CN103834726A - 基于微流控微珠阵列芯片和dna聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法 - Google Patents

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张何
傅昕
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Abstract

本发明公开了基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法。本发明是将生物素修饰的微小核糖核酸捕获探针通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，该微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；然后将含有微小核糖核酸的样品溶液流入微流控微珠阵列检测芯片，再流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，最后流入亲合素标记的量子点，然后计算流入微小核糖核酸后微球表面荧光进行定性和定量。本发明高灵敏、高特异的检测微小核糖核酸，实现了总RNA样品中微小核糖核酸的特异及灵敏的定量分析。

Description

基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法
技术领域
本发明涉及微全分析系统的生物学检测技术领域，尤其涉及的是基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法。
背景技术
微小核糖核酸MicroRNA(miRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成，通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。至今为止已经发现了3000多个miRNA，其中大部分在动物体内都起着关键性的调控作用，是最主要的基因表达调控因子之一，据估计人体内大约2／3的基因都受到某个或一组miRNA的调控。因此发展miRNA的新型检测方法对于医学临床诊断具有重要意义。已发展的miRNA检测方法主要有微阵列芯片杂交分析技术、基于miRNA的RT-PCR技术、酶促发光技术、深度测序技术、电化学方法、微流控微阵列技术、微阵列RNA引物延伸技术及微球酶标记等技术，这类技术大都检测灵敏度有限，而且需要较大体积的检测溶液，使得在高灵敏微量分析领域的应用受到局限。微流控微珠阵列芯片是微流控芯片研究领域中发展的一种新型芯片模式，其优势包括：传感微球能够提供较大的表面积用于识别分子的固定；微球均相识别过程减少了反应时间；探针阵列形成过程和修饰过程的分离减少了成本；反应在微流控芯片中进行，极大减少了样品量且提高了检测灵敏度。该技术的发展较好解决了微量样品条件下高通量、高灵敏检测的难题，同时检测过程简单，不需要昂贵的检测仪器，为发展未来自动化高性能生物分子检测平台技术提供了新的方向，该技术用于微小核糖核酸的分析未见报道。
利用去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶介导的引物延伸技术检测miRNA，由于采用了常规杂交及酶促延伸双重特异性，与其他技术比较，该技术特异性较好，同时杂交前miRNA不需要标记，杂交后也不需要信号放大，极大简化了反应流程，增加了结果的可靠性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法。
本发明的技术方案如下：
基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法，其步骤如下：
(1)生物素修饰的微小核糖核酸捕获探针通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，该微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；
(2)将含有微小核糖核酸的样品溶液流入步骤(1)中形成的微流控微珠阵列检测芯片，微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交形成DNA／RNA二聚体；
(3)流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，以微小核糖核酸为引物，捕获探针为模版，通过DNA聚合酶介导的延伸反应，将生物素化延伸底物增加在微小核糖核酸的3’末端；其中介导反应时间为15～20min；
(4)流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微小核糖核酸上结合的生物素识别并固定；
(5)通过计算流入微小核糖核酸后微球表面荧光进行定性和定量。
所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(1)中，所述的捕获探针的3’末端包含由10个胸腺嘧啶和10个胞嘧啶构成的伸展序列；5’末端包含由5个胸腺嘧啶构成的模版序列。
所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(1)中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种。
所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(2)中，所述的微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交的时间为25～35min。
所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(3)中，所述的DNA聚合酶为去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶；生物素化延伸底物为biotin-11-dATP，其浓度为0.5～1.5μM。
所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(4)中，所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种；其发射范围为400nm～700nm。
本发明微流控微珠阵列芯片具有微量检测和高通灵敏检测的双重特性，能够较好的解决微小核糖核酸分析方法中微量检测、高灵敏检测以及高通量分析等性能难以兼容的问题，尤其适合显微切割样品和微创手术样品检测微小核糖核酸；本发明利用了常规杂交及酶促延伸技术的双重特异性，能够实现具有少数几个碱基差异的微小核糖核酸的识别，能够识别miRNA-29家族中的miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c(2-3个碱基差异)，且灵敏度高，能够检测0.1pM的微小核糖核酸，而且实现了总RNA样品中微小核糖核酸的特异及准确的定量分析；本发明的建立为微小核糖核酸的微量及高灵敏检测提供了一种有力的检测手段。
附图说明
图1为本发明的基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸的微小核糖核酸检测原理示意图；
图2为本发明实施例的微流控芯片内外检测微小核糖核酸的灵敏度对比曲线图；
图3为本发明实施例的总RNA样品检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
参照图1，是本发明方法的原理示意图。图1所示的具体原理如下：
首先，将生物素修饰的微小核糖核酸捕获探针2(3’末端包含由10个胸腺嘧啶和10个胞嘧啶构成的伸展序列(TC tag)，5’末端包含由5个胸腺嘧啶构成的模版序列(Poly(dT)5)修饰到亲和素修饰的微球表面1，制备出可用于微小核糖核酸检测的功能化微球3；流入微小核糖核酸检测目标4，与芯片内的功能化微球杂交，捕获探针与微小核糖核酸通过杂交结合并固定在微球表面5；流入生物素修饰的延伸底物6和去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶7，通过延伸反应将生物素修饰的底物6增加到微小核糖核酸4的3，末端，通过该方式将生物素基团增加到微球表面8；然后流入亲和素修饰的量子点9，量子点利用亲和素与生物素的结合特性固定在微球表面形成了识别微球10；最后根据识别微球表面荧光信号获取检测信息。
实施例
(1)用于微小核糖核酸检测的功能化聚苯乙烯微珠的制备：采用10-30μm亲和素修饰聚苯乙烯微球作为微小核糖核酸捕获探针固定的固相界面，取100μL质量百分浓度为1％-3％的亲和素修饰微球于离心管中，用100μL亲和洗脱液(20mM Tris pH7.5，1M NaCl，1mM EDTA，0.0005％wt Triton X-100)洗涤两次，离心条件为3500rpm，5min，去上清；然后加入44μL的亲和洗脱液、3μL0.1-0.3μM如表1所示的微小核糖核酸捕获探针，常温孵育15-30min；通过离心洗涤方法去除未结合的分子并将功能化微球悬浮于100μL亲和洗脱液。捕获探针通过修饰的生物素与微球表面的亲和素特异性结合并固定在微球表面，从而形成了具有微小核糖核酸检测能力的功能化聚苯乙烯微球。
(2)微流控微珠阵列芯片的制备：首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW9.0)绘制出来，并以2400dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜；然后将光掩膜的图案通过紫外曝光的方法转移到覆盖有光刻胶的PCB板上，并用化学刻蚀方法在曝光PCB板上制备出芯片的阳模板；最后将聚二甲基硅氧烷前聚体与固化剂按质量比10∶1比例混合后于真空泵中除去气泡，然后平铺在芯片阳模板上(厚约1mm)。置于65℃烘箱中3h，待固化后取出，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基从阳模板上剥离下来。功能化微球通过微珠装载片基固定在以微型小室为单位构成的阵列中；功能化微珠固定后，剥离微珠装载片基并将微球固定阵列片基和试剂传送片基贴合构建检测芯片。
表1合成的寡核苷酸探针(5’-3’端)
(3)(a)芯片内微小核糖核酸目标物检测：根据图1所示的操作流程，包含0.01pM-10nM的微小核糖核酸溶液10μL，包括：10mM Tris-HCl(pH7.5)，750mM NaCl，0.025％wt Tween20，在压力驱动下流入步骤(2)制备的包含功能化微珠阵列的微流控微珠阵列芯片检测区，42℃孵育30min，用50℃洗脱液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)洗涤5min；流入20μL延伸反应溶液，包括：10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT，0.2μgSSB，10U exonuclease-deficient(exo-)Klenow DNApolymerase，1μM biotin-11-dATP，于37℃孵育15min，通道洗脱后将以体积1：20稀释的亲合素修饰量子点溶液(CdSe-ZnS量子点，最大发射波长605纳米)通入检测区与微球反应30min，最后用TE溶液洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，通过计算微球表面荧光对微小核糖核酸进行定量；通过对不同浓度微小核糖核酸的芯片检测可获得如图2所示的曲线1。
(b)芯片外微小核糖核酸目标物检测：在0.2ml的Eppendorf管中构建芯片外反应体系，包括：1-2μL功能化微珠，0.01pM-10nM的微小核糖核酸，10mM Tris-HCl(pH7.5)，750mM NaCl，0.025％wt Tween20，42℃孵育30min；用50℃洗脱液(10mM Tris-HCl，pH8.0，lmM EDTA)洗涤2次，离心去上清；加入20μL延伸反应溶液，包括：10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT，0.2μg SSB，10Uexonuclease-deficient(exo-)Klenow DNA polymerase，1μM biotin-11-dATP，于37℃孵育15min，洗涤离心后去上清，加入以体积1：20稀释的亲合素修饰量子点溶液(CdSe-ZnS量子点，最大发射波长605纳米)常温反应30min，最后用TE溶液洗涤2次。将反应后的微球置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，通过计算微球表面荧光对微小核糖核酸进行定量；通过对不同浓度微小核糖核酸的芯片外检测可获得如图2所示的曲线2。结果显示：采用构建的微流控芯片传感器最低可以检测到0.1pM的微小核糖核酸，而采用芯片外检测方法最低只能检测到20pM的微小核糖核酸分子。基于芯片的微小核糖核酸传感技术较芯片外检测体系灵敏度提高了200倍，由此可见微流体的物质传递增强性能导致了芯片内微小核糖核酸分析的灵敏度高于芯片外的分析灵敏度，这充分证明了该方法用于高灵敏微小核糖核酸分析的适用性。
(4)对总RNA样品的分析性能：从肿瘤细胞A549中提取总RNA，使用OMEGAmiRNA Isolation Kit分离大分子RNA(大于200碱基)；构建包含不同浓度微小核糖核酸目标物的溶液10μL，包括：50ng大分子RNA，10mM Tris-HCl(pH7.5)，750mMNaCl，0.025％wt Tween20，在压力驱动下流入步骤(2)制备的的包含功能化微珠阵列的微流控微珠阵列芯片检测区，42℃孵育30min，用50℃洗脱液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)洗涤5min；流入20μL延伸反应溶液，包括：10mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT，0.2μg SSB，10U exonuclease-deficient(exo-)Klenow DNA polymerase，1μM biotin-11-dATP，于37℃孵育15min，通道洗脱后将以体积1：20稀释的亲合素修饰量子点溶液(CdSe-ZnS量子点，最大发射波长605纳米)通入检测区与微球反应30min，最后用TE溶液洗涤5min。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜中的CCD成像系统下，对颗粒进行观察拍摄，并用荧光图像分析软件进行分析，通过计算微球表面荧光对微小核糖核酸进行定量；对包含不同浓度微小核糖核酸目标物的总RNA样品进行芯片检测，并与溶液样品检测结果比对。结果如图3所示，总RNA样品不会干扰微小核糖核酸目标物在芯片内的检测，而且检测结果与溶液样品检测结果相近。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Figure ISA0000100718570000011

Claims (6)

1.基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法，其特征是，其步骤如下：
(1)生物素修饰的微小核糖核酸捕获探针通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，该微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；
(2)将含有微小核糖核酸的样品溶液流入步骤(1)中形成的微流控微珠阵列检测芯片，微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交形成DNA／RNA二聚体；
(3)流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，以微小核糖核酸为引物，捕获探针为模版，通过DNA聚合酶介导的延伸反应，将生物素化延伸底物增加在微小核糖核酸的3’末端；其中介导反应时间为15～20min；
(4)流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微小核糖核酸上结合的生物素识别并固定；
(5)通过计算流入微小核糖核酸后微球表面荧光进行定性和定量。
2.根据权利要求1所述的微小核糖核酸检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述的捕获探针的3’末端包含由10个胸腺嘧啶和10个胞嘧啶构成的伸展序列；5’末端包含由5个胸腺嘧啶构成的模版序列。
3.根据权利要求1所述的微小核糖核酸检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种。
4.根据权利要求1所述的微小核糖核酸检测方法，其特征是，步骤(2)中，所述的微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交的时间为25～35min。
5.根据权利要求1所述的微小核糖核酸检测方法，其特征是，步骤(3)中，所述的DNA聚合酶为去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶；生物素化延伸底物为biotin-11-dATP，其浓度为0.5～1.5μM。
6.根据权利要求1所述的微小核糖核酸检测方法，其特征是，步骤(4)中，所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种；其发射范围为400nm～700nm。
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