CN102312007A - 铂类药物疗效相关基因snp检测特异性序列和液相芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铂类药物疗效相关基因SNP检测特异性序列、液相芯片，所述液相芯片主要包括有：选自：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQID NO.5及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、和/或SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10的野生型及突变型特异性ASPE引物对；分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的序列；扩增SNP位点的目标序列的引物。本发明所述检测液相芯片及检测方法的检测灵敏度高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

Description

铂类药物疗效相关基因SNP检测特异性序列和液相芯片

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及铂类药物疗效相关基因ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1的SNP检测的特异性序列和液相芯片。

背景技术

自从1967年顺铂的抗癌活性被发现以来，铂类抗癌药物的研究和应用得到了迅速的发展。目前已发展出以卡铂为代表的第二代，和以奥沙利铂为代表的第三代铂类药物。铂类是目前常用的广谱抗肿瘤药，已成为癌症化疗中不可缺少的药物。铂类药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要是消化系统毒性，常见为恶心、呕吐，还可有肾毒性、肝毒性和骨髓抑制，耳毒性和神经毒性较轻。

铂类药物的抗肿瘤作用是通过作用于DNA，形成Pt-DNA结合物，导致DNA的链内和链间交联，从而抑制DNA的合成及复制。大量的临床研究已经证实，铂类药物的疗效/毒副作用与患者体内四个基因的单核苷酸多态性(SNP)关系密切，即ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1。ERCC1和ERCC2都是DNA核苷酸切除修复途径的关键基因，XRCC1是DNA碱基切除修复途径中的重要因子。GSTP1是一种谷胱甘肽S转移酶，它通过将有毒物质的亲电子基团与谷胱甘肽结合，起到保护细胞大分子的作用。这四个基因通过参与DNA修复等生理过程，使受铂类化合物破坏的DNA回复正常或使DNA免受破坏，在肿瘤细胞中造成耐药，而在正常细胞中则能够减少毒副作用。因此，专家推荐患者在接受铂类化疗之前，进行相关的基因SNP检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案。这样将明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

大量临床研究显示，最常见的造成这四个基因功能减弱的多态性位点分别是ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。在中国人群中，ERCC1-C19007T、ERCC1-C8092A、ERCC2-A2282C和XRCC1-G1301A的基因分布频率分别约为21％、24％、5％和30％；GSTP1-A1578G基因分布频率约21％。大量研究表明，在ERCC1、ERCC2、XRCC1这三个基因中携有一个或以上功能减弱等位基因型的患者，在接受铂类化疗时，发生毒副作用的几率明显升高，以致治疗效果较差。而GSTP1-A1578G基因多态性位点的情况正好相反，遗传基因型为GA或GG的患者，在接受铂类化疗时，对铂类药物的反应率较高、有较好的疗效。因此，通过对这五个常见功能SNP位点进行检测，根据患者的基因型判断是否采用铂类药物或制定个体化用药方式，将能明显提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前已建立了若干以PCR为基础的检测基因单核苷酸多态性(SNP)的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种SNP位点的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多个SNP位点，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。

发明内容

本发明的目的之一是提供与铂类药物疗效密切相关的ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于单项或者并行检测以下5个常见的SNP位点：ERCC1的C19007T和C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G。

一种铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，包括有：

1.针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对分别选自：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、和/或SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10；

2.分别包被有特异的anti-tag序列1的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的序列；优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

3.针对ERCC1基因的C19007T、ERCC1基因的C8092A、ERCC2基因的A2282C、XRCC1基因的G1301A、和/或GSTP1基因的A1578G SNP位点的目标序列的扩增引物。优选地，分别扩增出五个具有SNP位点的目标序列的引物选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的序列，即针对C19007T的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，针对C8092A的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，针对A2282C的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，针对G1301A的SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28，针对A1578G的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30。

本发明的另一目的是提供用于铂类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，该序列特性强，能准确区分SNP的各种基因型。

所述特异性序列为：针对ERCC1基因的C19007T的SNP位点的SEQ ID NO.31及SEQ IDNO.32、针对ERCC1基因的C8092A的SNP位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对ERCC2基因的A2282C的SNP位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对XRCC1基因的G1301A的SNP位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和/或针对GSTP1基因的A1578G的SNP位点的SEQID NO.39及SEQ ID NO.40。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。

2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分SNP的各种基因型。

3.使用本发明所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成五个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。

5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片试剂盒，主要包括有：

一、特异性引物序列(ASPE引物)

针对铂类药物疗效相关基因的各5个常见SNP位点分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由Tag+特异性引物序列组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1ASPE引物序列(Tag+特异引物)

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条ASPE引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，与选择的十种tag序列相应的微球上的anti-tag序列如表2所示：

表2与ASPE特异性引物右端的Tag序列对应的微球上的anti-tag序列

选择的十种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA]中，2-8℃避光保存。

三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物：

目标检测的5种常见SNP位点ERCC1的C19007T、C8092A，ERCC2的A2282C，XRCC1的G1301A，以及GSTP1的A1578G都在不同的基因或外显子上。利用Primer5.0设计五对引物(见表3)，分别扩增出五条具有SNP位点的目标序列。

表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2运用实施例1所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

2×Tm杂交缓冲液

试剂	来源	终浓度	每250ml的用量
				1MTris-HCl，pH8.0	SigmaT3038	0.2M	50ml
5M NaCl	Sigma S5150	0.4M	20ml
				Triton X-100	Sigma T8787	0.16％	0.4ml

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA.

二、待测样品的PCR扩增

利用Primer5.0设计五对引物，多重PCR一步扩增出ERCC13’UTR和外显子4、ERCC2外显子23、XRCC1外显子10和GSTP1外显子5共五条具有SNP位点的目标序列，产物大小分别为638bp、250bp、507bp、295bp和399bp。引物序列(SEQ NO.21-30)见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.21-30的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存。

三、PCR产物的酶切处理

参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：

1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；

2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取C19007T-w、C19007T-m、C8092A-w、C8092A-m、A2282C-w、A2282C-m、G1301A-w、G1301A-m、A1578G-w和A1578G-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：

PCR程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，选择上述十种微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH₂O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；

7.95℃解链60s，37℃杂交15min；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；微球于≥3000g离心2-5min；

11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。

对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：

1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；

2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；

3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：

突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NETMFI+野生型NET MFI)

4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。

使用本方法检测20份样本的ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为突变型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的铂类药物疗效相关基因突变型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出ERCC1、ERCC2、XRCC1和GSTP1基因SNP类型，且结果稳定可靠。

表4样本检测结果(MFI)

表5样本基因型分析结果

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (9)

1.一种铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，包括有：

(1).针对GSTP1基因的A1578G SNP位点设计的野生型和突变型特异ASPE引物对，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；

(2).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20中的序列；

(3).针对GSTP1基因的A1578G SNP位点的目标序列的扩增引物。

2.根据权利要求1所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(3)中所述引物为：针对A1578G的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30。

3.根据权利要求1所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。

4.根据权利要求3所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。

5.一种铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(1).针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因SNP位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述野生型及突变型特异性ASPE引物对为：针对GSTP1基因的A1578G的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10，以及选自针对ERCC1基因的C19007T的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、针对ERCC1基因的C8092A的SEQID NO.3及SEQ ID NO.4、针对ERCC2基因的A2282C的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和针对XRCC1基因的G1301A的SSEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8中的一对以上；

(2).分别包被有特异的anti-tag序列的10种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的序列；

(3).扩增出具有需要检测的、相应SNP位点的目标序列的引物对：针对GSTP1基因的A1578G的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30，以及选自针对ERCC1基因的C19007T的SEQ IDNO.21及SEQ ID NO.22、针对ERCC1基因的C8092A的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、针对ERCC2基因A2282C的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和针对XRCC1基因的G1301A的SEQ IDNO.27及SEQ ID NO.28中的一对以上。

6.根据权利要求5所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。

7.根据权利要求6所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。

8.一种用于铂类药物疗效相关基因SNP检测的特异性序列，其特征是，所述特异性序列包括针对GSTP1基因的A1578G的SNP位点的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40。

9.根据权利要求8所述的铂类药物疗效相关基因SNP检测液相芯片，其特征是，所述特异性序列还包括有：针对ERCC1基因的C19007T的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对ERCC1基因的C8092A的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对ERCC2基因的A2282C的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、和/或针对XRCC1基因的G1301A的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38。