CN101935711B - 整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列检测引物组及其应用 - Google Patents
整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列检测引物组及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医学领域，涉及一种整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列检测方法，其包括：步骤1，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物和针对散在重复序列Alu、MIR和Kpn家族特征序列的特异性引物混合后，通过聚合酶链式反应扩增DNA样品；步骤2，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物和PS引物混合，通过聚合酶链式反应，对由步骤1得到的基因扩增产物再次扩增。本方法能高效、准确地扩增和检测出与人类基因组散在重复序列位置相邻的整合态HPV，有助于临床医生对受感染细胞病理演变的转归趋势作出正确判断，从而实现在疾病早期阶段阻断病程发展，防止癌症发生的目标。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种检测整合至人基因组中的人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸成分的实验方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，缩写HPV)是一种闭合环状双股脱氧核糖核苷酸(DNA)病毒，按其L1基因的特征可分为100多种亚型。其中，与人类恶性肿瘤有关的病毒亚型包括5、6、8、11、16、18、31、33型等，它们携带的病毒癌基因，比如：E6、E7等，在长期共存基础上，可随同病毒基因组本身一起整合到受感染人体细胞的基因组中，与染色体共同复制、转录，最终导致细胞癌变。因此掌握HPV病毒基因组所处的状态，即：是处于细胞内的游离态，还是处于与人类基因组联结的整合态，可以帮助临床医生判断受感染细胞病理演变的转归趋势，预测它们是将进入一般性的病毒损害和凋亡过程；还是将进入与病毒长期共存，逐步癌变的过程。据此，医生能够制定合理的治疗方案，在早期阶段及时阻断病程发展，达到防止癌症发生的目标。
散在重复序列(Interspaced repeat sequence，缩写IRS)是基因组上一段短脱氧核糖核苷酸序列，可用于协助识别染色体上与IRS相邻的某些未知基因的位置。人类很多IRS已经明确，并得到广泛应用，其中，以Alu、MIR和Kpn序列为最常见。在人类单倍体基因组中，Alu序列有约100万个拷贝，估计平均每隔3000个碱基，就会出现一段Alu序列。MIR序列的拷贝数略少于Alu，约为30万个。Kpn序列数量更少些，约3万拷贝。当HPV整合至染色体后，由于其癌基因E6、E7所在的基因组序列必然位于某个IRS附近，因此可以利用邻近的IRS，通过聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，缩写PCR)检测出整合态HPV。这种PCR方法只要在某种恰当的针对IRS和HPV基因组的特异性引物存在的情况下，就可以实施。所得扩增产物可以在琼脂糖电泳或脱氧核糖核苷酸测序中加以鉴定，并根据电泳条带大小、强弱或脱氧核糖核苷酸测序结果，判断待测样本中，是否存在HPV整合情况。
PCR技术由Muller在1983～1985年间发明，其原理是利用引物、脱氧核糖核酸聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸单体在以目标基因为扩增模板的脱氧核糖核酸双链上，通过变性、退火和延伸的反复循环，将微量原始模板以几何级数方式扩增至106～109倍以上，从而能被电泳等方法检测出来。这种检测方法的技术关键在于引物设计。理想的引物具有专一性识别能力，它们能够从人类数万种基因的复杂背景中，挑选出自己的目标序列，即脱氧核糖核酸模板，进行特异扩增。通常，在PCR中，所采用的引物为一对含有15～25个碱基对的寡聚核苷酸单链，它们可分别与目标基因两端分属于正义链和反义链的5’端脱氧核糖核酸序列互补结合，起到引导脱氧核糖核酸聚合酶进行延伸的作用。理论上，PCR扩增产物将按2n的指数曲线增长。于是当进行30～40轮反应循环后，原来一条模板就会倍增至230～40条脱氧核糖核酸双链，后者与原始模板序列完全一致，相当于忠实扩增了109～1012倍左右。但受脱氧核糖核酸聚合酶延伸能力和扩增效率的限制，扩增产物长度一般在1000～2000碱基对之间，增加倍数一般在106～109倍之间。
发明内容
本发明目的是提供一种检测整合至人基因组中的人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸成分的实验方法，即将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物(即：第一组引物)、用于扩增散在重复序列Alu、MIR和Kpn家族成员的引物(即：第二组引物)以及一条被命名为“PS”的引物(即：第三组引物)以不同方式混合在一起，进行聚合酶链反应，从而使DNA样品中与IRS相邻的整合态HPV基因组成分得到高效、准确的扩增和检测。
下面三组引物中，用于指代简并引物的符号意义为：R＝A、G；Y＝C、T； K＝G、T；S＝G、C；M＝A、C；W＝A、T；B＝G、C、T；V＝A、G、C；D＝A、G、T；H＝A、C、T；N＝A、G、C、T。
第一组：通用于HPV各亚型的简并引物
第一对
编号010101(SEQ ID NO 1)：5’-MAVTRCWKKCTTGCRWAAYACRCA-3’
编号010102(SEQ ID NO 2)：5’-KMARYKYYKTGCAKARMTSDKSTA-3’
第二对
编号010201(SEQ ID NO 3)：5’-SYKYHCCTGTTKTKTKBTSYACWA-3’
编号010202(SEQ ID NO 4)：5’-CMWWAAACCAKCCDKTACAH-3’
第三对
编号010301(SEQ ID NO 5)：5’-RYBTAKRTCWKTACTRTYWYTTC-3’
编号010302(SEQ ID NO 6)：5’-AYTKGTCCTGVMMSVMAYYT-3’
第四对
编号010401(SEQID NO 7)：5’-WAYWAYRTCWGGKGGRCATGTWCC-3’
编号010402(SEQID NO 8)：5’-ARBTSDGTWRCCGAHGCMCG-3’
第五对
编号010501(SEQ ID NO 9)：5’-GSGWKYMACATAHKCATCSGTRBY-3’
编号010502(SEQ ID NO 10)：5’-MAVRTAKACDGTRBYSTCRCTA-3’
该组的每个引物对，其两个成员针对的都是HPV基因组的同一基因区，前后相距不超过1000个碱基对。两个成员可分别应用于两个阶段的PCR扩增，它们前后相继，通过重复PCR扩增的验证，保证了产物具有高度特异性。所有引物都设计在了HPV基因组的保守区，且识别和结合的目标序列在基因组内部平均分布，故无论HPV以何种方式整合，上述引物对都能保证以最大概率扩增得到整合态HPV基因。
第二组：用于Alu、MIR和Kpn各家族成员的简并引物
第一对
编号020101(SEQ ID NO 11)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTT GATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTACAGAGHGAGACTCH-3’
编号020102(SEQ ID NO 12)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTDGAGTCTCDCTCTGT-3’
第二对
编号020201(SEQ ID NO 13)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTCCTCAGTTTCCTCANY-3’
编号020202(SEQ ID NO 14)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTGATGAGGAAACTGARK-3’
第三对
编号020301(SEQ ID NO 15)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTGTGCACATGTACCCTAVR-3’
编号020302(SEQ ID NO 16)：5’-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTAGGTGTAGTTGTGCAGGTTTGTTACATA-3’
该组第一对引物对针对Alu序列的各家族成员，其识别和结合的目标序列在基因保守区内，可保证它与多数Alu同源序列有相似的结合能力；第二对引物对是针对MIR各家族成员的，也是根据基因保守区设计得到；第三对引物对针对的是Kpn序列各家族成员，设计原理一样。这三对引物均用于半定向扩增IRS与整合态HPV所在部位之间的脱氧核糖核酸序列。之所以要把这些建立在第二组引物基础上的PCR扩增称为半定向扩增，原因是该组引物不仅可以扩增含HPV基因的IRS邻近序列，并且对于相邻IRS之间的无关序列，即使在其不含HPV基因成分的情况下，也有将它们扩增出来的可能性。另外，要注意，该组每个引物对所包含的两个成员，都是反向互补的，因此在PCR过程中必须将两者分开，绝不可在同一反应体系中使用同一引物对。
第三组：PS引物
编号030001(SEQ ID NO 17)：5’-GGTTGATCGTGAGAGT-3’
该组引物用于扩增第一、二组引物为基础进行PCR得到的脱氧核糖核酸扩增产物，引物结合处位于第二组引物内部。这组引物与人或HPV基因组同源性极低，因此得到非特异性扩增产物的概率也非常低。又因该组引物只扩 增前阶段PCR的既得产物，而不扩增未经过前阶段PCR扩增的人或HPV基因序列，故称其为定向扩增。该组引物对整合态HPV的选择性是通过其在第二组引物内的结合区获得的。如果前次扩增产物不具HPV基因成分，则其两端将都由第二组引物构成。相同的序列间会反向互补，并以较高退火温度自我结合，于是阻碍了PS引物与之的结合。如前次扩增产物含HPV基因成分，则其两端将分属于第一、二组引物，这两种序列之间并不互补，因此不会自我结合。于是，PS引物便可顺利与目标序列结合，而不受干扰。然后，它们可与第一组引物一起，对前次含整合态HPV基因的扩增产物进行第二阶段的扩增，这样便形成了选择性。
用于检测整合态HPV的PCR可分为两个阶段：1、半定向扩增阶段，和2、全定向扩增阶段。这两个阶段既可以在同一反应容器中进行，也可以在两个或更多不同的反应容器中进行。每个阶段都由若干个温度循环构成，每个温度循环包括变性、退火和延伸三个步骤，变性温度为93摄氏度～95摄氏度，退火温度为45摄氏度～72摄氏度，延伸温度为50摄氏度～72摄氏度。变性、退火和延伸的保温时间为5秒～3分钟。每阶段所设定扩增循环数在10～50次之间。第一阶段的脱氧核糖核酸扩增模板是待测样品基因组抽提物，第二阶段扩增模板所用的是第一阶段PCR扩增产物。
第一阶段PCR过程中，用于扩增反应的引物组成为：(1)1～5条编号为010x01的引物，其中x表示1～5号数字；(2)1～3条编号为020y0z的引物，其中y表示1～3号数字，x表示1～2号数字。上述引物既可以加入同一个反应容器中，以相同成分的缓冲溶液、脱氧核糖核苷酸单体、脱氧核糖核酸聚合酶的反应体系，于同样温度条件下扩增；也可以将010x01引物与020y0z引物，按照一条第一组引物对一条第二组引物，或一条第一组引物对多条第二组引物等不同方式的进行组合，然后置于不同的反应容器中，于相同反应体系和温度条件下扩增。
此处设定：对于第一阶段PCR过程中使用的引物，其第一组引物总量和第二组引物总量的比值，按摩尔数计为n：1，要确保n必须大于10，且一个反应体系中，所用第二组引物的总量必须小于1pmol，这种措施可称为“IRS-PCR扩增的引物极限法”。采取这一措施的主要目的在于通过对引物绝对数量的限制，来减少因单引物随机结合而致相邻IRS之间无关序列扩增所得产物的数量，从而降低进入第二阶段PCR 扩增时，在有待扩增的脱氧核糖核酸模板混合物中，作为初次产物的IRS无关序列和目标序列的浓度比值。
第二阶段PCR过程中，用于扩增反应的引物组成为：(1)1～5条编号为010x02的引物，其中x表示1～5号数字；或者仍然使用与第一阶段反应相同的编号为010x01的引物，其中x表示1～5号数字。(2)编号为030001的PS引物。如果第一阶段使用的是多管扩增，第二阶段使用的是单管扩增，那么在第二阶段中要将前阶段PCR扩增产物取出相同数量的一部分，即相同微升数，并加以混合，然后添加到第二阶段所用的单一反应容器中。如果第一阶段PCR使用的是多管扩增，第二阶段使用的也是多管扩增，那么在第二阶段中要将前阶段PCR扩增产物取出相同数量的一部分，即相同微升数，然后一一对应地添加到对应的反应容器中，使得前后两管所用010x01引物和010x02引物能够一致起来，以确保它们所针对的是同一HPV基因区。
第一阶段和第二阶段也可以合并起来，置于同一反应容器中，进行PCR扩增。这种扩增使用的引物共有三种。(1)1～10条编号为010a0b的引物，其中a表示1～5号数字，b表示1～5号数字；(2)1～3条编号为020c0d的引物，其中c表示1～3号数字，d表示1～2号数字；(3)编号为030001的PS引物。这种情况下，使用的循环次数和温度为：第一阶段10～20次循环，变性温度为93摄氏度～95摄氏度，退火温度为50摄氏度～72摄氏度，延伸温度为50摄氏度～72摄氏度；第二阶段30～50次循环，变性温度为93摄氏度～95摄氏度，退火温度为40摄氏度～55摄氏度，延伸温度为50摄氏度～72摄氏度。变性、退火和延伸的保温时间为5秒～3分钟。要注意的是，纳入的第一、二组引物数量越多，则得到的PCR检测灵敏度就越高，但因此形成非特异性产物的机会也越多，这会使检测的特异性降低。
具体实施方案
实施例1
在同一反应容器中，以相同反应体系和温度条件完成第一阶段和第二阶段PCR。
所用实验材料为：从临床获得的妇女宫颈脱落细胞样品一份，并取其基因组抽提物用于本次实验；10倍PCR缓冲液，25mmol/L MgCl2，4种脱氧核 糖核苷酸单体：即浓度为5mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP溶液，5U/μLTaq酶(市售)和无菌水；编号为010101、010201、010301、010401、010501的第一组引物，编号为020101、020201、020301的第二组引物和编号为030001的第三组引物。
配制如下的50μL反应体系：
(1)样品基因组抽提物溶液：10μL
(2)第一组引物溶液：1μL，其中含010101、010201、010301、010401、010501号引物各20pmol
(3)第二组引物溶液：1μL，其中含020101、020201、020301号引物各20fmol
(4)第三组引物溶液：1μL，其中含030001号引物20pmol
(5)dNTP：1μL，其中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各5nmol
(6)10倍PCR缓冲液：5μL
(7)25mmol/L MgCl2：5μL
(8)5U/μL Taq酶：1μL
(9)无菌水：25μL
在热循环仪上，设置PCR程序如下：
(1)50摄氏度，2分钟
(2)94摄氏度，5分钟
(3)93摄氏度，15秒
(4)60摄氏度，90秒
(5)循环步骤(3)～(4)，共10次
(6)93摄氏度，15秒
(7)50摄氏度，90秒
(8)循环步骤(6)～(7)，共40次
(9)72摄氏度，10分钟
反应完成后，取出扩增产物10μL，在含溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶中，以120伏电压电泳20分钟。紫外灯下，可见凝胶中，相对于分子量标准的200～2000碱基对区间内，PCR产物中分布有十余条脱氧核糖核酸片段条带， 割胶取出最亮者，抽提其中含有的脱氧核糖核酸扩增产物，并加以测序鉴定，证实此条带为一条同时含有部分人和HPV E6基因的嵌合型脱氧核糖核酸双链扩增产物。
实施例2
第一阶段PCR在5个反应容器中进行，第二阶段PCR在1个反应容器中进行。
所用实验材料为：从临床获得的妇女宫颈脱落细胞样品一份，并取其基因组抽提物用于本次实验；10倍PCR缓冲液，25mmol/L MgCl2，4种脱氧核糖核苷酸单体：即浓度为5mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP溶液，5U/μLTaq酶和无菌水；编号为010101、010201、010301、010401、010501、010102、010202、010302、010402、010502的第一组引物，编号为020101、020102、020201、020202、020301、020302的第二组引物和编号为030001的第三组引物。
为第一阶段PCR配制5管如下的25μL反应体系：
(1)样品基因组抽提物溶液：10μL
(2)第一组引物溶液：1μL，对单个反应容器而言，体系中只含010101、010201、010301、010401或010501号引物当中的一条，其含量为20pmol
(3)第二组引物溶液：1μL，其中所含为020101、020201、020301号引物组合，或是020102、020202、020302号引物组合中的一个，组合中每种引物含量为20fmol
(4)dNTP：1μL，其中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各5nmol
(5)10倍PCR缓冲液：5μL
(6)25mmol/L MgCl2：5μL
(7)5U/μL Taq酶：1μL
(8)无菌水：1μL
为第一阶段PCR，设置PCR程序如下：
(1)50摄氏度，2分钟
(2)94摄氏度，5分钟
(3)93摄氏度，15秒
(4)60摄氏度，90秒
(5)循环步骤(3)～(4)，共15次
(6)72摄氏度，5分钟
待第一阶段PCR完成后，从5个反应容器扩增产物中各取出1μL，混合后待用。然后，为第二阶段PCR配制1管50μL反应体系如下：
(1)第一阶段PCR扩增产物的混合物：10μL
(2)第一组引物溶液：1μL，其中含010102、010202、010302、010402、010502号引物各20pmol
(3)第三组引物溶液：1μL，其中含030001号引物20pmol
(4)dNTP：1μL，其中含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各5nmol
(5)10倍PCR缓冲液：5μL
(6)25mmol/L MgCl2：5μL
(7)5U/μL Taq酶：1μL
(8)无菌水：26μL
为第二阶段PCR，设置PCR程序如下：
(1)50摄氏度，2分钟
(2)94摄氏度，5分钟
(3)93摄氏度，15秒
(4)50摄氏度，90秒
(5)循环步骤(3)～(4)，共35次
(6)72摄氏度，10分钟
待第二阶段PCR完成后，取出10μL扩增产物，以120伏电压，于含溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶中，电泳20分钟。紫外灯下，见凝胶中，对应于分子量标准200～2000碱基对片段的区间内，在PCR产物中分布有几条脱氧核糖核酸片段条带，割胶取出其最亮者，抽提其中所含的脱氧核糖核酸，并加以测序鉴定，证实此条带为一条含有人基因组和HPV E6基因接头序列的脱氧核糖核酸双链扩增产物。
序列表
<110>复旦大学附属妇产科医院
<120>整合态人乳头瘤病毒的散在重复序列检测法
<160>17
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<222>(65)
<223>n＝a或g或c或t，r＝a或g，y＝c或t，k＝g或t，s＝g或c，m＝a或c，w＝a或t，b＝g或c或t，v＝a或g或c，d＝a或g或t，h＝a或c或t
<400>13
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttcctcagtttc 60
ctcany 66
<210>14
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>r＝a或g，y＝c或t，k＝g或t，s＝g或c，m＝a或c，w＝a或t，b＝g或c或t，v＝a或g或c，d＝a或g或t，h＝a或c或t
<400>14
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgatgaggaaa 60
ctgark 66
<210>15
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400>15
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgtgcacatgt 60
accctavr 68
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<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400>16
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgtgcaggttt 60
gttacata 68
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<400>17
Ggttgatcgtgagagt 16
Claims (5)
1.一种用于以散在重复序列法检测整合态人乳头瘤病毒的引物组，其特征在于，该引物组由三类不同的引物按一定数量和方式组合而成，它们是：（1）通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物，即序列表中SEQ ID NO 1-10所示的核酸分子；（2）用于扩增散在重复序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物，即序列表中SEQ ID NO 11-16所示的核酸分子；以及（3）PS引物，即序列表中SEQ ID NO 17所示的核酸分子。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的用于构成该引物组的通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物是序列表中SEQ ID NO 1-10所示的核酸分子中的任意1～10条。
3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的用于构成该引物组的用于扩增散在重复序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物是：（1）序列表中SEQID NO 11、13和15所示的核酸分子中的任意1-3条；或者（2）序列表中SEQ IDNO 12、14和16所示的核酸分子中的任意1-3条。
4.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的用于构成该引物组的PS引物是序列表中SEQ ID NO 17所示的核酸分子。
5.权利要求1所述的引物组在制备以散在重复序列法检测整合态人乳头瘤病毒的检测制剂中的用途，其中，将通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物、用于扩增散在重复序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物和PS引物以不同方式加以混合，进行多重和多阶段聚合酶链式反应，使DNA样品中整合态HPV基因组成分得到扩增和检测；其中，通用于人乳头瘤病毒各亚型基因的扩增引物总量的摩尔数与用于扩增散在重复序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物总量的摩尔数之比大于10：1，其中，用于扩增散在重复序列Alu、MIR和Kpn各家族的引物总量的摩尔数小于1pmol。
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