KR20180023248A - 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 - Google Patents
어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180023248A KR20180023248A KR1020160108260A KR20160108260A KR20180023248A KR 20180023248 A KR20180023248 A KR 20180023248A KR 1020160108260 A KR1020160108260 A KR 1020160108260A KR 20160108260 A KR20160108260 A KR 20160108260A KR 20180023248 A KR20180023248 A KR 20180023248A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- virus
- monoclonal antibody
- diagnostic kit
- fish
- vhsv
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 83
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 title claims description 33
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 33
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 70
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 31
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 28
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 12
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical group CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminophenyl)-4-[[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]methyl]benzamide Chemical group NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC1=NC=CC(C=2C=NC=CC=2)=N1 HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 5
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000001449 Viral Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 241000711825 Viral hemorrhagic septicemia virus Species 0.000 abstract description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 241000148627 Hirame novirhabdovirus Species 0.000 description 14
- 241000711804 Infectious hematopoietic necrosis virus Species 0.000 description 14
- 241000036569 Carp sprivivirus Species 0.000 description 12
- 241001326160 Marine birnavirus Species 0.000 description 12
- 241001492212 Striped Jack nervous necrosis virus Species 0.000 description 12
- 241000710921 Infectious pancreatic necrosis virus Species 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001280377 Oncorhynchus tshawytscha Species 0.000 description 3
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- QEIFSLUFHRCVQL-UHFFFAOYSA-N (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) hydrogen phosphate;(4-methylphenyl)azanium Chemical compound CC1=CC=C(N)C=C1.C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QEIFSLUFHRCVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710198202 Non-virion protein Proteins 0.000 description 2
- 241001112535 Novirhabdovirus Species 0.000 description 2
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-N 1-nitrotetrazole Chemical compound [O-][N+](=O)N1C=NN=N1 KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000907195 Channa striata Species 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001502129 Mullus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 241001282110 Pagrus major Species 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000295697 Pimephales promelas Species 0.000 description 1
- 241000269980 Pleuronectidae Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000157468 Reinhardtius hippoglossoides Species 0.000 description 1
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 1
- 241000277288 Salmo trutta Species 0.000 description 1
- 241001125046 Sardina pilchardus Species 0.000 description 1
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001504592 Trachurus trachurus Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101900220844 Viral hemorrhagic septicemia virus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000013120 national analysis Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N trimethylpyrocatechol Natural products CC1=CC(O)=C(O)C(C)=C1C DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/4603—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates from fish
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 검출하기 위한 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주와 이로부터 생산되는 단클론항체 Anti-2C10를 제공하며, 이를 이용하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 진단할 수 있는 진단키트 및 진단방법을 제공함으로써 양식장에서 대량폐사를 일으켜 막대한 손해를 입히고 있는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 진단과 치료 및 예방에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 구조단백질을 에피토프로 하여 감수성 및 특이성이 우수하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염의 진단, 예방 및 치료 등에 유용하게 이용될 수 있는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체에 관한 것이다.
바이러스성 출혈성 패혈증(VHS, Viral Hemorrhagic Septcemia)은 1980년대 초반까지는 유럽 지역에서 주로 무지개 송어나 몇몇 담수어종에서 큰 피해를 주고 있는 바이러스성 질병으로 알려져 있었으나, 1988년 미국 서부 태평양 연안으로 회유하는 은연어와 왕연어에서 발견되면서 그 감염대상이 해수어에까지 확대된 것을 확인하였다. 현재까지 감염이 확인된 어종으로는 넙치, 무지개송어, 대서양 연어, 브라운송어, 은연어, 왕연어, 대구, 넙치, 터봇, 정어리, 명태 등을 포함하는 약 50여 종의 해산어류와 담수어류이다.
국내의 경우 2001년 이후 매년 남해 및 제주도 수역에서 겨울과 봄의 저수온기에 양식넙치에서 보고된 바 있다. 일본에서는 넙치, 전갱이, 까나리, 참돔, 방어 등 자연산 어류에서 분리되었으며, 국내에서는 숭어, 고등어, 황돔, 병어 등에서 분리되었다.
바이러스성 출혈성 패혈증의 원인바이러스는 단일가닥의 RNA 바이러스로 Rhabdoviridae과 Novirhabdovirus속의 외막을 가진 바이러스이다. 50~70ㅧ180~240 nm의 크기에 바이러스 입자의 모형은 전형적인 Rhabdovirus의 형태인 타원형이며, 한쪽은 둥글고 다른 한쪽은 편평한 모양이다. 학계에서는 담수에서 분리된 VHSV의 Glycoprotein(G) 유전자 염기서열을 기초로 유전형으로 구분하고, 이들 유전형은 지리적 분리 유래에 따라 유럽분리주가 속한 genogroup I, 발트해 분리주가 속한 genogroup II, 영국과 아일랜드의 북해 연안에서 분리되는 genogroup III, 북미, 일본, 한국 분리주가 속한 genogroup IV의 4가지 유전형적 구분이 일반화되어 있다. 더욱이 genogroup IV에서 한국분리주는 일본분리주와 동일한 minor cluster에 속하지만 북미분리주와는 다른 cluster에 속해 북미 분리주와는 뚜렷한 차이를 보이고 있다.
VHSV는 다른 어류바이러스인 infectious hematopoietic necrosisvirus (IHNV)와 hirame rhabdovirus (HIRRV)와 함께 family Rhabdoviridae, genus Novirhabdovirus에 속하는 약 11,000 bp의 negative-strand RNA virus로 6개의 유전자들, nucleocapsid (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), non-virion protein (NV)와 polymerase (L) 유전자들이 3'-N-P-M-G-NV-L-5'의 순으로 구성되어 있는 것이 특징이다.
현재, VHSV는 세계동물보건기구 (World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약 (Aquatic Animal Health Code)에 의해 '관리대상질병 (notifiable disease)'으로 지정되어 있으며, 국내에서도 수산생물질병 관리법 제2조에서 규정하는 수산생물전염병으로, 방역조치 대상에 포함되어 감염 및 질병발생이 확인되면 이동제한과 소독 조치가 이루어지는 질병이다. 최근, 다양한 수산생물질병의 발생과 소비자들의 안전한 먹거리에 대한 수요 증가로 인해 전 세계적으로 수산생물의 방역 (Aquatic animal Disease Control), 예찰 (Surveillance) 및 모니터링 (Monitoring)의 중요성이 더욱 커지고 있다.
또한, 국가적인 예찰 및 방역활동 뿐만 아니라 지역적 (regional) 이고 구역화 (zoining)된 수산생물의 질병 예찰 및 모니터링 연구결과의 분석은 향후 수산생물질병의 역학조사 및 질병 관리에 필요한 유용한 자료를 제공 할 뿐만 아니라 자국 내 특정 질병에 대한 무병(청정)지역을 증명할 수 있는 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 VHSV의 국내 분리주의 서열변이에 대한 지속적인 연구 및 다른 국가 분리주와의 서열비교와 지속적인 모니터링도 중요하게 되었다.
국립수산과학원에 의해 실시된 우리나라 양식장의 병원체 감염률 조사에서 2006년 이후 바이러스성 신경괴사 바이러스의 검출률이 가장 높게 나타났으며(60% 이상), 이어 바이러스성 출혈성 패혈증바이러스에 의한 감염이 뒤를 따랐다(28%). 이와 같이 바이러스성 출혈성 패혈증은 높은 감염률을 나타내고 있으며, 밀집양식에서 전염성이 높아지고, 한번 감염으로 대량폐사를 일으켜 수산어가에 큰 피해를 입히고 있으나, 감염 시 초기 진단이 어려운 점이 있어 이의 용이한 진단방법 및 치료와 예방에 대한 연구가 시급하다.
본 발명은 종묘 생산시기에 대량 발생하여 높은 폐사율을 보이는 어병의 원인바이러스인 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 감수성 및 특이성이 높아 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증의 진단, 치료 및 예방에 용이하게 이용할 수 있는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 단클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 제공하는 데에 목적이 있다.
본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 검출하기 위한 단클론항체를 생산하는 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주와 이로부터 생산되는 단클론항체 Anti-2C10을 제공하며, 이를 이용하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 진단할 수 있는 진단키트 및 진단방법을 제공한다. 상기 진단키트는 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함하며, 상기 표지체는 HRP(Horse-radish peroxidase)이며, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)인 것을 특징으로 한다.
또한 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에 의해 생산되는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론 항체 Anti-2C10를 코팅완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주하여 플레이트를 코팅시키는 단계(1); 상기 (1)의 플레이트에 검사하고자하는 피검어 조직마쇄액을 반응시키는 단계(2); 상기 (2)의 플레이트를 인산완충용액으로 세척하는 단계(3); 상기 (3)의 플레이트에 HRP-축합 신경괴사바이러스 단클론항체를 반응시키는 단계(4); 상기 (4)의 플레이트에 TMB를 첨가하여 발색시키는 단계(5); 상기 (5)의 발색반응이 끝나면 황산으로 효소반응을 정지시키는 단계(6); 및 상기 (6)의 발색정도를 405 nm에서 흡광도를 측정하는 단계(7);로 이루어진 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단방법을 제공한다.
상기 진단키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입이며, 상기 스트립 타입의 진단키트는 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에 의해 생산되는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론 항체 Anti-2C10와 금의 접합체, 마우스 면역글로불린에 대하여 특이적인 항체가 코팅된 멤브레인과 피검체 흡습패드가 부착된 스트립을 포함하는 신속 면역크로마토그래피법에 의한 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트를 제공한다.
본 발명에 따른 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 단클론항체 및 이를 생산하는 융합세포주를 이용하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대하여 감수성 및 특이성이 높은 진단시약, 진단키트 및, 예방제, 치료제의 생산에 이용할 수 있어 안전한 수산양식을 수행할 수 있다.
도 1은 20%와 35% 사이의 sucrose 농도에서 관찰되는 바이러스 밴드를 나타낸 사진이다.
도 2는 SDS-PAGE에서 관찰되는 정제된 VHSV의 구조 단백질을 나타낸 사진이다.
도 3은 바이러스성 출혈성 패혈증의 단클론 항체에 대한 isotyping 결과를 나타낸 표이다.
도 4는 단클론 항체의 VHSV 부위 확인을 나타낸 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다(M: marker (kDa), 1: 양성대조구 (Anti-VHSV polyclonal antibody), 2: 음성대조구 (1차항체: 2% Skim milk), 3: 2C10.
도 5는 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다. P: 양성대조구 (항원: FYeosu05, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody), 1: 항원: FYeosu05, 항체: 2C10, 2: 항원: FWando05, 항체: 2C10, 3: 항원: FJeju14, 항체: 2C10, 4: 항원: FHM cells, 항체: 2C10.
도 6은 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 1: FYeosu05, 2: FWando05, 3: FJeju14, 4: FHM 상층액, 5: FHM 마쇄액, 6: 증류수.
도 7은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다(M: marker (kDa), 1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV, 10: SSN-1).
도 8은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV.
도 9는 단클론 항체의 VHSV-감염어에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다. P1: 항원: 정제된 VHSV, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, P2: 항원: VHSV-감염어의 조직 마쇄액, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, 1: VHSV 감염어의 조직 마쇄액, 항체: 2C10, 2: 정상어의 조직 마쇄액, 항체: 2C10.
도 10은 단클론 항체의 수탁증을 나타낸다.
도 2는 SDS-PAGE에서 관찰되는 정제된 VHSV의 구조 단백질을 나타낸 사진이다.
도 3은 바이러스성 출혈성 패혈증의 단클론 항체에 대한 isotyping 결과를 나타낸 표이다.
도 4는 단클론 항체의 VHSV 부위 확인을 나타낸 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다(M: marker (kDa), 1: 양성대조구 (Anti-VHSV polyclonal antibody), 2: 음성대조구 (1차항체: 2% Skim milk), 3: 2C10.
도 5는 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다. P: 양성대조구 (항원: FYeosu05, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody), 1: 항원: FYeosu05, 항체: 2C10, 2: 항원: FWando05, 항체: 2C10, 3: 항원: FJeju14, 항체: 2C10, 4: 항원: FHM cells, 항체: 2C10.
도 6은 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 1: FYeosu05, 2: FWando05, 3: FJeju14, 4: FHM 상층액, 5: FHM 마쇄액, 6: 증류수.
도 7은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다(M: marker (kDa), 1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV, 10: SSN-1).
도 8은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV.
도 9는 단클론 항체의 VHSV-감염어에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다. P1: 항원: 정제된 VHSV, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, P2: 항원: VHSV-감염어의 조직 마쇄액, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, 1: VHSV 감염어의 조직 마쇄액, 항체: 2C10, 2: 정상어의 조직 마쇄액, 항체: 2C10.
도 10은 단클론 항체의 수탁증을 나타낸다.
본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스이러스 구조단백질을 에피토프로 하여 감수성 및 특이성이 우수하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염의 진단, 예방 및 치료 등에 유용하게 이용될 수 있는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체와 이를 생산하는 융합세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다.
<
실시예
1> 바이러스의 배양
실험에 사용된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)는 2005년 전남 여수에 소재한 넙치 양어장에서 분리되었다. 분리된 바이러스 (FYeosu05)를 대량으로 배양하기 위하여 75㎠ tissue culture flask (Nunc, Denmark)에 fathead minnow cell line (FHM)을 단층으로 배양한 후 바이러스를 접종하여 15℃에서 10일간 배양하면서 cytopathic effect (CPE)를 관찰하였다. 세포에 바이러스가 감염되어 90% 이상 용해된 세포 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 세포 잔여물을 제거한 후 상층액을 분리하였다. 분리된 바이러스 상층액은 실험에 사용되기 전까지 -80℃에서 보존하였다.
<
실시예
2> 바이러스의 농축 및 정제
바이러스 배양액에 polyethylene glycol (PEG)-6000 (Sigma, USA)과 NaCl을 각각 7.5% (w/v), 2.3% (w/v)로 첨가한 후 4℃에서 overnight 하였다. PEG가 처리가 된 바이러스 배양액을 4℃에서 12,000 rpm으로 30분간 원심 분리한 후 pellet을 phosphate buffer saline (PBS: 0.13M NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)완충용액으로 현탁하였다. 현탁액은 30,000 rpm에서 2시간 동안 초원심을 실시한 후 pellet을 PBS로 재부유 시켜 바이러스를 농축하였다.
바이러스를 정제하기 위해, 농축된 바이러스를 step sucrose gradient (20%, 35%, 50% sucrose 용액 (w/w)) 위에 넣은 후 21,000 rpm으로 2시간 동안 초원심분리를 실시하였다. 20%와 35% 경계 지점에 형성된 바이러스로 추정되는 band를 주사기를 이용하여 취한 후, PBS로 현탁하여 30,000 rpm으로 2시간 동안 초원심 분리하였다. 원심 분리 후 얻어진 침전물은 PBS 완충용액으로 다시 재현탁하여 실험에 사용되기 전까지 -80℃에 보존하였다.
<
실시예
3> 바이러스의 구조 단백질 분석
정제된 바이러스의 구조단백질을 분석하기 위해 sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시하였다. 정제된 바이러스에 동량의 SDS-sample buffer (1.59％ SDS, 0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 14% glycerol (w/v), 0.01% bromophenol blue (w/v), 4% 2-mecaptoethanol (v/v))를 첨가하여 100℃에서 3분간 열처리한 후 SDS-PAGE (12％ acrylamide separating gel, 4％ acrylamide stacking gel, 30 mA, 2 hours)를 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 0.2％ coomassie brilliant blue R-250 (Wako, Japan)로 염색하여 결과를 확인하였다.
<
실시예
4> 바이러스 면역 및
hybridoma
제작
면역은 정제 바이러스 (약 100 ㎍)와 complete freunds adjuvant를 1:1 비율로 혼합하여 BALB/c 마우스의 복강에 1차 면역하였다. 2주 후 마우스의 꼬리로부터 채혈한 후 ELISA를 실시하여 항체가를 측정하였으며, 바이러스만을 사용하여 2차 면역하였다. 3일 후 마우스의 비장 조직을 분리한 후 PEG 1500 (Roche, USA)를 이용하여 myeloma cell (Sp2/0Ag14)과 융합시킨 후 hypoxanthine, thymidine (HT) (gibco, USA) 배지를 사용하여 96 well plate (TPP, Switzerland)에 분주하여 CO2배양기에서 37℃로 배양하였다.
<실시예 5> Hybridoma의 screening
바이러스에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 hybridoma를 screening하기 위하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 실시하였다. 항원은 정제된 바이러스액을 96 well plate (corning, USA)에 well 당 50 ㎕ (250 ng/well)씩 분주하여 4℃에서 overnight 또는 37℃에서 2시간 coating하였다. 2% skim milk/TBST (Tris-buffered saline-Tween 20) 200 ㎕를 분주하여 blocking 한 후, TBST로 1회 세정하고 1차 항체로서 hybridoma 배양 상등액을 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 반응하였다.
TBST로 3회 세정한 후 2차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Pierce, USA)를 2% skim milk/TBST로 5,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. TBST로 5회 세정한 후 tetramethylbenzidine base (TMB, color reagents) (surmodics, TMBC)를 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer (Multiskan, USA)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
<
실시예
6> Western blot을 이용한
단클론
항체 반응 조사
항원에 대한 항체의 인식 능력을 확인하기 위하여 western immunoblot 분석을 실시하였다. SDS-PAGE는 위와 동일한 방법으로 실시하였다. 정제된 바이러스를 사용하여 전기영동 한 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치 (ATTO, Japan)를 이용하여 144 ㎃에서 1시간 동안 nitrocellurose membrane (advantec, Japan)에 blotting하였다. Blotting 후 2% skim milk로 blocking하여 1시간 반응시킨 후, buffer 1 (0.1M maleic acid, 0.15M NaCl, pH 7.5)으로 15분간 세정하였다. 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 hybridoma 배양 상등액을 2% skim milk로 2배 희석하여 1시간 반응시킨 후 위와 동일한 방법으로 세정하였다.
2차 항체로는 alkaline phosphatase (AP)가 표식되어 있는 goat polyclonal anti-mouse IgG antibody (novus, USA)를 2% skim milk로 1,000배 희석하여 1시간 반응시킨 후 5회 세정하고 발색제 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2용액 (pH 9.5) 20㎖, NBT (75 ㎎/㎖ 4-nitrotetrazolium blue chloride) 90 ㎕, BCIP (50 ㎎/㎖ 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt/dimethyl-formamide) 70㎕)로 발색하여 육안으로 확인하였다. 발색이 완료된 후 발색 정지액 (1mM EDTA, 10mM Tris-HCl)을 첨가하였다.
<실시예 7> 단클론항체의 Isotyping
제작된 단클론 항체의 heavy 및 light chain의 subtype을 확인하기 위하여 Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit (Pierce, USA)를 사용하여 ELISA를 매뉴얼에 따라 실시하였다.
<실시예 8> VHSV 분리주들에 대한 단클론 항체의 특이성 조사
FYeosu05 분리주에 대한 단클론 항체가 다양한 VHSV 분리주들에 대해 반응하는지를 조사하기 위하여 2005년도 완도, 2014년 제주에서 분리한 VHSV 분리주를 사용하여 (FWando05, FJeju14) western blot과 ELISA를 실시하였다. Western blot에 사용한 바이러스 항원은 3개의 VHSV 분리주를 (FYeosu05, FWando05, FJeju14) 각각 FHM 세포에 접종한 후 3일째 SDS-sample buffer를 첨가하여 세포를 lysis 시킨 후 100℃에서 3분간 열처리하여 제작하였다. Western blot은 위와 동일한 방법으로 실시하였다. ELSIA는 FYeosu05 (109.3 tissue culture infective dose (TCID)50/㎖), FWando05 (108.3 TCID50/㎖), FJeju14 (108.8 TCID50/㎖) 상층액을 사용하여 다음의 방법으로 실시하였다.
VHSV를 증류수로 320배 희석하여 96 well ELISA microplates (Greiner-bio-one, Germany)에 각각 50 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다. T-PBS (0.05% Tween-20/PBS (v/v))로 3회 세정하였고 5% skim milk를 380 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 동안 blocking하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 1차 항체로는 본 연구에서 제작한 단클론 항체를 시료당 2개의 well에 50 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 horseradish peroxidase (HRP)가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Youngin, Korea)를 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하였으며, 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 5회 세정한 후 ELISA 발색액 (100mM Na2HPO4, 50mM citricacid, 1 ㎎/㎖ o-phenylen diamine, 0.1% H2O2)을 well 당 50 ㎕ 분주하여 발색하였다. 각 well에 1N H2SO4를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
<실시예 9> 어류바이러스들에 대한 특이성 조사
FYeosu05 분리주에 대한 단클론 항체가 다양한 어류바이러스에 대해 반응하는지를 조사하기 위해, VHSV, 전염성 조혈기 괴사증 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV), 넙치 랩도바이러스 (Hirame rhabdovirus, HIRRV), 잉어 봄 바이러스혈증 바이러스 (spring viraemia of carp virus, SVCV), 전염성 췌장괴사증 바이러스 (Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV), 해양 버나바이러스 (marine birnavirus, MABV) 및 신경괴사증 바이러스 (nervous necrosis virus, NNV)를 사용하여 western blot과 ELISA를 실시하였다.
Western blot에 사용한 바이러스 항원은 7종의 어류바이러스를 FHM (VHSV), epithelioma papulosum cyprini (EPC) (SVCV, HIRRV), chinook salmon embryo (CHSE-214) (IHNV, IPNV, MABV) 또는 striped snakehead (SSN-1) (NNV) 세포에 접종한 후 3일째 SDS-sample buffer를 첨가하여 세포를 lysis 시킨 후 100℃에서 3분간 열처리하여 제작하였다. Western blot은 위와 동일한 방법으로 실시하였다. ELSIA는 VHSV FYeosu05 (109.3 TCID50/㎖), IHNV (107.3 TCID50/㎖), HIRRV (108.3 TCID50/㎖), SVCV (107.55 TCID50/㎖), IPNV (109.55 TCID50/㎖), MABV (109.3 TCID50/㎖) 그리고 NNV (108.05 TCID50/㎖) 상등액을 사용하여 ELISA를 실시하였다. ELISA는 VHSV 분리주들에 대한 특이성 조사에 사용한 방법으로 실시하였다.
<실시예 10> VHSV-감염어에 대한 특이성
FYeosu05 분리주에 대한 단클론 항체가 현장시료 (VHSV-감염어)에 반응하는지를 조사하기 위하여 VHSV 감염실험을 실시한 후 폐사어와 정상어를 사용하여 실험을 실시하였다. 넙치 치어 (3.5ㅁ0.5 g)를 수온 10℃로 유지된 10 L 수조 2개에 각각 20마리씩 수용한 후, 1개의 수조에는 VHSV를 105.5 TCID50/ml의 농도로 1시간 침지시켰으며, 다른 1개의 수조에는 HBSS를 1시간 침지시켰다 (대조구). 사육수는 1일에 1번씩 교환해 주었으며 (환수율:70%), 10일간 누적폐사율을 조사하였다: 누적폐사율, 실험구: 50%, 대조구: 0%. VHSV에 감염되어 폐사된 넙치와 건강한 넙치 (대조구)의 신장과 비장을 적출한 후 HBSS로 1 : 10 (0.1 g/mL)이 되게 혼합하여 마쇄하였고, 이를 6,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 얻어진 상층액을 사용하여 western blot을 실시하였다.
<
실시예
11>
VHSV
-감염
진단키트
본 발명은 단클론항체를 포함하는, 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 감염을 진단할 수 있는 진단키트를 제공한다. 특히 본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트는 항원-항체 복합체를 색체입자결합법으로 검출하는 진단키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트는 본 발명의 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다. 상세하게는, 상기 진단키트는 본 발명의 단클론항체를 탄산염 (pH 9.4)으로 희석하여 최종농도가 10 ㎍/㎖인 단클론항체 희석액으로 코팅된 플레이트, 1:2,000배로 희석된 HRP(Horse-radish peroxidase)-축합 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 단클론항체, 인산완충용액, TMB 및 1N H2SO4 로 구성된다.
본 발명의 진단키트를 이용하여, 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 의심어에 대해 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 다음과 같다. 단클론항체가 코팅된 플레이트에 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 의심어 또는 양식장에서 무작위로 선택한 피검어의 마쇄액을 각 well 당 100 ㎕ 씩 첨가하고 실온에서 60분 동안 반응시킨 다음, 인산완충용액으로 플레이트를 3회 세척한다.
HRP-축합 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 단클론항체를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 25℃에서 60분 동안 반응시킨 다음 인산완충용액으로 플레이트를 3회 세척한다. 그런 다음, HRP의 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하고 암소에서 30분 동안 반응시켜 발색반응을 유도한다. 그런 다음, 1N H2SO4를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하여 효소반응을 정지시킨다. 본 발명 의 진단키트를 이용하여 이렇게 처리한 플레이트를 ELISA 리더 (reader)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정 결과, 흡광도가 0.2 이상인 경우 양성으로 판정한다.
<실시예 12> 면역크로마토그래피법을 이용한 VHSV-감염 라피드 진단키트
본 발명은 본 발명의 단클론항체를 포함하는, 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 감염을 신속히 진단할 수 있는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 VHSV-감염 라피드 진단키트를 제공한다. 상기 제조한 항체 및 Anti-VHSV 항체를 0.58 ㎍/스트립 농도로 PBS에 희석하여 나이트로셀룰로오스 멤브레인 검사선(T: VHSV의 검출선) 위치에 흡착시켜 코팅 용액으로 사용하였다. 또한 대조선(C) 위치에는 마우스의 Ig를 인식하는 항체 0.75 ㎍/스트립을 코팅하였다. 또한 Anti-2C10 항체를 골드 콜로이드(gold colloid)와 결합시켰다. 염화금을 시트로산 나트륨 용액으로 환원시켜 플레인 골드(plain gold)를 제조한 후 상기 항체를 첨가하면서 40 nm 크기의 항체가 결합된 골드입자를 532 nm에서 흡광도가 10+/-1이 되도록 제조하였다. 여기에 결합된 항체를 안정화시키기 위하여 Polyethylene glycol(PEG) 용액을 처리하였다.
골드 입자와 항체가 결합된 각각의 골드 접합체들을 혼합하여 8.3 ㎕/스트립이 되도록 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적신 후 건조시켜 골드 패드를 제조하였다. 흡습 패드 및 검체 패드 제조는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다. 이후, 1) 검체 패드, 2) 골드 패드, 3) 멤브레인(T: 검사원 위치, C: 대조선 위치), 4) 흡습패드, 및 5) 플라스틱 카드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45 mm/스트립 크기로 절단하여, 절단된 스트립을 최종 디바이스의 하판에 넣고 검체적용홀이 형성되어있는 상판을 덮어 VHSV-감염 라피드 진단키트를 제작하였다.
어류 바이러스성 출혈성 패혈증을 진단하기 위하여, 피검어의 조직마쇄액 또는 혈청을 희석하여 검체 적용홀에 적용한다. 이때 검체 중에 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스가 존재하면 골드패드의 골드 입자에 접합되어 있는 Anti-2C10 항체와 1차로 결합하게 되며, 이후 이 결합체는 면역크로마토그라피법 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하게 되면서 멤브레인의 검사선 위치(T)에 있는 Anti-VHSV 항체와 2차적으로 결합하면서 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 보라색 밴드를 나타내게 된다. 그러나 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스가 존재하지 않으면 대조선 밴드(C)만 나타난다.
<시험예 1> 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 정제
도 1은 20%와 35% 사이의 sucrose 농도에서 관찰되는 바이러스 밴드를 나타낸 사진이며, 도 2는 SDS-PAGE에서 관찰되는 정제된 VHSV의 구조 단백질을 나타낸 사진이다. FHM 세포에 대량 배양한 VHSV를 사용하여 PEG로 농축한 후, step sucrose gradient에서 초원심을 실시한 결과, 20%와 35% 사이의 sucrose 농도에서 바이러스로 추정되는 밴드가 관찰되었다. 바이러스로 추정되는 밴드를 초원심으로 수집한 후, SDS-PAGE를 실시한 결과, 192 kDa (VHSV L protein), 62 kDa (G protein), 42 kDa (N protein), 29 kDa (P protein), 25 kDa (M protein)의 단백질이 확인되었다.
<시험예 2> Hybridoma 제작 및 단클론 항체의 screening
정제된 VHSV를 면역시킨 마우스의 비장 조직과 Sp2/0Ag14 myeloma 세포를 PEG로 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 ELISA와 western blot으로 스크린 한 결과, 10개 시료에서 양성 반응을 나타내었다. 10개의 시료를 대상으로 ELISA로 3회 클로링을 실시한 결과, 최종적으로 1개의 clone (2C10)을 선별하였다. 이후의 실험에서는 1개의 clone으로부터 생산된 항체를 사용하여 (항체의 이름 : clone의 이름과 동일하게 사용) 특이성 조사를 실시하였다.
<
시험예
3>
단클론
항체의
isotyping
도 3은 단클론 항체에 대한 isotyping 결과를 나타낸 표이다. 2C10 단클론 항체를 대상으로 rapid ELISA mouse mAb isotyping kit를 사용하여 IgG의 heavy 및 light chain의 subtype을 조사한 결과, H-chain은 IgG2a로 나타났으며, L-chain은 κ로 확인되었다.
<시험예 4> VHSV에 대한 단클론 항체의 바이러스 인식 부위 조사
도 4는 단클론 항체의 VHSV 인식 부위를 나타낸 웨스턴 블로팅 결과이다(M: marker (kDa), 1: 양성대조구 (Anti-VHSV polyclonal antibody), 2: 음성대조구 (1차항체: 2% Skim milk), 3: 2C10.
단클론 항체의 VHSV 인식 부위를 조사하기 위해, 정제된 VHSV를 사용하여 western blot을 실시한 결과, VHSV의 G protein (62kDa)을 인식하는 것이 확인되었다.
<시험예 5> VHSV 분리주들에 대한 특이성 조사
도 5는 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다. P: 양성대조구 (항원: FYeosu05, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody), 1: 항원: FYeosu05, 항체: 2C10, 2: 항원: FWando05, 항체: 2C10, 3: 항원: FJeju14, 항체: 2C10, 4: 항원: FHM cells, 항체: 2C10.
단클론 항체를 사용하여 다양한 VHSV 분리주에 대한 특이성 조사하기 위해, 3개의 VHSV 분리주 (FYeosu05, FWando05, FJeju14)에 감염된 FHM 세포와 정상 FHM 세포를 사용하여 western blot을 실시하였다. 단클론 항체는 3개의 VHSV 분리주에 모두 반응하였으며, 인식하는 부위는 도 4와 동일하였다. FHM 세포에는 반응하지 않았다.
도 6은 단클론 항체의 VHSV 분리주들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다(1: FYeosu05, 2: FWando05, 3: FJeju14, 4: FHM 상층액, 5: FHM 마쇄액, 6: 증류수.). VHSV 배양액 (분리주: Yeosu05, Wando05, Jeju14), FHM 배양액, FHM 마쇄액을 사용하여 ELISA를 실시한 결과, 3개의 VHSV 분리주에 반응하였으나 (OD값: 0.37 - 0.42), FHM과 FHM 마쇄액에는 반응하지 않았다.
<
시험예
6> 다른
어류바이러스들에
대한 특이성 조사
도 7은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 나타내는 웨스턴 블로팅 사진이다(M: marker (kDa), 1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV, 10: SSN-1).
단클론 항체를 사용하여 어류바이러스들에 대한 특이성 조사하기 위해, VHSV, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV 및 NNV에 감염된 세포와 정상 세포 (CHSE-214, SSN-1)를 사용하여 western blot을 실시하였다. 단클론항체는 VHSV에 만 반응하였고, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV, NNV, CHSE-214, SSN-1에는 반응하지 않았다.
도 8은 단클론 항체의 어류바이러스들에 대한 특이성을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다 (1: VHSV, 2: IHNV, 3: HIRRV, 4: SVCV, 5: EPC, 6: IPNV, 7: MABV, 8: CHSE-214, 9: NNV). 바이러스 배양액 (VHSV, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV 및 NNV)과 FHM 배양액을 사용하여 ELISA를 실시한 결과, 단클론 항체는 VHSV에 만 반응하였고, IHNV, HIRRV, SVCV, IPNV, MABV, NNV에는 반응하지 않았다.
<시험예 7> VHSV-감염어에 대한 특이성 조사
도 9는 단클론 항체의 VHSV-감염어에 대한 특이성을 나타낸 웨스턴 블로팅 사진이다(P1: 항원: 정제된 VHSV, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, P2: 항원: VHSV-감염어의 조직 마쇄액, 항체: Anti-VHSV polyclonal antibody, 1: VHSV 감염어의 조직 마쇄액, 2: 정상어의 조직 마쇄액). 단클론 항체를 사용하여 VHSV-감염어에 대한 특이성을 조사하기 위해, VHSV에 감염된 넙치와 건강한 넙치의 신장ㆍ비장 마쇄액을 사용하여 western blot을 실시하였다. 단클론항체는 VHSV 감염어의 조직에서만 반응하였으며, 정상어의 조직에는 반응하지 않았다. 단클론 항체가 인식하는 부위는 Fig. 3과 동일하였다.
본 발명은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 검출하기 위한 융합세포주 및 이로부터 생산되는 단클론항체를 제공하며, 이를 이용하여 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 진단할 수 있는 진단키트 및 진단방법을 제공함으로써 양식장에서 대량폐사를 일으켜 막대한 손해를 입히고 있는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 진단과 치료 및 예방에 이용할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.
<수탁번호>
기탁기관명 : 한국세포주연구재단
수탁번호 : KCLRFBP00369
수탁일자 : 2016816
Claims (8)
- 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에 의해 생산되는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론 항체 Anti-2C10를 포함하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트.
- 제1항에 있어서, 상기 진단키트는 항원-항체 복합체를 색채입자결합법으로 검출하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트.
- 제2항에 있어서, 상기 진단키트는 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체; 및 발색기질을 포함하며, 상기 표지체는 HRP(Horse-radish peroxidase)이며, 상기 발색기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine)인 것을 특징으로 하는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트
- 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에 의해 생산되는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론 항체 Anti-2C10를 코팅완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주하여 플레이트를 코팅시키는 단계(1);
상기 (1)의 플레이트에 검사하고자하는 피검어 조직마쇄액을 반응시키는 단계(2);
상기 (2)의 플레이트를 인산완충용액으로 세척하는 단계(3);
상기 (3)의 플레이트에 HRP-축합 신경괴사바이러스 단클론항체를 반응시키는 단계(4);
상기 (4)의 플레이트에 TMB를 첨가하여 발색시키는 단계(5);
상기 (5)의 발색반응이 끝나면 황산으로 효소반응을 정지시키는 단계(6); 및
상기 (6)의 발색정도를 405 nm에서 흡광도를 측정하는 단계(7);로 이루어진 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단방법.
- 제1항에 있어서, 상기 진단키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입인 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트.
- 제5항에 있어서, 상기 스트립 타입의 진단키트는 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에 의해 생산되는 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론 항체 Anti-2C10와 금의 접합체, 마우스 면역글로불린에 대하여 특이적인 항체가 코팅된 멤브레인과 피검체 흡습패드가 부착된 스트립을 포함하는 신속 면역크로마토그래피법에 의한 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 진단키트.
- 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주에서 생산되는 단클론 항체 Anti-2C10.
- 기탁번호 KCLRF-BP-00369의 융합세포주.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160108260A KR101882087B1 (ko) | 2016-08-25 | 2016-08-25 | 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160108260A KR101882087B1 (ko) | 2016-08-25 | 2016-08-25 | 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180023248A true KR20180023248A (ko) | 2018-03-07 |
| KR101882087B1 KR101882087B1 (ko) | 2018-07-25 |
Family
ID=61688772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160108260A KR101882087B1 (ko) | 2016-08-25 | 2016-08-25 | 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101882087B1 (ko) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102025079B1 (ko) * | 2019-04-12 | 2019-09-25 | 대한민국 | 고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법 |
| KR20190138607A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 잉어봄바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138610A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 무지개송어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138609A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 |
| KR102281658B1 (ko) * | 2021-04-02 | 2021-07-26 | 제주대학교 산학협력단 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 저항성 예측용 snp 마커 및 이의 용도 |
| KR102384570B1 (ko) * | 2021-11-30 | 2022-04-08 | 전남대학교산학협력단 | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사 진단키트용 검체시료조성물 및 상기 조성물을 이용한 넙치랩도바이러스병 현장진단방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102034609B1 (ko) * | 2019-04-12 | 2019-10-21 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 검출용 조성물 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN202404102U (zh) * | 2011-11-10 | 2012-08-29 | 鲁东大学 | 鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸 |
| US20120260358A1 (en) * | 2009-10-16 | 2012-10-11 | Takashi Aoki | Aptamer capable of binding to viral hemorrhagic septicemia virus |
| KR101642784B1 (ko) * | 2016-01-15 | 2016-07-27 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 |
-
2016
- 2016-08-25 KR KR1020160108260A patent/KR101882087B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120260358A1 (en) * | 2009-10-16 | 2012-10-11 | Takashi Aoki | Aptamer capable of binding to viral hemorrhagic septicemia virus |
| CN202404102U (zh) * | 2011-11-10 | 2012-08-29 | 鲁东大学 | 鱼类病毒性出血性败血症病毒快速检测试纸 |
| KR101642784B1 (ko) * | 2016-01-15 | 2016-07-27 | 대한민국 | 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별방법 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Clin. Vaccine Immunol., Vol. 21(3), pp. 435-442 (2014.01.15.)* * |
| Journal of Clinical Microbiology, Vol. 30, No. 9, pp 2338-2345 (1992) * |
| 국내 등록특허 제10-1372364호에는 본 발명은 RbFTL-3 단백질, RbFTL-3을 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자로 형질전환된 어류세포, 상기 핵산분자를 포함하는 VHSV(Viral hemorrhagic septisemia virus) 감염 억제용 조성물 및 어류의 VHSV 감염 억제 방법을 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV) 감염 관련 신규한 유전자 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 감염 억제용 조성물을 개시하고 있다. |
| 국내 등록특허 제10-1429112호에는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 커큐민(Curcumin)을 유효성분으로 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septisemia Virus; VHSV)에 대한 항바이러스 조성물을 개시하고 있다. |
| 국내 등록특허 제10-1595442호에는 본 발명은 VHSV 분리지역 특이적인 유전형 (genotype)을 결정하는 단일염기다형성 (SNP)과 이를 판별하기 위한 PNA 및 이를 이용한 VHSV 분리지역 특이적인 유전형 (genotype)을 결정하는 단일염기다형성 (SNP) 판별 방법을 제공하며, 서열번호 1로 이루어진 염기서열을 포함하는 PNA를 이용하여 VHSV G-protein의 C755A 및 A756G의 단일염기다형성 변이를 검출할 수 있는 PNA 및 키트를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 지역 특이적 유전형 판별용 프로브 및 그 용도를 개시하고 있다. |
| 그러나 상기 발명들은 어류 바이러스성 출혈성 패혈증바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도를 제공하는 본 발명과는 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다. |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190138607A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 잉어봄바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138610A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 무지개송어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
| KR20190138609A (ko) | 2018-06-05 | 2019-12-13 | 전남대학교산학협력단 | 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 |
| KR102025079B1 (ko) * | 2019-04-12 | 2019-09-25 | 대한민국 | 고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법 |
| KR102281658B1 (ko) * | 2021-04-02 | 2021-07-26 | 제주대학교 산학협력단 | 넙치의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 저항성 예측용 snp 마커 및 이의 용도 |
| KR102384570B1 (ko) * | 2021-11-30 | 2022-04-08 | 전남대학교산학협력단 | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사 진단키트용 검체시료조성물 및 상기 조성물을 이용한 넙치랩도바이러스병 현장진단방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101882087B1 (ko) | 2018-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20180023248A (ko) | 어류 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR101625979B1 (ko) | 항 ｈ5 아형 ａ형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 모노클로날 항체 | |
| JP5490725B2 (ja) | Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの普遍的な検出のための結合タンパク質およびエピトープブロッキングｅｌｉｓａ | |
| JP3584990B2 (ja) | 抗ヒトインフルエンザウイルス抗体 | |
| Lima et al. | Serology applied to plant virology | |
| CN110272488B (zh) | 猫杯状病毒单克隆抗体及其应用 | |
| KR20160074756A (ko) | 공수병 바이러스 p 단백을 표적으로 하는 단클론 항체 또는 항원 검출 및 중화항체가 측정 시험을 위한 용도 | |
| KR101865878B1 (ko) | 넙치랩도바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR20180023250A (ko) | 넙치의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR101990858B1 (ko) | 흰반점 증후군바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| CN104404000B (zh) | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| KR101884069B1 (ko) | 어류 신경괴사바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| CN117624354A (zh) | 一种抗人乙酰化tau281兔单克隆抗体及其应用 | |
| KR101990850B1 (ko) | 전염성 췌장괴사증 바이러스 및 신경괴사증 바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR102091731B1 (ko) | 해양버나바이러스 및 신경괴사증바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR102341370B1 (ko) | 넙치랩도바이러스병 감염 여부 현장검사용 진단키트 및 진단방법 | |
| Toloza-Moreno et al. | Immunodetection of Furcraea Necrotic Streak Virus-FNSV in fique plants (Furcraea macrophylla Baker) using a polyclonal antibody IgY produced in chicken egg yolk | |
| KR102163242B1 (ko) | 무지개송어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| KR102196159B1 (ko) | 조류 인플루엔자 바이러스 h7 아형의 헤마글루티닌에 대한 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| CN101591390A (zh) | 抗h5n1来源的禽流感病毒核蛋白np的单克隆抗体及其应用 | |
| CN110904053B (zh) | 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| Qian et al. | Preparation of monoclonal antibody against Macrobrachium rosenbergii Nodavirus and application of TAS-ELISA for virus diagnosis in post-larvae hatcheries in east China during 2000–2004 | |
| CN110257341B (zh) | 分泌抗马铃薯m病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| KR102163241B1 (ko) | 돌돔의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론 항체 및 이의 용도 | |
| KR20190138607A (ko) | 잉어봄바이러스에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |