JPH10506991A - 構造体アレイを利用して分析物を捕捉する装置および方法 - Google Patents

構造体アレイを利用して分析物を捕捉する装置および方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、被験サンプル中の分析物の存在もしくは量を決定するための分析装置に関するものである。その分析装置は、入口ポート、ベント、流路および構造体アレイを有する。構造体の表面には固定化試薬が共有結合的または非共有結合的に付着している。固定化試薬は被験サンプル中の分析物を捕捉し、そこで分析物が検出系によって検出される。本発明はさらに、本発明の分析装置を利用するアッセイを行うための方法および試薬をも提供するものである。本発明はさらに、本発明の分析装置を製造する方法をも提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 構造体アレイを利用して分析物を捕捉する装置および方法 １．発明の属する技術分野 本発明は、被験サンプル中の分析物を検出するための装置に関する。該装置は 、装置中の構造体のアレイを利用して、分析物を捕捉するものである。２．発明の背景 被験サンプル中の分析物の定性的または定量的測定は、生理的および非生理的 状態の診断において常に重要な問題である。試薬と混和している被験サンプルを 分析することで、機器の用いたり、機器を用いずに検出可能な信号が得られる。 被験サンプル中の各種分析物の測定を行う方法および装置が提供されている。 本発明の趣旨において特に対象となるものは、小型の使い捨て装置である。その ような装置は通常、細片またはトラック（track）装置が関与するものである。 多孔質の装置は通常、装置を通過させて流体を運ぶ何らかの形の多孔質材料を 使用するものである。これらの装置は通常、シート、細片、液浸棒などの形態で ある。細片装置は、表面積が大きく、孔径が小さいという利点を持つ。そのよう な材料を 利用する装置の欠点の一つは、装置形成においてプロセスがランダムであるため に、多孔質材料にロット間の変動が生じ得るという点である。その変動により、 装置の性能に差が生じ得る。 トラック装置は、容易に再現可能な均一表面を提供するものであるが、間隔が 広すぎて、妥当な時間内に内部表面での分析物の拡散とその後の捕捉を行うこと ができない。 従って、トラック装置の寸法再現性と多孔質材料を用いる装置の小孔および大 表面積を有する小型の使い捨て装置を作製することは有利であると考えられる。 そうすれば、多孔質装置とトラック装置の問題は同時に解決されると考えられる 。 電子業界において小型装置を作製するには、いくつかの方法が利用されてきた 。例えば、ムンヒマイヤーらの論文（Munchmeyer et al., Rev.Sci.Instrum,，6 3(1)，713-721,（1992））には、シンクロトロン照射リソグラフィーを利用して 原型（マスター）を作製する、光学および電気微小部品製造のＬＩＧＡ技術が開 示されている。エンゲルらの論文（Angell et al., Scientific American，248: 44-55(1983)）には、マイクロエレクトロニクス用シリコンウェハへの微細加工 によるエッチングが記載されている。マンツらの論文（Manz et al., Trends in Analytical Chemistry ，Vol．10，No．5，pp．144-149，(1991)）には、より 迅速なクロマトグラフィー分離および電気泳動分離を行うフローインジェクショ ン分析および検出器セル用の再現性の良い微細加工単結晶シリコンおよびガラス が開示されている。 小型装置に向かう傾向は、電子業界に限ったものではない。サトーらの論文に は（Sato et al., Sensors and Actuators,A21-A23，pp.948-953,(1990)）、２ つの異なった細胞群間の１：１細胞融合操作を同時に行うことができるマイクロ メカニックスのシリコン装置が開示されている。微小チャンバで細胞の融合が奏 功していることが認められている。 ナヤク（Nayak）に対する米国特許４７８９６２８号には、リガンド：アンチ リガンドアッセイ用に表面積を大きくするための、孔底部から上方に伸びる互い に分離した複数の突出物が開示されている。その複数の分離した突出物は、相互 に連絡する流路を形成している。しかしながら、突出部の寸法が大きく、流路の 幅が大きいため、低濃度分析物を用いた微量アッセイや迅速な信号形成は行うこ とができない。 ワイルディングら（Wilding et al.）に対するＷＯ９３／ ２２０５３Ａ１号には、被験サンプル中の分析物を検出する微細加工検出装置が 開示されている。その装置は、投入口から伸びるマイクロメートル単位の流路を 有する。流路は微細加工によってシリコン中に形成されたものである。結合部分 が流路内面を覆っていて、分析物を検出する。 現在の分析技術、すなわち多孔質装置およびトラック装置は、十分なアッセイ 性能を与える材料を提供するものではない。微量の流体を許容できる速度で流し 、許容できる効率で分析物を捕捉することができる再現可能は装置が必要とされ ている。図面の簡単な説明 図１には、菱形構造体のアレイを示してある。構造体の表面は分析物捕捉部位 である。図中の矢印は、装置での流体の流れの方向を表す。このアレイにおける 菱形の列は、流体流動方向に対してジグザグ配置となっている。 図２には、本発明の分析装置で使用される六角形構造体のアレイを示してある 。 図３には、本発明の分析装置で使用される三角形構造体のアレイを示してある 。 図４には、本発明の分析装置で使用される円形構造体のアレ イを示してある。 図５には、本発明の分析装置を用いて実施例１で実施されるｈＴＳＨアッセイ の結果を示してある。 図６には、本発明の分析装置の１実施態様を示してある。発明の概要 本発明は、被験サンプル中の分析物の存在もしくは量を決定するための分析装 置であって、試薬固定化用の部位を提供する表面を有する構造体のアレイを有し てなる装置に関するものである。固定化試薬は、該構造体表面に共有結合的もし くは非共有結合的に付着しており、分析物、分析物類似体、補助結合要素もしく は標識試薬を結合することができる。本発明の分析装置はさらに、複数の流路を 有し、分析物、分析物類似体、補助結合要素もしくは標識試薬を含む被験サンプ ルが該流路を流れ、分析物、分析物類似体、補助結合要素もしくは標識試薬が該 流路の幅全体に拡散して、固定化試薬と結合することができる。検出可能な標識 に接合した特異的結合要素を有する標識試薬が、被験サンプルに存在する分析物 の存在もしくは量を決定する信号を出す。 本発明はさらに、本発明の分析装置を利用する方法ならびにそのような装置を 製造する方法に関するものでもある。発明の詳細な説明 定義 本発明の各種実施の態様について説明する前に、本明細書で使用のいくらかの 用語を定義する。 「補助的特異的結合要素」とは、標識試薬もしくは固定化試薬の特異的結合要 素に加えてアッセイで使用される、いかなる特異的結合要素をも指す。アッセイ では１以上の補助的特異的結合要素を使用することができる。例えば、補助的特 異的結合要素は、分析物自体が標識試薬に直接付着しない場合などに、標識試薬 を対象分析物に結合させることができる。別の形態としては、補助的特異的結合 要素は、分析物自体が固定化試薬に直接付着できないと考えられる場合などに、 固定化試薬を対象分析物に結合させることができる。補助的特異的結合要素は、 サンプルに付加して、あるいは別個の試薬として付加してアッセイ装置に組み入 れることができる。 「分析物」もしくは「対象分析物」とは、少なくとも１個のエピトープもしく は結合要素位を有する検出もしくは測定すべき化合物もしくは組成物を指す。天 然の分析物特異的結合要素が存在するか、あるいは分析物特異的結合要素を製造 することができるいかなる物質も分析物たり得る。分析物には、毒物、 有機化合物、蛋白、脂質、脂肪酸、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモ ン、糖、ステロイド、ビタミン、ドラッグ（治療用および不正な目的用に投与さ れるものを含む）ならびに上記物質のいずれかの代謝物もしくは該物質に対する 抗体などがあるが、これらに限定されるものではない。「分析物」という用語は さらに、抗原性物質、ハプテン、抗体、巨大分子およびこれらの組み合わせをも 含むものである。 「分析物類似体」とは、分析物特異的結合要素と交差反応するが、その程度は 分析物自体より高いかもしくは低い可能性のある物質である。分析物類似体には 、分析物類似体が対象分析物と共通の少なくとも１個のエピトープ部位を有する 限りにおいて、分析物の修飾物や、分析物分子の断片化部分もしくは合成部分な どがあり得る。分析物類似体の例としては、分析物分子全体の少なくとも１個の エピトープを複製していることで、分析物類似体が分析物特異的結合要素に結合 することができる合成ペプチドアレイがある。 「毛管」とは、空隙を囲む固体表面であって、その空隙では適正な表面張力の 液体によって空気が優先的に置換され得るものを指す。毛管現象の機構は、系の 表面自由エネルギーによっ て決まる。毛管を通って液体の自然拡散が起こるには、系の表面自由エネルギー が拡散プロセス中に低下しなければならない。本発明で使用される装置では、対 象の生体液に適した固体表面を選択することによって、そうすることができる。 「捕捉部位」とは、固定化試薬と分析物との間で特異的結合反応が起こるよう な構造体の一定部分または所定の部分を指す。 「チャンバ」とは、毛管ではない所定寸法の封止空間すなわち空洞を指す。チ ャンバには入口および出口の開口を設けることができる。チャンバは、毛管力ま たは差圧によって充填することができる。特定チャンバの寸法を制御することで 、試薬添加、流量、インキュベーション、反応領域または検出を制御することが できる。さらに、試薬を共有結合的もしくは非共有結合的にチャンバ表面に付着 させることができる。 「流路」とは、装置の隣接する構造体間の空間を指す。流路は毛管であること もできる。一般に、流路は入口ポート、他の毛管またはチャンバに連絡している 。流路長さは、分析物測定および検出ができるだけの長さのものである。 「接合」とは、ある部分が別の部分と化学的に結合して接合体を生成すること を指す。蛋白に対する共有結合的接合のため のカップリング剤については、米国特許５０５３５２０号（参照により本明細書 に全体を組み入れる）に記載されている。酵素を抗体に結合させるホモ二官能性 カップリング剤も、１９９２年４月３０日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７ ２６８号に記載のように、当業界で知られている。 「カップリング剤」とは、二官能性の架橋またはカップリング剤、すなわち２ 個の反応性の基もしくは「末端」（中間部分によって繋がれている場合もある） を有する分子を指す。反応性末端は、各種官能基であることができ、それには例 えば、ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性エステル、イミドエステル 、アルデヒド、エポキシド、スルホニルハライド、イソシアネート、イソチオシ アネートおよびニトロアリールハライドなどのアミノ反応性末端；ならびにピリ ジルジスルフィド、マレイミド類、チオフタルイミド類および活性ハロゲンなど のチオール反応性末端などがあるが、これらに限定されるものではない。ヘテロ 二官能性架橋試薬は、アミノ反応性末端とカルボキシル反応性末端などの２個の 異なった反応性末端を有するものであるが、ホモ二官能性試薬は各末端に同様の 反応性部分を有するものである。 本発明で使用される市販のヘテロ二官能性試薬には、ｍ−マレイミドベンゾイ ル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ）、スクシニミジル４−（ Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、 スクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）マレイ ミド−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤やそれらの誘導体を含むが、これらに 限定されるものではない。その様な誘導体には、４−（Ｎ−マレイミドメチル） シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシニミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）、 ｍ−マレイミドベンゾイルスルホコハク酸イミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）お よび４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スルホスクシニミジル（スルホ−ＳＭ ＰＢ）などのスルホスクシニミジル誘導体を含む。 他のヘテロ二官能性試薬には、Ｎ−スクシニミジルブロモアセテートおよびＮ −スクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾネート（ＳＩＡＢ）など の市販の活性ハロゲン−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤ならびにスルホスク シニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾネート（スルホ−ＳＩＡＢ）な どのスルホスクシニミジル誘導体などがある。 カップリング剤の別の群は、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルチオ）プ ロピオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性およびチオール開裂可能な薬剤 である。Ｎ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチンおよびＬ−シスチンジメチルエス テル・２塩酸塩などのチオール開裂可能な薬剤も使用可能である。 「デッドゾーン」とは、流体が蓄積するかあるいは流体の流動が投入口から前 方に移動して装置の検出部分へ進まない流路中の部分を指す。 「拡散」とは、対象物が周囲の流体分子の衝突によってランダムに運動するこ とを指す。拡散により、対象物の高濃度側から低濃度側への、対象物の正味の移 動が生じる。 「固定化試薬」とは、構造体表面に共有結合的または非共有結合的に付着した 試薬を指す。固定化試薬は、浸漬、ペンによる書き込み、毛細管もしくは試薬ジ ェット印刷その他の好適な付与法を用いる付与などの当業界で公知の各種方法に よって構造体表面に施すことができる。付与および付着の方法は、本発明におい て重要な点ではない。 一般に、固定化試薬は、構造体表面に共有結合的もしくは非共有結合的に付着 して「捕捉部位」を形成する特異的結合要素である。通常、固定化試薬を選択し て、分析物、標識試薬また はそれらの錯体を結合させる。好ましい実施態様においては、固定化試薬は分析 物に結合して、サンドイッチ錯体を形成する。固定化試薬を選択することで、分 析物を直接結合させるかあるいは分析物に結合した補助的特異的結合要素によっ て分析物を間接的に結合させることができる。固定化試薬は、好適な付着法によ って、アッセイ実施の前または実施中に構造体に固定化することができる。さら に、固定化試薬は流路を通過する分析物および／または標識試薬の移動を遅くす ることができる。固定化試薬はさらに、流体によって除去し得るような形で構造 体に付着するようにすることができる。さらに、捕捉部位は、例えば染料によっ て印を施して、捕捉部位に標識が固定化されていない場合であっても、構造体上 の捕捉部位の位置を肉眼的にまたは機器的に把握することができる。染料がアッ セイもしくはアッセイの構成要素を妨害しない限りにおいて、染料をその目的に 使用することができる。 固定化試薬は、単一捕捉部位であるいは複数の捕捉部位で提供することができ る。さらに、固定化試薬の形状を決定して各種形状を取らせることができる。す なわち、各種形態の検出もしくは測定を行うことができる。別法として、固定化 試薬を実 質的に均一な形で構造体のかなりの部分に分布させて、捕捉部位を形成すること ができる。捕捉部位での信号発生の程度は、被験サンプル中の分析物の量に関係 する。 「入口ポート」または「導入ポート」または「サンプル入口」は、同義語であ る。それらは被験サンプルが分析装置中に導入される部位を指す。その部位は、 装置の受容部分につながっている。装置の受容部分としては、チャンバ、毛管も しくは流路があり得る。 「標識試薬」とは、特異的結合要素に付着した検出可能な標識を有する物質を 指す。付着は共有結合的もしくは非共有結合的であるが、付着の方法は本発明の 重要な点ではない。標識試薬は、被験サンプル中の分析物の量に直接もしくは間 接に関係する検出可能信号を発生させるものである。標識試薬の特異的結合要素 成分を選択して、分析物に直接結合させるか、あるいは以下に詳述する補助的特 異的結合要素によって分析物に間接的に結合させることができる。さらに、標識 試薬は、固定化試薬に特異的に結合する特異的結合要素に付着した検出可能標識 を有することができる。標識試薬は被験装置中に組み入れることができ、被験サ ンプルと組み合わせて被験溶液を形成するこ とができ、被験サンプルとは別個に装置に負荷することができ、あるいは捕捉部 位で予め堆積させておくかまたは可逆的に固定化することができる。さらに、特 異的結合要素を、好適な付着法によって、アッセイ実施の前もしくはアッセイ中 に標識することができる。 「標識」もしくは「標識化」は、肉眼的または機器的手段によって検出可能な 信号を発生させることができる物質を指す。本発明での使用に好適な各種標識に は、化学的手段または物理的手段によって信号を出す標識などがある。そのよう な標識には、酵素および基質；色原体；触媒；蛍光化合物；化学発光化合物；放 射性標識；金、セレンなどのコロイド状非金属粒子、染色プラスチックもしくは 染色微生物などの染色もしくは着色粒子、着色もしくは着色可能な有機ポリマー ラテックス粒子、ならびにリポソームその他の直接肉眼で観察できる物質を含む 媒体等があり得る。コロイド状金属および染料粒子は、米国特許４３１３７３４ 号および同４３７３９３２号に開示されている。非金属性コロイド状物の製造お よび使用については、米国特許４９５４４５２号に開示されている。標識として 使用するための有機ポリマーラテックス粒子は、米国特許４２５２４５９号に開 示されている。 標識が、肉眼で検出可能な着色有機ポリマーラテックス粒子などのようにそれ 自体で検出可能な信号を発生させることができるか、または蛍光化合物のように 機器的に検出可能であるか、あるいは酵素／基質信号発生系などの１以上の別の 信号発生成分との併用で検出可能な限りにおいて、特定の標識の選択は、本発明 においては重要な点ではない。標識試薬の標識または特異的結合要素成分を変え ることで、各種の異なった標識試薬を生成することができる。さらに、選択を行 う場合、検出すべき分析物および所望の検出手段を考慮することは、当業者には 明らかである。 本明細書で使用の「反応混合物」とは、被験サンプルならびにその他の被験サ ンプル中の分析物検出のための生物的、化学的および物理的物質および試薬の混 合物である。反応混合物には、希釈剤および緩衝剤なども含まれ得る。 「信号発生成分」とは、別のアッセイ試薬または分析物と反応して分析物の存 在を示し、肉眼的手段または機器的手段によって検出可能な反応生成物もしくは 信号を発生させることができる物質を指す。本明細書で使用する「信号発生系」 とは、所望の反応生成物または信号を発生させるのに必要なアッセイ試 薬の群を指す。例えば、１以上の信号発生成分を標識と反応させて、検出可能な 信号を発生させることができる。例えば、標識が酵素の場合、その酵素を１以上 の基質または別の酵素および基質と反応させて検出可能な反応生成物を生成する ことで、検出可能信号の増幅を行うことができる。 「特異的結合要素」とは、化学的もしくは物理的手段によって、別の分子と特 異的に結合する部分を指す。抗原・抗体特異的結合要素に加えて、他にもビオチ ンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、補体のヌクレオチドアレイ、補体 のペプチドアレイ、エフェクターおよび受容体分子、酵素補因子および酵素、酵 素阻害薬および酵素、ペプチドアレイおよびアレイもしくは蛋白全体に特異的な 抗体、ポリマー酸および塩基、染料および蛋白結合剤、ペプチドおよび特異的蛋 白結合剤（例：リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ−蛋 白）などの特異的結合要素がある。ただし、これらに限定されるものではない。 さらに、特異的結合要素には、分析物類似体または組換え技術もしくは分子工学 によって形成される特異的結合要素などの元の特異的結合要素の類似体である分 子も含まれ得る。特異的結合要素が免疫反応物である場合、それには例 えば抗体、抗原、ハプテンもしくはそれらの錯体があり得て、抗体を使用する場 合には、それにはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、組換え蛋白もし くは抗体、キメラ抗体、それらの混合物もしくは断片、さらには抗体と他の特異 的結合要素の混合物であり得る。そのような抗体の製造およびそれの特異的結合 要素としての使用の好適さについての詳細は、当業者には公知である。 「構造体」とは、本発明の装置の基体層から生じる物理形状を指す。構造体の 表面は大きい表面積を与えるものである。構造体は、構造体表面にある捕捉部位 で十分な分析物捕捉を行えるようなパターンもしくはアレイで配置されている。 構造体には各種形状を用いることができる。例えば、三角形構造体を利用して、 分析物を捕捉することができる。さらに、同一装置中にいくつかの異なった形状 を併用することができる。すなわち、同一装置中で三角形構造体と菱形構造体を 用いて試薬を捕捉することができる。 「被験サンプル」とは、本発明を用いて検出する分析物を含むサンプルを指す 。被験サンプルは分析物以外にも他の成分を含有することができ、液体、生体液 もしくは液体中に可溶化することができる固体の物理的属性を有することができ 、例えば 流動する液流などのあらゆる大きさもしくは容量のものとすることができる。被 験サンプルには、他の物質が分析物もしくは分析物類似体を妨害しない限りにお いて、分析物以外の物質が含まれていてもよい。被験サンプルの例としては、血 清、血漿、食品、髄液、痰液、精液、羊水、尿、唾液、その他の体液、ならびに 地下水もしくは廃水、土壌抽出物および残留農薬などの環境サンプルなどがある が、これらに限定されるものではない。発明の説明 本発明の装置は、構造体のアレイを利用して、被験サンプル中の分析物を捕捉 するものである。構造体は列状に配置されて、流体輸送のためのほぼ均一な流路 を与え、また表面積を大きくするものである。分析物は、被験サンプル中に拡散 し、構造体表面に結合している特異的結合要素によって捕捉される。本発明の分 析装置は、シート、液浸棒、細片、キュベットなどとして利用することができる 。さらに、複数の分析物の存在もしくは量を１個の分析装置で求めることができ る。本発明は好ましくは、装置が毛管現象もしくは差圧に基づいて装置を流れる 流体の運動を駆動して、流体の測定、事象の計画的実施（staging）、試薬もし くは対象物（エンティティー）の捕捉、 反応時間、試薬の混合を制御したり、検出可能な信号を測定したりする装置およ び方法を提供するものである。流体が流れる経路を変えることによって、混合、 インキュベーション、反応および検出などの各種作業を行うことができる。１．本発明の装置の製造方法 本発明の分析装置は、装置中の構造体アレイに基づいて、分析物を捕捉するも のである。構造体は、材料のレーザー加工、型押し、リソグラフィー・ガルバノ フォルムンク・アブフォルムンク(Lithographie Galvanoformung Abformung、Ｌ ＩＧＡ)、電気メッキ、電鋳、フォトリソグラフィー、反応性イオンエッチング 、イオンビームフライス加工、圧縮成形、鋳造、反応射出成形、射出成形および 微細加工などの各種方法によって製造することができる。当然のことながら、本 発明の構造体の製造に利用される方法は、その方法で多量の均一な構造体および 装置が得られる限りにおいて、重要な点ではない。さらにその方法によって、構 造体の表面積が大きいものとなり、互いに近接して配置されて、狭い流路を形成 するものでなければならない。流路が狭いことで、分析物の流体中での拡散が起 こり、捕捉部位での分析物および／または標識試薬の捕捉効率が高くな る。一般的かつ好ましくは、分析装置中の構造体は装置の基体層と同じ材料で製 造する。 これらの方法はいずれも、原型を製造する技術から始まる。通常はツールをそ の原型から作り、それを用いて本発明の分析装置を大量生産するか、場合によっ ては本発明の分析装置として直接使用するだけの量で原型を製造することができ る。 大量生産される構造体は、好ましくはあらゆる数のポリマー材料から製造する 。それには、ポリプロピレンおよびポリエチレンなどのポリオレフィン；ポリエ チレンテレフタレートなどのポリエステル；ポリスチレン、スチレンアクリロニ トリルおよびアクリロニトリルブタンジエンスチレンなどのスチレン含有ポリマ ー；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリレートおよびポリアクリロニトリル などのアクリル酸ポリマー；ポリビニルクロライドおよびポリビニリデンクロラ イドなどの塩素含有ポリマー；アセタールホモポリマーおよびコポリマー；セル ロース性化合物およびそのエステル；硝酸セルロース；ポリビニリデンフルオラ イド、ポリテトラフルオロエチレンなどのフッ素含有ポリマー；ポリアミド；ポ リイミド；ポリエーテルエーテルケトン；ポリフェニレンスルフィドおよびポリ エーテル スルホンなどの硫黄含有ポリマー；ポリウレタン類；ポリジメチルシロキサンな どの珪素含有ポリマーなどがあるが、これらに限定されるものではない。さらに 構造体は、上記材料のコポリマー、混合物および／または積層物；アルミニウム ホイルなどの金属ホイル；金属被覆したフィルム；および上記材料上に金属を堆 積させたもの；ならびにガラスおよびセラミック材料から製造することができる 。 そのような方法の一つとして、エキシマレーザーなどのレーザーを利用してフ ォトマスクを照射して、フォトマスクを通過する光によって下の材料を研削する ことで、材料基板に流路を形成することができる（サーセルらの報告（Sercel， J.，et al.，SPIE Proceedings，Vol.998,（１９８８年９月）参照）。この方法 を利用して、原型を作製することができる。原型は装置として直接使用して大量 に製造することができるか、あるいは鋳型として用いて装置を大量に複製するた めに利用するツールを製作することができる。 装置を作製する別法はＬＩＧＡ法であり、ムンヒマイヤーらの報告（D.Munchm eyer et al.，Rev.Sci.Instrum.，63(1),1992）に記載されている。Ｘ線シンク ロトロン源を利用してフ ォトレジストに照射する。フォトレジストを現像すると原型が形成され、それを ニッケルで電気メッキして鋳型キャビティを形成することができる。次に、液体 ポリマーをニッケル鋳型中で型どりするかあるいは注入することができる。この 方法を用いて、直接分析装置を製造するかあるいは原型からツールを製作するこ とができる。 本発明の装置を製造する別の方法としては、フォトリソグラフィー、反応性イ オンエッチングおよびイオンビームフライス加工でフォトレジストその他の材料 に適切な構造体を決定する方法等の半導体製造法を利用するものである。その方 法を行って、装置を直接製造することができたり、あるいはその方法を行ってツ ールを作製し、それから多量の装置を製造することができる。 本発明の装置を製造するさらに別の方法は、装置を微細加工するというもので ある。微細加工には、微細ツールを利用してスチール、プラスチック、合成およ び非合成ポリマー、シリコンウェハ、ならびにその他の金属、セラミックスおよ びガラスなど（これらに限定されるものではないが）の材料に流路を刻む工程が 関与する。これらの方法を行って、装置を直接製造す ることができるか、あるいはその方法を行ってツールを作製し、そのツールから 大量の装置を作製することができる。 本発明の分析装置を大量生産するために作製されるツールは上記の方法から製 造することができる。ツールは、電気メッキなどの手段（これに限定されるもの ではないが）によって製造することができる。この方法により、ニッケルなどの 硬いツールを得て、原型を複製する。 ツールを作製したら、型押し、射出成形、反応射出成形、鋳造および圧縮成形 （これらに限定されるものではない）によって分析装置を大量生産することがで きる。型押しでは、加熱した耐久性ツールを加熱したポリマー基板に押しつける 。別法としては、低温のツールを加熱したポリマー基板に押しつけることができ る。射出成形は、溶融ポリマーを用いて鋳型キャビティ中に注入するものである 。反応射出成形では、液体樹脂を注入して、それが化学的プロセスによって固体 化するものである。鋳造は、低圧成形プロセスを用いる。圧縮成形は、加熱した ツールを用い、それによって装置の溶融および成形を行うものである。２本発明の装置の形状 一般に本発明の装置は、被験サンプルが最初に入る入口ポートを有するもので ある。一般に流路は毛管であり、被験サンプルを入口ポートから装置、捕捉部位 を提供する構造体アレイおよび装置中の気体を排気する排出口などのベント(ven t)を通過させる。さらに、チャンバおよび別の毛管を加えて、装置を特製のもの とすることができる。一般に、装置を通る被験サンプルの運動は、毛管力に基づ くものである。さらに、１以上の毛管を用いて、被験サンプルを入口ポートから 流路まで送ることができる。さらに、１以上の毛管を用いて、装置の構造体部分 から排出することができる。しかしながら、毛管力に代えて、あるいは毛管力と の併用で差圧を利用して、装置中で流体の流動を起こすことができる。 排出口に代えて、自己排気材料を利用して、装置中の気体を排気し、装置中へ の酸素取り込みを行うことができる。装置内で、酸素を反応（例：オキシダーゼ 反応）に利用することができる。自己排気材料および分析装置でのそれの利用に ついては、１９９３年１２月２９日出願の米国特許出願０８／１７４９７３号お よび同時係属中の１９９４年４月１８日出願 の米国特許出願０８／２２９２５６号（これらはいずれも参照により本明細書に 組み込まれる）に記載されている。 流路は、隣接する構造体間に形成され、流体がそこを通過して流れることがで きる。流路および構造体の設計はいずれも、構造体表面と流体分子との間の接触 を至適化する上で重要である。通常、流路の深さは約１μｍ〜約１ｍｍの範囲で ある。流路の平均幅は通常、約０．０２μｍ〜２０μｍの範囲である。構造体の 高さは通常、約１μｍ〜１ｍｍの範囲であり、平均幅は通常、１μｍ〜１ｍｍの 範囲である。デッドゾーンが低減されるか排除される限りにおいて、構造体アレ イをいかなる数でも選択することができる。構造体アレイの好ましい形状は、菱 形のアレイ、八角形のアレイ、六角形のアレイなどの一つのアレイで配置されて いるものである。好ましい構造体は、デッドゾーンを低減するものである。図１ 、２、３および４には構造体の好ましい形状を示してある。さらに、構造体の複 数の部分をひと続きに配置しても良い。そのひと続きのアレイを、毛管によって 互いにつなぐことができる。 本発明の装置で行われるアッセイは、構造体表面での捕捉を至適化するもので ある。本願に記載の方法を利用することによ って、捕捉部位の幾何的構造を緻密に制御して、捕捉の均一性および効率を向上 させる。流路が狭く深く、しかも構造体表面積が大きいと、分析物が拡散し、分 析物捕捉が向上する。流路設計を被験サンプル中の対象物の拡散に基づいて行っ て、構造体表面での固定化試薬と相互作用するようにする。通常は、対象物は流 路の断面にランダムに分配される。対象物は構造体表面に分配されて、そこで固 定化試薬と相互作用することができる。 固定化試薬は、構造体表面や毛管および／またはチャンバ中で共有結合的もし くは非共有結合的に付着することができる。試薬を徐放試薬、空間的に隔たった 試薬として施すか、あるいは表面にコーティングして乾燥させることができる。 そのような表面への固定化試薬付与法は当業者には公知である。 本発明の装置を利用する方法には、特異的結合要素が関与する。検出法では、 蛍光染料または着色粒子などの着色標識の結合を行うことができる。別法として 、検出において、着色生成物を生成することができる酵素の結合を行うことがで きる。 装置は毛管その他のチャンバに基づいて、流体の運動を制御することから、内 部チャンバの寸法の正確な制御が必須である。 本発明の装置は、凝集アッセイ、競争的アッセイ、非競争的アッセイおよびサン ドイッチアッセイにおいて、糖およびコレステロールなどの標準的臨床化学検査 アッセイで利用することができる。アッセイは、分離手段が不要な均一系であっ ても、あるいは分離段階を行う不均一系であってもよい。通常は、本発明の装置 で行われるアッセイは均一系である。 本発明の装置では、１以上の別の流路を使用することができる。被験サンプル を入口ポートから移動する毛管は異なった経路すなわち構造体への主要経路と別 途（alternate）経路に枝分かれしている。別途経路は、分岐点からある程度の 距離で主要経路に再度合流することができる。別途経路の流体抵抗が主要経路と ほぼ同等である場合、被験サンプルの流れは、装置のどちらの経路にも同等に進 む。別途経路が主要経路より実質的に高い流体抵抗を有する場合、別途経路での 流れの方が遅くなる。別途経路が主要経路より低い流体抵抗を有する場合、別途 経路での被験サンプルの流れの方が大きくなる。流れの断面積、表面張力、排気 (venting)および被験サンプルの粘度を変えることによって、流体抵抗を各経路 内で変化させることができる。これらのパラメータおよび距離によって、主要経 路への再合流 時間を決定することができる。別法として、各別途経路を、互いに独立の流速で 、それ自体の独立の構造体アレイに直接流れるようにすることができる。それに より、複数の捕捉部位が可能となり、単一の試験部位で複数の分析物の存在また は量を同時に測定することができる。 別途経路は、試薬と被験サンプルとを混合するための領域を設けることができ る。例えば、チャンバを試薬添加領域として使用することができる。１以上のチ ャンバを、別途経路および主要経路に設けることができる。 さらに、装置経路に捕獲装置を入れて、ある一定の大きさ以上の流体成分を除 去することができる。例えば、本発明の装置にセパレータを組み入れて、例えば 全血から血漿または血清を分離することができる。例えば、親水性の焼結多孔質 材料の基質の表面に、赤血球凝集剤を塗布することができる。基質は、装置にお いて、構造体の前方に設けることになると考えられる。全血サンプル中の赤血球 は基質の隙間に捕獲され、実質的に赤血球を含まない血清または血漿が基質を通 過して、毛管現象によって装置の構造体部分に移動する。米国特許４９３３０９ ２号が本願に、参照により全文組み込まれる。 本発明の装置の利点は、該装置によって、極微量の被験サンプルで分析物の存 在または量を調べることができるという点である。例えば、全血サンプルからの 極微量の血清または血漿を用いて、分析物を検査することができる。 検出対象分析物を含む被験サンプルは、入手源から得られたままで直接使用さ れる流体であることができるか、あるいは各種方法で前処理して、その特性を変 えることができる。次に被験サンプルを、装置の受容部分に連絡する入口ポート から装置中に導入する。装置の受容部分はチャンバまたは毛管である。次に、被 験サンプルは毛管を介して移動する。被験サンプルは毛管中、構造体前方のチャ ンバまたは構造体表面で１以上の試薬と接触し得る。試薬には、検出可能な信号 が発生し得る系を関与させることができる。 液体の被験サンプルを用いて、被験サンプルが毛管現象または差圧によって妥 当な流速を持つようにすることができる。毛管現象または差圧が被験サンプル輸 送の駆動力であることは理解しておくべき点である。毛管現象は、（１）気体、 流体が流れる表面および流体の表面エネルギー、（２）毛管流路の寸法および（ ３）排気効率という３つの重要な因子によって決まる。 毛管流と差圧流のいずれの場合の流速も、毛管またはチャンバの幾何形状および 流体の粘度によって影響される。流速はさらに、差圧の増減によっても影響され 得る。差圧付与の方法には、手動、モーター、ポンプ、減圧などによるものがあ るが、これらに限定されるものではない。 被験サンプルの粘度が高すぎる場合、それを希釈して、妥当な流動時間を得る ことができる毛管流速を得て、アッセイの時間を制御することができる。 被験サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、眼球レンズ液、脳髄液、膿汁、汗 、滲出液、尿、母乳などの生体液等（これらに限定されるものではない）の入手 源から得ることができる。被験サンプルには、抽出、添加、分離、希釈、濃縮、 濾過、蒸留、透析など（これらに限定されるものではない）の前処理を行うこと ができる。生体液以外に、他の液体被験サンプルを用いることができ、対象成分 は液体あるいは液体媒体に溶解もしくは懸濁させた固体とすることができる。 使用される被験サンプル媒体は天然媒体であることができるか、あるいは被験 サンプルを液体媒体中に導入して、毛管現象および検出可能信号に必要な所望の 特性を与えることができる。 添加剤および溶媒を被験サンプル媒体に加えて、酸素化、安定性および流動性を 増減することができる。 検出方法としては、色、光吸収もしくは光透過の変化、ｐＨ、導電率、蛍光、 物理相の変化などがあるが、これらに限定されるものではない。 被験サンプルが検出系の検出可能成分を提供することができるか、あるいはそ のような成分を加えることができる。その成分は、検出系の性質に応じてかなり 変動する。そのような検出方法の一つでは粒子を利用し、その粒子が光を散乱す るかあるいは流速変化を起こすものである。粒子には、細胞、液体系とは混和性 のないポリマー粒子、ラテックス粒子、活性炭粒子、金属粒子、多糖類もしくは 蛋白粒子、セラミック粒子、核酸粒子、凝集粒子などがあり得るが、これらに限 定されるものではない。粒子の選択は、検出方法、分散の分散性もしくは安定性 、不活性性、流動変化への関与（participation）などによって決まる。 捕捉部位での特異的結合要素への分析物の結合は、装置における被験サンプル の圧力をモニタリングすることによって適宜検出することができる。例えば、流 路を出入りする被験サンプ ルに接続した圧力検出器によって、流路での流れの制限を起こす分析物によって 起こる圧低下を検出することができる。 別の検出法には、ハイブリッド形成アッセイなどがある。構造体表面をポリヌ クレオチドプローブなどの固定化試薬でコーティングすることができる。補体で ある分析物ポリヌクレオチドの固定化ポリヌクレオチドプローブへの結合につい ては、蛍光標識プローブなどの標識プローブを加えて、分析物ポリヌクレオチド に結合させることができる。蛍光の量は、被験サンプル中の分析物量に正比例す る。別法としては、ハイブリッド形成アッセイを、ポリヌクレオチドを検出可能 標識に接合させる競争的形態で行うことができる。ポリヌクレオチド標識試薬は 、固定化ポリヌクレオチドへの結合に関して、分析物と競合する。 捕捉部位での分析物の特異的結合要素との反応は、凝集によって検出すること ができる。例えば、捕捉部位で分析物または分析物／特異的結合要素錯体に結合 することができる蛍光もしくはルミネセンス標識分子を用いて、被験サンプル中 の分析物の存在または量を検出することができる。例えば、捕捉部位での血球の 凝集を、被験サンプルの血液型についての陽性検査として役立てることができる 。構造体表面の固定化試薬が凝集を 誘発することで、血液型についての陽性検査を行う。 本発明の装置で、ルミネセンスを検出することができる。例えば、ルミネセン ス発光は、マイクロプレート読取装置を用いて容易に検出することができる。分 析物は、分析物に結合し得る２つの抗体を有する特異的結合要素によって検出す ることができ、その場合１個の抗体をフルオレセインで標識して発光させ、第２ の抗体をローダミンで標識して光を吸収させることができる。ローダミン標識抗 体およびフルオレセイン標識抗体のそれぞれが分析物に結合する場合、フルオレ セインの消光を観察して、分析物の存在を示すことができる。別の例としては、 フルオレセイン抗体を捕捉部位に固定するものである。次に、分析物およびロー ダミン標識抗体を捕捉部位に搬送し、フルオレセインの消光を観察して、分析物 の存在を示す。 さらに別の検出系では、化学的検出を行うことができる。例えば、グルコース 測定は、媒体の吸収または反射率の変化とグルコース濃度とを関連づけるもので ある。グルコース測定のある通常の方法は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ Ｐ）およびジクロロヒドロキシベンゼンスルホネート（ＤＣＨＢＳ）とともにグ ルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダ ーゼ（ＰＯＤ）とを用いて、尿または血清中のグルコース濃度を測定するもので ある。全ての試薬をゼラチンなどの水で膨潤し得る基質中に入れ、構造体上に堆 積させる。構造体表面には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの透明 薄膜を積層する。通常は血清または尿である被験サンプルを入口ポートに投入す る。被験サンプルに接触すると、構造体上に堆積したゼラチンが膨潤して、グル コースと反応する試薬を放出する。グルコースと反応すると、吸光度、反射率ま たは肉眼観察によって測定できる可溶性の赤色染料が生成する。 別法として、ＰＯＤまたはＧＯＤを構造体上に固定化することができ、４−Ａ ＡＰおよびＤＣＨＢＳを被験サンプルとともに導入して、反応を開始することが できる。 場合によっては、グルコース、コレステロールまたは類似の分析物についての アッセイで、着色形成試薬を固定化するのが簡便である。その場合、バラスト（ ballast）基すなわち長鎖アルキル基を染料分子のある部分に付加させて、可溶 性を低下させることができる。バラスト基を組み込むことによって可溶性を低下 させた染料分子の例は、サートル（Thirtle）の論文（the Principles and Chem istry of Color Photography, Thirtle，J.R．in the Theory of the Photographic Process, 4th Edition.，T .H.James,Ed.，MacMillian Publishing Co., Inc,，New York.，1977，pp.369-3 72；参照により本明細書に組み込む）に記載されている。バラスト化ＤＣＨＢＳ の類似体を、構造体のある局所的領域のみで着色形成を起こすことができる構造 体上に直接コーティングすることも考えられる。 検出はさらに、酵素を用いて行うこともできる。固定化試薬は、分析物に特異 的に結合する。標識化試薬は、分析物に対する特異的結合要素に接合した酵素を 有する。酵素に対する基質を加えることで、酵素と基質の間に酵素反応が起こる 。検出・測定される酵素の量は、被験サンプル中に存在する分析物の量に相関し 得る。例えば、診断アッセイ、特に特異的結合アッセイ方式の場合の酵素検出試 薬としては、アルカリ性ホスファターゼが一般に使用される。別法としては、標 識試薬が、酵素と固定化試薬に特異的に結合する特異的結合要素を有するように することができる。酵素に対する基質を加えることで、酵素と基質との間に酵素 反応を起こす。検出・測定される酵素の量は、被験サンプルに存在する分析物の 量に相関し得る。 対象分析物は、アッセイの目的および被験サンプルの入手源 に応じてかなり多様である。分析物には、蛋白、ペプチド、アミノ酸、炭水化物 、ホルモン、ステロイド、ビタミン、脂質、核酸、微量元素、治療目的で投与さ れるドラッグおよび不正な目的で投与されるドラッグを含む薬剤、細菌、ウィル スおよび代謝物があり得る。分子の凝集も対象となり得るものであり、特にはウ イロイド、ウィルス、単細胞生物などの原核細胞および真核細胞、リンパ球など の哺乳動物細胞、上皮細胞、腫瘍などの天然の凝集の場合である。さらに、天然 の結合分子（例：抗体結合受容体）の存在する物質または結合分子を製造するこ とができる物質であれば分析物となり得る。従って、抗原性物質、ハプテン、抗 体、それらの組み合わせなども分析物となる。 特定の目的で、他の添加物を加えることもできる。特定のｐＨを維持するには 、緩衝剤が望ましい場合がある。酵素阻害剤も加えることもできる。他の対象試 薬としては、抗体、酵素、抗原、ペプチド、ビオチン／アビジン、保存剤、安定 剤、活性化剤、酵素基質および補因子、酸化剤、還元剤などがあるが、これらに 限定されるものではない。当然のことながら、添加する添加剤もしくは試薬は、 アッセイ成績を妨害するものであってはならない。 さらに、対照手段を用いて、アッセイ結果を検証することができる。ある対照 手段では、ほぼ自動的に、分析物検出アッセイと同時に行われる確認アッセイを 含むものである。特定の実施態様では、分析物を含む被験サンプルを所定量の標 識試薬と接触させて、分析物／標識試薬錯体を含む混合物を形成する。得られた 混合物を毛管現象によって装置を通して移動させる。第１の手順では、混合物は 固定化した抗分析物特異的結合要素を有する捕捉部位と接触し、特異的結合要素 が分析物／標識試薬錯体と結合する。この捕捉部位は被験サンプル捕捉部位であ る。第２の手順では、混合物は最初に陽性対照試薬を含む試薬領域と接触する。 陽性対照試薬は、被験サンプル分析物と同じ標識試薬に対する結合特異性を有す る移動性の特異的結合要素である。陽性対照試薬は、被験サンプルのものと同一 の分析物であるか、あるいは相当する分析物類似体であることができる。混合物 が陽性対照試薬領域と接触すると、陽性対照試薬が再生され、未結合の標識試薬 と特異的に結合して陽性対照試薬／標識試薬錯体を形成する。この錯体は、陽性 対照捕捉部位に移動する。陽性対照捕捉部位には、第１の手順と同じ固定化抗分 析物特異的結合要素が含まれている。従って、陽性対照捕捉部位 は、検出可能な固定化錯体を形成することができる。陽性対照捕捉部位での検出 可能信号により、アッセイ試薬が機能性を有し、試験結果が妥当であることが確 認される。例えば、被験サンプル中に分析物が存在しない場合には、陽性対照捕 捉部位に検出可能な信号があり、被験サンプル部位に検出可能信号がない場合に 、被験サンプルが陰性であるという結果が、妥当な試験結果であると確認される 。被験サンプル中に分析物が存在する場合には、陽性対照捕捉部位に検出可能信 号があり、被験サンプル捕捉部位に検出可能信号がある場合に、患者サンプルが 陽性であるという結果が、妥当な試験結果であると確認される。陽性対照捕捉部 位自体に検出可能信号がない場合は、標識系の試薬が分解したか、あるいは被験 サンプル中の他の因子が陽性対照試薬に対する標識試薬の結合あるいは陽性対照 捕捉部位にある固定化特異的結合要素に対する標識陽性対照錯体の結合を妨害し たことを示している。 本発明の装置にはさらに、別の対照機構および／または領域を組み込んで、例 えばアッセイ終了を指示することもできる。これらの他の対照機構は当業者には 公知である。 装置は、試薬の添加、濾過などに使用することができる各種 領域や、毛管現象および差圧によって別個に流体の流れを駆動する別個の領域を 有することができる。 本発明の分析装置を利用するアッセイの種類は数多くある。サンドイッチアッ セイでは、抗原に対する親和性を有する特異的結合要素を有する標識試薬を固定 化特異的結合要素／分析物錯体に結合させる。信号応答は、分析物濃度に正比例 する。 競争アッセイでは、分析物と標識試薬との間に競争を起こさせる。信号応答は 、分析物濃度に反比例する。 本発明の装置は、キュベットの形で製造することもできる。構造体は、透明窓 を有し捕捉部位での捕捉を機器で検出できるような容器内に設けることができる 。キュベットを分光光度計内に設置して、読みとることができる。例えば、本発 明の装置の表面部にピルチャー・ハミルトン・フィルム（Pilcher Hamilton Fil m; Pilcher Hamilton Corporation，Greer，S.C.,29651）の最上層を設けること で、キュベットを構成することができる。入口ポートは最上層に設けることがで きるか、あるいは装置の一部のままにしておくことができる。両面粘着テープ（ 3M Corp.，St.Paul，MN.，55144）を、最上層表面に付着させた。被験サンプル を入口ポート内に入れることができ、捕 捉部位で捕捉が起こる。 本発明の装置は、アッセイ細片の形態で製造することもでき、アッセイ細片の 一端を、分析物を含む被験サンプル液と接触させる。被験サンプルは毛管現象に よって装置を通過して移動し、構造体での分析物の捕捉が起こる。そのような装 置は液浸棒の形で製造することもできる。本明細書に、参照により、米国特許５ ２００３１７号の全文が組み込まれる。 本発明の装置は、１個の分析装置で、複数の分析物を調べることもできる。構 造体の異なった領域および／または独立の領域を設けて、それぞれに対して、個 々の分析物および／または標識試薬に結合するそれら領域に施してある異なった 分析物に対して特異的な固定化試薬を持たせることができる。構造体の独立の領 域はひと続きに配置することができるか、あるいは複数経路で配置することがで きる。機器をプログラムして、各種領域を独立に読みとることができる。そのよ うな１例としては、構造体のある領域に抗ベンゾイルエコグニン抗体を固定化し 、構造体の別の領域には、抗カンナビノイドを固定化し、構造体の別の領域には 抗アンフェタミン抗体を固定化した乱用薬物アッセイがある。これら３薬剤のい ずれかもしくは全ての代謝物 および／または分子を含む被験サンプルは、それらの個々の領域に結合する。陽 性および陰性の検出は、肉眼的および／または機器的に行うことができる。異な った分析物について調べる構造体の各領域には、その分析物用に特異的試薬を固 定化することができる。３．拡散による対象物捕捉のための流路設計 以下に、分析物捕捉のための構造体を利用する本発明の装置における捕捉効率 を概算するのに必要な式をまとめてある。これらの式は、流路の任意の断面の幾 何形状に適用するよう一般化したものである。これらの式は、非常の多様な流路 設計に対応したものではなければならない。これらの式は一般的な設計に適用さ れることから、捕捉効率についての数値的な予測を直接提供するものではない。 その代わり、流路の断面形状を最初に決め、相当する流体速度分布Ｕ（ｙ，ｚ） を標準的な方法を用いて予め計算しなければならない。次に、それら２つの値を 式に代入することで、捕捉効率についての固有の数値的近似値を誘導し、流路長 さ（Ｌ）、対象物径（ｄ）および壁面の反応係数（ｋ）などのパラメータと相関 させることができる。数値結果を容易に求めることができる流路断面の例として は、矩形 形状および円形形状の２つがある。しかしながら、評価できる断面形状の種類に 関しては制限はない。 これらの式によって示唆される分析上の仮定を、以下に全て記載してある。こ れらは、式が妥当である流路設計および流動条件の範囲を規定するものである。 計算についての主な仮定 １．定常状態流体条件 流体（対象物を含有するもの）が流路を完全に満たし、流体速度が経時変化 しない。 ２．非圧縮性層流 この仮定は、検討される全種類の液体および流速値に適用可能である。 ３．希釈対象物濃度レベル（５容量％未満） これは、対象物の存在とは独立に流体の速度分布についての解を求めること ができるもので、流体の移動時に対象物間に考慮すべき相互作用が起こらないこ とを保証するものである。 ４．流路断面形状および寸法は、流路長さ全体にわたって一定である（これに より、捕捉領域での流体通過の収束や発散が除外される）。 これは、全ての流体は専ら流路の方向に流れ、長さ方向に速度変化がないこ とを示唆するものである。 一般式（３次元） Ｃ＝Ｃ（ｘ，ｙ、ｚ）＝局所対象物濃度レベルとした場合、流体の対流効果お よび拡散効果による流路内での懸濁対象物の定常状態輸送は、下記式の通りであ る。 正規化空間座標および流路内での正規化流体速度は、下記式の通りである。 流路壁に接触する対象物の結合速度式は以下の通りである。 流路に進入し、流路を出る対象物の流速は以下の通りである。 対象物捕捉効率値は以下の通りである。 流路長さ方向での捕捉された対象物の局所密度は以下の通りである。 記号の定義 Ｃ：流路内で懸濁した対象物の局所濃度レベル＝ｆ（ｘ，ｙ，ｚ） ｘ：流路流動方向（流路壁に平行）の空間座標 ｙ，ｚ：流路流動方向に直交する空間座標 Ｌ：流路長さ ｄ：対象物径 Ｄ：流体内での対象物の拡散係数 ｋ：流路壁での対象物の結合反応係数 φ：流路分散パラメータ Ｕx：流路流体速度プロファイル＝ｆ（ｙ，ｚ） ｎy：流体方向に向かう流路壁上の単位法線ベクトル（ベクトルのｙ成分） ｎz：流体方向に向かう流路壁上の単位法線ベクトル（ベクトルのｚ成分） ε：流路の対象物捕捉効率値 ρ（ｘ）：流路長さ方向の捕捉対象物の局所密度（対象物／単位長さ） Ｎin：流路に入る対象物の総量 拡散による対象物捕捉を最大とするための装置設計のガイドラインは、流路幅 および流速を最小とし、構造体の捕捉表面積を最大とすることである。特定の構 造体設計を行うことで、流体のデッドゾーンを低減することができる。それによ り、構造体表面の固定化試薬を流体の流れに対して曝露することができる。 さらに、本発明の装置は、容量測定的な流体流速制御の側面を持つ。他の毛管 駆動式の装置では、流体が装置を通過するに 連れて流速の経時的低下を示し、その結果捕捉効率の経時変化が生じる。本発明 では、毛管寸法の低下、断面積の変化または湿潤性変化を考慮して、装置におけ る総サンプル流速を経時的に安定した状態とすることができる。本発明の装置に おける容量測定的な流速制御により、捕捉効率を制御することができる。 本発明を利用するアッセイを、以下の実施例において説明する。これら実施例 は本発明の実施の態様たるべきものであり、本発明は、これら実施例に限定され るものではない。これら実施例において、構造体は装置の幅方向に列状に配置さ れている。実施例２〜５では、被験サンプル中の分析物についての陽性結果によ り、捕捉部位において、装置の幅で肉眼観察できる棒線が生じる。 実施例１ 構造体を抗β−ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）（Abbott Laboratories ，Abbott Park，IL.，60064）の２ｍｇ／ｍＬ溶液０．５μＬでコーティングし 、３７℃で９０分間インキュベーションする。次に、構造体を１ｍｇ／ｍＬのウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（Ｍ ＯＰＳ）（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO., 63178）緩衝液溶液（ｐＨ７．０）で上塗りし、少なくとも４時間インキュベー ションする。次に構造体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、未結 合蛋白を除去する。 ポリスチレン構造体の最上部に、裏面が粘着性のビステックス（Vistex）コー ティングしたポリカーボネート薄層を積層する。 ｈＴＳＨ校正物質５０μＬのサンプルを、セージ・インスツルーメント・シリ ンジ・ポンプ（Sage Instruments Syringe Pump，Cole-Parmer Instruments，Ch icago，IL.，60648）駆動の２５０μＬのハミルトン注射器（Hamilton Co.，Ren o，NV., 89502）にて、流速０．５５μＬ／分で装置の入口ポートに注入する。 サンプルは、微粒子表面に接合した抗α−ｈＴＳＨ（Abbott Laboratories）を 有する溶液（Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.，97402）中、直径２８２ｎ ｍの橙赤色蛍光微粒子とともに予備混合する。 混合物には、０．１％の微粒子溶液１部、ＩＭｘ（登録商標）希釈液（Abbott Laboratories，Abbott Park，IL）２部およびｈＴＳＨ校正物質６部（５０μＬ ＝６部）を含有させる。アッセイは約５分間行う。 ４８５ｎｍ励起フィルター、５０５ｎｍ二色フィルターおよび５６０ｎｍ発光 フィルターを通して像形成した２ｍｍスリットビームを用いる反射率計を用いて 装置を分析する。微粒子は最大励起波長５０５ｎｍを持ち、５６０ｎｍで最大蛍 光を有する。１００ポイント／ｍｍのサンプリング速度で全長１５ｍｍにわたっ て部分の走査を行う。構造体に結合した抗β−ｈＴＳＨ抗体による微粒子捕捉は 、サンプル中のｈＴＳＨ濃度に正比例する。 実施例２ 黒色のポリピロール粒子を、Ｂ型肝炎表面抗原に対するポリクローナルヤギ抗 体（抗ＨＢｓＡｇ）でコーティングする。コーティングしたポリピロール粒子を 、装置の構造体前方のチャンバ表面に塗布する。構造体表面には、マウスモノク ローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体を固定化する。マウスモノクローナル抗体は、ポリク ローナルヤギ抗体とは異なった表面抗原エピトープに対して反応性である。 ＨＢｓＡｇを含有する被験サンプルを、チャンバにつながった装置の入口ポー トに加える。被験サンプルを、コーティングしたポリピロール粒子と混合するこ とで、被験サンプルの ＨＢｓＡｇが抗ＨＢｓＡｇをコーティングした粒子に特異的に結合する。毛管現 象により、抗原−抗体粒子錯体がチャンバから構造体アレイに移動する。抗原− 抗体粒子錯体は、被験サンプルＨＢｓＡｇの量に比例して捕捉部位に蓄積する。 黒色棒線（バー）形成を肉眼で調べて、被験サンプル中のＨＢｓＡｇの存在を示 す。 実施例３ 黒色のポリピロール粒子を、組換えＨＢｓＡｇ抗原でコーティングする。コー ティングしたポリピロール粒子を、装置の構造体前方のチャンバ表面に塗布する 。構造体には、異なった組換えＨＢｓＡｇ抗原がコーティングしてある。抗ＨＢ ｓＡｇ抗体を含む被験サンプルを、チャンバにつながった装置入口ポートに加え る。被験サンプルを、コーティングしたポリピロール粒子と混合することで、被 験サンプルの抗ＨＢｓＡｇ抗体が組換えＨＢｓＡｇをコーティングした粒子に特 異的に結合する。毛管現象により、抗原−抗体粒子錯体がチャンバから構造体ア レイに移動する。ポリピロール粒子は、被験サンプル抗ＨＢｓＡｇ抗体の量に比 例して捕捉部位に蓄積する。黒色棒線形成によって、被験サンプル中の抗ＨＢｓ Ａｇ抗体の存在を決定する。 実施例４ 黒色ポリピロール粒子を、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のいずれにも共通のｐ ４１組換えＨＩＶ抗原でコーティングする。コーティングしたポリピロール粒子 を、装置の構造体前方のチャンバ表面に塗布する。構造体には、ＨＩＶ−１ウィ ルスとＨＩＶ−２ウィルスの両方からの組換えｐ４１抗原とｐ２４抗原をコーテ ィングする。 抗ＨＩＶ抗体を含有する被験サンプルを、チャンバにつながった装置入口ポー トに加える。被験サンプルを、コーティングしたポリピロール粒子と混合するこ とで、粒子にコーティングされた組換えＨＩＶ抗原に特異的な被験サンプルの抗 ＨＩＶ抗体が結合する。毛管現象により、抗体−抗原粒子錯体がチャンバから構 造体アレイに移動する。 ポリピロール粒子は、被験サンプルの抗ＨＩＶ抗体の量に比例して捕捉部位に 蓄積する。黒色棒線形成の肉眼検査によって、被験サンプル中の抗ＨＩＶ抗体の 存在を示す。 実施例５ 黒色ポリピロール粒子を、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通のＨＩＶ抗原 に特異的なモノクローナル抗体混合物でコー ティングする。構造体は、ＨＩＶ−１ウィルスとＨＩＶ−２ウィルスの両方に共 通のＨＩＶ抗原に特異的なモノクローナル抗体の混合物でコーティングする。 ＨＩＶ−１ウィルスとＨＩＶ−２ウィルスの両方に共通のＨＩＶ抗原を含有す る被験サンプルを、装置入口ポートに加えて、被験サンプルを毛管現象によって 構造体アレイのところまで移動させる。被験サンプル中のＨＩＶ−１ウィルスと ＨＩＶ−２ウィルスの両方に共通のＨＩＶ抗原は、構造体表面にコーティングさ れたモノクローナル抗体に特異的に結合する。コーティングしたポリピロール粒 子のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を入口ポートに加え、毛管現象によっ て構造体のところまで移動させ、そこで、ポリピロール粒子は捕捉部位で捕捉さ れたＨＩＶ抗原に特異的に結合する。 ポリピロール粒子は、被験サンプルのＨＩＶ抗原の量に比例して捕捉部位で蓄 積する。黒色棒線の形成を肉眼で調べることで、被験サンプル中のＨＩＶ抗原の 存在を示す。 実施例６ ポリヌクレオチドを蛍光（フルオレセイン）標識粒子に付着させる。コーティ ングした蛍光粒子を、装置の構造体の前方に あるチャンバの表面に塗布する。構造体にも、対象ヌクレオチドに対して補体と なるポリヌクレオチドをコーティングする。 被験サンプル中に存在するか、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もし くはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を介して増幅しておいた対象のヌクレオチドア レイを含有する被験サンプルを、装置入口ポートに加え、そこで被験サンプルは チャンバに移動する。被験サンプルをポリヌクレオチドコーティングした蛍光粒 子と混合することで、被験サンプルの対象ヌクレオチドは補体ポリヌクレオチド 蛍光標識粒子に結合する。毛管現象によって、ヌクレオチド−補体ポリヌクレオ チド−蛍光粒子錯体はチャンバから構造体アレイに移動する。 錯体は、被験サンプルの対象ヌクレオチドの量に比例して、捕捉部位で補体ポ リヌクレオチドに結合する。 実施例７ ポリアニオン性材料を、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通のＨＩＶ抗原に 特異的なモノクローナル抗ＨＩＶ抗体の混合物に加える。ポリアニオン性材料を 、装置の構造体の前方にあるチャンバ表面に施す。構造体を、ポリグルタミン酸 などのカチオン性溶液で処理する。 ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通のＨＩＶ抗原を含有する被験サンプルを 装置入口ポートに加え、そこで被験サンプルは毛管現象によってチャンバに移動 する。被験サンプルを、ポリアニオン性材料に結合した抗体と混合することで、 ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通の被験サンプルのＨＩＶ抗原は抗体に特異 的に結合する。毛管現象により、ＨＩＶ抗原−抗ＨＩＶ抗体−ポリアニオン錯体 がチャンバから構造体アレイに移動する。 ポリアニオン性材料は、構造体表面のカチオン性材料によって捕捉される。Ｈ ＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通のＨＩＶ抗原に対して特異性を有する抗ＨＩ Ｖ抗体に結合した蛍光（フルオレセイン）標識粒子を、装置入口ポートに加える 。毛管現象によって、抗ＨＩＶ抗体に結合した標識粒子が、装置の構造体まで移 動して、捕捉部位で捕捉されたＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共通のＨＩＶ抗 原に結合する。 抗ＨＩＶ抗体に結合した蛍光標識粒子は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方に共 通の被験サンプルのＨＩＶ抗原の量に比例して捕捉部位に蓄積する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ローリー，マイケル・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、ワイ ルドウツド、ロイヤル・オーク・レーン・ 33720、ナンバー・201 (72)発明者 オースタ，ギヤリー・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、アツシユウツド・レーン・5377 (72)発明者 ルーミス，ニール・ダブリユ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・63403、 レシーン、サウス・ウイスコンシン・アベ ニユー・1730 (72)発明者 シヤイン，エリツク・ビー アメリカ合衆国、イリノイ・60022、グレ ンコー、グローブ・ストリート・459 (72)発明者 シアフイラ，トーマス・ジー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53104、 ブリストル、ワンハンドレツドセブンス・ ストリート・21616

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 被験サンプル中の分析物の存在もしくは量を決定する分析装置であって、 共有結合的もしくは非共有結合的に付着した固定化試薬を提供する表面を有し 、該固定化試薬が、分析物、分析物類似体、補助結合要素および標識試薬からな る群から選択されるものに結合することができる構造体アレイと 前記分析物、分析物類似体、補助結合要素または標識試薬を含有する前記被験 サンプルが通って流れ、該分析物、分析物類似体、補助結合要素または標識試薬 が幅全体に拡散し、前記固定化試薬に結合する複数の流路と、 を併せ持つ分析装置。 ２． 前記分析物が、抗原、ヌクレオチドアレイ、レクチンまたはアビジンから なる群から選択され、前記固定化試薬が抗体、補体ヌクレオチドアレイ、炭水化 物またはビオチンから成る群から選択される請求項１に記載の分析装置。 ３． 前記構造体が、コポリマー、混合物、積層物、金属被覆ホイル、金属被覆 薄膜、あるいはポリオレフィン、ポリエステ ル、スチレン含有ポリマー、ポリカーボネート、アクリル酸ポリマー、塩素含有 ポリマー、アセタールホモポリマーおよびコポリマー、セルロース性化合物およ びそのエステル、硝酸セルロース、フッ素含有ポリマー、ポリアミド、ポリイミ ド、ポリエーテルエーテルケトン、硫黄含有ポリマー、ポリウレタン類、珪素含 有ポリマー、ガラスおよびセラミック材料からなる群から選択される材料に金属 を堆積したものから製造されたものである請求項１に記載の分析装置。 ４． 前記構造体が類似の形状を持ち、該形状が、菱形、六角形、八角形、矩形 、正方形、円形、半円形、三角形およびエリプス（elipses）からなる群から選 択される請求項１に記載の分析装置。 ５． 前記構造体アレイが、被験サンプル流方向に対してジグザグに並んでいる 請求項４に記載の分析装置。 ６． 赤血球凝集剤で処理したセパレータをさらに有する請求項１に記載の分析 装置。 ７． 前記構造体アレイが、複数の固定化試薬を有して、前記被験サンプル中の 複数の分析物について調べるものである請求項１に記載の分析装置。 ８． サンプル添加用のチャンバをさらに有し、該チャンバが複数の経路を有し 、該経路のそれぞれが構造体アレイにつながっており、該経路は前記被験サンプ ルを前記チャンバから前記構造体アレイまで輸送するものである請求項１に記載 の分析装置。 ９． 被験サンプル中の分析物の存在もしくは量を決定する分析装置であって、 入口ポートおよびベント； 構造体アレイ（表面が、共有結合的もしくは非共有結合的に該構造体の該表面 に付着した固定化試薬を提供するものであり、分析物、分析物類似体および補助 結合要素からなる群から選択されるものを結合することができる構造体アレイと 、 前記分析物、分析物類似体または補助結合要素を含有する前記被験サンプルが 通って流れ、該分析物、分析物類似体または補助結合要素が幅全体に拡散し、前 記固定化試薬に結合する複数の流路と、 前記固定化試薬で信号を発生させることができる検出可能標識に接合した特異 的結合要素を有してなる標識試薬と、 を併せ持つ分析装置。 １０． 被験サンプル中の分析物の存在または量を求める方法であって、 入口ポート、ベント、複数の流路および構造体アレイを有する分析装置であっ て、前記各構造体は該構造体の少なくとも一つの表面に、分析物、分析物類似体 、補助結合要素および標識試薬からなる群から選択されるものを結合することが できる固定化試薬を有する分析装置を用意し、 前記被験サンプルを前記入口ポートに加え、前記複数の流路が前記被験サンプ ルを前記入口ポートから前記構造体アレイに移動させ； 前記被験サンプルを前記流路に進入させ、前記分析物を前記流路の幅全体に拡 散させ、そこで前記固定化試薬を前記分析物に結合させ、 検出可能標識に接合した特異的結合要素を有する分析物検出系によって前記分 析物を検出し、該検出可能標識は前記捕捉部位で信号を発生させることができ、 前記検出によって前記被験サンプル中に存在する前記分析物の存在もしくは量を 測定する方法。 １１． 被験サンプル中の分析物の存在または量を求める方法 であって、 被験サンプル入口ポート、ベントおよび複数の流路を有する構造体アレイを有 する分析装置であって、前記構造体の前記表面に、ポリアニオン性材料を結合さ せることができるポリカチオン性材料が固定化されており、該ポリアニオン性材 料は分析物特異的結合要素に結合している分析装置を用意し、 前記ポリアニオン性材料と前記被験サンプルとを混合することで、前記特異的 結合要素前記分析物に結合させ、該混合物を前記構造体アレイまで移動させ、 前記ポリカチオン性材料に固定化した前記被験サンプル中の分析物の存在また は量を検出する方法。 １２． 原型から分析装置を製造する方法であって、前記原型が構造体アレイを 有し、該アレイ間には１以上の流路があり、該方法がレーザー処理、ＬＩＧＡ、 微細加工、フォトリソグラフィー、反応性イオンエッチング、イオンビームフラ イス加工、型押し、電鋳、電気メッキ、射出成形、圧縮成形、鋳造または反応射 出成形からなる群から選択されるものである方法。
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