es SEQ ID NO: 9. Un oligonucleotido de invasion de cadena particularmente preferido es un derivado modificado de SEQ ID NO: 9, mas preferentemente SEQ ID NO: 10.
Como se ha analizado anteriormente, el oligonucleotido de invasion de cadena usado en la invencion comprende uno o mas oligonucleotidos modificados en su region 3' para bloquear su uso como un sustrato de polimerasa. Por lo tanto, un derivado modificado de SEQ ID NO: 4 o 9 puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas nucleotidos modificados en su region 3', normalmente en los 10-15 o 10-20 nucleotidos del extremo 3'. Las modificaciones pueden seleccionarse de cualquiera de las analizadas anteriormente. El derivado modificado puede ser un oligomero de PNA de secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 4 o 9.
Ademas de derivados modificados de SEQ ID NO: 4 y 9, pueden usarse oligonucleotidos de invasion de cadena variantes.
Las variantes de SEQ ID NO: 4 y 9 son tfpicamente oligonucleotidos de mas de 30 nucleotidos, mas preferentemente al menos 35, al menos 40 o al menos 45 nucleotidos de longitud, que comprenden una region que es parcial o completamente complementaria de al menos 30 nucleotidos contiguos de la secuencia complementaria de diana original correspondiente en las SEQ ID NO: 4 o 9. Preferentemente, dichas variantes comprenderan una region que es parcial o completamente complementaria de al menos 32, 35, 37, 40, 42 o 45 nucleotidos contiguos de la secuencia complementaria de diana presente en las SEQ ID NO: 4 o 9.
Las variantes anteriores pueden comprender una region que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 desapareamientos (sustituciones) con respecto a la region complementaria de diana correspondiente del oligonucleotido de invasion de cadena original de las SEQ ID NO: 4 o 9 (y por lo tanto la secuencia diana) y por lo tanto es parcialmente complementaria de las mismas. Por lo tanto, por ejemplo, las variantes pueden comprender una region de al menos 30 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2, 3, o 4, tales como 1-4 o 1-3 desapareamientos con una region
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correspondiente de al menos 40 nucleotidos contiguos del oligonucleotido de invasion de cadena original correspondiente. Las variantes pueden comprender una region de al menos 35, 40, 42 o 45 nucleotidos de longitud que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6, tal como 1-5 o 1-3 desapareamientos con una region correspondiente de una longitud equivalente en el oligonucleotido de invasion de cadena original correspondiente. Cualquier desapareamiento en la secuencia de oligonucleotido de invasion de cadena variante puede ser a al menos 2, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 nucleotidos de distancia.
Como alternativa, las variantes pueden comprender una region de al menos 32, 35, 37, 40, 42 o 45 nucleotidos de longitud que es completamente complementaria de la region complementaria de diana del oligonucleotido de invasion de cadena original.
Las variantes de las SEQ ID NO: 4 y 9 tambien pueden ser oligonucleotidos de mas de 30 nucleotidos de longitud que comprenden una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana del oligonucleotido de invasion de cadena original correspondiente, preferentemente al menos 75 %, al menos 80 %, mas preferentemente al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % de identidad de secuencia.
Ademas, los oligonucleotidos de invasion de cadena variantes pueden comprender una secuencia adicional complementaria de la secuencia de nucleotidos 5' o 3' flanqueante del gen tcdA o tcdB con respecto a la region de union del oligonucleotido de invasion de cadena original, tal como 5 -10 o 5-15 nucleotidos de la region 5' flanqueante y/o region 3.
La secuencia restante de los oligonucleotidos de invasion de cadena variantes normalmente no esta relacionada con la secuencia diana y tampoco esta relacionada normalmente con el oligonucleotido de invasion de cadena original.
Los oligonucleotidos de invasion de cadena variantes comprenden ademas uno o mas oligonucleotidos modificados en su region 3' tales como, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas nucleotidos modificados, que pueden estar en los 10-15 o 10-20 nucleotidos del extremo 3'. Las modificaciones pueden seleccionarse de cualquiera de las analizadas anteriormente.
Un oligonucleotido de invasion de cadena de la invencion puede comprender ademas un marcador detectable, por ejemplo un colorante fluorescente.
Amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana
El acido nucleico procedente de la muestra se pone en contacto con los cebadores cadena arriba y cadena abajo y el oligonucleotido de invasion de cadena para fines de deteccion, en condiciones que promueven la amplificacion de la secuencia de acido nucleico diana.
Dichas condiciones comprenden tfpicamente la presencia de una enzima ADN polimerasa. Las condiciones adecuadas incluyen cualquier condicion usada para posibilitar la actividad de enzimas polimerasas conocidas en la tecnica.
Las condiciones tfpicamente incluyen la presencia de los cuatro dNTP, dATP, dTTP, dCTP y dGTP o analogos de los mismos, agentes tamponantes adecuados/pH y otros factores que son necesarios para rendimiento o estabilidad de enzimas. Las condiciones pueden incluir la presencia de detergentes y agentes estabilizantes. La temperatura usada es tfpicamente isotermica, es decir constante durante todo el proceso de amplificacion. La temperatura usada depende tfpicamente de la naturaleza de la enzima polimerasa y otros componentes enzimaticos y tambien refleja la temperatura de hibridacion necesaria para los cebadores y oligonucleotidos de invasion de cadena. Cuando se usa Bsu polimerasa, una temperatura adecuada es de 40 grados centfgrados.
La polimerasa usada tfpicamente tiene actividad de desplazamiento de cadena. La expresion "desplazamiento de cadena" se usa en el presente documento para describir la capacidad de una ADN polimerasa, opcionalmente junto con protefnas accesorias, para desplazar cadenas complementarias al encontrar una region de ADN bicatenario durante sfntesis de ADN. Las ADN polimerasas adecuadas incluyen poll de E. coli, B. subtilis o B. stearothermophilus, y fragmentos funcionales o variantes de los mismos, y ADN polimerasas T4 y T7 y fragmentos funcionales o variantes de los mismos. Una polimerasa preferida es ADN polimerasa Bsu o un fragmento funcional o variante del mismo.
Las condiciones pueden comprender ademas la presencia de una recombinasa. Puede usarse cualquier sistema de recombinasa en el metodo de la invencion. El sistema de recombinasa puede ser de origen procariota o eucariota, y puede ser bacteriano, de levadura, de fago o de mamffero. La recombinasa puede polimerizar en un oligonucleotido monocatenario en la direccion 5'-3' o 3'-5. La recombinasa puede proceder de un fago myoviridae, tal como T4, T2, T6, Rb69, Aeh1, KVP40, fago de Acinetobacter 133, fago de Aeromonas 65, cianofago P-SSM2, cianofago PSSM4, cianofago S-PM2, Rbl4, Rb32, fago de Aeromonas 25, fago de Vibrio nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, fago 31, fago 44RR2.8t, Rb49, fago Rb3 o fago LZ2. En una realizacion preferida, se usa la recombinasa T4 UvsX (Numero de
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referencia: P04529) o una variante funcional o fragmento de la misma. Tambien pueden usarse los sistemas Rad de eucariotas o el sistema recA-Reco de E. coli u otros sistemas procariotas.
Las condiciones pueden comprender ademas la presencia de protefnas accesorias de recombinasa, tales como protefna de union monocatenaria (por ejemplo gp32, numero de referencia P03695) y agente de carga de recombinasa (por ejemplo UvsY, numero de referencia NP_049799.2). En una realizacion preferida, las condiciones comprenden la presencia de las protefnas T4 gp32, UvsX y UvsY.
La recombinasa (tal como UvsX) y, cuando se use, el agente de carga de recombinasa (tal como UvsY) y protefna de union a ADN monocatenario (tal como gp32), pueden ser cada uno protefnas nativas, hfbridas o mutantes de las mismas o diferentes fuentes de fago myoviridae. Una protefna nativa puede ser una variante natural o de tipo silvestre de una protefna.
Las condiciones pueden comprender ademas otros factores usados para potenciar la eficacia de la recombinasa tales como compuestos usados para controlar las interacciones de ADN, por ejemplo prolina, DMSO o agente aglutinante que se sabe que potencian la carga de recombinasas en ADN (Lavery P et. Al JBC 1992, 26713, 93079314; documento WO2008/035205).
Las condiciones pueden comprender tambien la presencia de un sistema de regeneracion de ATP. Los expertos en la materia conocen diversos sistemas de regeneracion de ATP, e incluyen enzimas glucolfticas. Los componentes adecuados de un sistema de regeneracion de ATP pueden incluir una o mas de fosfocreatina, creatina quinasa, mioquinasa, pirofosfatasa, sacarosa y sacarosa fosforilasa. Las condiciones pueden comprender ademas la presencia de ATP.
Tambien pueden incluirse componentes adicionales tales como iones de magnesio, DTT u otros agentes reductores, sales, BSA/PEG u otros agentes aglutinantes.
Los diversos componentes descritos anteriormente, que incluyen los cebadores y el oligonucleotido de invasion de cadena, pueden proporcionarse en diversas concentraciones para posibilitar la amplificacion de ADN. Los expertos en la materia pueden seleccionar concentraciones de trabajo adecuadas de los diversos componentes en la practica.
Deteccion de presencia de ADN amplificado
La presencia de ADN amplificado resultante del contacto de la secuencia de acido nucleico diana con los cebadores y el oligonucleotido de invasion de cadena en condiciones que promueven la amplificacion de ADN puede supervisarse por cualquier medio adecuado.
Uno o ambos de los cebadores, o el oligonucleotido de invasion de cadena pueden incorporar un marcador u otro resto detectable. Puede usarse cualquier marcador o resto detectable. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen radioisotopos o restos fluorescentes y pares de TERF de un fluoroforo y resto aceptor. Como alternativa, o ademas, pueden usarse una o mas sondas que detectan el ADN amplificado, incorporando de nuevo un marcador u otro resto detectable. Las sondas pueden unirse en cualquier localizacion adecuada en el amplicon. Las sondas que detectan diferentes secuencias diana amplificadas pueden senalizar a diferentes longitudes de onda fluorescentes para proporcionar deteccion multiple. Tambien pueden usarse colorantes que se intercalan con ADN amplificado para detectar el ADN amplificado, tales como SYBR green y naranja tiazol.
La deteccion de la senal del ADN amplificado puede realizarse por cualquier sistema adecuado, incluyendo PCR en tiempo real.
Cebadores y oligonucleotidos
La presente divulgacion tambien proporciona los cebadores y oligonucleotidos de invasion de cadena de SEQ ID NO: 2 a 5 y 7 a 10 y variantes de las mismas como productos en sf mismos, y composiciones y formulaciones que comprenden dichos cebadores y oligonucleotidos de invasion de cadena. Los cebadores y opcionalmente el oligonucleotido de invasion de cadena pueden usarse en cualquier metodo de deteccion de C. difficile toxfgeno. Normalmente, el metodo es un metodo de amplificacion de ADN basado en invasion de cadena. Sin embargo, puede usarse cualquier metodo de amplificacion de ADN que permita la deteccion especffica de C. difficile toxfgeno. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo pueden usarse en un metodo de amplificacion de ADN que no requiere uso de un oligonucleotido de invasion de cadena, tal como PCR.
Composiciones y kits
La invencion tambien se refiere a composiciones y kits que comprenden al menos dos oligonucleotidos seleccionados de (a) un cebador cadena arriba, (b) un cebador cadena abajo y (c) un oligonucleotido de invasion de cadena. El cebador cadena arriba, cebador cadena abajo y oligonucleotido de invasion de cadena son como se han descrito anteriormente. La composicion o el kit pueden comprender un cebador cadena arriba y uno cadena abajo,
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un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena, o un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena. Preferentemente, la composicion o el kit comprende un cebador cadena arriba, un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena. La composicion o el kit pueden ser adecuados para la deteccion de C. difficile de acuerdo con el metodo de la invencion, o un metodo de amplificacion de ADN alternativo.
Cuando la composicion o el kit sea adecuado para su uso para la deteccion de la secuencia de acido nucleico diana de la SEQ ID NO: 1 (tcdB), normalmente el cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma, el cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma, y el oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma, y que comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3'. El oligonucleotido de invasion de cadena puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 5.
Cuando la composicion o el kit sea adecuado para su uso para la deteccion de la secuencia de acido nucleico diana de la SEQ ID NO: 6 (tcdA), normalmente el cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma, el cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma, y el oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, y que comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3'. El oligonucleotido de invasion de cadena puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 10.
La composicion o el kit puede proporcionar un primer conjunto de oligonucleotidos que permite la deteccion de la secuencia de acido nucleico diana de la SEQ ID NO: 1 y adicionalmente un segundo conjunto de oligonucleotidos que permite la deteccion de la secuencia de acido nucleico diana de la SEQ ID NO: 6.
La composicion anterior puede ser por ejemplo una solucion, liofilizado, suspension, o una emulsion en un vehfculo oleoso o acuoso.
En el kit anterior, los al menos dos oligonucleotidos pueden proporcionarse como una mezcla, o en recipientes separados. El kit comprende opcionalmente ademas instrucciones para su uso en un metodo de la invencion. El kit puede comprender un medio para la deteccion de ADN amplificado.
El kit o la composicion comprende opcionalmente una o mas sondas que detectan ADN amplificado. El kit o la composicion comprende opcionalmente una o mas de una ADN polimerasa, una recombinasa y protefnas accesorias de recombinasa. Preferentemente, la ADN polimerasa es polimerasa Bsu. Preferentemente, la recombinasa es bacteriofago T4 UvsX, opcionalmente en combinacion con las protefnas accesorias de recombinasa UvsY y gp32. El kit o la composicion pueden comprender ademas dNTP, tampones adecuados y otros factores que son necesarios para la amplificacion de ADN en el metodo de la invencion como se ha descrito anteriormente.
Diagnostico de una infeccion por C. difficile y aplicaciones medicas
La presente invencion es particularmente ventajosa en el entorno medico. Los metodos de deteccion de la invencion proporcionan un ensayo muy especffico para posibilitar la determinacion de si una muestra clfnica contiene una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno. El metodo puede aplicarse a una serie de situaciones de enfermedad asociadas con C. difficile toxfgeno. Ademas, el metodo puede aplicarse para exploracion de vehfculos de C. difficile toxfgeno.
La determinacion de si esta presente o no C. difficile toxfgeno puede ser en el contexto de cualquier enfermedad o dolencia presente o que se sospeche que este presente en un paciente. Dichas enfermedades pueden incluir las provocadas por, ligadas a o empeoradas por la presencia de C. difficile toxfgeno. Por lo tanto, un paciente puede presentar sfntomas que indiquen la presencia de C. difficile toxfgeno, y puede obtenerse una muestra del paciente para determinar la presencia de C. difficile y opcionalmente tambien el toxinotipo del mismo por el metodo descrito anteriormente.
La invencion proporciona por lo tanto un metodo para diagnosticar una infeccion provocada por C. difficile toxfgeno en un sujeto, que comprende determinar la presencia de una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno segun la invencion en una muestra de dicho sujeto. El metodo puede comprender ademas otras etapas de identificacion de la cepa de C. difficile toxfgeno, tal como por cultivo microbiologico de una muestra proporcionada por el sujeto.
Una realizacion particularmente preferida de la invencion es la identificacion de C. difficile toxfgeno presente en pacientes que tienen una infeccion del tracto gastrointestinal, en particular que tienen sfntomas de diarrea.
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La invencion proporciona por lo tanto un metodo de diagnostico para enfermedades gastrointestinales, tales como diarrea que estan provocadas por C. difficile toxfgeno. El metodo de diagnostico puede comprender ademas detectar marcadores de resistencia a antibioticos y marcadores de virulencia. El metodo posibilita una mejora drastica del tratamiento del paciente de enfermedades gastrointestinales ya que permite el tratamiento terapeutico optimo para un paciente dado. Por lo tanto el ensayo reducirfa la duracion de las estancias en el hospital, la frecuencia de readmision y reducirfa costes.
El metodo de diagnostico puede realizarse convenientemente basandose en acido nucleico procedente de una muestra de un paciente, lo que proporciona una indicacion a los especialistas clfnicos de si la enfermedad gastrointestinal se debe a una infeccion por C. difficile toxfgeno. El metodo de diagnostico puede proporcionar tambien una indicacion del toxinotipo y la virulencia de C. difficile y si el C. difficile es resistente a algun antibiotico. Dependiendo del resultado del ensayo puede despues optimizarse el tratamiento medico, por ejemplo mediante el uso de antibioticos.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1 - DISENO DE LOS ENSAYOS DE tcdB Y tcdA DE C. DIFFICILE
El diseno de oligonucleotidos especfficos para la deteccion y amplificacion de genes tcdA y tcdB fue diffcil. Los genes tcdA y tcdB muestran alta homologfa de secuencia no solamente entre sf sino tambien con las otras toxinas clostridiales grandes. El gen de citotoxina de C. sordellii, tcsL, es el homologo mas cercano de tcdB (Popoff, 1987; Green, 1995). Los anticuerpos para tcsL de C. sordellii son reactivos de forma cruzada con toxina B de C. difficile. Por lo tanto, los ensayos de flujo lateral para la deteccion de toxina B de C. difficile habitualmente reaccionan de forma cruzada con tcsL de C. sordellii. El diseno de oligonucleotidos especfficos se complico adicionalmente por la necesidad de un oligonucleotido invasor especffico.
Ademas, el contenido de GC del genoma de C. difficile es bajo (29,1 %) lo que se aplica tambien al gen tcdB, el contenido de GC del cual es 27,4 %. Este contenido de GC bajo tambien hizo el diseno de oligonucleotidos adecuados para amplificacion de ADN diffcil. Los cebadores con contenido de GC bajo tendran una temperatura de fusion (Tm) baja, que desestabiliza la union de oligonucleotidos y da como resultado poca eficacia de amplificacion.
En primer lugar, se seleccionaron regiones adecuadas de los genes tcdA y tcdB para ser diana de deteccion y amplificacion. Se muestran posteriormente regiones diana particulares para tcdB (SEQ ID NO: 1) y tcdA (SEQ iD NO: 6). Las regiones diana se seleccionaron 1) para ser especfficas para C. difficile, es decir para diferir de especies de Clostridium estrechamente homologas, 2) para mostrar buena inclusividad de toxinotipos de C. difficile y 3) tener un mayor contenido de GC que el genoma de C. difficile en promedio.
En segundo lugar, se disenaron oligonucleotidos especfficos para amplificacion de las regiones diana. Se muestran posteriormente oligonucleotidos particulares usados para deteccion y amplificacion del gen tcdB y gen tcdA de C. difficile (SEQ ID NO: 2-5 y 7-10).
Ejemplo 2 - PRUEBA DE ENSAYO DE tcdB
Se usaron oligonucleotidos detectores de tcdB de SEQ ID NO: 2, 3 y 5 para amplificar el gen tcdB de C. difficile mediante amplificacion de ADN de invasion de cadena isotermica a 40 °C. Se uso colorante fluorescente de union a ADN Sybr Green I para deteccion de amplificacion y se midio la fluorescencia con un fluorfmetro o un instrumento de PCR en tiempo real. La mezcla de reaccion contenfa tampon de reaccion (Tris-acetato 10 mM, pH 8, EDTA 0,5 mM, DTT 4 mM, sacarosa 150 mM, BSA 0,1 mg/ml, DMSO 5 %), ATP 2 mM, PEG1000 5 %, sal di(tris) de fosfocreatina 60 mM, dNTP (con dTT reemplazado mediante dUTP), sacarosa fosforilasa 12,5 mU/pl, creatina fosfoquinasa 25 mU/pl, Bsu polimerasa 62,5 mU/pl, bacteriofago T4 UvsX 0,1-0,3 mg/ml, bacteriofago T4 gp32 0,25-0,5 mg/ml, Mg- acetato 10 mM y oligonucleotidos en presencia o ausencia de ADN molde.
Se ensayo la capacidad de los cebadores finales y el oligonucleotido invasor para producir dfmeros de cebadores o autocebado en ausencia de ADN molde (control sin molde, NTC). La capacidad de los oligonucleotidos para detectar y amplificar el ADN diana correcto se ensayo en presencia de ADN genomico (ADNg) de C. difficile BAA-1382. La presencia o ausencia de producto de amplificacion se determino tanto por aumento de la fluorescencia de SybrGreen I (Fig. 1(a)) como por analisis de curva de fusion (Fig. 1(b)).
Los productos de amplificacion se analizaron adicionalmente con un sistema de electroforesis de microchip MultiNA (Fig. 1(c)). El electroferograma de reaccion de amplificacion de tcdB positivo con 10 000 copias (cp) de ADNg de C. difficile como molde mostro la aparicion de un fragmento de ADN con la longitud esperada. Este fragmento no se detecto en la reaccion de control sin molde.
Ejemplo 3. ESPECIFICIDAD PARA C. DIFFICILE
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La especificidad del ensayo de tcdB se comprobo mediante el uso de ADN g de C. sordellii ATCC 9714 como molde en una reaccion como se ha descrito en el Ejemplo 2. El gen de toxina tcsL de C. sordellii es el homologo mas cercano hallado de tcdB. Los resultados se muestran en la Fig. 2(a). La reaccion de tcdB con 10 000 cp de ADNg de C. sordellii como ADN molde no mostro ninguna amplificacion de ADN mientras que 10 000 cp de C. difficile BAA- 1382 (630) mostraron una clara amplificacion medida por el aumento de la intensidad de fluorescencia de SybrGreen I.
Ejemplo 4. SENSIBILIDAD DE DETECCION DE C. DIFFICILE
La sensibilidad del ensayo de tcdB se comprobo con una serie de diluciones de C. difficile BAA-1382 (630) y se midio la amplificacion con fluorescencia de Sybr Green I y se detecto mediante PCR en tiempo real. Los resultados se muestran en la Fig. 2(b). 10 - 10 000 cp/reaccion de ADNg de C. difficile como molde mostro amplificacion positiva mientras que NTC, control negativo y 1 cp/reaccion no se amplificaron. La reaccion de control negativo contenfa una mezcla de ADNg aislado de Enterobacter aerogenes, Citrobacter sp., Shigella sonnei, Shigella flexneri, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae, al menos 1000 cp/reaccion cada uno. NTC=control sin molde.
Ejemplo 5. INCLUSIVIDAD DE DETECCION DE TOXINOTIPOS DE C. DIFFICILE
La inclusividad del ensayo de tcdB se comprobo con toxinotipos de C. difficile 0, III, VIII y X. Se muestran resultados en la Figura 3(A) y (C). Se usaron 2 ng de ADNg/reaccion de cada toxinotipo como molde en la reaccion de tcdB. Todos los toxinotipos ensayados proporcionaron un resultado de amplificacion positivo (Fig. 3A). Ademas, el analisis de curva de fusion indico amplificacion de un unico amplicon especffico (Fig. 3C).
La inclusividad del ensayo de tcdB se comprobo ademas con un panel mayor de 37 toxinotipos de C. difficile 0, I, II, IIIa, IIIb, IIIc, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XIa, XIb, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII; XIX, XX, XXI; XXII; XXIII; XXIV, XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX, XXX, XXXI, XXXII y XXXIII. Los resultados se muestran en la Figura 3(B) y (D). Todos los toxinotipos excepto por XIa y X1b, 35 en total, proporcionaron un resultado de amplificacion positivo (Fig. 3(B), y el analisis de curva de fusion postamplificacion de reacciones de amplificacion positiva mostro amplificacion de un unico amplicon (Fig. 3(C). El analisis de curva de fusion postamplificacion para los toxinotipos XIa y XIb tampoco mostro amplificacion. Se espera la amplificacion negativa para los toxinotipos XIa y XIb ya que estos no producen toxina A ni toxina B (Rupnik et al. 2001). Carecen del gen tcdB completamente pero contienen al menos algunas partes del gen tcdA.
Ejemplo 6. PRUEBA DE ENSAYO DE tcdA SIBA
Se usaron oligonucleotidos de deteccion de tcdA de las SEQ ID NO: 7, 8 y 10 para amplificar el gen tcdA de C. difficile a 40 °C con una mezcla de reaccion como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se ensayo la capacidad de los cebadores finales para producir dfmeros de cebadores o autocebado en ausencia de ADN molde (control sin molde, NTC). La capacidad de los oligonucleotidos para detectar y amplificar el ADN diana correcto se ensayo en presencia de 10 - 10 000 cp/reaccion de ADN genomico (ADNg) de C. difficile BAA-1382. La presencia o ausencia de producto de amplificacion se determino por aumento de la fluorescencia de SybrGreen I (Fig. 4a) y se midio con instrumento de PCR en tiempo real. Se realizo analisis de curvas de fusion para confirmar la amplificacion de amplicon especffico individual (Fig. 4b).
Secuencias de la invencion
SEQ ID NO: 1
AACCAAAGTGGAGTGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGATTTAAATATTTTGCCCCA SEQ ID NO: 2 AACCAAAGT GGAGT GTTACAA SEQ ID NO: 3 T GGGGCAAAAT ATTT A
SEQ ID NO: 4 TCCTCCTGT ACCTCGTT ACAAACAGGT GT ATTT AGTACAGAAGAT GGATTT AAAT A SEQ ID NO: 5
TCCTCCTGTACCTCGTTACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGmAmUmGmGmAmUmUmUmAmAmAmUmA/I nvdT/. mX = 2'-O-metil ARN. invdT = dTTP invertido.
SEQ ID NO: 6 ATGGATAGGT GGAGAAGTCAGTGATATT GCTCTTGAATACATAAAACAATGGGCTGATATTAA SEQ ID NO: 7 AT GGAT AGGT GGAGAAGT C SEQ ID NO: 8 TTAATCTCAGCCCATTG
SEQ ID NO: 9 TCCTCCTGT ACCT CAGAAGT CAGT GAT ATT GCTCTT GAATACATAAAACAAT GG SEQ ID NO: 10
TCCTCCTGTACCTCAGAAGTCAGTGATATTGCTCTTGAATmAmCmAmUmAmAmAmAmCmAmAmUmGmG/Inv dT/. mX = 2'-O-metil ARN. invdT = dTTP invertido.
Referencias
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LISTADO DE SECUENCIAS
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 66 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> REGION DIANA <400> 1
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aaccaaagtg gagtgttaca a 21
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SECUENCIA DE CEBADOR <400> 3
tggggcaaaa tattta 16
<210>4 <211> 56 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDO INVASOR DE CADENA <400> 4
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<210>5 <211> 56 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> OLIGONUCLEOTIDO INVASOR DE CADENA MODIFICADO <220>
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taa 63
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<223> OLIGONUCLEOTIDO INVASOR DE CADENA <220>
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<223> 2'-O-METIL ARN
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Claims (16)

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    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno en una muestra, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador cadena arriba, al menos un cebador cadena abajo y al menos un oligonucleotido de invasion de cadena en condiciones que promueven la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico diana,
    en el que cada uno de dicho cebador y dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende una region complementaria de dicha secuencia de acido nucleico diana;
    en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union de dicho cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo; y en el que dicho cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, en el que dicho cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
  2. 2. Un metodo para detectar una secuencia de acido nucleico diana de C. difficile toxfgeno en una muestra, comprendiendo dicho metodo poner en contacto dicha muestra con al menos un cebador cadena arriba, al menos un cebador cadena abajo y al menos un oligonucleotido de invasion de cadena en condiciones que promueven la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico diana,
    en el que cada uno de dicho cebador y dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende una region complementaria de dicha secuencia de acido nucleico diana;
    en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena hace al menos una parte de la secuencia de acido nucleico diana monocatenaria para permitir la union de dicho cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo; y en el que dicho cebador cadena arriba es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, en el que dicho cebador cadena abajo es un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena es un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9, o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9, y en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
  3. 3. Un metodo segun la reivindicacion 1 en el que la variante del cebador cadena arriba comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, la variante del cebador cadena abajo comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y la variante del oligonucleotido de invasion de cadena que comprende una region complementaria de diana comprende una region complementaria de diana que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4.
  4. 4. Un metodo segun la reivindicacion 2 en el que la variante del cebador cadena arriba comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, la variante del cebador cadena abajo comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la variante del oligonucleotido de invasion de cadena que comprende una region complementaria de diana comprende una region complementaria de diana que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9.
  5. 5. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas poner en contacto dicha muestra con una recombinasa.
  6. 6. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se lleva a cabo en condiciones isotermicas que promueven la amplificacion de dicha secuencia de acido nucleico diana.
  7. 7. Un metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3 o 5 dependiente de la reivindicacion 1, en el que dicho oligonucleotido de invasion de cadena es de la secuencia de la SEQ ID NO: 5.
  8. 8. Un metodo segun la reivindicacion 2 o la reivindicacion 4 o 5 dependiente de la reivindicacion 2, en el que dicho
    5
    10
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    20
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    35
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    45
    50
    oligonucleotido de invasion de cadena es de la secuencia de la SEQ ID NO: 10.
  9. 9. Una composicion que comprende un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ Id NO: 2 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 2; un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4 o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4 y comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
  10. 10. Una composicion que comprende un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 7; un oligonucleotido de menos de 30 nucleotidos de longitud que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 8; y un oligonucleotido de mas de 30 nucleotidos de longitud, en el que dicho oligonucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9 o es una variante que comprende una region complementaria de diana que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9 o que comprende una region complementaria de la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9 y comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados en su region 3' que lo hacen no extensible.
  11. 11. Un kit que comprende tres oligonucleotidos como se define en la reivindicacion 9 o como se define en la reivindicacion 10.
  12. 12. Una composicion o un kit segun la reivindicacion 9 u 11, en el que la variante del cebador cadena arriba comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, la variante del cebador cadena abajo comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 3 y la variante del oligonucleotido de invasion de cadena que comprende una region complementaria de diana comprende una region complementaria de diana que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 4.
  13. 13. Una composicion o un kit segun la reivindicacion 10 u 11, en el que la variante del cebador cadena arriba comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 7, la variante del cebador cadena abajo comprende una secuencia que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia de la SEQ ID NO: 8 y la variante del oligonucleotido de invasion de cadena que comprende una region complementaria de diana comprende una region complementaria de diana que tiene 1, 2, 3 o 4 desapareamientos con la secuencia complementaria de diana de la SEQ ID NO: 9.
  14. 14. Una composicion o un kit segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, que comprende ademas una ADN polimerasa y/o una recombinasa.
  15. 15. Uso de un cebador cadena arriba, un cebador cadena abajo y un oligonucleotido de invasion de cadena, cada uno como se define en la reivindicacion 1 o cada uno como se define en la reivindicacion 2, en un metodo para deteccion de C. difficile toxfgeno.
  16. 16. Un metodo para diagnostico de una infeccion por C. difficile en un sujeto, que comprende llevar a cabo un metodo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en una muestra de dicho sujeto.
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