RU2633692C2 - Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами - Google Patents
Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2633692C2 RU2633692C2 RU2015143410A RU2015143410A RU2633692C2 RU 2633692 C2 RU2633692 C2 RU 2633692C2 RU 2015143410 A RU2015143410 A RU 2015143410A RU 2015143410 A RU2015143410 A RU 2015143410A RU 2633692 C2 RU2633692 C2 RU 2633692C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microspheres
- pcr
- primer
- biotin
- suspension
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор праймеров для выявления Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi, Bartonella, вируса энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, бабезиоза и эрлихиоза. Также рассмотрены способы мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа. Данное изобретение может быть использовано для обнаружения основных патогенов, передающихся клещами, с целью профилактики заболеваний. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами.
Предпосылки изобретения
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой протокол амплификации нуклеиновых кислот in vitro, разработанный в середине 1980-х, и также является часто используемой в настоящее время техникой для тестирования нуклеиновых кислот. Способ, применяемый для тестирования ПЦР-продукта, представляет собой электрофорез в агарозном геле (AGE), при этом с помощью AGE можно разделять ДНК-фрагменты с различающимся размером около 100 п.о. При помощи AGE невозможно разделить ПЦР-продукты с длинами фрагментов, мало отличающимися или идентичными друг другу. Кроме того, с помощью AGE определяют наличие ПЦР-продукта путем возбуждения флуоресцентного красителя ультрафиолетовым светом с образованием флуоресцентного свечения, при этом чувствительность данного тестирования является относительно низкой. Также с помощью AGE определяют продукты по их размеру, что характеризуется низкой специфичностью и не дает возможность разделять фрагменты одинаковых размеров, полученные с помощью неспецифической амплификации. Более того, красители, обычно применяемые для электрофореза, такие как этидия бромид, представляют собой канцерогены, таким образом, являясь вредными для здоровья при постоянном контакте.
Клещ является кровососущим паразитом, который паразитирует на поверхности тела животных. Как один из самых важных переносчиков заболеваний клещ представлен различными видами, которые широко распространены, и имеют много жизненных форм, а также способны к поражению различных хозяев, таких как птицы, рептилии, млекопитающие и т.п., и способны к распространению многих видов патогенов, при этом большинство заболеваний, вызванных распространением патогенов, являются серьезными природно-очаговыми заболеваниями и зоонозами, и для большинства этих болезней не существует эффективной вакцины, что наносит большой ущерб человеческому здоровью и животноводческому хозяйству. Исследование способа недиагностического тестирования заболеваний, передающихся клещами, в дальнейшем должно расширяться, и в настоящее время необходимо создать удобный и эффективный способ недиагностического мультиплексного тестирования заболеваний, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью. Предыдущие исследования были направлены на тестирование одного вида патогена, и некоторые методы недиагностического тестирования в предшествующем уровне техники были недостаточно чувствительны для раннего выявления большинства случаев инфекционных заболеваний, передающихся клещами; и, кроме того, с точки зрения биологической классификации, патогены, передающиеся клещами, относятся к различным микроорганизмам, таким как бактерии, вирусы, риккетсии, спирохеты и т.п., и в настоящее время большинство тестов на патогены, передающиеся клещами, направлено только на один вид патогена, и такие тесты выполняют специалисты из различных областей классификации патогенов в соответствии со своими профессиональными сферами, что является тратой человеческих ресурсов и денег, и независимое внедрение тестирования в соответствующие профессиональные области не выгодно для принятия комплексных контролирующих мер с высокой эффективностью. Поэтому тестирование патогенов, передающихся клещами, нужно рассмотреть комплексно, в связи со множеством факторов.
Суспензионный микрочип, также называемый жидким микрочипом или жидким чипом, является очень гибкой многофункциональной технологической платформой, которая дает возможность проведения исследований, таких как определение биологических макромолекул типа белков и нуклеиновых кислот, а также идентификация и анализ рецепторов и лигандов. При помощи суспензионного микрочипа выполняют качественный и количественный анализ тестируемого объекта посредством флуоресцентных кодированных микросфер, способных к соединению с зондом, и тестирование через два лазерных луча, при этом для достижения мультиплексного тестирования нуклеиновых кислот 100 видов различных биологических реакций могут быть осуществлены в одной реакционной ячейке. Однако известный способ недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов требует больших затрат времени и имеет сложные этапы. В связи с наличием мультиплексного зонда при мультиплексном тестировании выбор температуры гибридизации также является затруднением в развитии технологии.
Краткое описание изобретения
Для решения проблем, существующих в предшествующем уровне техники, целью настоящего изобретения является обеспечение способа недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с высокой чувствительностью и большой специфичностью.
Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, в частности, включающий следующие этапы:
1) разработка специфического праймера для тестирования, соответствующего нуклеотидной последовательности ПЦР-амплифицированного участка, внесение в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической этикеткой (Tag) и биотиновое мечение 5'-конца обратного праймера;
2) гибридизация продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;
3) специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag на микросферах при определенных условиях;
4) добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование продукта с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер, где праймерная последовательность представлена следующим образом.
Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.
Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и стрептавидина-фикоэритрина (SA-PE), в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.
Улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включает следующие этапы:
1) проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца;
2) добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом;
3) тестирование гибридизированных микросфер с помощью прибора;
где определенный праймер для тестирования разработан соответственно тестируемому вирусу, где 5'-конец прямого праймера связан со специфической Tag, С9 или С18 включается между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо и 5'-конец обратного праймера метится биотином.
Кроме того, праймерная последовательность представлена следующим образом.
Кроме того, необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем соединения их с помощью вставочной последовательности, и 5'-конец обратного праймера метить биотином.
Более того, гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях может осуществляться связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.
Также для амплификации необходимы следующие условия:
В настоящем изобретении раскрыт высокопроизводительный способ недиагностического тестирования, в котором применяется система на основе суспензионных микрочипов в качестве платформы для специфической идентификации патогенов, передающихся клещами, при помощи комбинации технологии мультиплексной ПЦР и этикетка (Tag)-технологии с высокой чувствительностью и высокой специфичностью тестирования, обеспечивающими основу для мониторинга заболеваний, передающихся клещами, а также тестирование и предупреждение возникновения новых патогенов, передающихся клещами, способных распространяться в нашей стране.
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1 представлена кривая зависимости доза-эффект интенсивности флуоресценции на поверхности кодированных микросфер от плотности ДНК, где в определенном диапазоне интенсивность флуоресценции на поверхности кодированных микросфер положительно коррелирует с количеством добавленной матрицы, где горизонтальная координата отображает количество матричной ДНК, добавленное в пробирку для мультиплексной ПЦР, и вертикальная координата отображает интенсивность флуоресценции на поверхности соответствующих кодированных микросфер. Полуколичественный анализ нуклеиновых кислот проводили с помощью аппроксимации стандартной кривой.
На фигуре 2 проиллюстрированы результаты тестирования вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella с помощью способа, разработанного в настоящем изобретении; где ось X отображает тестируемый образец, ось Y отображает тестируемые микросферы и ось Z отображает измеренный флуоресцентный сигнал (MFI).
Подробное описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение проиллюстрировано более подробно, как указано далее, со ссылкой на прилагаемые графические материалы, где иллюстративные варианты осуществления представлены в прилагаемых графических материалах. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено в различного рода формах и, таким образом, при рассмотрении не должно ограничиваться приведенными здесь примерами вариантов осуществления. В действительности, представленные варианты осуществления даны для того, чтобы сделать настоящее изобретение целостным и завершенным и в полной мере передать суть настоящего изобретения специалисту в данной области.
Настоящее изобретение описывает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, а также относится к усовершенствованиям способа недиагностического тестирования с помощью суспензионных микрочипов и к условиям реакции, и этапам способа ПЦР, и, в частности, к внедрению вырожденных праймеров в тестирование с помощью суспензионных микрочипов. Чип, применяемый в этом способе, в основном состоит из микросфер с последовательностями Tag, биотинилированного праймера, праймера с Tag и стрептавидин-фикоэритрина, при этом способ включает следующие этапы: осуществление амплификации мультиплексной ПЦР с получением меченых мультиплексных целевых продуктов с применением прямого праймера с Tag и обратного праймера с биотинилированным концом и осуществление множественной гибридизации посредством специфичности связывания между последовательностями Tag и усреднения температуры гибридизации, где не только захват микросферами ПЦР-продуктов, но также и связывание стрептавидин-фикоэритрина и биотина на ПЦР-продуктах, захваченных микросферами, достигается в процессе гибридизации, и затем стимулирование распределения флуоресценции в среде микросфер с использованием красного лазера для определения типа ПЦР-продукта на основании разных цветов сред микросфер, возбуждение фикоэритрина с применением зеленого лазера и измерение количества зарегистрированных флуоресцирующих молекул, связанных в среде микросфер для косвенного определения содержания ПЦР-продуктов, связанных в средах микросфер.
В TAG-технике по настоящему изобретению применяется Tag, которая содержит только три основания и таким образом не может быть связана ни с одной природной ДНК и ПЦР-продуктом, таким образом, обеспечивается специфичность процесса гибридизации и усреднение условий гибридизации, а также процесс тестирования становится более удобным и эффективным. Настоящее изобретение в основном направлено на всестороннее тестирование различных патогенов, переносимых взятым из природы клещом, таких как вирус клещевого энцефалита и Rickettsia австралийской лихорадки Q. Высокопроизводительное тестирование, осуществляемое при обработке образцов взятых из природы клещей одной партии для определения патогенов, передающихся клещами, экономно и эффективно, что может способствовать упрощению тестирования, стадий мониторинга и процедур контроля заболеваний и мер предупреждения для повышения эффективности и уменьшения количества повторной работы. Настоящее тестирование также может быть использовано для экспресс-теста патогенов, переносимых с объектами импорта и экспорта из-за границы или с пищевыми продуктами и т.д.
Настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий:
во-первых, разработку специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера, связывание в процессе синтеза 5'-конца прямого праймера со специфической Tag и мечение биотином 5'-конца обратного праймера;
гибридизацию продуктов реакции с соответствующими кодированными микросферами соответственно после завершения ПЦР;
специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag микросфер при определенных условиях;
затем добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, тестирование с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа тестируемого объекта посредством возбуждения красной флуоресценции в среде микросфер и возбуждением фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер.
В указанном способе необходимо искусственно добавлять участок метки к 5'-концу прямого праймера путем связывания их с помощью вставочной последовательности и 5'-конец обратного праймера необходимо метить биотином. Гибридизацию осуществляют в условиях 37°С с одновременным добавлением микросфер, ПЦР-амплифицированного продукта и SA-PE, в то же время в этих условиях можно осуществлять связывание между стрептавидин-фикоэритрином и биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами.
Настоящее изобретение также предусматривает способ мультиплексной ПЦР, способный эффективно амплифицировать 9 видов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы:
1. разработка специфического праймера для тестирования в соответствии с нуклеотидной последовательностью ПЦР-амплифицированной области, выравнивание праймера с применением программного обеспечения BIOEDIT и внесение праймера в GenBank для определения специфичности праймера;
2. разработка некоторых праймеров для патогенов в виде вырожденных праймеров для лучшей избыточности тестирования и положительных результатов тестирования всех патогенов, относящихся к соответствующему виду;
3. присоединение 5'-конца прямого праймера к специфической Tag, включение С9 или С18 между прямым праймером и Tag как дополнительное плечо в процессе синтеза и мечение 5'-конца обратного праймера биотином;
4. составление реакционной системы ПЦР согласно оптимизированному соотношению и осуществление амплификации при оптимизированных условиях.
Настоящее изобретение также предусматривает улучшенный способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, включающий следующие этапы: 1. проведение ПЦР-амплификации тестируемого образца; 2. добавление соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-амплифицированным продуктом и 3. тестирование гибридизированных микросфер на приборе.
Оптимизированная система и оптимизированные условия амплификации, включенные в способ ПЦР-амплификации по настоящему изобретению, выглядят следующим образом.
Условия амплификации:
В настоящем изобретении способ добавления соответствующих микросфер для гибридизации с ПЦР-продуктом включает
1. добавление 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее количество микросфер составляет 35 мкл, и затем вычисление соответствующего количества, которое следует добавить согласно результатам подсчета микросфер;
2. добавление 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов, полученных при использовании ДНК патогенов, передающихся клещами, в качестве матриц в соответствующие пробирки и затем равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;
3. затем добавление 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;
4. гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;
5. перенос гибридизированного продукта на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавление 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллирование для ресуспендирования микросфер;
6. тестирование продукта на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяют для тестирования, где численность микросфер определяют возбуждением красной флуоресценции в среде микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводят при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.
По сравнению с традиционным способом недиагностического ПЦР-тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:
1. благодаря системе усиления сигнала в устройстве и усилению функции биотин-авидина чувствительность тестирования ПЦР-продуктов настоящего изобретения выше, чем при электрофорезе в агарозном геле (AGE);
2. благодаря захватыванию ПЦР-продуктов специфическими зондами специфичность тестирования по настоящему изобретению намного выше, чем при способе, с помощью которого ПЦР-продукты определяют на основании длины фрагментов;
3. настоящее изобретение может быть использовано для разделения и идентифицирования фрагментов со схожей или одинаковой длиной, так что конструкция праймеров для мультиплексной ПЦР может быть гибкой.
По сравнению с традиционным способом мультиплексного недиагностического тестирования настоящее изобретение имеет преимущество в том, что:
1. температура гибридизации усредняется посредством применения TAG-технологии, так что реакция гибридизации продуктов мультиплексной ПЦР патогенов может быть проведена при одной и той же температуре, тем самым улучшая производительность тестирования;
2. конструкция, которая вводит TAG-последовательность в 5'-конец прямого праймера, и мечение 5'-конца обратного праймера биотином в процессе синтеза праймера позволяют проводить реакцию гибридизации между микросферами и ПЦР-продуктами одновременно с реакцией между биотином и стрептавидин-фикоэритрином, что экономит время реакции и повышает эффективность тестирования;
3. введение вырожденных оснований позволяет диапазону тестирования не быть ограниченным определенным видом, или определенным пораженным болезнью или инфицированным растением, таким образом, система мультиплексного тестирования может применяться для тестирования видов.
Как показано на фигурах 1 и 2, настоящее изобретение предусматривает способ недиагностического мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, который применяется для тестирования девятикратных ПЦР-продуктов вируса клещевого энцефалита, вируса синьцзянской геморрагической лихорадки, Rickettsiae группы пятнистой лихорадки, Babesia spp., Ehrlichia, Francisella tularensis, Rickettsia австралийской лихорадки Q, Borrelia burgdorferi и Bartonella, где способ включает следующие этапы:
1. определение диагностических фрагментов вышеупомянутых двенадцати вирусов, получение последовательности гена-кандидата из GenBank NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США), разработка специфического праймера для тестирования с использованием программного обеспечения и синтез корреляционных праймерных последовательностей, где 5'-конец прямого праймера помечается Tag, связанной с праймером посредством С9 или С18 (имеющими одинаковый результат связывания); и мечение 5'-конца обратного праймера биотином с праймерной последовательностью, показанной в таблице 1, и разбавление этих праймеров до 10 мкмоль/л;
2. проведение амплификации вышеупомянутых девяти видов патогенов, тестируемых при помощи выполнения мультиплексной ПЦР с использованием вышеуказанных праймеров.
Всего тестировали 100 экземпляров собранных образцов клещей путем проведения общего моделирования; образец определяли как положительный, если измеренное значение флуоресценции было равным или в три раза выше фонового значения флуоресценции, при этом тестировали 1 экземпляр Rickettsia австралийской лихорадки Q и 2 экземпляра вируса клещевого энцефалита, что соответствует результатам в изолированной культуре и флуоресцентной количественной ПЦР, и таким образом все образцы были определены верно.
Захватывание и тестирование ПЦР-продукта, подвергаемого тестированию захватыванием зондом, проводили посредством следующих стадий:
i. добавляли 3500 микросфер каждого типа микросфер, имеющих метки анти-Tag, в раствор для гибридизации, так что общее содержание микросфер составляло 35 мкл, и затем вычисляли соответствующее количество для добавления согласно результатам подсчета микросфер;
ii. добавляли 5-17 мкл соответствующих ПЦР-продуктов патогенов, передающихся клещами, в соответствующие пробирки и затем производили равномерное перемешивание смеси многократным пипетированием;
iii. затем добавляли 4 нг/мкл SA-PE в 1 × растворе ТМАС в каждую лунку с получением общего объема 80 мкл;
iv. проводили гибридизацию в течение определенного времени при 37°С;
v. переносили гибридизированный продукт на пластину фильтра для фильтрации несвязанных ПЦР-продуктов путем всасывания и затем добавляли 80 мкл 1 × раствора ТЕ в каждую лунку и осциллировали для ресуспендирования микросфер;
vi. тестировали продукт на приборе после завершения реакции. Систему Bio-PlexTM применяли для тестирования, где численность микросфер определяли возбуждением красной флуоресценции в средах микросфер и количественный анализ связанных ПЦР-продуктов проводили при помощи возбуждения фикоэритрина на поверхности микросфер.
Количественное тестирование
Тестируемые целевые нуклеиновые кислоты серийно разводили согласно общим правилам с разведением более чем на 6 порядков и затем выполняли ПЦР разведенных последовательностей посредством вышеуказанного способа ПЦР и при вышеуказанных условиях реакции. Тестирование ПЦР-продуктов осуществляли, как описано выше, и уравнение, предусматриваемое системой анализа Bio-Plex версии 4.0, использовали для аппроксимации стандартной кривой, основанной на результатах тестирования, таким образом, количественного определения тестируемых образцов нуклеиновых кислот достигали только замещением значений MFI соответствующих тестируемых образцов согласно стандартной кривой.
Например, геном Borreia burgdorferi серийно разводили в 10 раз до 8 фг-800 нг, ПЦР-амплификацию и тестирование выполняли на разведенном геноме согласно разработанному способу и результаты тестирования аппроксимировали стандартной кривой, основанной на уравнении кривой: стандартная кривая: FI=-6,53652+(1881,23+6,53652) / ((1+(конц. / 14,9405)^-1,61702))^0,916998, при этом предел тестирования, рассчитанный по стандартной кривой, составлял 173 фг/пробу.
Анализ Результатов
Вместе с этим тестированием в качестве фона тестирования также проводили тестирование гибридизации негативных контролен ПЦР. Для каждой системы тестирования и каждого фона тестирования выходные данные, полученные с помощью прибора, представляли собой значение медианы интенсивности флуоресценции (MFI) идентичным образом подсчитанных микросфер в соответствующей реакционной системе, т.е. статистическое среднее значение интенсивностей сигналов микросферы, соответствующих идентичным образом подсчитанным микросферам (100 или более). Значения интенсивности флуоресценции (MFI) и фоновые значения MFI (BFI) соответствующих лунок считывали с помощью системы суспензионных микрочипов Bio-Plex.
Анализ результатов
Образец определяли как положительный, если значение MFI тестируемого образца превышало интенсивность фонового сигнала тестирования более чем в три раза.
Claims (18)
1. Суспензионный микрочип для мультиплексного выявления патогенов, передающихся клещами, содержащий набор следующих праймеров
геморрагической
лихорадки
пятнистой
лихорадки
2. Способ мультиплексного выявления с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа по п. 1, включающий следующие этапы:
1) применение праймеров для специфического выявления согласно нуклеотидной последовательности ПЦР-амплицированной области, подтверждение специфичности праймера, выявленного в GenBank, связывание специфической Tag с 5'-концом прямого праймера и проведение мечения биотином 5'-конца обратного праймера в процессе синтеза;
2) перекрестное сшивание продукта реакции с соответствующей кодированной микросферой после ПЦР;
3) специфическое захватывание Tag-последовательности ПЦР-продукта с помощью анти-Tag на микросферах при определенных условиях и
4) добавление стрептавидин-фикоэритрина для связывания с биотином на ПЦР-продукте, захваченном микросферами, выявление с применением системы суспензионных микрочипов LUMINAX и проведение качественного и количественного анализа выявляемых объектов посредством возбуждения красной флуоресценции в среде микросфер и фикоэритрина, связанного посредством определенных реакций на поверхности микросфер.
3. Способ выявления по п. 2, где к 5'-концу прямого праймера необходимо искусственно добавлять участок метки, который связан со вставочной последовательностью, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.
4. Способ выявления по п. 2, где микросферы, ПЦР-амплифицированный продукт, SA-PE добавляют одновременно с перекрестным сшиванием при температуре 37°С, в то же время при этих условиях могут осуществлять объединение стрептавидин-фикоэритрина с биотином на ПЦР продукте, захваченном микросферами.
5. Способ мультиплексного выявления с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами, с применением суспензионного микрочипа по п. 1, где способ выявления включает следующие этапы:
1) проведение ПЦР-амплификации выявляемых образцов;
2) добавление соответствующей микросферы для перекрестного сшивания с ПЦР продуктом и
3) использование компьютера для выявления микросфер после перекрестного сшивания;
где специфический праймер, применяемый для выявления, применяют в соответствии с определяемым вирусом, и 5'-конец прямого праймера связывают со специфической Tag, обеспечивают включение С9 или С18 между праймером и Tag в качестве дополнительного плеча, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.
6. Способ выявления по п. 5, где к 5'-концу прямого праймера необходимо искусственно добавлять участок метки, который связан со вставочной последовательностью, и 5'-конец обратного праймера метят биотином.
7. Способ выявления по п. 5, где микросферы, ПЦР-амплифицированный продукт, SA-PE добавляют одновременно для перекрестного сшивания при температуре 37°С и в то же время при этих условиях могут осуществлять присоединение стрептавидин-фикоэритрина к биотину на ПЦР продукте, захваченном микросферами.
8. Способ выявления по п. 5, где условия амплификации являются следующими
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310102092.X | 2013-03-27 | ||
| CN201310102092.XA CN103173567B (zh) | 2013-03-27 | 2013-03-27 | 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 |
| PCT/CN2013/085199 WO2014153948A1 (zh) | 2013-03-27 | 2013-10-14 | 针对蜱传病原的悬浮芯片多重检测引物及方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015143410A RU2015143410A (ru) | 2017-05-16 |
| RU2633692C2 true RU2633692C2 (ru) | 2017-10-16 |
Family
ID=48633754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015143410A RU2633692C2 (ru) | 2013-03-27 | 2013-10-14 | Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103173567B (ru) |
| RU (1) | RU2633692C2 (ru) |
| WO (1) | WO2014153948A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173567B (zh) * | 2013-03-27 | 2015-01-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 |
| CN105483232A (zh) * | 2015-12-24 | 2016-04-13 | 四川国际旅行卫生保健中心 | 一种立克次体液相基因芯片的检测方法 |
| CN105543346B (zh) * | 2015-12-24 | 2019-04-16 | 四川国际旅行卫生保健中心 | 一种立克次体多重荧光pcr检测方法 |
| CN113444773B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-06-16 | 黑龙江省牡丹江林业中心医院 | 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒 |
| CN114058716A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-02-18 | 河套学院 | 蜱媒病原体多样性的分析方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062470C1 (ru) * | 1992-07-06 | 1996-06-20 | Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций ГК санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Способ диагностики клещевого энцефалита |
| RU2233888C1 (ru) * | 2002-12-15 | 2004-08-10 | Дальневосточный государственный медицинский университет | Способ обнаружения микроорганизма "montezuma" |
| CN101560558A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-10-21 | 中国检验检疫科学研究院 | 多重pcr产物的悬浮芯片检测方法 |
| RU2415947C1 (ru) * | 2009-10-13 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОЦИТАРНОГО ЭРЛИХИОЗА Ehrlichia spp. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ" |
| CN102943128A (zh) * | 2012-10-29 | 2013-02-27 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560557B (zh) * | 2009-03-04 | 2012-07-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其非诊断性检测方法 |
| WO2010126771A1 (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | University Of Miami | Systems, kits and methods of identifying ocular fungal and amoebic pathogens |
| CN103173567B (zh) * | 2013-03-27 | 2015-01-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种针对蜱传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 |
-
2013
- 2013-03-27 CN CN201310102092.XA patent/CN103173567B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-10-14 WO PCT/CN2013/085199 patent/WO2014153948A1/zh active Application Filing
- 2013-10-14 RU RU2015143410A patent/RU2633692C2/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2062470C1 (ru) * | 1992-07-06 | 1996-06-20 | Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций ГК санитарно-эпидемиологического надзора РФ | Способ диагностики клещевого энцефалита |
| RU2233888C1 (ru) * | 2002-12-15 | 2004-08-10 | Дальневосточный государственный медицинский университет | Способ обнаружения микроорганизма "montezuma" |
| CN101560558A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-10-21 | 中国检验检疫科学研究院 | 多重pcr产物的悬浮芯片检测方法 |
| RU2415947C1 (ru) * | 2009-10-13 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОЦИТАРНОГО ЭРЛИХИОЗА Ehrlichia spp. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ" |
| CN102943128A (zh) * | 2012-10-29 | 2013-02-27 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2014153948A1 (zh) | 2014-10-02 |
| CN103173567A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103173567B (zh) | 2015-01-14 |
| RU2015143410A (ru) | 2017-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2633692C2 (ru) | Праймер и способ мультиплексного тестирования с помощью суспензионных микрочипов патогенов, передающихся клещами | |
| CN103966358B (zh) | 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN110551853A (zh) | 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN110699489B (zh) | 非洲猪瘟病毒cd2v基因的实时荧光pcr检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN105039586A (zh) | 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒 | |
| CN107828914B (zh) | 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN110564895A (zh) | 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
| CN110358866A (zh) | 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒 | |
| CN113718063A (zh) | 同时检测asfv、pcv2和prv病毒的多重芯片数字pcr引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN114438214A (zh) | 结直肠癌肿瘤标志物及其检测方法与装置 | |
| CN113444773B (zh) | 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒 | |
| WO2014067390A1 (zh) | 一种针对蚊媒病毒的悬浮芯片多重非诊断性检测引物及方法 | |
| CN113186321A (zh) | 一种芽囊原虫绝对荧光定量pcr检测方法 | |
| CN105002284A (zh) | 一种副鸡嗜血杆菌荧光定量pcr检测方法 | |
| CN103173566B (zh) | 一种针对鼠传病原的悬浮芯片多重非诊断性检测方法 | |
| CN110257560B (zh) | 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用 | |
| CN115896354A (zh) | 一种同时检测25种禽类疫病病原体的复合扩增引物组及试剂盒 | |
| CN114381551A (zh) | 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒 | |
| CN114395643A (zh) | 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法 | |
| Zhang et al. | Rapid detection of giant salamander iridovirus by cross-priming amplification | |
| CN104593493A (zh) | 一种检测羊巴贝斯虫的实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN110592271A (zh) | 传染性造血器官坏死症病毒（ihnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN109762941A (zh) | 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片 | |
| CN109576395A (zh) | 一种猪圆环病毒3型的聚合酶螺旋扩增检测试剂及检测方法 | |
| CN110592270A (zh) | 锦鲤疱疹病毒（khv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 |