CN102782115A - 微流控分析平台 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了对常规的微量滴定板的新的改进，涉及将微流控通道与所述微量滴定板整合以简化分析操作，提高操作速度并减少试剂消耗。本发明可以用于代替常规的微量滴定板并可以容易地代替而不用对现存的为微量滴定板设计的仪器系统做任何变化。本发明还公开了一种与样品装载孔整合的微流控装置，其中整个流动过程是毛细作用驱动的。

Description

微流控分析平台
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年7月20日提交的第61/226,764号美国临时申请以及2010年1月21日提交的第61/297,221号美国临时申请的优先权，它们每一个都全部引入作为参考。
政府权利
本工作在批准号为R44EB007114下部分地受到美国国立卫生研究院(NIH)的资助。政府可以对本发明具有一定的权利。
发明领域
本发明涉及微量培养板(microplate)分析的改进，特别涉及将微流控(microfluidic)技术与常规微量培养板结构整合以改善微量培养板的性能和在其上进行的分析。
发明背景
免疫分析技术广泛地用于多种应用，例如在“Quantitative Immunoassay：A Practical Guide for Assay Establishment，Troubleshooting and ClinicalApplications；James Wu；AACC Press；2000”中所描述的。最普通的免疫分析技术是非竞争性分析，此种非竞争性分析的实例是广为人知的夹心免疫分析(sandwich immunoassay)，其中使用两种结合剂来检测分析物，并且竞争性分析中只需要一种结合剂来检测分析物。
可以将在夹心免疫分析(分析)中最基本的形式描述如下：(通常)在固相支持物上包被作为第一结合剂的捕捉抗体。选择所述捕捉抗体使得其为分析物提供特异性亲和性并且理想地不与任何其他分析物反应。在该步骤之后，将包含目标分析物的溶液引进这个区域，借此该目标分析物与捕捉抗体结合。在将过量的分析物洗去之后，向这个区域加入作为第二结合剂的第二检测抗体。所述检测抗体也为分析物提供特异性亲和性并且理想地不与任何其他分析物反应。此外，所述检测抗体通常用报告剂(reporteragent)“标记”。所述报告剂被设计成通过一种或多种检测技术可检测，所述检测技术例如光学的(荧光或化学发光或大面积成像)、电的、磁的或其他的方式。在分析顺序中，检测抗体进一步与分析物-捕捉抗体复合体结合。在去除过量的检测抗体之后，最后通过适当的技术手段询问(interrogate)在检测抗体上的报告剂。采用这种形式，来自报告剂的信号与样品中分析物的浓度成比例。在所谓的“竞争性”分析中，引起检测抗体和(检测抗体+分析物)结合物之间的竞争反应。所述分析物或分析物类似物被直接包被在固相上，并且结合到固相分析物(或类似物)上的检测抗体的量与溶液中检测抗体和游离分析物的相对浓度成比例。免疫分析技术的优点是通过使用结合剂提供的对于目标分析物的检测特异性。
注意上面的描述适用于最普通形式的分析技术-例如用于检测蛋白质。也可以使用免疫分析技术来检测其他感兴趣的分析物，例如，但不限于，酶、核酸以及更多。类似的概念也被广泛地用于包括在病例中的其他变化；使用“捕捉”抗原和检测分析物来检测分析物抗体。
96孔微量滴定板(microtiter plate)，也称为“微量培养板(microplate)”、“96孔板”、“96孔微量培养板”，已成为生物化学实验室的负重荷机器。微量培养板已用于多种应用，包括基于免疫分析(分析)的检测。微量培养板的其他应用仅列出一部分，包括用作培养基，用于储存、细胞分析、化合物筛选。目前96孔板普遍用于所有的生物化学实验室，并且开发出了大量的仪器，例如自动分配系统、自动洗板系统。事实上，美国分子生物科学协会(SBS)和美国国立标准学会(ANSI)已公布了微量培养板的确定尺寸的指导原则-并且大多数的制造商都遵循它们以使得与可以处理这些板的仪器系统一致。除了以上描述的基础自动化仪器外，还有开发用来改进微量培养板性能的特定方面的大量特定仪器系统的实例。例如，专利如US7488451，将其整体引入本文作为参考，US7488451公开了一种用于微粒的分配系统，其中该系统是针对装载微粒到微量培养板中；而US5234665，将其整体引入本文作为参考，公开了一种分析用于细胞分析的微量培养板中聚聚模式的方法。
96孔平台，尽管已非常好的确立并且被普遍接受，但是具有少量显著的缺点。每个反应步骤需要大约50到100微升的试剂体积，并且每个培养步骤需要大约1到8小时的培养间隔以达到满意的响应；其中所述培养时间通常受到在特定步骤中试剂的浓度控制。为了试图增加每个板的收率并减少反应体积(从而控制每个板的费用)，研究人员开发了增加浓度的形式例如384和1536孔微量培养板。这些微量板具有与96孔板相同的足迹(footprint)，但是具有不同的孔密度和孔与孔的间距。例如，标准的1536孔在每个分析步骤仅需要2-5微升的试剂。尽管使试剂体积大量节省，但是1536孔板却具有重现性的问题，因为过度小的体积可以容易地蒸发，因此改变了分析反应的净浓度。在所谓的“高通量筛选”(HTS)方法中1536孔板通常由专用的机器人系统来操作。事实上，如在公布的专利申请WO05028110B1中公开的，有创新实例，其中研究人员甚至进一步扩大了板的“密度”(即在给定区域内孔的数目)，将其整体引入本文作为参考，其中制造一组大约6144孔用以处理纳升大小的流体体积。当然，这也需要如相关专利US7407630中公开的专用的仪器系统，将其整体引入本文作为参考。为了更改微量培养板结构，研究人员投入了巨大的精力，多数通常都是在SBS/ANSI指导原则的限制之内来开发新的设计。这其中的一个例子公开在包括US7033819、US6699665和US6864065的专利中；它们全部都引入本文作为参考，其中在常规的96孔微量培养板的孔底部制造一个第二组的微米大小的孔。这些微型孔用来诱捕(entrap)细胞并研究它们的运动形式，除此之外还有其他的用这种形式可能进行的分析。在US7371563和相关申请US6803205中解释了在通过选择性附着和分离孔的底部来处理微量培养板方面的灵活性；将它们两者均引入本文作为参考。US7138270和WO03059518A3，将它们两者全部引入本文作为参考，公开了一种技术，其中使用与96孔板相同的足迹和孔布局，但是显著地减少了每个板的体积。例如US7374724也证实了与使用整合的填充柱用于过滤和/或提取一样的先进的功能性，其全部引入本文作为参考。研究人员还在微量培养板底部整合了膜用于：(a)过滤，以及(b)如US20040247490A1中所公开的通过流动分析应用；其全部引入本文作为参考。对于所述的通过流动应用，小孔径的膜滤器需要相当强的移动力以使液体从膜中移动。
小型化和自动化的下一步是微流控系统的开发。微流控系统理想地适用于基于分析的反应，如在US6429025、US6620625和US6881312中公开的，它们全部引入本文作为参考。除了基于分析的分析外，微流控系统也被用于研究分析的科学，例如US20080247907A1和WO2007120515A1，它们两者全部引入本文作为参考，描述了用于研究分析反应的动力学的方法。微流控系统也被证实用于例如细胞处理和基于细胞的分析，如在US7534331、US7326563和US6900021中所描述的，它们全部引入本文作为参考，除此之外还有其他的。微流控系统的关键优点是它们能够用高流通量和非常低的反应体积进行大量的平行反应。这些实例公开在US7143785、US7413712和US7476363中，它们全部引入本文作为参考。对特别用于高通量微流控的仪器系统进行了广泛地研究和开发，如在US20020006359A1、US6495369和US20060263241A1中公开的，它们全部引入本文作为参考。同时，微流控系统的宏观体系与芯片接口(world-to-chip interface)问题的关键难题仍然没有完全解决。对于这个问题，研究人员通常开发定制的溶液，其中的一个实例公开在US6951632中，根据应用将其全部引入本文作为参考。这一单独问题已成为普及使用微流控的重要瓶颈。另一个普及使用微流控的问题是没有标准化的平台。通常微流控装置具有特定的布局，它很好的适用于给定的应用但是导致流控的进口和出口放置在不同的位置。实际上，在本领域中通常被接受的微流控装置甚至在足迹或厚度上也很少有通用性，如果有的话。
在这个程序中下一个合理步骤自然是微流控系统与标准化的96或384或1536孔布局地整合。通常，即使“微流控(microfluidic)”微量培养板使用与常规微量培养板相同的足迹，功能性对于细胞分析也是非常特别的，如在US20060029524A1和US7476510中通过实例所公开的，它们两者全部引入本文作为参考。研究人员广泛地使用标准化的微量培养板形式作为模板来建立微流控装置。这些实例大量存在于文献中，如Witek和Park等人的作品“96-Well Polycarbonate-Based Microfluidic Titer Plate forHigh-Throughput Purification of DNA and RNA，”Anal.Chem.，2008，80(9)，pp 3483-3491，和“A titer plate-based polymer microfluidic platform for highthroughput nucleic acid purification，”Biomedical Microdevices；Volume 10，Number 1/February，2008；21-33；和“A 96-well SPRI reactor in aphoto-activated polycarbonate(PPC)microfluidic chip，”Micro ElectroMechanical Systems，2007.MEMS.IEEE 20th International Conference on，21-25 Jan.2007，Page(s)：433-436；和Choi等人的作品“A 96-wellmicroplate incorporating a replica molded microfluidic network integratedwith photonic crystal biosensors for high throughput kinetic；biomolecularinteraction analysis，”Lab Chip，2007，7，1-8，以及进一步在Tolan等人的作品“Merging Microfluidics with Microtitre Technology for More EfficientDrug Discovery，”JALA，Volume 13，Issue 5，Pages 275-279(October 2008)；以及更进一步在Joo等人的作品“Development of a microplate readercompatible microfluidic device for enzyme assay，”Sensors and actuators.B，Chemical；2005，vol.107，no2，pp.980-985观察到的。特别是对基于细胞的分析，由Lee等人描述了与微量培养板具有相同的足迹的微流控构造，“Microfluidic System for Automated Cell-Based Assays，”Journal of theAssociation for Laboratory Automation，Volume 12，Issue 6，Pages 363-367；以及甚至由CellAsic作为商品提供的(http://www.cellasic.com/M2.html)。所有这些都是微流控装置的实例，所述微流控装置是建立于与96(或384)孔板相同的足迹上，然而不利用板的全部密度。
US6742661和US20040229378A1，将它们两者全部引入作为参考，公开了将96孔结构与微流控通道网络整合的示例性实例。如在US6742661的优选的实施方案中所描述的，一组孔通过通孔口连接到微流控电路中。在优选的实施方案中，微流控电路可以是H或T型扩散装置。US6742661还描述了用于控制在该装置内部液体移动的方式。该装置使用流体静力和毛细作用力的结合来实现液体转移。如在US6742661中更详细的解释，可以由(a)或者通过叠加另外的孔层来增加额外的厚度到微量培养板结构，或者(b)通过用外部的泵驱动压力补充现存的流体静力来控制流体静力。US6742661首先使用流体静力(使用上述任一种方法调节)，其中在微流控电路的不同入口之间存在流体静力的差异。特别地，设想该流体静压力的差异是由连接到微流控电路的不同入口的孔中的液体柱的高度(或深度)差异引起的。在US6742661中说明的装置构思必定是将层流扩散界面(Laminar Flow Diffusion Interface(LFDI))型微流控装置与96孔结构整合的创新性方法。然而，US6742661仅仅设想了源于并且终止于所公开的装置的孔的自含式流控的流型(self-contained fluidic flow pattern)。此外，在US6742661中描述的流量控制技术落入了“压力驱动的”流动的宽范畴之内，其中液体柱的流体静压力控制流动特性。最重要的是，US6742661没有设想使用单通道从孔结构移动液体到排出结构而不使用如本发明所设想的与微流控通道的任何附加连接或来自于微流控通道的任何附加连接。在以上列出的这些方面，US6742661实质上和明显地区别于本发明。
US20030049862A1，其全部引入本文作为参考，是另一个尝试整合微流控与标准的96孔构造的示例性实例。非常重要的是注意US20030049862A1与通常公认的相比，以稍微不同的方式定义了“微流控(microfluidics)”。如在US20030049862A1中所定义的，“与在流控衬底或自身板中安置流控通道的现有技术不同的是，本发明在每个流控模块中安置流控通道”。这是通过插入合适大小的圆柱状的插入物到表面匹配的微量培养板的圆柱状孔中来实现的。为了确保在插入的圆柱体的顶面和孔的底面之间一致的间隙，定义了“微通道”。此外，在US20030049862A1中公开的装置的构造固有地依赖于外部的流动控制，不管是通过自动的方式例如通过使用微泵还是通过手动的方式例如使用吸管。关于(a)定义微通道结构的方式，以及(b)流体运动控制的方式，US20030049862A1显著地区别于本发明。本发明公开的结构和装置是不需要任何外部流动控制的简单的流通构造。
US20030224531A1，其全部引入本文作为参考，同样公开了将微流控连接到孔结构(包括具有96、384、1536孔板标准布局的那些结构)用于电喷射应用的实例。US20030224531A1使用一组连接到另一组深度为微米或者甚至亚微米大小的浅的过程区的试剂孔，其中所述过程区一端连接到试剂孔，另一端连接到电喷射发射极顶端。流体运动的力(如在US20030224531A1中定义的运动力)优选通过穿过流体柱的电位或者也通过穿过柱的压力差来提供，这与本发明中流体运动完全地通过毛细作用力具有显著性差异。可以通过入口和出口微通道连接到过程区，其中构造所述微通道以提供额外的功能性(例如标记或纯化)。US20030224531A1与本发明之间的关键差别在于，US20030224531A1使用(孔+微流控)结构基本上作为质谱仪最终分析的样品处理方法。在优选实施方案中，本发明描述了在衬底的相对面与装载孔实质上相同的位置使用微通道几何结构；此外，由此微通道形成加速反应的反应室，该反应在装载孔内部也会发生；而且，反应信号仅由读数器通过光学方式询问，所述读数器也可以询问常规的96孔板。
WO03089137A1，其全部引入本文作为参考，公开了另一种用于增加96孔板的通量的创新方法。在该发明中，在金属氧化物，优选氧化铝衬底内部的纳米大小的通道内部进行分析。如在WO03089137A1中公开的，每个单孔有附着在底部的金属氧化物薄膜衬底。在操作过程中，每个孔单独密封并通过普通来源施加真空(或压力)，这使得将要抽取的孔中的液体被推向衬底的底部(或远离衬底的底部)。这种方法通过来回地输送分析试剂通过膜上极小的开口可以达到分析性能的显著改进。WO03089137A1中描述的发明依赖真空和/或压力来源来调节在金属氧化物衬底中的液体的输送并需要精确的压力控制装置来达到最佳性能。
与本发明明显相似的发明公开在US20090123336A1中，其全部引入本文作为参考。US20090123336A1公开了使用连接到一系列孔的一组微通道，其中所述孔是384孔板的形式。如在US20090123336A1中所描述的，装载孔充当多个检测室的普通入口，每一个检测室放置在384孔板上的“孔”的位置。这也代表了本发明的一种可能的实施方案-如在该公开中进一步披露的不同的使用方法中。更重要地，因为在使微流控互相连接到高密度微流控通道网络中的挑战，这如果不是不可能的话也是极其困难的，US20090123336A1限于使用连接到单个装载点的多个检测室。这在US20090123336A1发明的使用方法上施加了局限性，该方法需要专门的处理步骤从而在每个连续连接的室中完成独特的分析。特别地，如在US20090123336A1中所公开的，在连续连接的室中完成独特的分析的唯一方式是在密封通道表面之前将捕捉抗体沉积在通道表面。这个步骤本身将需要高级的分配系统以便在准确确定的位置精密地(a)递送需要的液体体积递送；因此增加了系统的总成本。在其他实施方案中，通过浸没通道的一端到液体溶液中来将普通溶液吸入到连续连接的通道的阵列中。发明人还声明“当存在普通装载通道时，可以通过毛细作用力或压力差将试剂同时装载到所有的通道中......”。尽管理论上是正确的，但是在微流控领域中熟知的是通过单一来源来控制多分枝通道中的流动在实际上是不可能的。在至少一个分枝通道中总是存在优先更高的流速，这意味着经过多个这样的通道进行的分析有差异。
如在本文中记载的，从本发明的公开内容中会更加清楚，所有的上述现有技术在以下列出的方面或多个方面不同于本发明：
1.全部的在先公开都使用某种形式的抽吸来将液体移动到孔和从孔中移出。
2.多数在先公开仅使用常规微量培养板的足迹和孔位置布局来合并相同的微流控装置的多份复制品。此外，多数微流控装置具有多个进口和/或出口。
3.多数在先公开需要相同的高级微流控宏观体系与芯片接口技术用于引入或引出样品。
4.多数在先公开需要特别适合于给定微流控结构的用于液体处理的专门的仪器系统。
对于即时检验(point-of-care test(POCT))应用经常需要使用基于免疫分析的测试方法，所述测试方法可以检测对应用延长的动态范围，例如前面所描述的。用于POC检验的最普通的技术是通过使用所谓的“侧流分析”(“Lateral Flow Assay”(LFA))技术。LFA技术的实例在US20060051237A1、US7491551、WO2008122796A1和US5710005中有描述，它们全部引入本文作为参考。在WO2008049083A2中也描述了LFA的特别的创新技术，其全部引入本文作为参考，该技术使用通常可得到的纸作为衬底，其中流动路径由不渗透的(水的)边界的光刻法图形限定。在例如US20060292700A1的公开内容中披露了LFA技术的进展，其全部引入本文作为参考，其中使用扩散衬垫(diffusive pad)来改善结合的均一性，从而提供了分析性能的改进。其他公开例如W09113998A1、WO03004160A1和US20060137434A1，将它们全部引入作为参考，使用了所谓的“微流控”技术来开发更先进的LFA装置。由于在微通道或微通道+精确的流阻模式的制造中的精确度，微流控LFA装置可能要求比基于膜(或多孔衬垫)的LFA装置更好的可重复性。在某些情况下，例如在US20070042427A1中公开的那些装置组合了在微流控和LFA领域中通常使用的技术，将其全部引入本文作为参考，其中，如US20070042427A1中所公开的，流动由波纹管式泵启动，此后由吸收衬垫维持。
因此本发明提出了如以上所描述的现有技术的缺点，并试图开发一种简单并可靠的将微流控技术与微量培养板平台的标准化平台的优点整合的构造。使用本发明构造的“微流控微量培养板”与所有设计为同样大小的常规微量培养板的仪器是兼容的，本发明的技术在这个意义上也是独特的。
发明的简要说明
本发明仔细考虑并改进了“微流控(microfluidic)微量培养板”，其中将微流控通道与常规微量培养板的孔结构整合。全部的微量培养板尺寸和孔的布局与SBS/ANSI标准中规定的96或384或1536孔的形式相匹配。所述微流控微量培养板包含一组限定在衬底的一个面上的孔。在衬底的相对面每个孔经在孔的底部适当设计的通孔连接到微流控通道。所述微流控通道反过来被附加的密封层密封，所述密封层在微通道的一端(出口)有开口。此外，所述密封层与吸收性垫相接触。
当液体被引入孔中时，通过毛细作用力被吸入微通道。液体沿微通道移动直到其到达吸收性垫。该吸收性垫产生比微通道更强的毛细作用力并将液体从通道中吸出。优选地，可以确保当液体离开孔并流入吸收性垫中时，液体的后端“附着”在孔和微通道之间的接口处。在这个阶段，孔中完全没有液体而通道中仍然充满了液体。现在当第二种液体加到孔中时，存留第一种液体的毛细管屏障被打破，并且衬垫的毛细管作用被重新启动，第二种液体也被经由通道吸入衬垫。这个顺序可以被重复许多次以完成免疫分析程序。因此，本发明的装置使得能够在微量培养板平台上进行微流控免疫分析程序。此外，使用板的方法与常规微量培养板是相同的，并且本发明的装置还与为常规微量培养板开发的合适的自动化设备兼容。本发明的装置的其他实施方案可以被用于例如基于细胞的分析。
附图的简要说明
图1显示了本发明的实施方案的俯视图，其中一组96个孔经由通孔连接到96个单个的微通道。
图2显示了本发明的实施方案的一部分的横剖视图，该图示出了孔结构、微通道结构、密封层和吸收性垫的相对位置。
图3显示了本发明的实施方案的三维图解，及构成微流控微量培养板的部件和相应的托架的细节。
图4A显示了本发明的实施方案，其中连接孔和微通道的通孔符合一定的规则。
图4B显示了本发明的可供选择的优选的实施方案，其中连接孔和微通道的通孔含有锥形部分。
图5显示了本发明的装置中不同的微通道截面在孔的底部连接到通孔。
图6显示了本发明的一个方面，其中通气孔合并到流动通道中。
图7显示了通道构造的不同的实施方案。
图8显示了通道构造的另外的实施方案。
图9显示了通道设计的其他实施方案以及这些通道设计对于流速和蒸发速度的影响。
图10显示了使用聚合物株来增加灵敏度的实施方案。
图11显示了适合于在微流控微量培养板中处理细胞的实施方案。
图12显示了通道构造的其他构造的实施方案。
图13显示了一种实施方案，其中独特的吸收性垫连接到每个微通道。
图14A和图14B显示了装置的横剖视图，该装置显示了压紧吸收性垫的效果。图14C显示了可供选择的实施方案从而通过使用凸出结构以确保在吸收性垫和微流控通道之间可靠的接触。
图15显示了吸收性垫布局的可供选择的实施方案，其中吸收性垫是微通道的行或列所共有的。
图16显示了吸收性垫布局的可供选择的实施方案，其中吸收性垫是微通道的行或列所共有的；而且其中所述吸收性垫与微通道一样位于衬底的对侧。
图17显示了一种实施方案，其中使用微通道附加的部分作为毛细管泵和废料槽来代替吸收性垫。
图18显示了装置的可供选择的实施方案，其中使用微流控插入板来代替单个连续的衬底。
图19显示了装置的可供选择的实施方案，其中使用微流控插入板来代替单个连续的衬底，并且使用附加层来将检测期间的光串扰(opticalcross-talk)减到最小。
图20显示了与图18的实施方案类似的实施方案，除了使用多个微流控插入板之外。
图21A显示了本发明的实施方案，其中多个微流控反应室连续地连接到共用的装载孔。图21B显示了一种实施方案，其中所述装载孔和微流控反应室不在相同的垂直瞄准线上。图21C和21D显示了实施方案，其中多个装载孔连接到单个微流控反应室用于“半-自动”微流控微量培养板。
图22显示了一种实施方案，其特别适合于用于延长的时间的低流速。
图23显示了用于基于化学发光的检测的实施方案。
图24显示了适合于完全手工操作的即时分析检验的本发明的实施方案。
图25显示了微流控微量培养板的图像。
图26显示了微流控微量培养板的另一种实施方案的图像。
图27显示了对比微流控微量培养板和常规微量培养板的化学荧光法测试结果。
图28显示了对比微流控微量培养板和常规微量培养板的化学发光法测试结果。
发明详述
如本文中所描述的，本领域技术人员将会理解，可以对本发明的优选的实施方案进行修改和变化，而不背离本发明的基本的新颖性。所有的这些修改和变化旨在引入本文，并在本发明的范围内。
如在本文中所引用的，μF96或μf96或OptimiserTM是指96孔微流控微量培养板，其中每个孔连接到至少一个微流控通道。除非另外明确描述，所述微流控微量培养板应假定由三个功能层，即衬底层(具有孔、通孔结构和微通道)、密封带层和吸收性垫层制成；其中，所述“96”是指96孔布局，并且类似地，μf384指的是384孔布局等等。也使用术语OptimiserTM来描述本发明，并且类似地，OptimiserTM-96是指96孔布局，OptimiserTM-384是指384孔布局等等。此外，“微通道”和“微流控通道”和“通道”除非上下文中另外指明，都是指相同的微流控结构。术语“接口孔”或“通孔”或“过孔”除非上下文中另外指明，都是指连接孔结构到微通道结构的相同结构。术语“单元”用来描述微流控微量培养板的功能单位，其中所述微流控微量培养板包含多个基本上相同的“单元”来构成整个微量培养板。
通过审查本发明的附图可以容易地理解本发明。通过考察图1、图2和图3可以理解基本构思。图1显示了微流控96孔板或微流控微量培养板的俯视图。所述板与常规微量培养板的尺寸相匹配(如公认的ANSI标准所定义的)。孔的位置也与ANSI标准相匹配。每个孔在衬底的对面与微通道相连接。在图1所示的实施方案中，所述孔和微通道被制造在相同的衬底层。从图1能够了解本发明的显著的特征，其中装载位置(用于加入液体试剂)和检测区在相同的垂直面上，这与常规微量培养板精确地匹配。
图2显示了微量培养板的一部分的横剖视图以分解的和装配的图显示96个中的一个单元。图3A以分解图显示了微量培养板、密封层和吸收性垫的三维图。图3B以分解图显示了微量培养板、密封层、吸收性垫和托架的三维图。每个孔在衬底的对面连接到微通道。微通道被密封层密封，所述密封层反过来在微通道的另一端有开口(相对于连续地连接到在孔的底部的通孔)。密封层的开口在另一端连接到吸收性垫。在优选的实施方案中，使用一组吸收性垫使得吸收性垫与装载孔和通道不在相同的垂直瞄准线上。可供选择地，如图3所示，所述的吸收性垫可以是连接到全部的96个微通道出口的单个连续的片。当液体被引入孔中时，通过毛细作用力将液体吸入微通道；所述液体沿着微通道移动直到其到达带的开口。因此，液体前部接触吸收性垫，所述吸收性垫施加更强的毛细作用力并吸引液体直到孔中变空。在优选的实施方案中，所述通孔、微流控结构和吸收性垫被设计成使得当液体流出孔时，液体柱的后端不可以移过通孔和微通道之间的接口。随后，所述孔完全排空它的液体内容物，并且所述液体部分地被吸收性垫吸收，而一部分的液体仍然占据整个微流控通道。这种构造可以用作基于免疫分析检验的培养步骤。
当第二种液体加入孔中时，所述第二种液体在通孔和微通道的接口处与第一种液体的后端接触。在这个阶段，从吸收性垫延伸经由微通道和通孔到孔中再次存在连续地液体柱。填充孔的液体柱的较低的表面张力将使得流动重新开始，第一种液体将会完全被吸出通道并被第二种液体代替。第二种液体也将被吸出通道直到第二种液体的后端到达通孔和微通道之间的接口，在这里流动再次停止。这种顺序连续进行直到完成所有免疫分析需要的步骤。这也表明了本发明的一个特别有利的方面-即操作的顺序仅涉及液体加入步骤的事实。不需要将液体从孔中移除因为它是自动排出的。这相当大地减少了操作所需要的步骤数并简化了微流控微量培养板的操作。同样，如早先所描述的，在优选的实施方案中，将吸收性垫放置使得衬垫与反应室不在相同的垂直瞄准线上。在该图中，衬垫可以是微流控微量培养板必不可少的；然而，如果需要，衬垫可以被设计成可去掉的部分，该部分可以在最后的液体装载步骤后被丢掉，例如图3所显示的实施方案的情形。
在本发明优选的实施方案中，所述包含孔、通孔和微通道的衬底是透明的。这便于从微量培养板的顶部以及底部进行来自微通道的信号的光学监测；在本领域中使用的许多酶标仪的共同特征。在其他的实施方案中，所述衬底可以是不透明材料使得来自微通道的光信号只能从包含通道的面被读出。例如，在图2中显示的实施方案中，如果衬底是不透明材料，只可以从“底部”读出信号。如稍后描述的，另一种方法可以使用插入层的旋转以便于进行具有不透明衬底材料的顶部读数。
可以通过常规的注入塑形方法制造微流控微量培养板，并且可以使用所有通常使用的适用于注入塑形的热塑性塑料作为微流控微量培养板的衬底材料。在一些优选的实施方案中，所述微流控微量培养板由聚苯乙烯材料制成，所述聚苯乙烯材料是本领域已知的用作微量培养板的适合的材料。在其他优选的实施方案中，所述微流控微量培养板由环烯烃共聚物(COC)或环烯烃聚合物(COP)材料制成，所述COC和COP材料是本领域中已知的显示较低的自发荧光性，并因此在基于荧光性或吸光度的检测应用中降低背景噪声。
使用本发明的用于夹心免疫分析的示例性分析程序描述如下。通过使用本领域已知的技术，可以在根据本发明的微流控微量培养板上进行许多这样的分析。如从描述中容易明白的，通过为当前的微量培养板形式设计的处理液体的自动控制系统可以进行所有的试剂加入步骤，而不需要做任何改变。
操作
1.将第一种液体吸入孔中以引起流动顺序。
2.装载到孔中的液体体积应当至少稍微大于通道的内部体积。
3.液体将会被吸入微流控通道并且由于毛细作用力会继续移动。
4.液体将会从孔中流出经由通道直到其到达出口，在出口液体会接触到吸收性垫。
5.这之后，吸收性垫会继续吸收液体直到所有孔中的液体变空进入通道，然后进入衬垫。当液体柱的后端到达孔底部的通孔和通道之间的接口时，液体流动将会停止。
6.这种构造中的流速完全地由(a)液体类型；(b)孔和通道以及接口端口(即通孔)的几何形状；(c)μf96(或OptimiserTM)微量培养板的材料性质，特别是表面特性；以及(d)衬垫的吸收特性来控制。
a.可以通过改变任何一种参数来控制流速。
b.最初的“填充”流速不依赖于衬垫并且仅基于通道特性。
c.因此通道充当固定阻力(除了在最后当液体变空时)，并且衬垫充当真空(或毛细管吸力)来源。
d.如果需要，可以在静态培养下进行分析步骤以保证流速变化对于分析响应具有最小的影响。
7.这之后可以加入第二种液体，并且可以重复相同的顺序。
a.可供选择地，可以在当第一种液体正好从孔中排空时装载第二种液体。这会导致连续的液体柱而在第一种和第二种液体之间没有停止流动。
8.在应该加入的最后的液体经过系统之后，如果需要可以移开吸收性垫。进一步的毛细作用力的缺乏将会确保液体运动的停止。
9.可以从孔的顶部或从底侧对板读数，或者如果孔结构干扰光信号，可以翻过μf96(或OptimiserTM)并从通道侧读数。如果需要后者，应当修改板结构使得板仍然适合用于SBS/ANSI 96孔板的标准托架。
结果分析
1.加入捕捉抗体并流动-捕捉抗体将非-特异性地吸附在通道表面。重复注射捕捉抗体溶液可以潜在地增加表面的浓度。
2.等待直到捕捉抗体溶液经过孔被完全吸入。所述捕捉抗体溶液仍然完全充满微通道。培养以使捕捉抗体结合到通道表面。
3.加入封闭缓冲液并流动；培养以使封闭培养基结合到其余的通道表面。
4.加入样品并流动；培养以使目标分析物与捕捉抗体连接
a.任选地，重复注射样品可以增加检测灵敏度。
5.(任选地)再次冲洗
6.加入标记的检测抗体并流动；培养以使检测抗体结合到捕捉到的目标分析物。
7.用缓冲液冲洗
8.对于基于荧光性的分析，现在可以转移板去读数。
9.对于发光分析-加入底物，所述底物将会充满通道并使它培养。
10.对于发光分析，现在可以转移板去读数。
图2所示的孔结构由直的(圆柱形的)部分和锥形的(圆锥形的)部分组成。所述锥形便于完全冲洗出孔的内容物，而不是在圆柱形孔结构的底部有小的通孔。正如可以被容易地想象的，存在大量可能用于这种基本构造方案的构造；例如，当通孔不在孔的中心而偏移到一侧时，或其中微通道形式是不同的构造时，或其中所述吸收性垫放置于不同的位置时，或其中孔结构和微通道相对于总板厚度(由SBS/ANSI标准设定为14.35mm)的相对深度和/或位置是变化的。实际上，尽管非常需要标准化，但是在某些实例中，也可以将OptimiserTM微流控微量培养板制成不符合ANSI/SBS规格的尺寸。这些中的少数作为实施方案的实例描述可能支持这种构造构思。在此描述的实施方案仅用来说明本发明的灵活性，而无意以任何方式限定本发明。
在图3的三维(3D)图中显示了一种优选的实施方案。如图3的插入片段所示，孔在顶部没有“直的”部分，只有锥形的部分。这最小化了在从孔的垂直壁到锥形壁的转换点处存在任何残留物的可能性。同样，如图2和图3所示，可以将孔配置成使得衬底完全包围孔或可以将环绕的衬底制成“唇”结构的形式。后者使该部分需要的聚合物材料的量减到最小，从而降低了成本。“唇”结构的使用同样使得该部分更加经得起注射成型操作的检验，由于在这种构造中较少量的材料在成型过程中显示出更少的收缩，这是有利的，因为所述收缩可以引起孔、通孔和微通道形式的变形。
图4A显示了本发明的一个优选的方面。如图4A所示，优选地，孔的宽度(w)应该大于，并且至少等于孔的深度(d)。这确保了当液体被引入孔中时，液体的前部弯液面可以“下沉”并接触密封带的表面。该弯液面同样接触连接在孔的一部分的微通道的全部的4个“壁”(在上面提及的图中的左手侧)。此后，毛细作用力将从孔中吸引液体并充满微通道。为了确保液体充满微通道，微通道的至少一个壁应当是亲水的。在一个优选的实施方案中，所述密封层是合适的粘性膜，其中所述粘性显示亲水性能。这将确保当装载液体到孔中时，前部弯液面接触密封带，所述液体将在带上“扩散”；接触微通道部分，此后继续被吸入通道中。在进一步优选的实施方案中，所述密封层可以是另一种可塑体，该可塑体与制造孔和通道结构所使用的可塑体类似，并且两者使用本领域已知的技术，举几个例子，例如热粘合(thermal bonding)、粘性膜辅助粘合(adhesive filmassisted bonding)、激光或超声粘合(laser or ultrasonic bonding)来进行装配。在可供选择的实施方案中，可以通过强制第一种液体通过通道来“预处理”所述通道。这可以通过对着接口孔放置吸管尖端或其他合适的液体处理工具使得产生合理的密封来容易地完成。然后注射液体将导致至少一部分液体被注入通道，此后毛细作用力将确保所述液体继续充满通道。进一步蔓延，在还另一个优选的实施方案中，也可以通过在通道中直接注入溶液来容易地完成不仅最初的分析步骤，而且所有的分析步骤，并且其中所述孔结构仅作为吸管或其他液体装载工具的向导。在再一个实施方案中，可以通过适当的选择本领域已知的表面处理来将通道的所有壁处理成亲水性的。在还一个实施方案中，可以使用本领域已知的技术给予包括全部的微通道壁的衬底材料亲水性；并且可以使用疏水性密封带。表面处理(即壁相对于液体最终的表面张力)的选择依赖于预期的分析应用。在多数情况下，优选具有疏水性的表面以便于基于疏水性相互作用的生物分子结合到表面。在其他情况下，亲水性表面可能更适用于生物分子与结合表面的亲水性相互作用；并且甚至在其他的情况下，可能需要疏水性和亲水性表面组合来使两种生物分子都结合。
在本发明的还另一种实施方案中，使用第一种“启动”液体来充满通道。液体例如异丙醇与大多数聚合物显示非常低的接触角，并且显示非常好的毛细作用流动。例如不论通道壁是亲水性的还是疏水性的液体都会充满通道。一旦液体接触吸收性垫，就会生成到装载孔的连续路径。此后加入的液体将会被自动地吸入通道。也可以修改孔的表面与微通道表面组合，以增加或减少施加在液体柱上的毛细作用力。例如，如果在孔的表面给予强的亲水性处理，后部弯液面将会有强的凹形，其中弯液面的突起指向孔的底部。这个弯液面形状将会与在液柱前端的弯液面形状(在它接触吸收性垫之前)竞争，并确保慢的填充。如果在另一方面，给予孔表面强的疏水性，后部弯液面可以实现凸形，其中弯液面的凸出部分朝向孔的顶部。这种弯液面形状将会增加存在于液柱前端的毛细作用力并引起更快的流速。
在其他优选的实施方案中，所述密封层可以被设计成可逆地连接到微通道衬底上。在这种构造中，对于一部分流控步骤可以移开所述密封层；例如，对于吸光度分析，可以轻轻移开密封层并加入停止液以停止吸光度反应。在还其他的实施方案中，所述密封层可以是适合于其他分析测定方法的特异性材料；例如，可以选择特别好的适合于由相关分析中的产品捕捉免疫沉淀的密封层。
在如图4B所示的本发明的另一种实施方案中，通孔结构自身可以是锥形的而不是如图4A所示的具有直的侧壁的圆柱形几何形状。该锥形形状将会促进毛细管作用将液体从孔经由通孔吸引到至少一个亲水性微通道壁。在还其他的实施方案中，可以选择性地处理在图4A和图4B中所示的孔和通孔结构以给予不同的表面功能性。例如，衬底层可以是大体上疏水的，只有孔和通孔的内表面处理成亲水的。所述衬底层由亲水性带旋转密封。因此在这种构造中，从孔到通孔再到微通道的底部(带)具有连续的亲水性路径以确保液体总是充满微通道而没有任何介入的气泡。
本发明其他优选的实施方案如图5所示。图5显示了在孔和微通道之间的接口孔处的微通道构造的实施方案。在图5A中，从通孔的横截面积到微通道的横截面积具有突然的转变。由于通道的横截面积要小得多，从孔中出去的液体会停止在接口处。在图5B中，微通道稍大于接口孔，而且通道横截面逐渐地变窄到最后的尺寸。在这种情况下，当液体流出孔时，将会继续流动(到吸收性垫)直到当微通道完全变空。可供选择地，可以使用具有非常强的毛细作用力的吸收性垫，使得即使采用图5A的构造，微通道也是完全空的。在前者的情况下，其中液体保留在微通道中直到加入下一种液体，这种情况可以用作培养步骤。使用这种构造是有利的，因为在这种情况下，分析性能相对地独立于流速的轻微变化，如果完全使用流过分析，会发生这种流速的轻微变化。后者的情况，其中液体从不在通道中停止，可供选择地称为连续流动或通流分析，这种分析操作显著快些。这在其中响应时间比控制精确度更关键的应用中可能是有利的，如对于一些及时即时检验应用的情况。也可以方便地开发流通模式(flow-throughmode)以增加检测的灵敏度。例如，当第一种结合剂(捕捉抗体)已经覆盖在微通道壁上，并且其余的未结合的结合部位被阻断时，可以在孔中装载更大体积的样品(包含目标抗原或分析物)。由于液体缓慢地流过通道壁，越来越多数量的抗原可以在表面与捕捉抗体结合。实际上，流通模式用于再次补充暴露于结合部位的目标抗原/分析物的供给直到大部分的结合部位与抗原结合。然后如之前所述将检测抗体或二级抗体连接到结合目标，这种方案可以从给定样品中检测非常低浓度的目标。关于微量的快速反应动力学确保了很大一部分抗原可以在短的时间内与捕捉抗体结合，在该短的时间内液体以流通模式处于通道中(很少几秒)。
图6显示了进一步帮助需要培养步骤的流动顺序的可靠性能的构造特征。如图6所示，与带上的出口孔靠得很近对着微通道出口的地方设计通气孔。采用这种构造配置，当孔中的液体变空时，液体的后端将会在通孔和微通道之间的接口处被“卡住”。强毛细作用力的吸收性垫可能继续施加毛细作用力，该毛细作用力通常会使液体也从微通道中流空。实际上，所述吸收性垫充当泵的来源并在液柱的前端创造了负压。当液体被吸收性垫吸出时，液柱将“收缩”回到微通道中。当液体通道的前端收缩超过通气孔时，衬垫的毛细作用将停下来，因为负压(来自衬垫)由大气压经过通气孔解除。通气孔也可以置于密封带上出口孔周边的内侧。后者的构造将确保一旦液体稍微收缩(由于由衬垫不断地吸收)，通气孔就使得负压消失。如进一步所描述的，有必要确保液体向后收缩，即远离出口。如果液体前部要保持静止(在出口处)并且如果液柱后端(在通孔接口处)反而要移动到通道中，即远离进口的话，当另外的液体装载到孔中时将形成气泡。在两种不同的液体之间介入的气泡将导致毛细作用从而停止并妨碍进一步的操作。
本发明一个重要的方面是使用微流控通道进行免疫分析，与常规微量培养板的孔结构截然不同。在本领域中公知的是微通道的高的表面积与体积的比值便于(a)由于有限的扩散距离导致的快速反应，以及(b)低的反应容积。在本发明的实践中可以使用各种各样的微通道构造。如下表所示，随着通道尺寸减小，表面积与体积比增加，伴随着完全充满通道所需的液体体积减少。通道尺寸将基于流速、表面积和表面积与体积(SAV)比的需要来确定。例如，假设500μm的装载孔在中间，并且其中最大的螺旋通道的半径为大约3mm；下述的构造是可能的。认为所有这样的变化都在本发明的范围内。
Figure BDA0000145136480000181
当然，除了先前的附图中所示的螺旋构造外，许多的通道构造也是可能的。图7A显示了一种同样很好地适用于本发明的迂回的通道。此外，通道可以包括从进口到出口连续的锥形。所述锥形将确保在液柱的前端具有渐增的毛细作用力并且导致与当通道不是锥形的情况相比不同的流速。在其他的实施方案中，可以从出口到进口设计成锥形使得通道从进口到出口逐渐变宽。这将导致与第一种锥形或当没有锥形存在时相比的另外一种流速。这种流速的差异可能对于连续流流过分析或用于静态培养分析的液体填充性能具有显著的影响，并可以有利地用于提供进一步的构造适应性。在还其他的实施方案中，可以将通道设计成非对称的，即宽度不等于深度不等于间距或它们的组合。
在图8中示出了微通道的其他优选的实施方案。如图8A中所示，微通道具有组合的几何形状，其中所述微通道的横截面尺寸在突出显示的末端部分相对于微通道其余部分的横截面尺寸是不同的。末端微通道部分有至少一个尺寸大于微通道其余部分可比较的尺寸。例如，末端部分可以是300μm宽×200μm深，而微通道的其余部分可以是200μm宽×200μm深。这保证了末端部分比在前的通道具有更低的流阻。这种构造在确保对于静态培养情况最适宜的流动性能中是有用的。如先前结合图6的解释描述的，优选吸收性垫吸出液体使得液体从出口向后收缩的连续作用。图8所示的构造可以确保由于液柱前端(靠近出口)的流阻低于液柱后端(在通孔接口处)的流阻，液体总是从出口向后“收缩”。
图8B中显示了另一种可以实现类似效果的优选的实施方案，其中突出显示的初始部分与微通道的其余部分的横截面尺寸相比是不同的。该初始微通道部分有至少一个尺寸小于微通道其余部分可比较的尺寸。例如，初始部分可以是100μm宽×200μm深，而微通道其余部分可以是200μm宽×200μm深。这确保了初始部分比其余部分有更大的流阻。这也将确保液体总是向后收缩，即远离出口，而不是收缩进入通道，即远离进口。此外，在微通道的开始使用高阻力部分也有利于连续流或流通模式的流量调节。如图9和关联的表所示，微通道中的流速高度依赖于微通道尺寸。流通模式需要(1)流速的精确控制以确保可重复性能，以及(2)以低流速流动以便于流过通道的液体有足够的停留时间以确保液体中的生物化学品最大限度地吸附/结合到通道壁的配体上的能力。如图9和关联的表中显示的不同尺寸所示出的，也可以用这些实施方案的组合来增加构造适应性。
图12显示了一种可供选择的构造，其中孔结构和微通道结构被设定在两个不同的衬底上。在这种构造中，在衬底的两个面上设定微通道，使得在一个面的通道相对于第二个面的壁区，反之亦然。这确保了在孔底部的水平足迹上没有浪费空间，并且可以产生更大的分析信号。
如先前所解释的，微流控相比常规的规模分析室的优势是在通道中高的表面积与体积的比值。这可以通过使用本领域已知的多种技术来进一步扩大。图10A中显示了一种这样的方法，其中通道中充满了大量的珠。各种珠可用于这种应用，列举几例，包括磁性珠、非磁性珠、聚合物株、二氧化硅珠、玻璃珠。可供选择地，通道可以有使用自动组装或其他合适的组装方法制造的完全统一的聚合物柱。所有的这些，和其他本领域已知的技术，可以显著地增加微通道内部的净余表面积，并可以允许甚至比微通道装置更快的反应时间。如在本说明书中稍后进一步解释的，珠的使用给予在装置操作中更大的灵活性。当要使用珠(聚合物或其他)时-直接将它们分配到孔底部合适大小的孔上。选择通道尺寸使得珠可以自由地流动通过它们。然后珠将流动到出口所有的路径直到它们到达吸收性垫，吸收性垫将阻止珠的进一步移动。在这个阶段，如果需要可以替换吸收性垫以去除溶液的任何残留物，在所述溶液中悬浮有珠。进一步的步骤将保持相同。可供选择地，可以通过使用自动组装技术或匀浆填充法填充珠。
在特别优选的实施方案中，所述珠为Ultralink BiosupportTM琼脂糖凝胶珠。这些珠提供多孔的表面积，这大大地扩大了珠的表面积。此外，这些珠很好地适合于生物化学品例如捕捉抗体的共价连接。在高表面浓度的捕捉抗体连接到珠之后，可以有效地钝化剩余的珠表面使非特异性吸附减到最小。Ultralink BiosupportTM珠通常用于亲和柱液相色谱法(affinity liquidcolumn chromatography)例如快速蛋白质液相色谱法(FPLC)，并且在微流控通道中它们的使用给予灵敏度极大的增加。对于FPLC应用，珠是通过共价连接捕捉实体以及随后在储液容器如试管中钝化而“准备的”，然后将珠填充到FPLC柱中。对于微流控微量培养板，可以使用类似的方法，并且可供选择地，这些过程也可以通过首先诱捕珠到适当设计的几何形状中，然后按顺序加入连接化学和钝化溶液来完成。这在提供用珠预先装好的“通用的”微量培养板以及允许终端用户连接需要的化学到珠方面提供了更大的灵活性。
图10A中所示的实施方案特别适合于需要非常高的灵敏度的应用。图10B中显示了使用微珠的一种可供选择的实施方案。如图10B所示，珠仅被诱捕在连接孔到通道的通孔中。事实上，设计通道的尺寸使得通道担任捕获(trapping)的几何形状的角色，并且狭窄的尺寸不允许任何珠进入通道。重点需要注意的是，在这个实施方案中，填充小珠的柱是“反应室”，并且微流控通道仅仅用于运送液体离开珠柱的底部到出口，因此仅是直的部分。Ultralink BiosupportTM珠的极高的结合能力在免疫分析应用中给予足够的灵敏度，即使是使用如图10B所示的非常小的“珠柱”。这种实施方案特别适用于高密度微量培养板例如384孔和1536孔的构造。
如上所述，使用珠(Ultraink BiosupportTM或其他的)的一种技术是用需要的试剂包被珠然后将它们装载到通道(或通孔)中。这种方法把微量培养板限定在与包被的捕捉分子反应的抗原。同时，“预包被”也给予珠表面亲水性以便于在填充珠的柱中发生毛细管流。对于“通用的”微量培养板，其中使用未包被的珠，未包被的/非钝化的珠的疏水性表面将大大减少，如果不是完全抑制毛细管流。为了防止这个问题的发生，可以使用处理的和未处理的珠的混合物。例如，当准备装载(在制造设备中)珠时，可以将适当比例的未处理的(疏水的)和钝化的(表面给予亲水性的)珠混合并装载到通道或通孔中。这将确保填充珠的柱可以在以减少结合部位(在钝化的珠上)为代价的情况下，支持毛细管流功能。尽管减少了，但是净余的结合部位数将仍然比仅在微通道壁上的结合部位数高的多。
本发明不只限于分析测定。例如，图11所示的构造可以被用于基于细胞的分析。在通道中的柱阵列(pillar array)当它们被从孔运送并在精确限定的位置被捕获时可以诱捕细胞。此后，可以将细胞暴露于不同的化学品以研究这些化学品对于某些细胞功能的影响。在某些情况下，响应可以是以从细胞释放的化学品的形式。在这种情况下，可以设计分析程序使得当加入细胞溶液之后并在加入刺激的化学品之前，用新的衬垫替换吸收性垫。因此，可以将从细胞释放的化学品收集到吸收性垫并进行分析。在其他实施方案中，微通道的表面可以被适当地处理以确保细胞可以粘附到壁上。在这种实例中，细胞可以首先在微通道中被培养并生长，随后暴露于测试化学品。
在本发明全部的实施方案中，吸收性垫可以是全部的流体处理步骤共用的，或者也可以被设计成在各个流体处理步骤后或在选择的一组步骤后被替换的。此外，吸收性垫可以在最后的流体处理步骤之后被移走或者可以仍然嵌入微流控微量培养板中。在优选的实施方案中，装配吸收性垫使得它们不与微通道和/或孔结构重叠。这确保了存在用于检测分析信号的光学上清晰的路径，而不用移动吸收性垫。图13显示了一种这样的实施方案，其中独特的吸收性垫与每个孔+通道结构一起使用。同样如图13所示，吸收性垫可以位于微量培养板或者可以位于单独的层上。在后者的情况下，微流控微量培养板放置于衬底之上，所述衬底使用适当的架构造支持吸收性垫。自然地，在所有的情况下，吸收性垫也可以是微流控微量培养板的所有的“孔”共用的连续的片。
在完全透明的结构中使用连续的吸收性垫的一个潜在性问题是衬垫将吸收所有的分析试剂的事实(包括光学活性组分)。然后区分来自微通道的光信号和来自衬垫中吸收的组分的光信号是不可能的。在多数实施方案中，在透明衬里上设想了密封带作为亲水性粘合剂。在吸收性垫是连续的片的情况下，可以选择密封带使得亲水性粘合剂放置于不透明的衬里上。穿孔切割所述带以产生出口孔，所述出口孔与先前描述的出口孔类似。微通道的末端和出口孔设置在远离孔和螺旋微通道样式的垂直观察窗处。这种具有不透明带衬里的结构将便于使用吸收性垫而没有光串扰效应，因为到衬垫仅有的“窗口”是密封膜上穿孔切割的孔，该孔转而置于远离观察窗的地方。所述微流控微量培养板被限制在“顶部-读数”模式，但是可以将衬垫整合作为微量培养板的一部分，从而排除了对于托架的需要。所述结构在一定程度上受应用的支配，例如，对于手工使用，可移动的衬垫方便操作员在读数前移去，而对于使用自动化设备的高通量筛选，为了与目前的仪器有兼容性优选使衬垫整合。
如图5所示，来自孔底部与微通道的通孔的突然转变导致了液柱表面张力压力的突然变化并在接口处停止流动。类似的情形也可能发生在如14A中所示的出口端。使用附加的基底层来压缩吸收性垫可以确保相对灵活的吸收性垫将凸起进入密封膜上产生的凹处，如图14B所示。此外，所述凸起部分将直接接触微通道横截面，在微通道横截面处微通道与出口孔接口。这可以确保吸收性垫总是与离开的液体相“接触”。可供选择地，如图14C所示，可以在微通道末端的出口部分制造突出结构。可以设计所述突出结构使得突出结构的平直表面(远离衬底)与密封带的表面(远离衬底)大约在一条直线上，从而使过渡效应最小化。图14C显示了可以用于产生突出结构的一系列的几何形状。
图15显示了另一种实施方案，其中衬垫被设计成条状，而且其中一条吸收性垫被一排(或列)孔+通道结构共用。图16显示了还一种实施方案，其中吸收性垫条被从“上部”放置，即，在与微通道相对的面上。因此，可以使用许多设计放置吸收性垫，而不背离本发明的精神。
正如同样容易明白的，任何能够施加毛细作用力高于微通道所施加的毛细作用力的材料都适于作为吸收性垫。各种材料例如滤纸、洁净室组织(cleanroom tissues)等都是容易明白的例子。其他隐秘的吸收“衬垫”可以包括致密结构例如在孔结构中的微米大小的二氧化硅珠。这些将施加非常高的毛细作用力并且所有被设想作为吸收性垫本发明范围内的吸收性垫。
事实上，图17中示出了一种微通道自身用作毛细管泵和废料槽的结构。如图17所示，改进了结构使得96孔布局上少数孔是“功能的”。每个孔经由通孔连接到微通道。在这种实施方案中的微通道被分成两个区，“功能的”通道和“废料”通道。废料通道被设计成使得其可以容纳所有在多步分析程序中加入的液体。当加入第一种液体它将流过通道最初的“功能的”部分，其中将在通道壁上发生如先前所描述的分析反应。此后，所述第一种液体将到达连续的微通道的“废料”部分。亲水性带将继续施加毛细作用力并将液体从孔中吸出。在通道的“废料”部分使用较大的横截面积，确保在“废料”通道的毛细作用力弱于在通孔：微通道接口处的毛细作用力，从而当第一种液体被从孔中排尽时停止流动。当加入第二种液体到孔中时，在通孔底部的毛细作用障碍被消除，并且流动将重新开始直到第二种液体从孔中排尽。这种构造给予完全整合的装置构造，不需要使用吸收性垫。此外，在这种实施方案中，由于流动是由“功能的”和“废料”通道部分之间的尺寸差异自动调节的，因此同样也不需要通气孔。这种实施方案通过将使用的组分数减到最小可以给予更大的可靠性。在还其他的实施方案中，所述废料通道可以仅仅是延伸通过衬垫层的通孔(直接“向上”)，所述衬底层形成微量培养板。适当厚度的衬底层将便于足够的液体被包含在“废料孔”中，所述衬底层可以进一步是不均匀厚度的。这种实施方案可以便于使用微流控毛细管泵的构思而不损失孔数。
到目前为止，将微流控通道和孔描述为作为相同结构的一部分，所述相同结构也规定了外部形状与96孔板的足迹相匹配(除了图12中所示的实施方案外，图12中仅孔是“微量培养板”衬底的一部分)。使用图18所示的实施方案可能是更有利的。如图18所示，微流控插入板与环绕的外壳一起使用-其中所述外壳规定常规微量培养板的形状和足迹(沿着周长)，其中所述微量培养板插入结构包含孔结构和微通道结构。这两部分可以被设计成使得微流控插入板可以从外壳中移出。图18中示出了这种使用，其中在一个方向上，特别是孔面对顶部的地方，装置被用于分析流控程序，而在另一个方向上，特别是当微流控插入板的微通道部分正面朝上时，装置被用于分析检测程序。外壳可以被设计成使得微流控插入板可以被放置于最适宜的高度以通过确保微通道与光检测器位于相同的焦平面来确保来自微通道的信号最好。这种实施方案特别适用于荧光检测，其中使用光的定向波束来引起荧光。对于化学发光应用，图19所示的实施方案可能更加适合。在这种实施方案中，附加的板放置于反向的微流控插入板的顶部。所述附加的板在微流控插入板的区域包含开口，在微流控插入板中放置微通道，而形成这些开口的结构的壁是不透明的。这可以确保在信号从一个反应室到达多重光检测器的地方“光串扰”效应的大量减少。图18的实施方案也适合于不透明衬底使用，使得旋转之后，通道侧可以由读取酶标仪(microplate reader)的“顶部”读数。在另一种可供选择的实施方案中，图12的装置可以被制造成使得装置的“孔”部分由不透明材料制成，而“通道”部分制造于透明衬底上。图20也显示了还可供选择的的实施方案，其中使用了多个微流控插入板。可以设计插入物的排列为特定的尺寸，例如允许的～25mm×～75mm的标准玻璃载玻片足迹，例如为微量培养板设计的液体处理设备从而同时操作4个插入物，以及载玻片读数器分别读取每个微流控插入物，以混合搭配的方式。
图21A显示了一种实施方案，其中一个装载孔连接到在衬底的另一面上和它正对的一个微通道结构，并且所述装载孔连接到多个其他的室，所述室被放置于对面但是在微量培养板的其他孔通常出现的位置。例如，如图21A所示，在第4排和第5排的一组24个孔连接到4个反应室中的每个。在一种应用中，该装置可以用于常规分析，其中使用来自4个反应室中的每个的相同信号来核实分析结果，正如在常规的基于微量培养板的分析中通常进行的每个样品一式三份或多份读数。在另一种实施方案中，珠的使用可以给予在装置中更大的灵活性。例如，装载到共用装载孔中的第一种液体可以含有珠悬浮溶液1，其中所述珠结合到特定的捕捉抗体。设计溶液1的体积使得当珠填装最下游的反应室时(由于早先所描述的吸收性垫而填装)珠仅填充那个特定的微通道结构。然后可以加入第二种珠溶液2，溶液2中含有结合于另一种抗体的珠。然后这些将填装到从上个最下游的反应室起的第二个，如此等等。因此，每个反应室可以被设置成在分析操作中检测与共同的样品来源不同的分析物。可供选择，针对共同的分析物的灵敏度可以筛选一系列不同的捕捉抗体或者使用这种构造可以进行其他这样的测试。当然，也可以修改该构造使得串联到装载孔的各个反应室可以具有不同的物理结构以确保在分析特性方面的差异。
图21B显示了本发明的另一种实施方案，其中装载孔和微流控通道沿着垂直平面去连接。如图21B所示，可以使用非常简化的(和更高容量的)孔结构，以圆柱体结构的形式，所述孔结构在一侧连接到微流控通道。所述微流控通道反过来通向螺旋(或其他合适形状的)检测区，所述检测区位于标准的96孔布局的另一个“孔”的足迹中。因此，在这种构造中，“96孔”构造减少到48孔构造，但是具有非常简化的物理结构。此外，这种构造使得在螺旋形微流控通道的顶部厚度非常小的塑料材料充当反应室。在设计中，其中有通孔的装载孔(锥形的)与微通道在相同的垂直瞄准线上，在微通道上方有坚固的和不均匀厚度的塑料材料。特别地，在基于荧光性检测的应用中，这增加了来自塑料材料自身的自体荧光，因为自体荧光也部分地与塑料材料的厚度有关。在图21B的构造中，在微流控反应室的顶部允许有厚度非常小(～250-500μm)的塑料材料，因此大大地最小化了由于来自塑料材料自身的自体荧光的背景信号。
图21C和图21D显示了特别适用于微流控微量培养板的半自动操作的实施方案。
图21C显示了本发明的实施方案，其中一组简化的装载孔连接到一个反应室。该示意图显示了其中3个装载孔连接到一个反应室的情况，并且容易明白的是这种结构可以扩大到通向一个反应室的更高数目的装载孔。这种在第一个简化的装载孔之后的简化的装载孔也使用专门的几何形状用于连接微流控通道，如图21C的插入物所示。从第一个简化的装载孔引出的连接通道，用光滑锥度连接到装载孔。用于另外的两个孔的连接通道环绕装载孔的底部，使得一部分的微通道与装载孔连接。这种几何形状使装载孔可作为双重用途，即作为装载孔也可作为通气孔。在操作过程中，使用多通道移液器用液体试剂同时充满全部的3个装载孔。假设疏水性衬底和亲水性密封带，当3种液体被装载在孔中时，它们将接触底部(密封带)，并且亲水性作用力将开始吸引液体到通道中，确认先前概述的所有变化也将同样有效地工作。在本说明书中，距反应室最近的孔被描述为孔1，孔2是第二上游的孔，如此等等。孔1中的液体流向反应室和下游的吸收性垫具有无阻挡的流路，并且来自孔1的液体将直接流向反应室。液体向孔2回流受到阻塞，因为介入的空气(在通道中)没有地方出去。同样地，由于没有放气路径，来自孔2的液体不能流进任一方向。因此，除了孔1外的所有孔中的液体被“捕获”在原位。当液体完全从孔1流出时，来自孔2的液体可以开始移动。在孔2的液体前面的空气可以从此刻空的孔1出去。由于通道是连续的部分，并且在所有的点都连接到亲水性的表面(带)，所以当来自孔2的液体穿过孔1的周边时，流动将持续，直到来自孔2的液体通过反应室并且变空。注意在所有的这些情况下，反应室使用较狭窄的尺寸以确保孔完全排空它的内容物。流动活动的这个顺序将继续并连续孔(孔3、孔4......)试剂将被顺序地运送通过反应室。通过确保足够的体积(来完成表面结合反应)，可以只使用一个装载步骤完成整个分析程序。这种实施方案提供了两种不同的益处：(a)显著地减少了运行分析程序所需要的工作，以及(b)由于整个流动顺序是“自动地”调控的，因此具有非常可重现的结果。注意可以以两种方式容纳附加的液体：(a)通过串联连接附加的孔(例如有6个装载孔用于应注射到反应室中的一系列的5个试剂和样品)或者(b)通过重复装载程序(例如，首先注射试剂1、2和样品，然后在全部的3个被运送通过反应室之后，再同时装载试剂3、4和5)。
图21D显示了根据本发明的“半-自动”微流控微量培养板的实施方案的一种不同的变化。在这个实施方案中，每个孔排入通道，所述通道连接到共同的连接通道。与图21C中的构造的关键差别是在连接通道之前的每个微通道的长度(从而体积)是显著不同的。此外，使用与前述的实例相同的命名习惯，孔1到反应室有非常短的路径长度，而孔2的路径长度至少为10倍长，如此等等。在这种构造中，当全部的液体被同时吸入到它们各自的孔中时，流动将在所有的通道中同时开始。首先，液体1(来自孔1)将到达反应室，并且将是反应室中仅有的液体。此后，液体2(来自孔2)将到达连接通道，并且液体1和液体2的混合物将流进反应室。可以设计各个孔的体积使得在小体积的混合物通过反应室后，孔1完全变空。此后，液体2将单独继续流过反应室直到液体3(来自孔3)到达连接通道，如此等等。当两种试剂应当在装载到反应室之前混合时，这种实施方案特别有用。实例包括但不限于，双组份化学发光底物，用于竞争性免疫分析的标记的抗原和样品抗原的混合物等等。此外，也可以设计流动顺序，使得在一个想要的时间间隔内，3种(或多种)试剂的混合物同时流过反应室。
图22显示了还另外一种实施方案。在本发明的这种实施方案中，特别的适合于其中长的时间间隔需要慢的流速的应用，微量培养板被安装在特殊的固定装置上。所述固定装置连接到空气泵，该空气泵可以在室温或升高的温度下通过所述固定装置抽吸空气，所述固定装置经过吸收性垫的下侧。设计流动顺序使得在需要延长持续时间的低的、稳定的流速的步骤之前，加入高体积液体以使衬垫完全饱和而不能吸收任何另外的液体。然后加入需要的液体到孔中，并将孔顶部密封以阻止蒸发损失，在每个孔密封上有一个小的通气孔结构。此外，在固定装置中引起的空气流将导致衬垫中液体的蒸发损失。当衬垫损失液体体积时，额外的液体体积将被从孔中以以用于延长时间的低的流速吸出。所述吸收性垫可以是所有孔共用的衬垫或是每个孔单独的衬垫。这种实施方案特别适合于例如研究细胞生长的应用，其中需要培养基稳定地慢速流动以维持细胞生存。
到目前为止，本发明讨论的“一个主体”的实施方案，如果制造在透明的衬底上，由于光学透明孔之间的光串扰，不适用于基于化学发光的检测。对于基于荧光的检测，只有当激活含有荧光实体的微通道时才产生光信号，并且在移去激发源之后光信号几乎即刻降到零。在化学发光的情况下，当底物加入到通道时，每个微通道单元将连续地产生信号。因此，当检测器在给定的孔的下方“读取”通道时，它也将获得来自相邻通道的杂散光信号，并且在测量中这种“串扰”可能导致不能接受的误差。如在一些实施方案中描述的，如果使用不透明的衬底，所述实施方案适合用于基于化学发光的检测，但是需要底部读数模式或者旋转板以使通道侧面朝上。多数光度计仅设计用于顶部模式读数并且所述旋转步骤不适用于自动化。
图23显示了一种本发明的微流控微量培养板的实施方案，该实施方案特别适用于基于化学发光的检测应用。图23的实施方案使用两片(two-piece)构造，其中使用不透明的片来完全包围微流控微量培养板的每个孔+通孔+通道“单元”，其中每个孔由透明的材料组成。如果使用连续的密封带，这种构造确保了每个单元几乎完全与其它单元隔离，唯一的光路是通过密封带。如果在其他的实施方案中，每个单元也单独地密封，所述单元将完全与其他单元隔离。图23的实施方案相当大地减小了在微流控微量培养板单元之间的光串扰，为可靠的基于化学发光的检测创造条件。
图24显示了一种特别适用于即时检验(POCT)的实施方案。这仅仅是微量培养板构造的简化的版本并且可以被用作完全手动即时检验(POT)分析系统。图24A显示了一种除了具有减少数量的装载/检测结构之外与先前描述的装置完全相同的装置，而图24B显示了一种可供选择的实施方案，其中微通道结构与装载孔不在相同的垂直瞄准线上。图21C和21D中示出的以及先前描述的“半自动”微流控微量培养板设计也很好地适用于半自动POCT。
图25显示了根据本发明的组合的OptimiserTM微量培养板，其具有常规96孔板的足迹和孔布局，并且图26显示了微流控微量培养板的另一种实施方案。图27显示了来自微流控微量培养板和常规微量培养板的使用基于化学-荧光分析的可比较数据，清楚地突出显示了微流控微量培养板的样品/试剂节约和速度优势。
1)IL-6的传统的96孔分析：
●加入抗IL-6捕捉抗体(100μl，2μg/ml)并在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)(T20-＞Tween 20去污剂)；每步300μl缓冲液
●封闭，300μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●IL-6抗原，系列浓度，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●抗-IL-6检测抗体，2μg/mL，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●HRP标记的抗-抗-IL-6检测抗体，5μg/mL，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●50μL化学荧光底物
●使用Biotek FLX-800荧光读取器检测化学荧光信号
2)微通道96孔
●加入抗IL-6捕捉抗体(7μl，2μg/ml)并在室温下(～23℃)培养5分钟
●封闭，7μL，在室温下5分钟
●IL-6抗原，系列浓度，30μL(或100μl)，在室温下5分钟
●抗-IL-6检测抗体，2μg/mL，7μL，在室温下培养5分钟
●HRP标记的抗-抗-IL-6检测抗体，5μg/mL，7μL，在室温下5分钟
●洗涤(TBS-T20，TBS)；每步20μl洗涤缓冲液
●7μL化学荧光底物
●使用Biotek FLX-800荧光读取器检测化学荧光信号
图28显示了来自根据根据本发明的微流控微量培养板和来自常规的微量培养板的使用基于化学-发光分析的测试数据。注意对于微流控微量培养板，为了避免如早先讨论过的化学发光的光“串扰”，每次进行一个孔的分析(即在特定的实验中，每次只测试一个孔)。进行下列分析：
3)传统的96孔：
●捕捉肌红蛋白抗体，1μg/mL，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●封闭，300μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●肌红蛋白抗原，系列浓度，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●结合AP的检测肌红蛋白抗体，1μg/mL，100μL，在37℃下培养1.5小时
●洗涤(TBS-T20 3次，TBS 2次)
●50μL AP底物
●使用Turner Biosystem GloRunner光度计检测化学发光信号
4)微通道96孔
●捕捉肌红蛋白抗体，20μg/mL，5μL，在室温(23℃)下培养5分钟
●封闭，10μL，在室温下培养5分钟
●肌红蛋白抗原，系列浓度，在室温(23℃)下培养5分钟
●结合AP的检测肌红蛋白抗体，20μg/mL，5μL，在室温(23℃)下培养5分钟
●洗涤：TBS-T20，30μL，2次，TBS，30μL，1次
●5μL AP底物
●使用Turner Biosystem GloRunner光度计检测化学发光信号
由于期望的较低的底物体积，来自本发明的微流控微量培养板的绝对信号较低。如从图28所观察到的，更重要的是，两种平台的数据趋势是相似的，这表明微流控微量培养板对于化学发光检测模式也是可行的分析平台。如同样明显的是，通过在适当接近微通道处放置一组电极模式，使用微流控微量培养板进行其他检测方式例如电化学检测也是可能的。
总而言之，本发明有利地提供了将微流控通道与一系列孔整合到平台上并符合SBS/ANSI标准的简单方法。例如，意料不到地发现本发明提供了下列优点并可以被用于多种应用以替代常规的微量培养板。
优点
1.μf96(或OptimiserTM)板将微流控方法的速度与多样性和很好建立的96孔平台相结合。
2.就使用者所关心的而言，操作与常规的96孔板完全相同，实际上具有减少的步骤数。
3.μf96(或OptimiserTM)板可以潜在地显著减少试剂消耗和/或样品需求。对于相对大量的样品，低至0.4μl的样品体积可能是足够的(对于50μm螺旋通道构造)。对于使用较少量的试剂-例如在免疫分析应用中的抗体，这也是重要的。
4.在应用例如免疫分析中，μf96(或OptimiserTM)板比常规的96孔板可以显著更快。与常规96孔板的数小时相比，一整套的96分析可以大概在5-30分钟内完成。
5.μf96(或OptimiserTM)板的费用可以与传统的板相当，由于它也是单一的注入成形操作。由于(a)一方面，微制造的主模，和(b)由更低的试剂消耗和更快的分析时间很好地抵消了衬垫层的少量增加的费用。
6.基本方法是极其多变的，并且使它自身不仅在实验室环境下，而且对于及时即时检测装置也提供了广泛的应用。
7.由于流动只由几何的和材料的作用来控制，因此操作者的误差减少，这导致了更加可重现的结果。
8.正如96孔板一样，μf96(或OptimiserTM)板操作也可以全部自动化。事实上，μf96(或OptimiserTM)仅需要板处理和自动试剂分配系统。与96孔板相比，这是一个非常简化的用于完全自动化的设备负载，所述96孔板需要(i)板处理系统；(ii)自动试剂分配系统；(iii)培养系统(由于长的培养时间)；以及(iv)板清洗系统。
根据前面描述的本发明的优选实施方案，本发明另外的实施方案，以及特征、益处和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，应当理解的是，本发明不应解释为以任何方式被前面描述的该优选的实施方案所限制，而是正如在此特别描述的可以对本发明做各种变化和修改，并且所有的这些变化和修改都意在本发明的范围内。任何这样的限制仅仅解释为被在此所附的权利要求所限定。

Claims (15)

1.一种微流控微量培养板，所述微流控微量培养板中具有许多用于进行分析的孔，其中微流控流动通道被整合到所述微量培养板中。
2.根据权利要求1所述的微量培养板，其中所述流动通道被整合到具有至少96个孔的微量培养板中。
3.一种微流控微量培养板，所述微流控微量培养板包含许多实质上相同的单元，其中每个单元包含以下的至少一个：
a.装载孔；
b.在装载孔底部的通孔，所述通孔在一端连接到装载孔，而在另一端连接到微流控通道；
c.封闭的微流控通道，所述微流控通道在一端连接到通孔，而在另一端连接到出口孔，而且进一步其中所述微流控通道的至少一个壁表现亲水的性能，而且进一步其中所述微流控通道的三个壁被衬底材料所限定，并且所述微流控通道的一个壁被密封装置所限定；以及
d.吸收性垫，所述吸收性垫连接到微流控通道的出口。
4.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述装载孔包括形状基本上是圆形的结构并且包括垂直侧壁。
5.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述装载孔包括形状基本上是圆形的结构并且包括垂直侧壁和锥形侧壁，并且所述垂直侧壁在所述锥形侧壁的上面。
6.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述装载孔包括形状基本上是圆形的结构并且仅包括锥形侧壁。
7.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微流控通道安装在相同的衬底中，所述衬底装有孔和通孔。
8.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微流控通道安装在单独的衬底中，所述衬底装有孔和通孔。
9.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述吸收性垫材料表现出比微流控通道更高的毛细作用力。
10.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微量培养板由基本上一个衬底组成，所述衬底装有装载孔、通孔和微流控通道，并且其中单个部分的外部形状符合微量培养板的ANSI/SBS规范。
11.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微量培养板由多个衬底组成，至少一个所述衬底装有装载孔、通孔和微流控通道。
12.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微量培养板由多个衬底组成，至少一个所述衬底装有至少一个单元，所述单元由装载孔、通孔和微流控通道组成。
13.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中所述微量培养板由多个衬底组成，并且其中一系列衬底只含有一个单元，所述单元装有装载孔、通孔和微流控通道。
14.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中至少一个衬底是光学透明材料并且至少一个衬底是光学不透明材料。
15.根据权利要求3所述的微流控微量培养板，其中至少一个衬底材料是热塑性材料。
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