KR20150005895A

KR20150005895A - 형광표지물질 및 이동성 표지자를 사용한 효율적인 다중 pcr 방법

Info

Publication number: KR20150005895A
Application number: KR1020140187998A
Authority: KR
Inventors: 문해란
Original assignee: (주)에스엘에스
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2015-01-15

Abstract

본 발명은 형광표지물질 및 이동성 표지자를 사용한 효율적인 다중 PCR 방법에 관한 것으로, 구체적으로 하나의 반응액에서 표적이 다른 둘 이상의 PCR을 시도하기 위해 둘 이상의 프라이머 세트를 사용하며, 각 프라이머 세트에 속하는 하나 이상의 프라이머를 각 프라이머 세트에 따라 다른 표지물질로 표지함으로써 표적에 따른 PCR 증폭산물을 구분하는 다중 PCR에 있어서, 프라이머 세트에 따른 표지물질의 조합으로 6-FAM, JOE, ALEXA 546 및 ALEXA 568로 이루어진 조합을 사용하는 것을 특징으로 하는 다중 PCR 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 4가지 이상 다수의 표적에 대한 다중 PCR에서도 각 표적에 대한 PCR 증폭산물을 명확하게 식별할 수 있어, 유전자 검사, 샘플 내의 생물체 동정, 미생물 또는 바이러스의 감염 여부 진단과 같이 다수의 표적 DNA 또는 RNA의 존재여부 확인이 필요한 경우, 빠르고 간편한 방법으로 정확한 결과를 확인할 수 있다. 특히, 짧은 반복 서열을 표적으로 하는 경우에도 효과적으로 증폭여부를 확인할 수 있다.

Description

형광표지물질 및 이동성 표지자를 사용한 효율적인 다중 PCR 방법{Efficient Multiplex PCR method using fluorescent markers and mobility markers}

본 발명은 형광표지물질 및 이동성 표지자를 사용한 효율적인 다중 PCR 방법에 관한 것으로, 구체적으로 프라이머를 표지물질로 표지함으로써 PCR 반응으로 생성된 증폭산물을 표지물질로 식별하는 방법을 사용하며, 하나의 표적에는 한 종류의 표지물질 만을 사용하고, 한 표적의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 표지물질로 표지하며, 표지물질로 6-FAM, JOE, ALEXA 546 및 ALEXA 568을 사용하는 것을 특징으로 하는 다중 PCR 방법에 관한 것이다.

다중 PCR(중합효소연쇄반응, polymerase chain reaction)은 한 번의 반응을 통해 여러 표적 DNA 혹은 RNA를 동시에 증폭할 수 있는 방법으로 다른 방법에 비해 비교적 빠르고 간편하게 수행할 수 있으므로 주로 유전자 검사, 샘플 내의 생물체 동정, 미생물 또는 바이러스의 감염 여부를 진단하기 위해 사용된다.

다중 PCR 방법에서 가장 보편적으로 사용하는 방법은 표적에 따라 PCR 증폭산물의 크기가 다르게 나타나도록 프라이머를 설계함으로써 증폭산물의 크기를 분석하여 해당 표적의 증폭여부를 구분하는 방법인데, 이 경우 한 번에 증폭시킬 수 있는 유전자의 수가 일반적으로 3 ~ 4개에 불과하다. 이는 프라이머들 서로 간의 경쟁이나 간섭효과 때문이기도 하지만, 일반적인 DNA 중합효소가 1kb 이내의 중합에서 최적의 증폭효율을 보이므로 이 범위 내에서 증폭산물의 크기를 구분할 수 있도록 하기 위해서는 그 선택범위가 매우 한정적이며, 프라이머들 간의 최적의 온도조건, 반응 물질들의 농도 등을 고려했을 때 원하는 유전자 증폭산물의 크기가 겹치는 경우가 발생하기 때문이다.

유전자 검사나 미생물 또는 바이러스 감염 진단을 위해서는 대부분 많은 수의 표적을 대상으로 하여 PCR을 수행하여야 하는데, 한 번의 PCR 반응을 통해 적은 수의 표적만을 식별할 수 밖에 없다면 표적을 바꾸면서 수차례 반복하여 PCR을 수행하여야 하기 때문에 시간과 비용, 인력 등이 많이 소요되는 문제가 있다. 특히 감염 진단의 경우에는 결과를 신속하게 확인하여야 하기 때문에 이는 매우 큰 단점이 될 수 있다.

이를 해결하기 위해 은염색이나, 방사성, 색소 등을 이용하여 다중 PCR의 표적 수를 확대하고자 하는 방법(대한민국 등록특허 제10-0277289호)이 있으나, 이러한 방법들은 일반적인 아가로즈 전기영동에 비해 결과분석에 많은 시간과 숙련성이 요구되고, 실질적으로 표적 수를 증가시키고자 하는 면에서는 크게 개선되지는 못하는 실정이다.

또한, 특히 짧은 반복 서열(STR, short tandem repeat)을 표적으로 하여 다중 PCR을 실시하는 경우, PCR 증폭산물이 단일크기로만 생성되는 것이 아니라 다양한 크기로 생성되기 때문에 각 표적에 따른 증폭여부를 확인하는 것이 매우 어려워진다.

이에 본 발명자는 다중 PCR을 수행하는데 있어서 보다 쉽고 빠르며 효율적인 방법을 통해 각 PCR 증폭산물을 보다 명확하게 구분할 수 있도록 함으로써 한 번에 많은 표적을 대상으로 다중 PCR을 수행할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다.

이의 결과, 기존에 DNA, RNA 또는 단백질 등의 표지를 위해 사용되는 형광물질을 프라이머에 적용하되, 표적에 따른 프라이머에 적용하는 각 형광물질로 6-FAM, JOE, ALEXA 546, ALEXA 568을 사용하여 다중 PCR을 수행하면 PCR 산물의 크기가 동일하거나 유사하더라도 적어도 4종류의 표적 증폭을 명확하게 구분할 수 있으며, 여기에 이동성 표지자 즉 PCR 산물의 분자량을 조절할 수 있고 PCR 반응에는 거의 영향을 미치지 않는 헥사 에틸렌 옥사이드를 프라이머와 형광물질의 링커로 적용하는 경우 보다 많은 종류의 표적 증폭을 명확하게 식별할 수 있고, 특히 이러한 방법을 짧은 반복 서열을 표적으로 하는 다중 PCR에 도입하는 경우 기존의 다른 방법에 비해 매우 효율적으로 증폭 여부를 식별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-0277289호

따라서 본 발명의 주된 목적은 한 번에 많은 종류의 표적을 대상으로 다중 PCR을 수행하여 이 결과를 명확하게 분석하기 위한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이를 위해 프라이머에 표지하는 형광물질의 조합 중 최적의 조합을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하나의 반응액에서 표적이 다른 둘 이상의 PCR을 시도하는 다중 PCR에 있어서, 프라이머를 표지물질로 표지함으로써 PCR 반응으로 생성된 증폭산물을 표지물질로 식별하는 방법을 사용하며, 하나의 표적에는 한 종류의 표지물질 만을 사용하고, 한 표적의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 표지물질로 표지하며,

상기 표지물질로

화학식 1의 6-카르복시플루오레신(6-carboxyfluorescein);

화학식 2의 6-카르복시-2',7'-디메톡시-4', 5'-디클로로플루오레신(6-carboxy-2',7'-dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein);

화학식 3의 6-[2-카르복시-5-[[2-[(5-카르복시펜틸)아미노]-2-옥소에틸]티오]-3,4,6-트리클로로페닐]-1,2,3,4,8,9,10,11-옥타히드로-2,2,4,8,10,10-헥사메틸-12,14-디술포-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-13-이움{6-[2-carboxy-5-[[2-[(5-carboxypentyl)amino]-2-oxoethyl]thio]-3,4,6-trichlorophenyl]-1,2,3,4,8,9,10,11-octahydro-2,2,4,8,10,10-hexamethyl-12,14-disulfo-Pyrano[3,2-g:5,6-g]diquinolin-13-ium}; 및

화학식 4의 [1,10-디히드로-2,2,10,10-테트라메틸-4,8-비스(술포메틸)-2H-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-6-일]-벤젠디카르복실산{[1,10-dihydro-2,2,10,10-tetramethyl-4,8-bis(sulfomethyl)-2H-pyrano[3,2-g:5,6-g]diquinolin-6-yl]-Benzenedicarboxylic acid};을 모두 사용하는 것을 특징으로 하는 다중 PCR 방법을 제공한다.

< 화학식 1 >

< 화학식 2 >

< 화학식 3 >

< 화학식 4 >

본 발명의 다중 PCR 방법에 있어서, 하나의 표지물질을 둘 이상의 표적에 사용하는 경우, 프라이머와 표지물질 사이에 링커를 포함시켜 PCR 증폭산물의 분자량을 조절하며, 이때 링커로 헥사 에틸렌 옥사이드를 사용하는 것이 바람직하다. 헥사 에틸렌 옥사이드를 하나의 단위체로 하여 이 단위체가 1개 또는 2개 이상 반복되도록 구성하여 PCR 산물의 분자량을 조절할 수 있다. 헥사 에틸렌 옥사이드의 단위체 당 약 2.5bp의 DNA에 상응하는 분자량 차이를 나타낸다.

상기 화학식 1의 표지물질은 6-FAM, 화학식 2의 표지물질은 JOE, 화학식 3의 표지물질은 ALEXA 546, 화학식 4의 표지물질은 ALEXA 568의 이름으로도 알려져 있으며 관련 제조사에 의해 제조 및 판매되고 있다. 이들 각 표지물질을 프라이머에 표지하는 방법은 공지의 기술이며, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 제조사에서 제공하는 메뉴얼 등을 통해 용이하게 실시할 수 있으므로 자세한 설명은 생략하기로 한다.

표적 DNA 또는 RNA를 증폭하기 위해서는 통상 서열이 다른 2종류의 프라이머를 사용하는데, 표적이 PCR을 통해 증폭되면 프라이머가 증폭산물에 포함되기 때문에, 2개의 프라이머 중 하나의 프라이머에만 표지를 하여도 최종 증폭산물에 표지가 된다. 따라서 표적 당 하나의 프라이머에만 표지를 하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 2개의 프라이머 모두에 표지를 하여 사용할 수도 있다.

다중 PCR은 다수의 표적을 대상으로 하기 때문에, 4가지 또는 그 이상의 서로 다른 표적을 대상으로 하는 경우가 많다. 표적이 4가지일 경우, 각 표적에 해당하는 프라이머에 각각 6-FAM, JOE, ALEXA 546, ALEXA 568를 표지하면 되는데, 표적이 이보다 많을 경우에는 4가지 그룹으로 나누어 여기에 해당하는 프라이머를 각각의 표지물질로 표지할 수 있다.

이 경우 같은 그룹에 속하는 표적이 증폭되면 증폭산물이 같은 표지물질로 표지된 상태가 되어 표지물질의 식별만으로는 해당표적의 증폭여부를 확실하게 구분하기 어렵기 때문에(도 5 참조), 증폭산물의 크기를 달리하는 방법 등 별도의 증폭산물 구분방법을 사용하여 증폭여부가 구분되도록 할 수 있다. 이를 위해 증폭산물의 크기를 달리하기 위하여 표적부위를 보다 좁거나 넓게 설정하여 프라이머를 제작하는 방법을 사용할 수 있으나, 프라이머의 서열을 변경해야 하고 성공적인 PCR의 조건 등 고려해야할 것이 많기 때문에 제약이 따른다. 따라서 본 발명에서는 이 경우 프라이머와 표지물질 사이에 링커(이동성 표지자)를 포함시키는 것이 바람직하다. 이때 링커는 증폭산물의 전기영동 시 이동성을 다르게 하기 위해 사용되는 것으로, 본 발명에서는 이 링커로써 헥사 에틸렌 옥사이드를 사용하는 것이 바람직하다. 이 헥사 에틸렌 옥사이드 하나의 분자는 약 2.5bp DNA의 이동성과 같기 때문에 프라이머에 포함시키는 헥사 에틸렌 옥사이드 분자의 개수를 조절함으로써 증폭산물의 크기를 조절할 수 있으며, 최종 증폭산물의 이동성 또한 예측할 수 있게 된다(도 5 참조).

본 발명의 다중 PCR 방법을 수행하기 위한 프라이머는 도 6과 같은 형태로 제조할 수 있다. 이때 도 6은 프라이머에 형광표지물질이 표지되고 링커가 포함된 형태이다.

다중 PCR 중에서도 특히 짧은 반복 서열(STR, short tandem repeat)을 표적으로 하는 경우, PCR 증폭산물이 단일크기로만 생성되는 것이 아니라 다양한 크기로 생성되기 때문에 표적이 둘 이상이면 각 증폭산물의 식별 범위가 겹쳐져 구분이 어려운 경우가 많은데, 이때 본 발명의 다중 PCR 방법을 사용하면 다수의 STR을 표적으로 하더라도 각 STR의 증폭여부를 명확하게 구분할 수 있게 된다.

본 발명에 따르면 4가지 이상 다수의 표적에 대한 다중 PCR에서도 각 표적에 대한 PCR 증폭산물을 명확하게 식별할 수 있어, 유전자 검사, 샘플 내의 생물체 동정, 미생물 또는 바이러스의 감염 여부 진단과 같이 다수의 표적 DNA 또는 RNA의 존재여부 확인이 필요한 경우, 빠르고 간편한 방법으로 정확한 결과를 확인할 수 있다. 특히, 짧은 반복 서열을 표적으로 하는 경우에도 효과적으로 증폭여부를 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 프라이머의 표지를 위해 사용되는 6-카르복시플루오레신(6-carboxyfluorescein), 즉 6-FAM의 화학구조이다.
도 2는 본 발명에서 프라이머의 표지를 위해 사용되는 6-카르복시-2',7'-디메톡시-4', 5'-디클로로플루오레신(6-carboxy-2',7'-dimethoxy-4',5'-dichlorofluorescein), 즉 JOE의 화학구조이다.
도 3은 본 발명에서 프라이머의 표지를 위해 사용되는 6-[2-카르복시-5-[[2-[(5-카르복시펜틸)아미노]-2-옥소에틸]티오]-3,4,6-트리클로로페닐]-1,2,3,4,8,9,10,11-옥타히드로-2,2,4,8,10,10-헥사메틸-12,14-디술포-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-13-이움{6-[2-carboxy-5-[[2-[(5-carboxypentyl)amino]-2-oxoethyl]thio]-3,4,6-trichlorophenyl]-1,2,3,4,8,9,10,11-octahydro-2,2,4,8,10,10-hexamethyl-12,14-disulfo-Pyrano[3,2-g:5,6-g ]diquinolin-13-ium}, 즉 ALEXA 546의 화학구조이다.
도 4는 본 발명에서 프라이머의 표지를 위해 사용되는 [1,10-디히드로-2,2,10,10-테트라메틸-4,8-비스(술포메틸)-2H-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-6-일]-벤젠디카르복실산{[1,10-dihydro-2,2,10,10-tetramethyl-4,8-bis(sulfomethyl)-2H-pyrano[3,2-g:5,6-g ]diquinolin-6-yl]-Benzenedicarboxylic acid}, 즉 ALEXA 568의 화학구조이다.
도 5는 프라이머에 링커를 포함시키지 않고 다중 PCR을 실시한 일실시예(A) 및 링커를 포함시켜 다중 PCR을 실시한 일실시예(B)의 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 형광물질 및 링커가 표지된 프라이머를 나타내는 개요도이다.
도 7은 6-FAM, JOE, TAMRA, ALEXA 568를 형광물질로 사용한 다중 PCR의 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 6-FAM, JOE, ALEXA 546, ALEXA 568를 형광물질로 사용한 다중 PCR(본 발명의 일실시예)의 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 6-FAM, HEX, TAMRA, ALEXA 568를 형광물질로 사용한 다중 PCR의 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 6-FAM, HEX, ALEXA 546, ALEXA 568를 형광물질로 사용한 다중 PCR의 분석결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 >

1. 프라이머 준비

16가지의 표적 DNA를 대상으로 하는 다중 PCR을 실시하였다.

16가지의 표적 DNA는 특별한 형질을 암호하지 않는 STR 부위를 대상으로 선별하였으며, 각 표적에 따른 프라이머는 표 1과 같다.

16가지 표적을 4가지 그룹으로 나누어 각 그룹의 표적을 증폭하기 위한 프라이머를 표 2의 조합에 따라 각 형광물질로 표지하였다.

각 형광물질은 Invitrogen 사(미국)의 제품을 사용하였으며, IDT 사에 합성을 의뢰하여 형광물질이 표지된 프라이머를 제조하였다.

각 프라이머 세트 중 한쪽의 프라이머에만 5' 말단에 형광물질을 표지하였고, 나머지 프라이머는 표지하지 않았다.

표적부위	정방향/ 역방향/ [형광 라벨링]
8S1179	5'-TAACACAAGTTGGGGGAAGCAT-3' 5'-[제1형광물질]-GATAGCAAGAAGGGCTTTCC-3'
21S11	5'-[제1형광물질]-AGCAAACTTCATCCACTTGG-3' 5'-TTCCTGTCCTCTAATGTAACTTACC-3
7S820	5'-[제1형광물질]-AACAGGATCAATGGATGCAT-3' 5'-TGGCTTTTAGACCTGGACTG-3'
CSF1PO	5'-CCTTGGGGGATATAGCCTAA-3' 5'-[제1형광물질]-TGAGTGACAGAGTGATACCATG-3'
D3S1358	5'-[제2형광물질]-CAAGGATGGGTGGATCAATA-3' 5'-TTGTATGAGCCACTTCCCAT-3'
THO1	5'-[제2형광물질]-TGTGAGCCAAGGCCTTATAG-3' 5'-GTCTGGGTTCTCCAAAGAAA-3'
13S317	5'-[제2형광물질]-ACAAAACCCCAAGTACGTGA-3' 5'-TATGACAGGCATCTGGGAGT-3'
16S539	5'-[제2형광물질]-GAGCCAGACCTTGTCTCAAA-3' 5'-AAGGGATTTTAGGAACTGATACG-3'
D2S1338	5'-[제2형광물질]-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3' 5'-TGATTCCAATCATAGCCACA-3'
D19S433	5'-[제3형광물질]-ACAGAAGTCTGGGATGTGGA-3' 5'-GCCCAAAAAGACAGACAGAA3'
vWA	5'-[제3형광물질]-ATAGACAGACAGACGGACTG-3' 5'-GGGAGTGGAGATTACCCCT-3'
TPOX	5'-[제3형광물질]-AGATAGCCTTTACAGTCACA-3' 5'-AAGTCAGTCACCATGCAAAAAGTA-3'
D8S51	5'-[제3형광물질]-TCCCATGCCAAAATTCTTAG-3' 5'-GAAAGAAAGAGAAAGAAGGAAGG-3'
Amelogenin	5'-[제4형광물질]-GTGGATAGACACATGACAGATAGG-3' 5'-TATTTGGCAAGGATAGATACAGG-3'
D5S818	5'-[제4형광물질]-CATCATCTGCACTCCACAAA-3' 5'-TGTCCATCGACAGATGAATG-3'
FGA	5'-[제4형광물질]-TGGTCTCTTCCTCATAACGAC-3' 5'-TGGGGGAGTCTTTGTGTGATT-3'

	조합1	조합2	조합3	조합4
제1형광물질	6-FAM	6-FAM	6-FAM	6-FAM
제2형광물질	JOE	JOE	HEX	HEX
제3형광물질	TAMRA	ALEXA 546	TAMRA	ALEXA 546
제4형광물질	ALEXA 568	ALEXA 568	ALEXA 568	ALEXA 568

2. PCR

인간의 유전체 DNA(Human genomic DNA)를 주형으로 하고 상기 1에서 준비한 각 조합에 따른 프라이머로 다중 PCR을 수행하였다. 하나의 반응혼합물의 조성은 표 3과 같이 하였으며, PCR 조건은 표 4와 같이 하였다.

반응 혼합물의 조성	농도
Tris Cl, pH 8.3	10mM
KCl	50mM
MgCl2	1.5mM
BSA	60㎍/㎖
dNTP	200μM
Sodium Azide	0.05%
Primers	각 프라이머 당 0.4μM

Thermal cycler 온도	시간	반복수
95℃	11분	1회
94℃	30초	30회
58℃	1분
72℃	30초
60℃	45분	1회

3. PCR 산물 분석

상기 2의 다중 PCR 반응을 통해 증폭된 산물을 전기영동을 통하여 분리하여 검출함으로써 증폭된 유전자들을 평가하였다.

분석 장비는 3130xl Genetic Analyzer 16-capillary(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하였고, 장비의 매뉴얼에 따라 증폭산물 2㎕와 Flourescent loading buffer mixture(Formamide : LIZ500, 24 : 1) 15㎕을 혼합하여 95℃에서 3분 가열한 다음 얼음에서 3분간 방치한 후 전기영동을 실시하여 분석하였다.

이의 결과 5가지 표적은 각 증폭산물의 크기 범위가 다른 표적의 증폭산물과 겹치는 것으로 나타났다.

4. 형광물질 및 링커가 포함된 프라이머를 이용한 다중 PCR

상기 3의 결과에 따라 증폭산물의 크기가 겹치는 문제를 해결하기 위해, 표 5와 같이 해당 프라이머에 헥사 에틸렌 옥사이드(HEO) 링커를 포함시켜 프라이머를 준비하였다. 링커는 형광물질이 표지된 프라이머에 포함시켰으며, 형광물질과 프라이머의 사이에 위치하도록 하였다(도 6 참조).

링커로 사용한 헥사 에틸렌 옥사이드는 1분자씩 표지할 때마다 평균 2.5bp DNA가 증가한 것과 동일한 전기영동상의 크기가 관찰되므로 원하는 이동간격 만큼 표지하였다.

표적부위	이동간격	프라이머에 포함된 HEO 분자수
CSF1PO	25bp	10
16S539	20bp	8
2S1338	15bp	6
13S317	12bp	5
TPOX	7bp	3

준비된 프라이머를 이용하여 상기 2에서와 동일한 방법으로 다중 PCR을 실시하였으며, 상기 3에서와 같은 방법으로 분석한 결과를 도 7 내지 10에 나타내었다.

이 결과에서 알 수 있듯이, 표지물질의 조합1, 3 및 4에서는 형광물질 사이에 간섭현상이 발생하기 때문에, 해당 형광물질의 피크가 실제로 어떤 표적에 대한 증폭산물인지 구분하기 어렵다는 문제가 있는 반면, 조합2의 경우에는 형광물질 서로 간에 간섭현상이 전혀 나타나지 않기 때문에 각 표적에 대한 증폭산물을 명확하게 구분할 수 있다.

또한, 링커를 사용함으로써 증폭산물의 크기 범위가 겹쳐 구분이 어려웠던 것 또한 명확하게 구분할 수 있음을 확인하였다.

Claims

하나의 반응액에서 표적이 다른 둘 이상의 PCR을 시도하는 다중 PCR 방법에 있어서,
프라이머를 표지물질로 표지함으로써 PCR 반응으로 생성된 증폭산물을 표지물질로 식별하는 방법을 사용하며,
하나의 표적에는 한 종류의 표지물질 만을 사용하고,
한 표적의 증폭을 위해 사용되는 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 표지물질로 표지하며,
상기 표지물질로
화학식 1의 6-카르복시플루오레신;
화학식 2의 6-카르복시-2',7'-디메톡시-4', 5'-디클로로플루오레신;
화학식 3의 6-[2-카르복시-5-[[2-[(5-카르복시펜틸)아미노]-2-옥소에틸]티오]-3,4,6-트리클로로페닐]-1,2,3,4,8,9,10,11-옥타히드로-2,2,4,8,10,10-헥사메틸-12,14-디술포-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-13-이움; 및
화학식 4의 [1,10-디히드로-2,2,10,10-테트라메틸-4,8-비스(술포메틸)-2H-파이라노[3,2-g:5,6-g]디퀴놀린-6-일]-벤젠디카르복실산;을 모두 사용하는 것을 특징으로 하는 다중 PCR 방법.
< 화학식 1 >

< 화학식 2 >

< 화학식 3 >

< 화학식 4 >
제 1항에 있어서,
하나의 표지물질을 둘 이상의 표적에 사용하는 경우,
프라이머와 표지물질 사이에 링커를 포함시켜 PCR 증폭산물의 분자량을 조절하며,
상기 링커는 헥사 에틸렌 옥사이드를 단위체로 하는 것임을 특징으로 하는 다중 PCR 방법.