CN103173567B - 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 - Google Patents

一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为：1）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；2）PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；3）微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；4）加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINEX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。本发明利用悬浮芯片系统作为平台，检测灵敏度高，特异性好，是一种高通量的检测方法。

Description

一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，也是目前核酸检测的主流技术，PCR产物的检测判定方法为琼脂糖凝胶电泳，而琼脂糖凝胶仅可区分相差约100bp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且电泳时常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常接触对身体健康不利。
蜱是一种寄生在动物体表的吸血寄生虫，作为最重要的医学媒介之一，蜱种类多、分布广、生活习性多样，能侵袭鸟类、爬行类、哺乳动物等多种宿主，并且能传播多种病原体，其中大多数是重要的自然疫源性疾病和人兽共患病，且大部分都没有有效的疫苗，给人类健康及畜牧业带来重大危害。应进一步加强对蜱传疾病的非诊断性检测方法的研究，而一种简便有效，高灵敏高特异的蜱传疾病多重非诊断性检测方法的建立也成为了目前必要之需。以往的研究都是针对一种病原体检测，且有些非诊断性检测方法灵敏度不够高，不能够早期发现蜱传传染病的流行；此外，从生物学分类角度来看，蜱传病原体涉及细菌、病毒及立克次体、螺旋体等多种微生物学，目前蜱传病原检测大多仅是针对单种致病原，不同病原体分类专业人员分别从自身专业领域进行检测，浪费人力、财力，且各专业独力实施，不利于高效、综合采取防治措施。因而，对于蜱传病原的检测应当综合多重考虑。
悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片（liquid array,liquidchip），是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应，从而实现对核酸的多重检测。但传统的悬浮芯片的非诊断性检测方法耗时长，步骤繁琐，在多重检测中，由于多重探针的存在，杂交温度的选择也是一个技术开发时的瓶颈。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性好的针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法。
为实现上述目的，本发明一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为：
1）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
2）PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
3）微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
4）加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINEX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列为：
进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
进一步，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为40℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
一种改进的针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，包括以下步骤：
1）PCR扩增待检样品；
2）加入相应的微球与PCR产物杂交；
3）上机对杂交后的微球进行检测；
其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’末端连接特异Tag，引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’末端进行生物素标记。
进一步，所涉及的引物序列为：
进一步，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
进一步，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为40℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
进一步，所述扩增条件为：
本发明利用悬浮芯片系统作为平台，结合多重PCR技术及TAG技术可以蜱传病原体进行特异性的识别，检测灵敏度高，特异性好，是一种高通量的非诊断性检测方法，为蜱传疾病监测以及可能传入我国的新型蜱传播病原体的检测以及预警提供了基础。
附图说明
图1为DNA浓度-编码微球表面的荧光强度剂量反应曲线；编码微球表面荧光强度与加入的模板量在一定的范围内成正相关，其中横坐标为多重PCR时管中加入的模板DNA的量，纵坐标代表相应编码微球表面的荧光强度。可以通过拟合的标准曲线实现对核酸的半定量分析；
图2表示用本发明建立的方法对森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、斑点热群立克次体、巴贝西原虫、埃里克体、土拉弗朗西斯菌、Q热立克次体、伯氏疏螺旋体、巴尔通体进行检测的结果；其中，X轴表示检测样品，Y轴表示检测微球，Z轴表示检测荧光信号（MFI）。
具体实施方式
下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。
本发明提供一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，还涉及对悬浮芯片非诊断性检测方法以及PCR过程中反应条件及步骤的改进，尤其是兼并引物引入悬浮芯片的检测。本方法中的芯片主要由带有标签微球、带有标签及生物素化的引物、链霉亲和素－藻红蛋白组成，所述方法包括：利用带有标签的上游引物和末端生物素化的下游引物多重PCR扩增出带有标签的多重目的产物，并且利用标签之间结合的特异性以及杂交温度的统一性实现杂交的多重性，杂交过程中既实现了微球对PCR产物的捕获，同时完成链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，之后以红色激光激发其球形基质上的分类荧光，依据其球形基质色彩不同确定类型；以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的PCR产物的含量。
本发明中使用TAG技术标签只有三种碱基构成，不能与任何天然DNA及PCR产物结合，因此保证了杂交过程的特异性及条件的均一性，同时使检测过程变得更简捷，高效。本发明主要针对野外捕获的蜱虫综合检测多种携带的病原体,如森林脑炎病毒，Q热立克次体等。将野外采集蜱虫样本同批次处理后高通量检测，经济、高效检测蜱传病原体，可为卫生防病部门提供简化的检测、监测步骤和程序，提高效率和减少重复工作量。还可用于进出口、边境的物品、食品等所携带的病原体进行快速检测。
本发明一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，该方法包括：
首先根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINEX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。
该方法使用的引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为40℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
本发明还提供一个能有效扩增9种蜱传病原体的多重PCR方法，该方法包括以下步骤：
1、根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，BIOEDIT软件比对并提交GENEBANK检测引物的特异性；
2、为使检测达到更好的兼并性，对相应属的病原均能有检测阳性，部分病原引物设计为兼并引物；
3、合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’末端进行生物素标记；
4、按优化后的配比配制PCR反应体系并且在优化的条件下进行扩增。
本发明还提供一种改进的针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，包括以下步骤：1、PCR扩增待检样品；2、加入相应的微球与PCR产物杂交；3、上机对杂交后的微球进行检测。
在本发明的PCR扩增过程中，包括优化体系和优化的扩增条件：
扩增条件：
在本发明的加入相应的微球与PCR产物杂交的过程中，包括：
1、取带有Anti-Tag标签的微球每种各3500个加入到杂交液中，使其总量为35μl，根据微球计数结果计算相应加入量；
2、向各管中加5～17ul各种以蜱传病原DNA为模板的PCR产物吹打混匀。
3、再向各孔加4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，使之总体积变为80ul。
4、40℃下杂交一定时间。
5、转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物再向各孔加入80ul1×TE溶液，振荡使微球重悬。
6、反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。
本发明与传统的PCR非诊断性检测方法相比，优点在于：
1、通过仪器的信号放大系统和生物素亲和素的放大作用，本发明对PCR产物的检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳；
2、通过特异性探针捕获PCR产物，检测特异性远好于用片段长度对PCR产物进行判断；
3、对片段长度大小相似或者一样的片段，同样可以进行区分识别，从而使多重PCR引物的设计趋于灵活。
本发明与传统的多重非诊断性检测方法相比，优点在于：
1.TAG技术的应用，均一了杂交温度，使多重病原PCR产物的杂交反应更易于在同一温度下进行，提高了检测的通量。
2.引物合成时上游引物的5’端引入TAG序列，下游引物5’端标记生物素，此设计可以使微球与PCR产物的杂交反应和生物素与链亲和素-藻红蛋白的反应同时进行，节省了反应时间，提高了检测的效率。
3.兼并碱基的引入可以使检测范围不仅限于种及某病株，能将本多重检测体系应用于种属的检测。
如图1、图2所示，本发明一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，用于森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、斑点热群立克次体、巴贝西原虫、埃里克体、土拉弗朗西斯菌、Q热立克次体、伯氏疏螺旋体、巴尔通体的九重PCR产物的检测：
1、确定上述十二种病毒的诊断片段，通过NCBI的GeneBank获取候选基因序列，利用软件设计特异检测引物，并合成相关引物序列，上游引物5’标记Tag，Tag与引物间由C9或C18连接，结果一致；下游引物5’端生物素标记，见表1，并将这些引物稀释成10μmol/L。
表1引物序列
2、使用以上引物的多重PCR反应扩增以上九种待检测病原。
模拟检测了共100份采集的蜱虫样本；检测荧光值大于等于三倍本底荧光值判为阳性，其中检测出Q热立克次体1份，森林脑炎病毒2份，与分离培养以及荧光定量PCR结果一致，样本全部正确识别。
捕获探针对待检测的PCR产物的捕获和检测：
i.取带有Anti-Tag标签的微球每种各3500个加入到杂交液中，使其总量为35μl，根据微球计数结果计算相应加入量；
ii.向各管中加5～17ul各种蜱传病原的PCR产物吹打混匀。
iii.再向各孔加4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，使之总体积变为80ul。
iv.40℃下杂交一定时间。
v.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物再向各孔加入80ul1×TE溶液，振荡使微球重悬。
vi.反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。
定量检测：
待检目标核酸系列稀释，一般设6个以上稀释度，同上面的PCR程序和反应条件进行PCR反应，同上面的反应进行PCR产物的检测，根据检测结果，运用Bio-Plex Version4.0分析系统提供的方程拟合标准曲线，根据标准曲线，代入各个待测样品的MFI值，即可实现待检样品核酸的定量分析。
如伯氏疏螺旋体基因组10倍系列稀释，2.8fg～280ng，按确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，曲线方程：Std.Curve:FI=-6.53652+(1881.23+6.53652)/((1+(Conc/14.9405)^-1.61702))^0.916998，从标准曲线推算检出限为173fg/test。
结果分析：
检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（Median Fluorescence Intensity,MFI），亦即读取的这种编号的微球群（100个或以上）的每个微球信号强度的统计平均值。通过Bio-Plex悬浮芯片系统读取各孔荧光值（MFI）以及本底荧光值（BackgroundMFI,BFI）。
结果判断：
当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国检验检疫科学研究院
 
<120>  一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法
 
<130>  发明
 
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<213>  Ehrlichia-42-F
 
<400>  17
CAATTGCTTATAACCTTTTGGT                                              22
 
<210>  18
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Ehrlichia-42-R
 
<400>  18
CCCTATTAGGAGGGATACGACCTT                                        24

Claims (7)

1.一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，具体为：
1)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性检测引物，并提交GENEBANK检测引物的特异性，合成时将上游引物5’末端连接特异Tag，下游引物5’末端进行生物素标记；
2)PCR反应结束后将反应产物分别与相应的编码微球杂交；
3)微球上的Anti-Tag在一定的条件下特异的捕获PCR产物上的Tag序列；
4)加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINEX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列为：
2.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
3.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为40℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
4.一种改进的针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法，所述非诊断性检测方法包括以下步骤：
1)PCR扩增待检样品；
2)加入相应的微球与PCR产物杂交；
3)上机对杂交后的微球进行检测；
其中，根据待检测的病毒，设计检测所用的特异引物，上游引物5’末端连接特异Tag，引物与Tag之间连接C9或C18作为加臂，下游引物5’末端进行生物素标记，其特征在于，所述非诊断性检测方法所涉及的引物序列为：
5.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述引物上游引物5’端需要人工添加一段标签并且之间用间隔序列相连，下游引物5’端经生物素标记。
6.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述杂交中同时加入微球，PCR扩增产物，SA-PE，条件为40℃进行杂交，同时此条件下可以进行链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合。
7.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述扩增条件为：
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