CN109609692A - 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents

用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑24所示的引物和SEQ ID NO.27‑45所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定。

Description

用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
背景技术
呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是人类最为常见的一类疾病，广泛发生于任何年龄、性别及地域，对个人、家庭和社会造成了严重的疾病负担。病毒感染是引发呼吸道感染的重要原因，在发达国家，急性病毒性呼吸道感染是婴幼儿和儿童住院的首要原因；在发展中国家急性病毒性呼吸道感染是主要的死亡原因。除病毒外，介于病毒和细菌间的肺炎支原体和肺炎衣原体常引起非典型性的肺炎，引起呼吸道感染以外的症状，容易在人口密集的地方引发流行。根据流行病学，引起呼吸道感染常见的病原体有甲型流感病毒(Influenza A virus，InfluA)、乙型流感病毒(Influenza B virus，InfluB)、呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial viruses type A，RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(respiratory syncytial viruses typeB，RSVB)、腺病毒(adenovirus，ADV)、人副流感I型病毒(Parainfluenza I virus，PIVI)、人副流感II型病毒(Parainfluenza II virus，PIVII)、人副流感III型病毒(Parainfluenza III virus，PIVIII)、人副流感IV型病毒(Parainfluenza IV virus，PIVIV)、人鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus，HMPV)、肺炎衣原体(Chlamydia Pneumoniae，CP)、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，LP)、冠状病毒NL63(human Coronavirus NL63，HCoV-NL63)、冠状病毒HKUI(human Coronavirus HKUI，HCoV-HKUI)、冠状病毒229E(human Coronavirus 229E，HCoV-229E)、冠状病毒OC43(humanCoronavirus OC43，HCoV-OC43)以及博卡病毒(human HBoVirus，HBoV)。
病毒的分离培养是呼吸道病毒鉴定的金标准，常用的培养细胞有人肺癌细胞(A549)、马丁达比犬肾细胞(MDCK)等，根据样本不同，不同的病毒培养的时间也有所不同，一般数日到两周不等；肺炎支原体的培养时间为2-4周，而肺炎衣原体通过一般的培养方法难以成功。随着世界医学水平的快速发展，核酸检测技术、免疫学方法检测技术等层出不穷，以其操作简便、灵敏度高等优点得到了广泛的应用。
目前，除了常见的呼吸道感染病原体外，一些新发病原体也逐渐增多，多重感染逐渐取代单一病原感染，急性感染的概率逐年上升。因此准确、快速、一体化的呼吸道病原体的筛检方案对于快速诊断及指导临床用药和治疗具有非常重要的意义。
呼吸道感染的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病原的分离和鉴定完成的。如上所述，病毒分离是诊断呼吸道常见病毒感染最主要的手段和金标准。但是病毒分离与中和实验存在共同的问题：操作繁琐、费时、灵敏度低，不适于做早期的快速现场诊断。
近年来，聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术已成为诊断呼吸道感染病原体最常用的一种方法，而多重实时荧光PCR技术(Real-Time PCR，RT-PCR)成为被广泛应用的呼吸道病原的分型技术。目前，国内外均建立了采用基于PCR技术对呼吸道病原体进行快速检测的方法。例如，中国专利申请号为201510904029.7的发明专利申请公开了使用RT-PCR检测16项呼吸道病原的方法：呼吸道合胞病毒、肠道病毒、冠状病毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、副流感病毒I、II、III型、博卡病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒及嗜肺军团菌。该方法针对16项呼吸道病原设计了特异性的引物和探针，通过双重标记的方法，设置了8组反应体系，实现了16项呼吸道病原体的快速检测。再如，中国专利申请号为201410811401.5的发明专利申请公开了使用RT-PCR检测19种呼吸道病原的方法：甲型流感病毒、H1N1亚型流感病毒、乙型流感病毒、鼻病毒、冠状病毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、副流感病毒I、II、III、IV型、博卡病毒、人偏肺病毒、肺炎支原体、腺病毒、肠道病毒、双埃可病毒及呼吸道合胞病毒，该方法针对19种病原设计了特异性的引物和探针，通过四重荧光标记的方法，设置了5组反应体系，实现了多种病原的检测。需要注意的是，上述两个发明专利申请中核酸的提取是通过人工操作实现的，且对于结果的判断是通过说明书进行人工判断的，存在一定的主观性。
常用的PCR检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。此外，RT-PCR所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确的检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ ID NO.27-45所示的探针。
可选地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.6μM、0.6-1.0μM、0.4-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.1-0.4μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.3-0.5μM，分别由SEQ ID NO.27-45所示的探针的含量各自为0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM和0.1-0.3μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物和SEQ ID NO.46所示的探针。
可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-10,25-26所示的引物和SEQ ID NO.27-32,46所示的探针；B管含有SEQ ID NO.11-14,25-26所示的引物和SEQ ID NO.33-37,46所示的探针；C管含有SEQ ID NO.15-20,25-26所示的引物和SEQ IDNO.38-40,46所示的探针；D管含有SEQ ID NO.21-26所示的引物和SEQ ID NO.41-46所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.27,29,33,34,38,41,42所示的探针具有第一荧光标记；SEQID NO.28,30,35,36,39,43,45所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.31,32,37,40,44所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.46所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
可选地，所述呼吸道感染病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感I型病毒、人副流感II型病毒、人副流感III型病毒、人副流感IV型病毒、人鼻病毒、人偏肺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、冠状病毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和博卡病毒中的至少一种。
本公开第二方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开第五方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的方法，其中，该方法包括：采用如上所述的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测呼吸道病原InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV的多重系统检测方法，能够实现形态学、免疫学及RT-PCR检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
近几年关于呼吸道病原的检测报道中大多采用RT-PCR的方法进行检测，该方法虽然可以实现多目标的检测，但是受荧光通道数目的限制，需要多个扩增体系联检才能实现，增加了操作的复杂性。本公开所建立的检测方法可以一次性的检测呼吸道病原InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV十九种目标，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。
(二)简易的操作环节
临床样本可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。
(三)较高程度的检测一体化
本公开针对呼吸道感染疾病多种病原体检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测呼吸道感染病原体的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定，
(四)特异性好
Hybeacon探针可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力。本公开所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性：所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括麻疹病毒、肠道病毒、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳杆菌等呼吸道感染的其他病原体。
(五)最低检出限
本公开所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQID NO.27-45所示的探针。
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测呼吸道感染病原体，避免了涂片、培养及RT-PCR检测等方法操作时间长及操作繁琐，能够快速、准确、高通量的并行检测多种呼吸道感染病原体。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖多种呼吸道感染病原体，特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自可以为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.6μM、0.6-1.0μM、0.4-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.1-0.4μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.3-0.5μM，分别由SEQ ID NO.27-45所示的探针的含量各自可以为0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM和0.1-0.3μM。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控(InternalAmplification Control，IAC)。进一步地，所述阳性内质控选用人核糖核酸酶P(RNaseP)基因，其含有SEQ ID NO.25-26所示的引物和SEQ ID NO.46所示的探针。这时，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.25-26所示的引物的含量各自可以为0.5-1.0μM和0.1-0.3μM，由SEQ ID NO.46所示的探针的含量可以为0.1-0.3μM。所述阳性内质控可以有效提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括A管、B管、C管和D管；A管可以含有SEQ ID NO.1-10,25-26所示的引物和SEQID NO.27-32,46所示的探针；B管可以含有SEQ ID NO.11-14,25-26所示的引物和SEQ IDNO.33-37,46所示的探针；C管可以含有SEQ ID NO.15-20,25-26所示的引物和SEQ IDNO.38-40,46所示的探针；D管可以含有SEQ ID NO.21-26所示的引物和SEQ ID NO.41-46所示的探针。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.27,29,33,34,38,41,42所示的探针可以具有第一荧光标记；SEQ ID NO.28,30,35,36,39,43,45所示的探针可以具有第二荧光标记；SEQ ID NO.31,32,37,40,44所示的探针可以具有第三荧光标记；SEQID NO.46所示的探针可以具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，SEQ ID NO.27,29,33,34,38,41,42所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ ID NO.28,30,35,36,39,43,45所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ IDNO.31,32,37,40,44所示的探针具有CY5荧光标记；SEQ ID NO.46所示的探针具有ROX荧光标记。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。
根据本公开，所述呼吸道感染病原体可以包括甲型流感病毒(InfluA)、乙型流感病毒(InfluB)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、腺病毒(ADV)、人副流感I型病毒(PIVI)、人副流感II型病毒(PIVII)、人副流感III型病毒(PIVIII)、人副流感IV型病毒(PIVIV)、人鼻病毒(HRV)、人偏肺病毒(HMPV)、肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)、嗜肺军团菌(LP)、冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、冠状病毒HKUI(HCoV-HKUI)、冠状病毒229E(HCoV-229E)、冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和博卡病毒(HBoV)中的至少一种。
本公开第二方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对多种呼吸道感染病原体进行检测的敏感性、特异性和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载上述包括A管、B管、C管和D管的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开第五方面：提供一种用于检测呼吸道感染病原体的方法，其中，该方法包括：采用上述包括A管、B管、C管和D管的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
其中，所述待测样本可以为病人鼻拭子样本，所述PCR扩增的条件可以为：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
本公开的方法能快速敏感特异地实现多种呼吸道感染病原体的系统筛检，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在Biosearch(USA)公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
表2
检测目标 探针代码 探针序列 Tm值(℃) SEQ ID NO
InfluA fluA-P aggccccct(fam)caaagccgagat(fam)cgcgcaga 69 27
InfluB fluB-P ccaatt(joe)cgagcagct(joe)gaaactg 64 28
ADV ADV-P acacct(fam)acttcagt(fam)atgg 60 29
HBoV HBoV-P tgct(joe)gaaagcat(joe)ggaagcagatgcct cc 55 30
RSVA RSVA-P ataccagct(cy5)tatagaact(cy5)acaa 57 31
RSVB RSVB-P atat(cy5)cagcttatagt(cy5)tctacaa 65 32
PIVI PIVI-P aagt(fam)caacaccaagt(fam)gtgt 63 33
PIVII PIVII-P gcagtt(fam)ggaagcgggat(fam)ctatca 56 34
PIVIII PIVIII-P gatat(joe)ggaggtct(joe)tgaacatcca 59 35
PIVIV PIVIV-P ccacggat(joe)gcattcgaat(joe)tccatcattctcctta 63 36
HRV HRV-P atcctt(cy5)attgattgct(cy5)tatggtgacaatat 65 37
MP MP-P tttccaacat(fam)cggcgt(fam)cggcctc 59 38
LP LP-P caa tggggt(joe)aatt tggat(joe)ggcaa atcagcctat 55 39
CP CP-P gcagt(cy5)aaccct(cy5)cgaagatgt tcctgcagat 68 40
HcoV-NL63 NL63-P taaggaaggt(fam)gctaaaact(fam)gttaat a 62 41
HcoV-OC43 OC43-P aaa aattt(fam)gcaggat(fam)ctttgggtgttatacaag 59 42
HcoV-HKUI HKUI-P aatggt(joe)atttttt(joe)ctagagtaagaatact 63 43
HcoV-229E 229E-P gtttgtt(cy5)gacaaaat(cy5)cactgaattccaa 69 44
HMPV HMPV-P tgcggcart(joe)cagacaat(joe)gc 55 45
IAC RP-P ccgccgat(rox)tctt(rox)ccccccgagcggctc 66 46
2、样本处理
采用ParaDNA配套的采样器采集鼻拭子等临床样本，直接置于ParaDNA的反应器中即可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司，逆转录酶GoScriptTM(货号A5001)购自Promega；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ParaDNA。
按照如下操作配制反应体系：总体系30μL，5×Goscript Buffer 5μL，氯化镁溶液3-4mM，dNTPS为1-1.5mM，上游引物0.8-1.0μM，下游引物0.2-0.5μM，Hybeacon探针100-300nM，逆转录酶1-2μL，具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。
表3
试剂盒含有5×Goscript Buffer、Phire Hot Start II DNA Polymerase，逆转录酶、10×引物探针混合液A管、10×引物探针混合液B管、10×引物探针混合液C管、10×引物探针混合液D管、阳性对照、阴性对照、超纯水。A管含有上表1中SEQ ID NO.1-10,25-26所示的引物和上表2中SEQ ID NO.27-32,46所示的探针；B管含有上表1中SEQ ID NO.11-14,25-26所示的引物和上表2中SEQ ID NO.33-37,46所示的探针；C管含有上表1中SEQ ID NO.15-20,25-26所示的引物和上表2中SEQ ID NO.38-40,46所示的探针；D管含有上表1中SEQ IDNO.21-26所示的引物和上表2中SEQ ID NO.41-46所示的探针。
将PCR管放入荧光定量PCR仪中，选择FAM、JOE、CY5和ROX作为报告基团，反应程序如下：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
反应结果判断：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管FAM荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管FAM荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管JOE荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管JOE荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管CY5荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管CY5荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管ROX荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管FAM荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管FAM荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管JOE荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管JOE荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管CY5荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管ROX荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管FAM荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管JOE荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管CY5荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管ROX荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管FAM荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管FAM荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管JOE荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管JOE荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管CY5荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管ROX荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
4、特异性验证
选择麻疹病毒、肠道病毒、巨细胞病毒、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳杆菌呼吸道感染的其他病原的临床样本(上述样本均来源于中国疾病预防控制中心细菌病预防控制所)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器采集痰液(液化)样本后，利用前期建立和优化的反应条件在ParaDNA上进行检测。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开的核酸试剂能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μL的呼吸道病原InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV核酸梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL，作为最低检出限评估的模板。
结果显示本公开试剂盒检测目标耐药基因的最低检出限均可达到10拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择500株评价用鼻拭子样本作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对所有样本均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
以100拷贝/μL的InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV临床样本作为评估用样本。
在第0天时，分装成10份冻存于-80℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，CY5为5H-吲哚菁，ROX为6-羧基-X-罗丹明。表5的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表4
表5
检测目标 探针代码 探针序列 Tm值(℃) SEQ ID NO
InfluA fluA-P1 cttatt(fam)gaaaat(fam)ttgcaggcttacc 69 87
InfluB fluB-P1 cct(joe)caaacaccccaat(joe)ggatacaagt 64 88
ADV ADV-P1 ccaccat(fam)gg gcaggagt(fam)tcgtcagaa 60 89
HBoV HBoV-P1 caagtaagt(joe)aaatacgcat(joe)gcgcaa 55 90
RSVA RSVA-P1 gatact(cy5)atagtt(cy5)acaaaaaaagatgggg 57 91
RSVB RSVB-P1 tcatgtt(cy5)gttaatct(cy5)taatgaagttgat 65 92
PIVI PIVI-P1 tgcat(fam)atccactat(fam)cccctgatgc 63 93
PIVII PIVII-P1 ataccaagact(fam)gagtttgt(fam)aactaagattc 56 94
PIVIII PIVIII-P1 tggat(joe)gtataacaggagt(joe)atatact 59 95
PIVIV PIVIV-P1 aat(joe)gacact(joe)caacaaattaaaggttcactt 63 96
HRV HRV-P1 tgacagcat(cy5)gattccaataaat(joe)aatg 65 97
MP MP-P1 ggct(fam)ggtcacctt(fam)cacggactttgtcaa 59 98
LP LP-P1 ctg cagaacat(joe)gtaattggccat(joe)ctgata 55 99
CP CP-P1 aagct(joe)cctgttgct(joe)gccgaacctac 68 100
HcoV-NL63 NL63-P1 tctggt(fam)acttccactcct(fam)aagaaacc 62 101
HcoV-OC43 OC43-P1 catgtt(fam)ggactcttggat(fam)caagcatggag 59 102
HcoV-HKUI HKUI-P1 ctttt(joe)gctaactctgtt(joe)tttaatat 63 103
HcoV-229E 229E-P1 ggt(cy5)tcagaattaacat(cy5)tgaagca 69 104
HMPV HMPV-P1 ccagcaat(joe)atctttagact(joe)taatgacag 55 105
IAC RP-P1 atggt(rox)gactt(rox)ccacccacaagg 66 106
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。
表6
由表6可知，对于样本中痕量的呼吸道感染病原InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。
表7
检测目标 实施例 对比例
InfluA 10 10
InfluB 10 10
ADV 10 9
HBoV 10 9
RSVA 10 9
RSVB 10 8
PIVI 10 8
PIVII 10 10
PIVIII 10 8
PIVIV 10 7
HRV 10 9
MP 10 9
LP 10 8
CP 10 8
HCoV-NL63 10 7
HCoV-HKUI 10 7
HCoV-OC43 10 7
HCoV-229E 10 9
HBoV 10 9
由表7可知，本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以检测出呼吸道感染病原InfluA、InfluB、RSVA、RSVB、ADV、PIVI、PIVII、PIVIII、PIVIV、HRV、HMPV、CP、MP、LP、HCoV-NL63、HCoV-HKUI、HCoV-OC43、HCoV-229E以及HBoV，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 12620ABT
<160> 106
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgagycttyt aaccgaggtc ga 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaaancgt ctacgctgc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaggacat tcaaagcc 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtgataa tcggtgc 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggatgcttc ggagtac 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggtttctaa acttgttccc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgtaccgta gacacttagc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcacccac cctctaggct gt 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttaactattt gcatcgtctt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctagtatc aaagtgataa 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggataaagat tgaaaataca ctc 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagttatct taagagcatc a 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagtcctccg gcccctgaa 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagtgtgtgc caacattctg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggcaataa ccaccggggc 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgcccccga gggtggcttg gaca 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgatagcat gtggtgtccc aacga 25
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgatcaaatc attaattcga ta 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgaaaaaatt attagaagag aa 22
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctaacgactt ttaagacgcc gattt 25
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcgtatgcgc agggggcaac gtgttg 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcaacaaca gagagctctg gaggcaa 27
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcttcagtca rttcaacaga a 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgcagatgt yggcatgt 18
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgaggcggtt ctcggtgggg gccgag 26
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caccaacgga cgtgaagccg gtgag 25
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aggccccctc aaagccgaga tcgcgcaga 29
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccaattcgag cagctgaaac tg 22
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acacctactt cagtatgg 18
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgctgaaagc atggaagcag atgcctcc 28
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ataccagctt atagaactac aa 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atatcagctt atagttctac aa 22
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aagtcaacac caagtgtgt 19
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcagttggaa gcgggatcta tca 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gatatggagg tcttgaacat cca 23
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccacggatgc attcgaattc catcattctc ctta 34
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atccttattg attgcttatg gtgacaatat 30
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tttccaacat cggcgtcggc ctc 23
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caatggggta atttggatgg caaatcagcc tat 33
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcagtaaccc tcgaagatgt tcctgcagat 30
<210> 41
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
taaggaaggt gctaaaactg ttaata 26
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aaaaatttgc aggatctttg ggtgttatac aag 33
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aatggtattt tttctagagt aagaatact 29
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtttgttgac aaaatcactg aattccaa 28
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgcggcartc agacaatgc 19
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ccgccgattc ttccccccga gcggctc 27
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gatcaagtga gcaggcagcg gaag 24
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctgcagttgc actcccatcc g 21
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggattgatta cccttcaacc cca 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcaatctat gtagagttga taa 23
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tatgaatatt caactatgga agatcctg 28
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cccatccaca gtggatccca tgaca 25
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tacagtggtg tttcaatgag tacgactgta c 31
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tagcgaagtg aaagtaaaag aatt 24
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gaagctatgg caagactcag gaatgaagaa 30
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
taggacattg tattgaacag cagctgtgt 29
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atgtttaggc aaatccaaat ctta 24
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gtccacagtt tttgacacca gccctcaat 29
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tctaggtgcc gaagggaggc tacttaa 27
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgcgtacagt gtggttgtag caacattga 29
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
taattgctgg tccgactagt ggagg 25
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tttatattgc agagcgtatt attgaccgt 29
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
aaattactgg gggtcagaag gaagg 25
<210> 64
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgctccctgt gggatttagt ggatac 26
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ttagaggtga ggttagatag gatc 24
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ggtccattat tttcattgtt gtgattaa 28
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acaatttatg accacagatg atttcc 26
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caaaaacctc ctgcattagt tcatcttgt 29
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggaacacgcg agcgggtggt tcggggtc 28
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gctgcgtcgc atcacttgca tccaag 26
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tagtcctaaa ggaaattgaa aaaa 24
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cgatggctat cacattagca taaccac 27
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
agaagagaag tgggatgtta ctgc 24
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctaacgactt ttaagacgcc gattt 25
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ctaataattc atctcgtgct agcagt 26
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tccaacgagg tttcttcaac tga 23
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ttacaacttc acttacacca tgtggct 27
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ataatctcct ttactgtagg ctgtt 25
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tgtggcggtt gctattatgt ta 22
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gcgtatactt aaatcttcaa tctt 24
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
aacgcactgt ttgtttttct gtcg 24
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ggtaggtctg ttgtaacgat aata 24
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tcagtcaatt caacagaagg tttcta 26
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cgcacggttt tccaacatca attttatt 28
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
attggcccga ggcctccgaa gtacatcac 29
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tcccctcctg gtcccctctc tga 23
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
cttattgaaa atttgcaggc ttacc 25
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cctcaaacac cccaatggat acaagt 26
<210> 89
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
ccaccatggg caggagttcg tcagaa 26
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
caagtaagta aatacgcatg cgcaa 25
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gatactatag ttacaaaaaa agatgggg 28
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tcatgttgtt aatcttaatg aagttgat 28
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tgcatatcca ctatcccctg atgc 24
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ataccaagac tgagtttgta actaagattc 30
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
tggatgtata acaggagtat atact 25
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aatgacactc aacaaattaa aggttcactt 30
<210> 97
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tgacagcatg attccaataa ataatg 26
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
ggctggtcac cttcacggac tttgtcaa 28
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
ctgcagaaca tgtaattggc catctgata 29
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
aagctcctgt tgctgccgaa cctac 25
<210> 101
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tctggtactt ccactcctaa gaaacc 26
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
catgttggac tcttggatca agcatggag 29
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
cttttgctaa ctctgttttt aatat 25
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
ggttcagaat taacattgaa gca 23
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ccagcaatat ctttagactt aatgacag 28
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
atggtgactt ccacccacaa gg 22

Claims (10)

1.一种用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-24所示的引物和SEQ ID NO.27-45所示的探针。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-24所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.4-0.6μM、0.6-1.0μM、0.4-0.6μM、0.8-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.6-1.0μM、0.4-0.5μM、0.6-1.0μM、0.1-0.4μM、0.6-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM、0.3-0.5μM、0.8-1.0μM和0.3-0.5μM，分别由SEQ ID NO.27-45所示的探针的含量各自为0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.4μM、0.2-0.4μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM和0.1-0.3μM。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控；
所述阳性内质控含有SEQ ID NO.25-26所示的引物和SEQ ID NO.46所示的探针。
4.根据权利要求3所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQ ID NO.1-10,25-26所示的引物和SEQ ID NO.27-32,46所示的探针；B管含有SEQ IDNO.11-14,25-26所示的引物和SEQ ID NO.33-37,46所示的探针；C管含有SEQ ID NO.15-20,25-26所示的引物和SEQ ID NO.38-40,46所示的探针；D管含有SEQ ID NO.21-26所示的引物和SEQ ID NO.41-46所示的探针。
5.根据权利要求4所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.27,29,33,34,38,41,42所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.28,30,35,36,39,43,45所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.31,32,37,40,44所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.46所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，其中，所述呼吸道感染病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、腺病毒、人副流感I型病毒、人副流感II型病毒、人副流感III型病毒、人副流感IV型病毒、人鼻病毒、人偏肺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、冠状病毒NL63、冠状病毒HKUI、冠状病毒229E、冠状病毒OC43和博卡病毒中的至少一种。
7.一种用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～6中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
8.权利要求1～6中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测呼吸道感染病原体的试剂盒中的用途。
9.一种用于检测呼吸道感染病原体的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
10.一种用于检测呼吸道感染病原体的方法，其中，该方法包括：采用权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；并且进行如下的判别：
若阳性对照成立，则检测结果有效；
若A管第一荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为InfluA阳性；A管第一荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ADV阳性；A管第二荧光通道通道有Tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为InfluB阳性；A管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HBoV阳性；A管第三荧光通道有Tm值为57℃的溶解峰曲线判定为RSVA阳性；A管第三荧光通道有Tm值为65℃的溶解峰曲线判定为RSVB阳性；A管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若B管第一荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVI阳性；B管第一荧光通道有Tm值为56℃对应的溶解峰曲线判定为PIVII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIII阳性；B管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为PIVIV阳性；B管第三荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为HRV阳性；B管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若C管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为MP阳性；C管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为LP阳性；C管第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为CP阳性；C管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格；
若D管第一荧光通道有Tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-NL63阳性；D管第一荧光通道有Tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-OC43阳性；D管第二荧光通道有Tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-HKUI阳性；D管第二荧光通道有Tm值为55℃对应的溶解峰曲线判定为HMPV阳性；D管第三荧光通道有Tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为HcoV-229E阳性；D管第四荧光通道有Tm值为66℃的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
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