CN116606826B - 植物ndh多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物NDH多克隆抗体及其制备方法。制备所述NDH多克隆抗体的抗原表位肽序列如序列表SEQ ID NO:1‑15所示。本发明设计NDH相关蛋白的抗原表位以及合成的相应的KLH偶联多肽，以该系列偶联多肽作为免疫原免疫动物获得相应的抗体，用于western blot法检测植物NDH相关蛋白的检测试剂，实现了NDH相关蛋白的全检测和精确定量检测，有利于对NDH的深入研究。
Description
技术领域
本发明属于检测用抗体制备技术领域，具体涉及一种植物NDH多克隆抗体及其制备方法。
背景技术
叶绿体NDH（辅酶II脱氢酶）复合体含有29个蛋白亚基，分布在SubA、SubB、SubM、SubL和SubE 5个亚复合物中。此外，叶绿体NDH复合体还通过光系统I（PSI）的天线蛋白Lhca5和Lhca6介导与两个PSI复合体组成一个NDH-PSI超级复合物。叶绿体NDH复合体主要参与叶绿体呼吸以及围绕PSI的环式电子传递途径（CET），它不但能够在胁迫条件下缓解叶绿体基质（stroma）侧的过度还原、维持光合电子传递链氧化还原系统的平衡，而且能够调节光合电子传递产物NAD(P)H/ATP的比例，为其他生化反应提供足额的ATP。NDH在植物光合作用过程中发挥着重要的作用，但是NDH主要为跨膜蛋白，在蛋白结构上大量跨膜会影响相关研究定量检测，现有市场NDH抗体非常少，常见的为单个亚基蛋白全长或特定一段蛋白免疫制备的抗体，这些抗体的专一性和灵敏性均不强，亚基间交叉反应太多，检测结果不可靠，为了更好对NDH蛋白研究我们研发出针对每个亚基特定抗原多克隆抗体，完全解决现在对光合电子传递链氧化还原系统研究使用NDH检测定量不准的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NDH多克隆抗体及其制备方法。
一种NDH抗原表位肽，所述抗原表位肽为：来自NDHA蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；来自NDHB蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:2所示；来自NDHC蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；来自NDHD蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；来自NDHE蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；来自NDHF蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；来自NDHG蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:7所示；来自NDHH蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；来自NDHI蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；来自NDHJ蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；来自NDHK蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；来自NDHL蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:12所示；来自NDHM蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；来自NDHN 蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；来自NDHO蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示。
优选的，在抗原表位肽氨基酸序列中不含有半胱氨酸的抗原表位肽末端加半胱氨酸。
一种NDH多克隆抗体的制备方法，按照如下步骤进行：
（1）抗原的合成：按照权利要求1所述NDH抗原表位的氨基酸序列，人工合成抗原多肽，在不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸；
（2）将抗原多肽连到具有强免疫原功能的KLH蛋白上并用PBS稀释后，得到抗原溶液；
（3）动物免疫：将步骤（2）制备的抗原溶液对动物进行免疫使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
步骤（2）PBS稀释至抗原浓度为0.5～5mg/mL。
述动物为兔、小鼠、大鼠、山羊中的一种。
一种检测植物中NDH相关蛋白的试剂盒，该试剂盒包含所述的多克隆抗体；所述相关蛋白包括NDHA蛋白、NDHB蛋白、NDHC蛋白、NDHD蛋白、NDHE蛋白、NDHF蛋白、NDHG蛋白、NDHH蛋白、NDHI蛋白、NDHJ蛋白、NDHK蛋白、NDHL蛋白、NDHM蛋白、NDHN 蛋白、NDHO蛋白。
一种所述多克隆抗体在检测植物中NDH蛋白的应用。
优选的，所述检测植物中NDH蛋白的方法为western blot。
本发明的有益效果：本发明设计NDH相关蛋白的抗原表位以及合成的相应的KLH偶联多肽，以该系列偶联多肽作为免疫原免疫动物获得相应的抗体，用于western blot法检测植物NDH相关蛋白的检测试剂，实现了NDH相关蛋白的全检测和精确定量检测，有利于对NDH的深入研究。
附图说明
图1 为NDHA抗体检测图；图中，1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图2 为NDHB抗体检测图；图中，1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：4000。
图3 为NDHC抗体检测图；图中，1-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图4 为NDHD抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；2-含0.5ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图5 为NDHE抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图6 为NDHF抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图7 为NDHG抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图8 为NDHH抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图9 为NDHI抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：4000。
图10 为NDHJ抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：3000。
图11 为NDHK抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；一抗稀释比例1：5000。
图12 为NDHL抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图13 为NDHM抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：1000。
图14 为NDHN抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：2000。
图15为NDHO抗体检测图；图中，1-含30ug色素的拟南芥WT型类囊体膜蛋白；2-含30ug色素的拟南芥WT总蛋白；一抗稀释比例1：5000。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
实施例1 抗原表位设计
采用antheprot软件，根据www.arabidopsis.org公布的拟南芥NDH蛋白序列（ATCG01100/NDHA、ATCG00890/NDHB、ATCG00440/NDHC、ATCG01050/NDHD、ATCG01070/NDHE、ATCG01010/NDHF、ATCG01080/NDHG、ATCG01110/NDHH、 ATCG01090/NDHI、 ATCG00420/NDHJ、ATCG00430/NDHK、AT1G70760/NDHL、AT4G37925/NDHM、AT5G58260/NDHN、AT1G74800/NDHO），对NDHA(A-O)的NDHA蛋白、NDHB蛋白、NDHC蛋白、NDHD蛋白、NDHE蛋白、NDHF蛋白、NDHG蛋白、NDHH蛋白、NDHI蛋白、NDHJ蛋白、NDHK蛋白、NDHL蛋白、NDHM蛋白、NDHN 蛋白、NDHO蛋白进行序列分析，分析内容包括跨膜区分，信号肽分析，修饰位点分析和全序列分析，从中找出可能的抗原表位，并将上述抗原表位中不含有半胱氨酸的序列末端加上半胱氨酸。
最终选定如表1所述的抗原表位：
抗原表位肽的人工合成：由吉尔生化（上海）有限公司通过氨基酸直接合成法合成。
抗原表位肽与载体蛋白的偶联：
1）将20mg SMCC溶于2ml DMF，0.8ml KLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS使蛋白终浓度为15mg/ml；
2）将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h；
3）用1L的1×PBS溶液于4℃下透析6h，除去游离的SMCC；
4）将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中；加入KLH蛋白的量为120mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml；
5）将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS溶液溶解；
6）用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0 .15做下一步；OD值＜0.05补加多肽，直至达到要求；OD值< 0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联；如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。
实施例2 多克隆抗体制备
免疫动物选择年龄在3个月、体重2.5±0.1kg，健康的雄性新西兰大白兔，以实施例1中制备的抗原，进行动物免疫。
首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用PBS（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH7.4）稀释至1mg/mL，分装后储存于-20℃。取500μL的1mg/mL抗原（即0.5mg，加入300μL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂（首次免疫）或弗氏不完全佐剂（第2-4次免疫）。对兔子的四肢、腋下及背部皮下进行多点注射，首次免疫三周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次（共进行4次免疫）。第3次免疫7天后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者，于第4次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜或者37℃温育3h，在4℃条件下，6000rpm离心10min，收集血清，分装后-80℃保存。
硫酸铵沉淀法浓缩蛋白样品：将20mL的血清用TBS缓冲溶液稀释到100mL，然后边搅拌该溶液中边加入饱和硫酸铵溶液，直至硫酸铵溶液浓度达到55%，4℃条件下，使用磁力搅拌器搅拌过夜。第二天将含有大量沉淀的溶液进行离心处理，弃上清，保留沉淀。加入10mL含有叠氮钠的PBS缓冲溶液溶解沉淀，用透析袋进行透析处理，去除硫酸铵。透析后，对透析袋中的溶液进行离心处理，收集上清。
亲和层析纯化抗多肽抗体：将上述透析离心后的蛋白溶液以0.5mL/min的速度加入层析柱（protein A FF）内，为保证抗体蛋白与填料的充分结合，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液的A280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液（50mM甘氨酸，pH2.7）以相同的速度洗脱，用事先加入中和缓冲液（1M Tris-HCl,pH8.0,1.5M NaCl，1mM EDTA）的离心管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查溶液的pH，如果pH低于7.4，可用中和缓冲液调至约pH7.4，以防止抗体变性，同时检测抗体的浓度，最后加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，即得纯化好的多克隆抗体。
实施例3 western blot检测抗体
拟南芥中总蛋白提取方法：
1.取约50mg组织放于离心管中，液氮中冷冻；
2.样品研磨至粉末；
3.加入相当于样品量2倍体积的蛋白提取液（例如：100 μl提取液/50 mg组织），并充分混匀；
4.沸水中变性样品，5 min；
5.最大转速离心10 min，分离上清与沉淀；注意：若蛋白为可溶蛋白或者存在明显的溶解，按1:1的比例添加匀浆液（例如：50μl 匀浆/50 mg组织），然后4℃最大转速离心10min。
6.以BSA为标准利用Bradford实验估测上清液中的蛋白浓度；注意：Bradford实验不能检测含SDS的蛋白溶液。
7.用SDS胶检测蛋白。
1×Laemmli SDS-PAGE buffer:
蛋白匀浆液：
类囊体膜蛋白提取方法：
0.33M Sorbitol (M=182.17) 60.12g
30mM Tricine/KOH (0.5M, pH 8.4) 40ml
5 mM EDTA (0.25M, pH 8.35) 20ml
10 mM NaHCO3 (M=84.01) 20ml
0.3M Sorbitol (M=182.17) 13.66g
20mM Hopes/KOH (1M, pH 7.6) 5ml
5 mM EDTA (0.5M, pH 8.0) 1.25ml
5 mM MgCl2 (M=203.3) 0.255g
1.87M Ascorbate 20ul
10% BSA 200ul
Medium I 20ml
提取步骤：
取50ml离心管，加入20mlMedium I+BSA+ASA溶液，置于冰上；
取生长3周左右的哥伦比亚型拟南芥叶片1g，加入上述溶液中，用匀浆器打碎；
将上述液体用两层的过滤膜过滤，然后4200g, 4度离心5min；
弃上清，沉淀用1ml的Medium II悬浮，然后8000g，4度离心2min；
弃上清，沉淀用不含山梨醇的Medium II悬浮，8000g，4度离心2min；
沉淀用200ul的不含山梨醇的Medium II悬浮即为类囊体膜蛋白；丙酮法定量。
将实施例2制备的抗体（作为一抗）分别稀释为不同的浓度，二抗稀释比例为1：20000。
制备分离胶，配方为：15%分离胶预混液 4.5ml+10%APS 25μl + TEMED2.5μl/块胶，用量为4.5ml /块胶，凝胶时间15min；制备浓缩胶，配方为：4.5%浓缩胶预混液 2ml +10%APS 20μl + TEMED 2μl /块胶，用量为2ml /块胶，凝胶时间20min。
上样：上样体积为10μl；标准Marker稀释20倍，上样10μl。
电泳：电泳缓冲液500ml /电泳槽，配方：50ml 10×Tris-Gly-SDS 电泳缓冲液 +450ml 超纯水；电泳电流10 mA 恒流，电压300 V，电泳时间3h40min。
转膜：采用NC 膜，膜孔径0.22μm，转膜液用量1.5L /电泳槽，配方：150ml 10×Tris-Gly-SDS 电泳缓冲液+300ml甲醇+1050ml 超纯水，转膜电流180 mA 恒流，转膜电压300 V，转膜时间：1h。
洗膜：洗膜液用量20ml /张膜，配方（每 L）: 100ml 10×TBS+5ml 20%Tween-20+895ml 超纯水；洗膜3次，每次10min，脱色摇床转速60 rpm。
封闭：封闭液为5%脱脂奶粉+20ml 1×TBST，用量为20ml /膜，封闭时间为1h，脱色摇床转速60 rpm。
一抗孵育：一抗稀释液（1×TBST +BD 脱脂奶粉）20ml + 一抗20 ml 0.2g，4℃转移脱色摇床过夜，然后洗膜。
二抗孵育：二抗稀释液（1×TBST +BD 脱脂奶粉）20ml + 二抗20 ml 0.2g，4℃转移脱色摇床2h，然后洗膜。
ECL曝光：ECL→A 液：B液=1:1（Cat No.WBKLS0500 Lot No.1529202），曝光30s。
测试结果如图1-14所示，NDHA、NDHB、NDHC、NDHD、NDHE、NDHF、NDHG、NDHH、NDHI、NDHJ、NDHK、NDHL、NDHM、NDHN 、NDHO的一抗浓度稀释至1：1000至1：5000均有清晰的检测结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.NDH抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为：来自NDHA蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；来自NDHB蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；来自NDHC蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；来自NDHD蛋白的抗原表位，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；来自NDHE蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；来自NDHF蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；来自NDHG蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:7所示；来自NDHH蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；来自NDHI蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；来自NDHJ蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；来自NDHK蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示；来自NDHL蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:12所示；来自NDHM蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示；来自NDHN 蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:14所示；和来自NDHO蛋白的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:15所示。
2.根据权利要求1所述NDH抗原表位肽，其特征在于，在抗原表位肽氨基酸序列中不含有半胱氨酸的抗原表位肽末端加半胱氨酸。
3.一种NDH多克隆抗体的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
（1）抗原的合成：按照权利要求1所述NDH抗原表位肽的氨基酸序列，人工合成抗原多肽，在不含有半胱氨酸的抗原表位末端加半胱氨酸；
（2）将抗原多肽连到具有强免疫原功能的KLH蛋白上并用PBS稀释后，得到抗原溶液；
（3）动物免疫：将步骤（2）制备的抗原溶液对动物进行免疫使其产生多克隆抗体，然后采集动物的多抗血清，分离纯化后，即得多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述NDH多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）PBS稀释至抗原浓度为0.5～5mg/mL。
5.根据权利要求3所述NDH多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述动物为兔、小鼠、大鼠、山羊中的一种。
6. 一种检测植物中NDH相关蛋白的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求3中所述的多克隆抗体；所述相关蛋白包括NDHA蛋白、NDHB蛋白、NDHC蛋白、NDHD蛋白、NDHE蛋白、NDHF蛋白、NDHG蛋白、NDHH蛋白、NDHI蛋白、NDHJ蛋白、NDHK蛋白、NDHL蛋白、NDHM蛋白、NDHN蛋白和NDHO蛋白。
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| GR01 | Patent grant | ||
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