CN103333967B

CN103333967B - 一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法

Info

Publication number: CN103333967B
Application number: CN201310293950.3A
Authority: CN
Inventors: 张何; 傅昕; 刘涟; 朱振军
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2033-07-12
Also published as: CN103333967A

Abstract

本发明公开了一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法。本发明主要是：将特异性捕获探针和电子富集蛋白固定于微球表面形成功能化微球，并将该微球固定在微流控芯片检测区中；将辣根过氧化物酶和检测探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；将目标核酸序列及纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列反应；通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的电子富集蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微球表面电子富集蛋白上结合的生物素识别并固定，通过荧光进行定量检测。本发明能解决当前核酸分析方法中存在的灵敏度低、检测流程复杂及难以实现微量样品分析的问题，并促进该技术领域的进一步发展。

Description

一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法

技术领域

本发明属于微全分析系统的生物学检测技术领域，具体涉及一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法。

背景技术

核酸分析在生物医学领域应用广泛，现阶段主要的核酸分析方法包括：微阵列技术、聚合酶链式反应、Southern印记、化学发光法、荧光光度法、共振光散射法等；这些方法在检测性能上普遍存在灵敏度不高、仪器昂贵、检测过程复杂、难于多目标平行检测等缺陷。微流控微珠阵列芯片是微流控芯片研究领域中发展的一种新型芯片模式，它有机的将传统的微阵列芯片和微流控芯片结合起来，以功能化微球作为传感元件实现高通量检测，以微流体作为试剂及样品传送方式实现微量检测。该技术的建立能够较好的解决了微量样品条件下高通量、高灵敏检测的难题，同时检测过程简单，不需要昂贵的检测仪器，为发展未来自动化高性能核酸检测平台技术提供了新的方向。

酶功能化纳米颗粒作为一种检测标记材料，由于一个纳米颗粒上能携带多个酶分子，已经成为信号放大技术领域中的一种极具应用前景的信号放大方法。酶功能化纳米颗粒标记技术在电化学领域应用较多，且多用于蛋白质的检测，例如：利用酶功能化的硅纳米颗粒，通过电化学和化学发光技术实现了甲胎蛋白的高灵敏检测（WuY,ChenC,LiuS.Enzyme-functionalizedsilicananoparticlesassensitivelabelsinbiosensing.AnalChem,2009,81(4):1600-1607）。该方法在核酸检测中应用较少，是一种具有较好前景的高性能核酸检测信号放大技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于核酸分析的高性能新型检测方法，即一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，以解决当前核酸分析方法中存在的灵敏度低、检测流程复杂及难以实现微量样品分析的问题，并促进该技术领域的进一步发展。

本发明的目的是通过如下的技术方案来实现的：该基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，包括如下步骤：

（1）通过生物素-亲合素结合方法将设计的特异性捕获探针和电子富集蛋白固定于微球表面形成功能化微球，并将该微球固定在微流控芯片检测区的相应微结构中，形成微流控微珠阵列检测芯片；

（2）将辣根过氧化物酶和检测探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；

（3）将目标核酸序列及步骤（2）形成的功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列反应，功能化微球可以特异性地识别及捕获目标核酸序列，并与功能化纳米颗粒探针形成三明治结构；

（4）通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的电子富集蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微球表面电子富集蛋白上结合的生物素识别并固定，通过荧光进行定量检测。

具体地说，步骤（1）中所述的微流控微珠阵列检测芯片包含两个聚二甲基硅氧烷微流控芯片即PDMS片基，第一PDMS片基的微结构阵列覆盖通道的尺寸为100～300微米宽、1000～3000微米长、5～15微米深；第二PDMS片基的微珠固定微结构阵列由10～20个单独的小室构成，其中单个小室的尺寸为100～150微米宽、100～150微米长、30～50微米深。

步骤（1）中所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种；所述的微珠尺寸为10～30微米。

步骤（1）中所述的电子富集蛋白为羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰的酪蛋白。

步骤（2）中所述的纳米颗粒为金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯纳米颗粒中的一种。

步骤（4）中所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种，其发射范围为400nm～700nm。

本发明的微流控微珠阵列芯片具有微量检测和高通量检测的双重特性，能够较好的解决常规分析方法中微量检测、高灵敏检测以及高通量分析等性能难以兼容的问题，可实现稀有样品的高灵敏分析；本发明采用多酶纳米信号放大及量子点荧光技术，可高灵敏检测分析目标，能够检测5fM的目标核酸序列；由于检测都是在封闭的微通道中进行，可以避免检测过程中存在的污染问题；本发明的建立为核酸的微量、高灵敏及高通量检测提供了一种有力的检测手段。

附图说明

图1为本发明实施例的微流控微珠阵列芯片的结构示意图及微结构显微照片。

图2为本发明的多酶纳米信号放大技术用于核酸检测的原理示意图。

图3为本发明实施例的微流控微珠阵列芯片检测核酸的灵敏度结果对比曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述。

参见图2，是本发明方法的原理示意图。图2所示的原理具体如下：

首先，生物素修饰的捕获探针3及生物素修饰的电子富集蛋白2按照一定比例修饰到亲和素修饰的微球表面1，制备出可用于核酸检测的功能化微球4；流入的目标核酸序列6及修饰了辣根过氧化物酶（HRP）和检测探针的纳米颗粒5，与构建的功能化微球阵列杂交，捕获探针及检测探针都能与目标核酸片段杂交，形成三明治结构7；然后流入酶催化底物溶液，包含生物素化的酪胺8和双氧水，辣根过氧化物酶在双氧水存在下能催化生物素化的酪胺形成活性分子9，该生物素化的活性分子能与电子富集蛋白功能化微球表面携带的羟苯基团发生共价交联，从而形成生物素基团功能化的微球表面10；流入亲和素修饰的量子点11，量子点利用亲和素与生物素的结合特性固定在微球表面形成了识别微球12；最后根据识别微球表面荧光信号获取检测信息。

下面是本发明实施例的具体实施过程：

（1）电子富集蛋白的制备：将0.3-0.5g酪蛋白溶解在10mL150-200mM的NaHCO₃溶液中，将溶解有2-4mg羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.5-1.0mg生物素化的琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺在搅动下逐滴加入到酪蛋白溶液中。混合溶液在室温下连续搅动1h，然后在去离子水中透析12-24h，再在磷酸缓冲液（20mM，pH7.6）中透析12-24h，溶液离心去除轻微的浑浊溶液，沉淀冻干备用。

（2）用于核酸检测的功能化聚苯乙烯微珠的制备：采用10-30μm亲和素修饰的聚苯乙烯微球作为探针固定的固相界面，取100μL浓度为1%-3%的亲和素修饰微球于离心管中，用100μL亲和洗脱液（20mMTrispH7.5,1MNaCl,1mMEDTA,0.0005%TritonX-100）洗涤两次，离心条件为3500rpm，5min，去上清；分别加入44μL的亲和洗脱液、3μL10-15μM的生物素化的电子富集蛋白及3μL0.1-0.3μM如表1所示的捕获探针，常温孵育10-15h；通过离心洗涤方法去除未结合的分子并将功能化微球悬浮于100μL亲和洗脱液。捕获探针及电子富集蛋白通过修饰的生物素与微球表面的亲和素特异性结合并固定在微球表面，从而形成了具有目标序列检测能力的功能化聚苯乙烯微球。

表1合成的寡核苷酸探针（5’-3’端）

（3）微流控微珠阵列芯片的制备：首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件（CorelDRAW9.0）绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按10:1（质量比）比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上（厚约1mm）。置于65°C烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）片基从阳模板上剥离下来。参见图1，设计的检测芯片由第一PDMS片基14和第二PDMS片基13组合而成，如图1A所示，第二PDMS片基13包含有由许多可用于微珠固定的小室所构成的阵列15，如图1B所示；在将片基贴合前，小室已经通过微珠装载片基，如图1C所示，有序及选择性装入了多种功能化微球，如图1D所示，微珠装载片基剥离后，将微球固定阵列片基和试剂传送片基贴合并使试剂传送通道16与小室阵列区重合，如图1E所示。设计的微流控芯片中，微珠固定微结构阵列由10个单独的小室构成，单个小室的尺寸为100μm宽、100μm长、30μm深；第一PDMS片基14包含的微结构阵列覆盖通道的尺寸为150μm宽、1.5mm长、10μm深。

（4）功能化金纳米颗粒探针的制备：取600μL制备的金纳米颗粒在10000rpm下离心15min去上清并浓缩至150μL，用0.1MK₂CO₃调pH为8.0左右，随后加入9.0μL辣根过氧化物酶溶液（5μg/μL），室温下反应30分钟，加入如表1所示的检测探针60μL(10μM)，10℃下摇床中200rpm反应20h。加入缓冲液使体系中含10mMPBS、0.02%Tween-20、0.15MNaCl（终浓度），10℃下摇床中200rpm反应20h。最后10000rpm15min离心去上清，并用洗涤液洗涤5次，重新悬浮于150μL洗涤液中（洗涤液成分：0.01MPBS，0.15MNaCl,0.025%Tween20,0.1%BSA），4℃冰箱内保存。

（5）（a）芯片内核酸检测：根据图2所示的操作流程，使用1fMto10nM如表1所示的目标序列构建15μL杂交溶液，包括：10mMTris-HCl(pH7.5),750mMNaCl,0.025%Tween20及2nM步骤（4）制备的修饰有检测探针及HRP的金纳米颗粒探针，在压力驱动下通过步骤（3）制备的的包含功能化微珠阵列的微流控微珠阵列芯片检测区，常温下孵育30min；用55°CTEbuffer(10mMTris–HCl,pH8.0,1mMEDTA)洗涤5min；流入10μL辣根过氧化物酶底物溶液，包括：0.008%H₂O₂，350μMbiotin-tyramine，50mMborate,pH8.8，于37°C孵育60min，通道洗脱后将1：20稀释的亲合素修饰量子点溶液通入检测区与微球反应30min，最后用TE溶液洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，通过对不同浓度的目标序列的芯片检测可获得如图3所示的曲线1。

（b）芯片外核酸检测：在0.2ml的Eppendorf管中构建芯片外反应体系，使用1fM-10nM如表1所示的目标序列在0.2mlEppendorf管中构建15μL杂交体系，包括：10mMTris-HCl(pH7.5),750mMNaCl,0.025%Tween20，2nM步骤（4）制备的修饰有检测探针及HRP的金纳米颗粒探针及1-2μL功能化微珠，常温下孵育30min；用55°CTEbuffer(10mMTris–HCl,pH8.0,1mMEDTA)洗涤5min，离心去上清；加入10μL辣根过氧化物酶底物溶液，包括：0.008%H₂O₂，350μMbiotin-tyramine，50mMborate,pH8.8，于37°C孵育60min，洗涤离心后去上清，加入1：20稀释的亲合素修饰量子点溶液常温反应30min，最后用TE溶液洗涤2次。将反应后的微球置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，通过对不同浓度的目标序列的芯片外检测可获得如图3所示的曲线2。结果显示：在信噪比（SNR）大于3的情况下，采用构建的微流控微珠阵列芯片最低可以检测到5fM的目标序列，而采用芯片外检测方法最低只能检测到5pM的目标序列。芯片核酸检测较非芯片检测体系信号放大了1000倍，由此可见微流体的物质传递增强性能导致了芯片内核酸分析的灵敏度高于芯片外的分析灵敏度，这充分证明了该方法用于高灵敏核酸分析的适用性。

Claims

1.一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)通过生物素-亲合素结合方法将设计的特异性捕获探针和电子富集蛋白固定于微球表面形成功能化微球，并将该微球固定在微流控芯片检测区的相应微结构中，形成微流控微珠阵列检测芯片；

(2)将辣根过氧化物酶和检测探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；

(3)将目标核酸序列及步骤(2)形成的功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列反应，功能化微球可以特异性地识别及捕获目标核酸序列，并与功能化纳米颗粒探针形成三明治结构；

(4)通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的电子富集蛋白上，与此同时流入双氧水，随后进行洗脱，洗脱后流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微球表面电子富集蛋白上结合的生物素识别并固定，通过荧光进行定量检测；

所述的电子富集蛋白为羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰的酪蛋白；

所述电子富集蛋白的制备方法为：将0.3-0.5g酪蛋白溶解在10mL150-200mM的NaHCO₃溶液中，将溶解有2-4mg羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.5-1.0mg生物素化的琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺在搅动下逐滴加入到酪蛋白溶液中；混合溶液在室温下连续搅动1h，然后在去离子水中透析12-24h，再在20mM，pH7.6的磷酸缓冲液中透析12-24h，溶液离心去除轻微的浑浊溶液，沉淀冻干备用。

2.根据权利要求1所述的基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微流控微珠阵列检测芯片包含两个聚二甲基硅氧烷微流控芯片即PDMS片基，第一PDMS片基的微结构阵列覆盖通道的尺寸为100～300微米宽、1000～3000微米长、5～15微米深；第二PDMS片基的微珠固定微结构阵列由10～20个单独的小室构成，其中单个小室的尺寸为100～150微米宽、100～150微米长、30～50微米深。

3.根据权利要求1所述的基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种。

4.根据权利要求3所述的基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的微珠尺寸为10～30微米。

5.根据权利要求1所述的基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的纳米颗粒为金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯纳米颗粒中的一种。

6.根据权利要求1所述的基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种，其发射范围为400nm～700nm。