KR101969516B1 - 선박평형수에 존재하는 장내구균 검출을 위한 pna 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

선박평형수에 존재하는 장내구균 검출을 위한 pna 프로브 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장내구균의 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적인 PNA 프로브 및 이를 이용한 선박평형수 내의 장내구균 검출 방법에 관한 것이다.

Description

선박평형수에 존재하는 장내구균 검출을 위한 PNA 프로브 및 이의 용도{PNA probe for pathogenic enterococcus and its use in ballast water}
본 발명은 선박평형수에 존재하는 장내구균 검출을 위한 PNA 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 장내구균의 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적인 PNA 프로브를 사용하여 장내구균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
국제해사기구(IMO, Internatinal Maritime Organization)는 해양생태계 교란의 주범으로 지적된 선박평형수 문제를 해결하기 위하여 선박평형수 기인 유해생물 이동 저감을 위한 선박평형수 관리협약을 제정하였으며, 협약 비준국이 30개국을 넘고, 비준국의 선복량이 전체의 35%를 넘으면 12개월 후 발효된다는 조건을 충족하여 2017년 9월 8일 선박평형수 관리 협약의 발효를 앞두고 있다. IMO의 D2기준에 따르면 선박평형수 처리장치를 통과한 배출수내 장내구균은 100 ml당 100 cfu 이하로 검출되어야 한다.
한편, PNA(peptide nucleic acid)는 DNA의 생화학적 불안정성을 보완하기 위해 유기합성된 것으로, 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 합성된다. PNA는 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소에 의해 분해되지 않는다. 열과 산에 대한 화학적 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction) 후 만들어진 PCR 산물과 반응시킨 PNA 프로브간의 결합력 차이를 융해온도(Tm, Melting Temperature) 값으로 구분하여 분석할 수 있는데, 원하는 Tm 값을 가지는 프로브를 설계하기 위해 PNA 프로브의 길이를 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 설계가 가능하다.
이에 따라, 본원에서는 선박평형수 관리 협약의 발효를 대비하여, 검출감도 및 특이성이 우수하고 안정성이 높은 장내구균 PNA 프로브를 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 주된 목적은 장내구균의 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적인 PNA 프로브 및 이를 이용한 선박평형수 내의 장내구균 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5 중 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 선박평형수 장내구균 검출용 PNA 프로브를 제공한다. 이러한 염기서열은 선박평형수에 포함된 장내구균을 검출하는데 가장 효과적이다. 이러한 염기서열은 선박평형수에 포함된 장내구균을 검출하는데 가장 효과적이다. 본 발명자들은 장내구균의 대표종인 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 과 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)을 선택하였다. 장내구균의 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)은 세균세포벽 펩티도글리칸의 전구체 합성에서 2D-알라닌＋ATP→D-알라닐-D-알라닌＋ADP＋인산의 반응을 촉매한다. 상기 ddl은 프로브를 디자인 하기에 사이즈가 적당하고, 쉽게 변이될 수 있기 때문에 장내구균의 감염성에 영향을 미치는 인자이다. 선박평형수는 해양오염을 막기 위해 장내구균의 유무와 그 감염요소를 확인할 필요가 있다. 또한 지속적으로 선박평형수의 장내구균 검출이 이루어져야 하는 바, 화학적·물리학적 및 생물학적 안정성이 탁월해 산업적으로 유용한 PNA를 이용하였다. 따라서, 본 발명은 선박평형수 관리협약에 의해 파생되는 산업과 연구에 유용하게 사용될 것이다.
서열번호 5의 염기서열을 포함하는 선박평형수 장내구균 검출용 PNA 프로브가 더 바람직하다. 실제 후술하는 실험결과, 서열번호 3 내지 5 중에서 서열번호 5가 가장 우수했다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule)을 추가로 포함하는 것일 수 있다. PNA의 어닐링(annealing) 여부를 가시화시키는 방법으로 상기 리포터 물질과 상기 소광물질을 이용할 수 있으며, 상보적인 DNA 염기서열이 있는 경우 형광신호가 나오게 된다. 여기서, 상기 리포터 물질은 FAM(6-carboxyfluorescein), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서, 상기 소광물질은 답실(Dabcyl), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 이클립스 딥 다크 퀸처(DDQ), QSY, 블랙베리, 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ) 및 IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 일실시예에 있어서, 리포터 물질을 FAM로 사용하고, 소광물질로는 Dabcyl을 사용하는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ddl의 검출한계는 10-4 내지 10-1 cfu/㎕ 농도인 것일 수 있다. 바람직하게는, 10-4 cfu/㎕ 농도인것 일 수 있다. 선박평형수 관리협약에 따르면, 배출수 내 장내구균은 100 ml당 100 cfu 이하로 검출되어야 한다. 상기 검출한계는 이를 커버할 수 있는 범위이며, 검출감도가 높다.
또한, 본 발명은 (a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; (c) 상기 PCR 증폭 산물에 상기에 따른 PNA 프로브를 가하여 real-time PCR을 시키는 단계; (d) 온도를 변화시키면서 상기 real-time PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (e) 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 장내구균을 검출하는 단계; 를 포함하는 선박평형수 장내구균 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 서열번호 6 내지 서열번호 9로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 수행하는 것일 수 있다. 상기 프라이머 세트를 이용할 경우, PCR 증폭되는 산물이 특이적이며 증폭시간을 단축할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 프로브가 어닐링할 단일 가닥을 양산하기 위해서 비대칭 PCR시 역방향 프라이머를 정방향 프라이머에 비해 5 내지 10배, 보다 바람직하게는 5배 더 넣어 줄 수 있다. 이로 인해 역방향 프라이머로부터 생산되는 단일가닥이 많아진다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 융해곡선을 얻는 단계는 온도를 증가시키면서 형광세기를 측정하여, 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광세기의 측정은 37℃ 내지 80℃로 온도를 증가시키며 형광을 측정하는 것일 수 있다. 초당 0.1℃ 씩 증가시키면서 형광의 세기를 측정하면, 온도가 올라감에 따라 검출 프로브와 상보적인 DNA가 분리된다. 이에 따라, 형광이 소광되어 형광세기가 떨어지게 되고, 멜팅 피크(melting peak)를 확인할 수 있다. 이를 통해 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브를 포함하는 선박평형수 병원성 장내구균 검출용 키트를 제공한다. 키트는 버퍼, DNA 중합효소와 같은 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면 장내구균의 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적인 PNA 프로브를 이용하여 선박평형수에 존재하는 장내구균의 유전자를 정확하게 검출할 수 있다. PNA 프로브는 안전성이 높고, 검출의 감도 및 특이성이 우수하므로, 보다 효과적으로 선박평형수의 검역에 활용될 수 있다.
도 1은 ddl 유전자가 삽입된 pBHA 벡터의 모식도이다.
도 2는 장내구균 ddl 유전자 검출을 위해 사용된 정방향과 역방향 프라이머 조합의 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 SYBR을 이용한 실시간 PCR법의 장내구균 ddl 유전자의 검출한계를 나타내는 그래프이다.
도 4는 PNA 프로브를 이용한 비대칭 PCR 수행 후 융해곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5는 PNA 프로브를 이용한 장내구균 ddl 유전자 비대칭 PCR의 검출한계를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 장내구균 ddl 유전자 염기서열 선별
NCBI 데이터베이스에 등록된 장내구균(E. faecium, E. faecalis) 에 대해 각각8종의 ddl 유전자 염기서열을 비교분석하였다. ddl 유전자 염기서열 중 487bp를 최종 선정하여 (주)바이오니아에 유전자 합성을 의뢰하였다(서열번호 1 및 서열번호2).
장내구균의 ddl 유전자 염기서열 선별
구분 명칭 (서열번호) 염기서열 크기 (mer)
Enterococcus faecalis 균의 ddl 유전자 염기서열 ddl (서열번호 1) AAATTTATGAAGAAGAAGCGATTGTTTTCCCTGTTTTACATGGGCCAAATGGTGAAGATGGAACAATTCAAGGATTCATGGAAACCATTAATATGCCTTATGTAGGCGCGGGTGTCTTAGCTAGCGTTAACGCAATGGACAAAATCATGACGAAATATCTTTTACAAACTGTTGGCATTCCACAAGTACCATTCGTGCCAGTTTTAAGAAGTGACTGGAAAGGAAATCCAAAAGAAGTCTTTGAAAAATGTGAAGGTTCTTTAATTTATCCGGTCTTTGTTAAACCTGCCAATATGGGTTCTAGTGTCGGAATTAGCAAAGTGGAAAATCGTGAAGAATTGCAAGAAGCATTGGAAGAAGCTTTCCGTTATGATGCCCGAGCAATTGTTGAACAAGGGATCGAAGCACGTGAAATTGAAGTAGCCATTTTAGGAAATGAAGATGTCCGTACGACTTTACCTGGTGAAGTGGTGAAAGATGTCGCTTT 487
Enterococcus faecium 균의 ddl 유전자 염기서열 ddl (서열번호 2) AAATCAAAGAAGAAGGAGCCATCGTTTTTCCAGTTTTACATGGGCCAAACGGGGAAGATGGAACGATCCAAGGCTTCTTAGAGACATTGAATATGCCTTATGTCGGCGCAGGCGTATTGACCAGTGCATGTGCCATGGATAAAATCATGACCAAGTATATTTTACAAGCTGCTGGTGTGCCGCAAGTTCCTTATGTACCAGTACTTAAGAATCAATGGAAAGAAAATCCTAAAAAAGTATTTGATCAATGTGAAGGTTCTTTGCTTTATCCGATGTTTGTCAAACCGGCGAATATGGGTTCTAGTGTCGGCATTACAAAAGCAGAAAACCGAGAAGAGCTGCAAAATGCTTTAGCAACAGCCTATCAGTATGATTCTCGAGCAATCGTTGAACAAGGAATTGAAGCGCGCGAAATCGAAGTTGCTGTATTAGGAAATGAAGACGTTCGGACGACTTTGCCTGGTGAAGTCGTAAAAGACGTAGCATT 487
합성한 유전자가 pBHA 벡터에 제대로 삽입되어 있는지를 EcoRI 제한효소 절단과 시퀀싱을 통해 확인한 후, 장내구균 검출용 프라이머와 프로브 선별 실험의 주형으로 사용하였다(도 1).
실시예 2. 장내구균 ddl 유전자 검출용 프라이머 선별 및 검출한계 분석
장내구균 ddl 유전자 검출에 사용할 부위를 포함하여 디자인된 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었다. 정방향 및 역방향 프라이머의 조합에 따라 유전자 합성 크기가 157-330 bp의 크기로 다양하게 증폭될 수 있도록 하였으며, conventional PCR로 다양한 크기의 PCR 산물을 합성할 수 있는 동일한 실험 조건을 선별하였다. 각 프라이머의 서열, 조합 및 그에 따른 PCR 산물의 크기는 표 2에 나타내었고, 최적의 PCR 조성물과 반응시간 및 반응온도는 표 4, 5와 같으며, PCR 산물은 2% 아가로스 젤을 이용한 전기영동으로 확인하였다. (도 2) 실시간 PCR을 통해서 정방향 프라이머 F1, F2, F3, F4, F5와 역방향 프라이머 R1, R2, R3, R4, R5를 조합한 실시간 PCR을 수행하여 장내구균 2종에 대해서 각각 F3(서열번호 6)/R3(서열번호 7), F4(서열번호 9)/R4(서열번호 8) 조합을 선별하였다.
장내구균 종특이적 유전자 ddl 검출을 위한 프라이머 서열
종 구분 명칭 염기서열 크기 (mer)
E.faecium ddl 정방향 프라이머 ddl F1 CTTATGTCGGCGCAGGCGTA 20
ddl F2 CGATTTCGCGCGCTTCAATT 20
ddl F3 (서열번호 6) CCGATGTTTGTCAAACCGGC 20
ddl F4 CAGCAACTTCGATTTCGCGC 20
ddl F5 ATTGACCAGTGCATGTGCCA 20
ddl 역방향 프라이머 ddl R1 CGAGAATCATACTGATAGGC 20
ddl R2 GGCGTATTGACCAGTGCATG 20
ddl R3 (서열번호 7) ATTTCGCGCGCTTCAATTCC 20
ddl R4 ATGTCGGCGCAGGCGTATTG 20
ddl R5 ACGATTGCTCGAGAATCATA 20
E.faecalis ddl 정방향 프라이머 ddl F1 CTTATGTAGGCGCGGGTGTC 20
ddl F2 CAATTTCACGTGCTTCGATC 20
ddl F3 CCGGTCTTTGTTAAACCTGC 20
ddl F4 (서열번호 9) ATGTAGGCGCGGGTGTCTTA 20
ddl F5 CTTAGCTAGCGTTAACGCAA 20
ddl 역방향 프라이머 ddl R1 CGGGCATCATAACGGAAAGC 20
ddl R2 GGTGTCTTAGCTAGCGTTAA 20
ddl R3 ATTTCACGTGCTTCGATCCC 20
ddl R4 (서열번호 8) TGGCTACTTCAATTTCACGT 20
ddl R5 ACAATTGCTCGGGCATCATA 20
프라이머 조합 및 그에 따른 PCR 산물 크기
프라이머 조합 PCR 산물 크기 (bp)
ddl F1 / ddl R1 321
ddl F2 / ddl R2 157
ddl F3 / ddl R3 264
ddl F4 / ddl R4 305
ddl F5 / ddl R5 289
ddl F1 / ddl R2 330
conventional PCR의 조성물
조성 용량 (μl)
주형 (template) 1
정방향 프라이머 1
역방향 프라이머 1
10X PCR buffer 2
dNTP mix 2
Taq polymerase 0.5
증류수 up to 20
conventional PCR의 반응시간 및 반응온도
Pre-denaturation 95℃ 10 min
Amplification Denaturation 95℃ 30 sec 35 cycles
Annealing 60℃ 30 sec
Extension 72℃ 30 sec
Final-Extension 72℃ 10 min
Conventional PCR을 통해 선별한 F3/R3, F4/F4 프라이머 조합으로 SYBR을 이용한 실시간 qPCR (Real-time PCR)을 수행하여 장내구균 종특이적 유전자의 검출한계를 분석하였다. SYBR을 이용한 실시간 PCR의 조성물과 반응조건은 표 6, 7에 나타내었다. 실험결과 장내구균 종특이적 유전자 ddl의 검출한계는 각각 1x103, 1x101 copies/ml 이었다 (도 3).
SYBR을 이용한 실시간 PCR의 조성물
조성 용량 (μl)
주형 (template) 1
정방향 프라이머 (5pM) 1
역방향 프라이머 (5pM) 1
2X SYBR qPCR mix 10
증류수 up to 20
SYBR을 이용한 PCR의 반응시간 및 반응온도
Pre-denaturation 95℃ 5 min
Amplification Denaturation 95℃ 10 sec 45 cycles
Annealing 60℃ 30 sec
Melting 60℃ to 97℃ at 0.1℃/sec
실시예 3. 장내구균 ddl 유전자 검출용 프로브의 선별
장내구균 종특적 유전자 ddl 검출을 위한 PNA 프로브는 융해온도(Tm) 최적화를 위해 PNA 프로브와 ddl 유전자 염기서열의 상보적인 결합이 일어날 수 있도록 설계하여 제작하였고, PNA 프로브 서열은 표 8에 나타내었다. 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브는 (주)파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였으며, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다.
장내구균 ddl 유전자 검출을 위한 PNA 프로브 서열
구분 명칭 염기서열 Tm(℃)
PNA 프로브의
염기서열		 ddl 1 (서열번호 3) GTTCTAGTGTCG 49.1
ddl 2 (서열번호 4) GGGTTCTAGTGT 55.6
ddl 3 (서열번호 5) TGGGTTCTAGTGTC 61.3
PNA 프로브의 구조 ddl PNA1 Dabcyl-GTTCTAGTGTCG-O-K(FAM)
ddl PNA2 Dabcyl-GGGTTCTAGTGT-O-K(FAM)
ddl PNA3 Dabcyl-TGGGTTCTAGTGTC-O-K(FAM)
실시예 4. 장내구균 종특이적 ddl 유전자 검출을 위한 PCR 및 융해곡선 분석
상기 실시예 2에서 선별한 프라이머 세트(F3/R3, F4/F4)와 PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석을 위한 PCR은 MyGo mini real-time PCR (IT-IS Life Science Ltd. 아일랜드)를 사용하였으며, 모든 실험 조건은 단일 가닥 표적핵산을 생성하기 위해 선별된 프라이머 세트와 PNA 프로브를 이용하여 비대칭 PCR (asymmetric PCR)를 수행하였다. 장내구균 종특이적 유전자 ddl가 정확하게 증폭되도록 하기 위해 비대칭 PCR 반응은 표 9와 같은 조성으로 수행하였다. 비대칭 PCR 수행시 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 농도비율은 1:5로 결정하였다. 비대칭 PCR은 95℃에서 10분간 변성시킨 다음, 95℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 15초 동안 반응시켰다(표 10).
PNA 프로브 비대칭 PCR의 조건
조성 용량 (μl)
주형 (template) 1
PNA 프로브 1
정방향 프라이머 (4pM) 1
역방향 프라이머 (20pM) 1
2.5X PCR buffer 9
Taq polymerase 1
증류수 up to 25
PNA 프로브 비대칭 PCR의 조건
Pre-denaturation 95℃ 10 min
Amplification Denaturation 95℃ 10 sec 45 cycles
PNA annealing 60℃ 30 sec
Extension 72℃ 15 sec
Pre-melt Hold 95℃ 5 min
37℃ 5 min
Melting 37℃ to 80℃ at 0.1℃/sec
융해곡선 분석은 비대칭 PCR 반응 후 95℃에서 5분, 37℃에서 5분 변성시킨 후 37℃에서 80℃까지 초당 0.1씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다 (표 9). 비대칭 PCR 반응 후 융해곡선을 분석한 결과 서로 다른 Tm값을 가지는 ddl PNA 1, 2, 3 프로브는 각각의 온도에서 melting peak을 나타냈다 (도 4). 결과에 따라, 높은 Tm값을 나타내는 ddl PNA 3 프로브를 선별하였다.
실시예 5. 장내구균의 ddl 유전자 특이적 PNA 프로브 실시간 PCR의 검출한계 분석
IMO D2 기준에 부합한 cfu 단위의 검출한계를 분석하기 위해 선별된 프로브 중에서 가장 높은 Tm값을 나타내는 ddl PNA 3 프로브를 이용하여 표 9와 같은 실험 조건으로 장내구균 콜로니에 대해 비대칭 PCR을 수행한 결과 장내구균 종특이적 유전자 ddl의 검출한계는 1x10-4 cfu/㎕ (10 cfu/100ml)이었다(도 5).
<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> PNA probe for pathogenic enterococcus and its use in ballast water <130> PA-D16559 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 487 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 1 aaatttatga agaagaagcg attgttttcc ctgttttaca tgggccaaat ggtgaagatg 60 gaacaattca aggattcatg gaaaccatta atatgcctta tgtaggcgcg ggtgtcttag 120 ctagcgttaa cgcaatggac aaaatcatga cgaaatatct tttacaaact gttggcattc 180 cacaagtacc attcgtgcca gttttaagaa gtgactggaa aggaaatcca aaagaagtct 240 ttgaaaaatg tgaaggttct ttaatttatc cggtctttgt taaacctgcc aatatgggtt 300 ctagtgtcgg aattagcaaa gtggaaaatc gtgaagaatt gcaagaagca ttggaagaag 360 ctttccgtta tgatgcccga gcaattgttg aacaagggat cgaagcacgt gaaattgaag 420 tagccatttt aggaaatgaa gatgtccgta cgactttacc tggtgaagtg gtgaaagatg 480 tcgcttt 487 <210> 2 <211> 487 <212> DNA <213> Enterococcus faecium <400> 2 aaatcaaaga agaaggagcc atcgtttttc cagttttaca tgggccaaac ggggaagatg 60 gaacgatcca aggcttctta gagacattga atatgcctta tgtcggcgca ggcgtattga 120 ccagtgcatg tgccatggat aaaatcatga ccaagtatat tttacaagct gctggtgtgc 180 cgcaagttcc ttatgtacca gtacttaaga atcaatggaa agaaaatcct aaaaaagtat 240 ttgatcaatg tgaaggttct ttgctttatc cgatgtttgt caaaccggcg aatatgggtt 300 ctagtgtcgg cattacaaaa gcagaaaacc gagaagagct gcaaaatgct ttagcaacag 360 cctatcagta tgattctcga gcaatcgttg aacaaggaat tgaagcgcgc gaaatcgaag 420 ttgctgtatt aggaaatgaa gacgttcgga cgactttgcc tggtgaagtc gtaaaagacg 480 tagcatt 487 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus ddl PNA probe 1 <400> 3 gttctagtgt cg 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus ddl PNA probe 2 <400> 4 gggttctagt gt 12 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus ddl PNA probe 3 <400> 5 tgggttctag tgtc 14 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Enterococcus faecium ddl <400> 6 ccgatgtttg tcaaaccggc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Enterococcus faecium ddl <400> 7 atttcgcgcg cttcaattcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Enterococcus faecalis ddl <400> 8 tggctacttc aatttcacgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Enterococcus faecalis ddl <400> 9 atgtaggcgc gggtgtctta 20

Claims (13)

  1. 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적이고, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 검출하는, 선박평형수의 장내구균 검출용 PNA 프로브.
  2. 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적이고, 서열번호 4의 염기서열로 이루어지며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 검출하는, 선박평형수의 장내구균 검출용 PNA 프로브.
  3. 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적이고, 서열번호 5의 염기서열로 이루어지며, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 검출하는, 선박평형수의 장내구균 검출용 PNA 프로브.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    (c) 상기 PCR 증폭 산물에 PNA 프로브를 가하여 real-time PCR을 시키는 단계;
    (d) 온도를 변화시키면서 상기 real-time PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (e) 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 장내구균을 검출하는 단계;를 포함하며,
    상기 PNA 프로브는 유전자 ddl(D-Alanine-D-Alanine ligase)에 특이적이고, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것과,
    상기 장내구균은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)인 것을 특징으로 하는, 선박평형수의 장내구균 검출 방법.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 단계(b)의 PCR은 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 비대칭 PCR은 역방향 프라이머를 정방향 프라이머에 비해 5 내지 10배 더 넣어 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 융해곡선을 얻는 단계는 온도를 증가시키면서 형광세기를 측정하여, 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 형광세기의 측정은 37℃ 내지 80℃로 온도를 증가시키며 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제3항에 따른 프로브를 포함하고, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)를 검출하는 선박평형수의 장내구균 검출용 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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