CN101750488A - 基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，所述系统为使用激光检测的检测系统；所述检测系统以微流控芯片(1)为核心，所述微流控芯片(1)由三层结构依次复合构成：上层的流体通路层(101)、中间的弹性薄膜层(102)、下层的气动控制层(103)；这三部分相互之间的具体关系如下：流体通路层(101)和气动控制层(103)通过其各自与弹性薄膜层(102)之间的表面张力紧密相连。本发明具有检测时间短、检测限低、重现性好、易于操作、样品用量少、集成化等优点。其具有可预见的巨大的科学价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及化学与物理科学，具体涉及芯片免疫分析技术；特别提供了一种基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统。
背景技术
β2-肾上腺素受体激动剂类药物是一类人工合成药物，主要用于防治人、兽支气管哮喘和支气管痉挛。β2-肾上腺素受体激动剂在体育比赛中可用于增强运动员、动物(如马)肌肉，提高运动成绩，国际奥委会将β2-肾上腺素受体激动剂列为禁用药物。80年代，国内外研究表明，在饲料中添加β2-肾上腺素受体激动剂具有营养再分配作用，可以明显提高瘦肉率。人体食用了含有β2-肾上腺素受体激动剂类药物的食品会有许多不良反应。对β2-肾上腺素受体激动剂的检测在临床药物代谢动力学，体育运动和食品安全方面都有重要意义。
现有技术中，检测β2-肾上腺素受体激动剂的方法和平台主要有以下几种：色谱技术、酶免疫分析技术、金标免疫检测技术和生物传感技术。β2-肾上腺素受体激动剂残留检测从综合考虑，多孔板的酶联免疫分析法(属于酶免疫分析技术)是目前检测盐酸克伦特罗最佳方法，但孔板上的孵育时间及免疫反应所需时间较长，不能自动化的完成操作。色谱法虽然是最终确认分析方法，但具有操作烦琐且费用高，仪器昂贵等缺点。金标免疫检测技术和生物传感技术局限于单次单份测定，目前无法实现高通量。
人们渴望获得一种技术效果更好的基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统以及基于此系统的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统。
对比现有技术而言，微流控芯片具有高通量，自动化，集成化，耗时少，快速，高效等优点，因此我们将微流控芯片与酶联免疫方法相结合来实现对β2-肾上腺素受体激动剂的快速检测。
本发明基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，所述系统为使用激光检测的检测系统；其特征在于：
所述检测系统以微流控芯片1为核心，所述微流控芯片1由三层结构依次复合构成：上层的流体通路层101、中间的弹性薄膜层102、下层的气动控制层103；这三部分相互之间的具体关系如下：流体通路层101和气动控制层103通过其各自与弹性薄膜层102之间的表面张力紧密相连。
本发明的所述检测系统中包含有2～100组检测单元201，检测单元201具体包含有如下组成部分：微阀单元202，分析通道203，样品液池204；
所述每个检测单元201上还连接有供给至少一个检测单元201使用的缓冲液池205和废液池206。
本发明所述检测系统优选通过设置在微流控芯片1上的微阀单元202实现进样：所述微阀单元202具体是3个或3个以上为一组使用，其通过程序控制运行；所述微阀单元202的构成如下：弹性薄膜层102、设置在流体通路层101上的坝结构207、设置在弹性薄膜层102另一侧的气动控制层103上与坝结构207处于对应位置处的气体空腔208。
所述检测系统中的微阀单元202是常闭阀，其在外来的低气压的作用下阀开启，高气压作用下又关闭。
本发明所述检测系统具体包含有以下组成部分：微流控芯片1、物镜2、分光镜3、聚焦透镜4、针孔5、发射光滤光片6、光电倍增管7、信号采集器8、激发光滤光片9激光器10；其中：按照距离微流控芯片1由近及远的顺序，基本按照直线依次布置着物镜2、分光镜3、聚焦透镜4、针孔5、发射光滤光片6、光电倍增管7；信号采集器8连接着光电倍增管7，分光镜3的一侧按照由近及远的顺序布置着激发光滤光片9、激光器10。
所述检测系统中，在检测过程中，激光器10的有效工作波长要求是470～650nm；在满足此要求的激光器10的激光激发条件下检测，待检测物发出560～620nm的荧光。
为了便于操作，所述检测系统中，每个检测单元201结构相同或成镜像对称，各检测单元201的分析通道203在检测区域集中排列；
所述分析通道203和/或气动控制层103中的气路通道209的宽度和深度在10～300微米的范围内。
在所述具有三层结构的微流控芯片中，所述的气动控制层103中布置有气路通道209，每个气路通道209控制着2～100组串联布置的气体空腔208，所述气体空腔208对应着与之相应的微阀单元202；
气路通道209通过控制气体空腔208的通、断气以及输送气量的大小进而控制微阀单元202。
所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统中，微流控芯片1中流体通路层101和气动控制层103所使用的材料可以为玻璃，弹性薄膜层102材质可以为PDMS聚合物。
所述检测系统中，任意3个微阀单元202具体是不在同一个气路通道209上的相邻排布的三个微阀单元202；
所述检测系统中，具备同时检测多个检测单元201的操作能力，具体做法是：在各分离通道的相同位置在50秒时间内直线移动激光器采集信号。
本发明的相关技术是基于上述检测系统的基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法，具体介绍如下：
基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法，其所述检测过程具体依次是：抗体包被、封闭液封闭、洗涤、酶标抗原和待测抗原与抗体竞争免疫反应、酶催化底物反应及激光诱导荧光检测。
所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，使用弹性薄膜层102作为竞争免疫反应的固相吸附载体，待测抗原和酶标记抗原作为竞争物与PDMS表面上的抗体进行竞争免疫反应。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，通过设置在微流控芯片1上的微阀单元202实现进样：所述微阀单元202具体是3个或3个以上为一组使用，其通过程序控制运行；所述微阀单元202的构成如下：弹性薄膜层102、设置在流体通路层101上的坝结构207、设置在弹性薄膜层102另一侧的气动控制层103上与坝结构207处于对应位置处的气体空腔208；进样操作过程通过程序控制运行；由微流控芯片1在弹性薄膜层102发生弹性形变时产生负压力，在负压的作用下，样品液池204、缓冲液池205中的液体流向废液池206。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，所使用的弹性薄膜层102具体是PDMS薄膜。其具有疏水性，具有强烈的吸附蛋白类物质的特性。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，使用辣根过氧化物酶催化无荧光的底物ADHP(10-Acetyl-3，7-dihydroxyphenoxazine，10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪)生成有荧光的产物试卤灵(resorufin，9-羟基-3-异吩恶唑酮)；
具体检测时，要求在波长为470～650nm的激光激发条件下检测，待检测物可以发出560～620nm的荧光。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，同时检测多个通道；具体做法是：在各分析通道203的相同位置在50秒时间内直线移动激光器采集信号。
本发明提供了一种β2-肾上腺素受体激动剂的快速检测系统及专用微流控芯片。本发明以竞争酶联免疫吸附反应为基础，激光诱导荧光为检测手段，与传统的多孔板式酶联免疫吸附反应相比，试剂消耗量低，灵敏度得到很大的提高。
本发明中，流体通路层101和气动控制层103的材料为玻璃，中间的弹性薄膜层2的材料为PDMS聚合物。上下两层的玻璃可以重复利用，PDMS薄膜是可更换的。
所述芯片气动控制层103中的气路通道209在气路出口210处通过外接的管路与电磁阀相连接，电磁阀控制高压气体或负压气体的输入。不同压力的气体的切换引发弹性薄膜层102的振动。高压气体输入时，弹性薄膜层102紧贴流体通路层101的坝结构207，微阀单元202关闭，流体静止；负压气体输入时，中间的弹性薄膜层102向下弯曲，微阀单元202打开，流体流动。任意三个连续微阀单元(202)的蠕动可以产生微泵的效应，推动流体的向前运动。整个集成芯片上的β2-肾上腺素受体激动剂的检测过程用气动的微泵微阀进行自动控制。
微流控芯片技术是当前仪器分析的研究热点，该技术主要以分析化学和生物化学为基础，利用微机电加工技术，在硅、玻璃、石英、高聚物表面加工出10-300微米的微通道网络，主要以电渗流和电泳流为驱动力，通过改变驱动电压，控制流体在微通道网络中的流动方向和速率，不仅易于实现对目标分析物的采样、稀释、富集、萃取、混合、反应、分离、检测等操作，而且易于将操作单元阵列化。迄今为止，在集成有气动微阀单元202的芯片平台上对β2-肾上腺素受体激动剂进行多组平行检测的方法未见报道。本发明创造性地设计了用于β2-肾上腺素受体激动剂检测的阵列微流控芯片，可实现多个样品的同时检测。整个过程在30分钟内完成，样品消耗在微升级。本发明与传统的微孔板方法相比，具有直接、快速、操作简单和样品用量少等优势。
总之，本发明可在一块几平方厘米的玻璃-PDMS杂交芯片上，在短时间内完成对多个样品中的β2-肾上腺素受体激动剂的同时检测。相对于现有技术而言，本发明具有直接、快速、自动控制、操作简单和样品用量少的特点。其具有可预见的巨大的科学价值和经济价值。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统组成原理示意图；
图2为微流控芯片1的结构组成原理示意图，含八个检测单元201；
图3为微流控芯片1的整体组成示意图俯视图；
图4为流体通路层101结构示意图；
图5为气动控制层103结构示意图；
图6为液路中坝结构207位置示意图；
图7为检测单元201结构原理示意图；
图8为阀结构的剖面图及三个微阀单元202连续运动示意图；
图9为同一块芯片上不同浓度盐酸克伦特罗标准品的重现性；图9为实施例1中集成微流控芯片上β2-肾上腺素受体激动剂检测的重复性图谱，被检测的β2-肾上腺素受体激动剂为盐酸克伦特罗(clenbuterol)；
图10为盐酸克伦特罗工作曲线；
图11为盐酸克伦特罗半对数工作曲线；
图12为回收率谱图1；
图13为回收率谱图2；图13为实施例2中集成微流控芯片上猪尿样中的β2-肾上腺素受体激动剂回收率的图谱。
具体实施方式
使用如说明书中所述的一种基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统：所述检测系统以微流控芯片1为核心，所述微流控芯片1由三层结构依次复合构成：上层的流体通路层101、中间的弹性薄膜层102、下层的气动控制层103；这三部分相互之间的具体关系如下：流体通路层101和气动控制层103通过其各自与弹性薄膜层102之间的表面张力紧密相连。
所述检测系统中包含有2～100组检测单元201，检测单元201具体包含有如下组成部分：微阀单元202，分析通道203、样品液池204；
所述每个检测单元201上还连接有供给至少一个检测单元201使用的缓冲液池205和废液池206。
所述检测系统优选通过设置在微流控芯片1上的微阀单元202实现进样：所述微阀单元202具体是3个或3个以上为一组使用，其通过程序控制运行；所述微阀单元202的构成如下：弹性薄膜层102、设置在流体通路层101上的坝结构207、设置在弹性薄膜层102另一侧的气动控制层103上与坝结构207处于对应位置处的气体空腔208。
所述检测系统中的微阀单元202是常闭阀，其在外来的低气压的作用下阀开启，高气压作用下又关闭。
所述检测系统具体包含有以下组成部分：微流控芯片1、物镜2、分光镜3、聚焦透镜4、针孔5、发射光滤光片6、光电倍增管7、信号采集器8、激发光滤光片9激光器10；其中：按照距离微流控芯片1由近及远的顺序，基本按照直线依次布置着物镜2、分光镜3、聚焦透镜4、针孔5、发射光滤光片6、光电倍增管7；信号采集器8连接着光电倍增管7，分光镜3的一侧按照由近及远的顺序布置着激发光滤光片9、激光器10。
所述检测系统中，在检测过程中，激光器10的有效工作波长要求是470～650nm；在满足此要求的激光器10的激光激发条件下检测，待检测物发出560～620nm的荧光。
为了便于操作，所述检测系统中，每个检测单元201结构相同或成镜像对称，各检测单元201的分析通道203在检测区域集中排列；
所述分析通道203和/或气动控制层103中的气路通道209的宽度和深度在10～300微米的范围内。
在所述具有三层结构的微流控芯片中，所述的气动控制层103中布置有气路通道209，每个气路通道209控制着2～100组串联布置的气体空腔208，所述气体空腔208对应着与之相应的微阀单元202；气路通道209通过控制气体空腔208的通、断气以及输送气量的大小进而控制微阀单元202。
所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统中，微流控芯片1中流体通路层101和气动控制层103所使用的材料可以为玻璃，弹性薄膜层102材质可以为PDMS聚合物。
所述检测系统中，任意3个微阀单元202具体是不在同一个气路通道209上的相邻排布的三个微阀单元202；
所述检测系统中，具备同时检测多个检测单元201的操作能力，具体做法是：在各分离通道的相同位置在50秒时间内直线移动激光器采集信号。
基于上述检测系统的基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法介绍如下：
基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法，其所述检测过程具体依次是：抗体包被、封闭液封闭、洗涤、酶标抗原和待测抗原与抗体竞争免疫反应、酶催化底物反应及激光诱导荧光检测。
所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，使用弹性薄膜层102作为竞争免疫反应的固相吸附载体，待测抗原和酶标记抗原作为竞争物与PDMS表面上的抗体进行竞争免疫反应。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，通过设置在微流控芯片1上的微阀单元202实现进样：所述微阀单元202具体是3个或3个以上为一组使用，其通过程序控制运行；所述微阀单元202的构成如下：弹性薄膜层102、设置在流体通路层101上的坝结构207、设置在弹性薄膜层102另一侧的气动控制层103上与坝结构207处于对应位置处的气体空腔208；进样操作过程通过程序控制运行；由微流控芯片1在弹性薄膜层102发生弹性形变时产生负压力，在负压的作用下，样品液池204、缓冲液池205中的液体流向废液池206。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，所使用的弹性薄膜层102具体是PDMS薄膜。其具有疏水性，具有强烈的吸附蛋白类物质的特性。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，使用辣根过氧化物酶催化无荧光的底物ADHP(10-Acetyl-3，7-dihydroxyphenoxazine，10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪)生成有荧光的产物试卤灵(resorufm，9-羟基-3-异吩恶唑酮)；
具体检测时，要求在波长为470～650nm的激光激发条件下检测，待检测物可以发出560～620nm的荧光。
所述β2-肾上腺素受体激动剂检测方法中，同时检测多个通道；具体做法是：在各分离通道的相同位置在50秒时间内直线移动激光器采集信号。
所述流体通路层101和气动控制层103的材料为玻璃，中间的弹性薄膜层102的材料为PDMS聚合物。上下两层的玻璃可以重复利用，PDMS薄膜是可更换的。
所述芯片气动控制层103中的气路通道209在在气路出口210处通过外接的管路与电磁阀相连接，电磁阀控制高压气体或负压气体的输入。不同压力的气体的切换引发弹性薄膜层102的振动。高压气体输入时，弹性薄膜层102紧贴流体通路层101的坝结构207，微阀单元202关闭，流体静止；负压气体输入时，中间的弹性薄膜层102向下弯曲，微阀单元202打开，流体流动。任意三个连续微阀单元202的蠕动可以推动流体的向前运动，可以产生微泵的效应。整个集成芯片上的β2-肾上腺素受体激动剂的检测过程用气动的微泵微阀进行自动控制。
所用集成微流控芯片为本实验室自行设计，通过夹心法制备，构型如图2所示。上层的流体通路层101和下层的气动控制层103为玻璃片，采用标准光刻、湿法腐蚀制作。上层流体通路层通道尺寸为300μm×50μm，下层气动控制层的通道尺寸为160μm×70μm。中间的弹性薄膜层102厚度为300μm，用来形成输运各种免疫试剂的微泵/微阀。在上述芯片中，上下两层的玻璃可以重复利用，中间的弹性薄膜是可更换的，这样大大降低了生产这种芯片的成本和制作周期。
实施例1
在集成芯片上对标准样品中的盐酸克伦特罗俗称瘦肉精，是典型的β2-肾上腺素受体激动剂类物质进行快速检测。抗体，封闭剂，酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗的混合物从样品液池204泵入分析通道203，洗涤液与底物从缓冲液池205泵入分析通道203。这部分工作以PDMS膜作为芯片免疫反应的固相吸附载体，在通道内进行竞争酶免疫分析。全部的分析过程如下：抗体包被→洗涤→封闭液封闭→洗涤→酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗竞争免疫反应→洗涤→酶催化底物→激光诱导荧光检测。上述过程都在微流控芯片的通道中进行，并由气动的微泵微阀控制完成。抗体包被→洗涤→封闭液封闭→洗涤这部分过程在芯片上提前做好待用。正式检测时只需酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗竞争免疫反应→洗涤→酶催化底物→激光诱导荧光检测这四个过程，检测可在30分钟之内完成。抗体，封闭剂，酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗的混合物从样品液池204泵入分析通道203，洗涤液与底物从缓冲液池205泵入分析通道203。
按照上述方法分别进行0ng/mL～10.0ng/mL浓度的盐酸克伦特罗重复性测定，得到在同一块芯片上不同浓度盐酸克伦特罗标准品的六个重复，其相对标准偏差(RSD)均小于8％，得到的重复性谱图如图9所示。经过计算，本专利所述方法的检测限低于0.1ng/mL，这比常规的微孔板式检测方法的检测限低很多。
实施例2
在集成芯片上对猪尿样中的盐酸克伦特罗进行快速检测。抗体，封闭剂，酶标盐酸克伦特罗与添加了盐酸克伦特罗的猪尿样的混合物从样品液池204泵入分析通道203，洗涤液与底物从缓冲液池205泵入分析通道203。这部分工作同样以PDMS膜作为芯片免疫反应的固相吸附载体，在通道内进行竞争酶免疫分析。全部的分析过程如下：抗体包被→洗涤→封闭液封闭→洗涤→酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗竞争免疫反应→洗涤→酶催化底物→激光诱导荧光检测。上述过程都在微流控芯片的通道中进行，并由气动的微泵微阀控制完成。抗体包被→洗涤→封闭液封闭→洗涤这部分过程在芯片上提前做好待用。正式检测时只需酶标盐酸克伦特罗与盐酸克伦特罗竞争免疫反应→洗涤→酶催化底物→激光诱导荧光检测这四个过程，检测可在30分钟之内完成。
按照上述方法在含一定浓度盐酸克伦特罗的猪尿样中分别添加0.5ng/mL，1.0ng/mL，1.2ng/mL，1.5ng/mL盐酸克伦特罗，经计算测得的回收率值在97％～124％之间。得到的猪尿样中盐酸克伦特罗回收率图谱如图12、图13所示。
Claims (10)
1.基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，所述系统为使用激光检测的检测系统；其特征在于：
所述检测系统以微流控芯片(1)为核心，所述微流控芯片(1)由三层结构依次复合构成：上层的流体通路层(101)、中间的弹性薄膜层(102)、下层的气动控制层(103)；这三部分相互之间的具体关系如下：流体通路层(101)和气动控制层(103)通过其各自与弹性薄膜层(102)之间的表面张力紧密相连。
2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：
所述检测系统中包含有2～100组检测单元(201)，检测单元(201)具体包含有如下组成部分：微阀单元(202)、分析通道(203)、样品液池(204)；
所述每个检测单元(201)上还连接有供给至少一个检测单元(201)使用的缓冲液池(205)和废液池(206)。
3.按照权利要求2所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：
所述检测系统通过设置在微流控芯片(1)上的微阀单元(202)实现进样：所述微阀单元(202)具体是3个或3个以上为一组使用，其通过程序控制运行；所述微阀单元(202)的构成如下：弹性薄膜层(102)、设置在流体通路层(101)上的坝结构(207)、设置在弹性薄膜层(102)另一侧的气动控制层(103)上与坝结构(207)处于对应位置处的气体空腔(208)。
4.按照权利要求3所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：所述检测系统中的微阀单元(202)是常闭阀，其在外来的低气压的作用下开启，在高气压作用下关闭。
5.按照权利要求1～4其中之一所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：所述检测系统具体包含有以下组成部分：微流控芯片(1)、物镜(2)、分光镜(3)、聚焦透镜(4)、针孔(5)、发射光滤光片(6)、光电倍增管(7)、信号采集器(8)、激发光滤光片(9)激光器(10)；其中：按照距离微流控芯片(1)由近及远的顺序，基本按照直线依次布置着物镜(2)、分光镜(3)、聚焦透镜(4)、针孔(5)、发射光滤光片(6)、光电倍增管(7)；信号采集器(8)连接着光电倍增管(7)，分光镜(3)的一侧按照由近及远的顺序布置着激发光滤光片(9)、激光器(10)。
6.按照权利要求5所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：所述检测系统中，在检测过程中，激光器(10)的有效工作波长要求是470～650nm；在满足此要求的激光器(10)的激光激发条件下检测，待检测物发出560～620nm的荧光。
7.按照权利要求2所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：
所述检测系统中，每个检测单元(201)结构相同或成镜像对称，各检测单元(201)的分析通道(203)在检测区域集中排列；
所述分析通道(203)和/或气动控制层(103)中的气路通道(209)的宽度和深度在10～300微米范围内。
8.按照权利要求2所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：
所述具有三层结构的微流控芯片中，所述的气动控制层(103)中布置有气路通道(209)，每个气路通道(209)控制着2～100组串联布置的气体空腔(208)，所述气体空腔(208)对应着与之相应的微阀单元(202)；
气路通道(209)通过控制气体空腔(208)的通、断气以及输送气量的大小进而控制微阀单元(202)。
9.按照权利要求2所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：所述基于微流控芯片的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统中，微流控芯片(1)中流体通路层(101)和气动控制层(103)所使用的材料为玻璃，弹性薄膜层(102)材质为PDMS聚合物。
10.按照权利要求3所述基于微流控芯片的的β2-肾上腺素受体激动剂检测系统，其特征在于：所述检测系统中，任意3个微阀单元(202)具体是不在同一个气路通道(209)上的相邻排布的三个微阀单元(202)；
所述检测系统具备同时检测多个检测单元(201)的操作能力，具体做法是：在各分离通道的相同位置在50秒时间内直线移动激光器采集信号。
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