CN114317411A - 一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法，具体培养方法包括：使用微流控细胞芯片分析仪进行细胞培养、试验，具体步骤包括：步骤一，芯片预处理；步骤二，细胞接种；步骤三，细胞培养；在完成细胞培养后，将培养成功的细胞用于后续药物评价性检测，具体步骤包括：步骤一：检测准备；步骤二：检测LDH浓度；步骤三：活性检测；并且还可以使用活死细胞染色、免疫荧光检测以及炎症细胞因子检测，通过实施上述步骤操作，精确调控细胞生长区域的温度和气体成分，摆脱了外置培养箱，实现显微镜下对细胞的长期持续观察，微流控细胞模型能够更好的模拟人体微环境，进行药物评价效果更为精准。

Description

一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测 毒性评价方法

技术领域：

本发明涉及细胞培养及药物毒性检测评价领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法。

背景技术

现有的体外毒理学评价模型预测能力较差，这在很大程度上阻碍了医药研发的进程，建立和发展可靠的体外毒理学评价替代模型可以有效提升评价数据的准确性，但现有的要通过包括动物实验、体外实验等一系列毒理学评价手段来确定其药效及安全性或其评价数据，现有技术还没有建立仿人体环境人肾小球内皮细胞模型相关研究，导致临床前模型的缺乏和其较差的预测能力导致了大量药物在临床试验中的失败和开发新药的成本上升，可靠的体外毒理学评价替代模型并且仿人体环境进行培养是医药研发领域面临的迫切需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法，所述培养方法包括：

步骤一，芯片预处理

将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用；

所述步骤一中微流控细胞芯片上设置有进液孔1-6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1-8内灌注PBS缓冲液，之后将1-8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液300-350ul，密封后室温静置30-40min，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗，之后放置备用；

步骤二，细胞接种

将所述微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入人肾小球内皮细胞溶液10-15ul，浓度为1-5x10⁶cells/ml；

将1号孔中加入含血清的培养基350ul；

向微流控细胞芯片施以0.25psi,8秒的加压条件，完成细胞向培养室的注入工作。

步骤三，细胞培养

以37℃、5％CO₂气体浓度的条件对步骤二完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，此时1号孔向培养基通过重力自然持续灌流，细胞进行贴壁培养24h后备用。

进一步的，所述步骤二中向6号孔内加入的人肾小球内皮细胞溶液浓度为2x10⁶cells/ml。

进一步的，所述步骤二中人肾小球内皮细胞溶液的加入量为15ul。

一种使用微流控芯片培育的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，该评价方法包括下列步骤：

步骤A：检测准备，将1号、2号孔中液体吸干，在2号孔中加入受试物350ul进行干预，将2号孔进样压力设定为0.5-1psi，以37℃、5％CO₂气体浓度的条件下持续培养48h后进行毒性指标检测；

步骤B：检测LDH浓度，将步骤一中获得的细胞培养液进行收集，将细胞培养液置于LDH试剂盒，检测LDH浓度，记录检测结果；

步骤C：活性检测，加入CCK-8检测工作液，以3psi、37℃、5％CO₂气体浓度的条件进行孵育1-6h，将产物转入细胞培养板中，将细胞培养板置于酶标仪待检，酶标仪吸光度设定为450nm，检测，记录检测结果；

进一步的，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行离心处理。

进一步的，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行过滤处理。

进一步的，所述步骤C中检测孵育时间为4h。

进一步的，该评价方法还包括：活死细胞染色，将步骤A中细胞加入活死细胞染料，调节微流控芯片压力为2-3psi，染色30min后进行荧光观察，记录观察结果；

进一步的，该评价方法还包括：免疫荧光染色，将步骤A中细胞加入4％甲醛固定细胞，封闭后加一抗和二抗孵育后进行荧光观察，记录观察结果。

进一步的，所述一抗浓度为1:50。

优点效果

本发明利用微流控细胞芯片分析仪培养人肾小球内皮细胞，通过微培养控制器精确调控细胞生长区域的温度和气体成分，摆脱了外置培养箱的限制，实现了显微镜下对细胞的长期持续观察。区别于传统的体内外药物毒性评价模型，微流控细胞模型能够更好的模拟人体微环境，进行药物评价效果更为精准。

附图说明

图1为本发明的培养人肾小球内皮细胞的培养效果图；

图2为本发明实施例1使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测得到的数据条形图；

图3为本发明的实施例1经LDH漏出检测得到的数据条形图；

图4为本发明的实施例1经活死细胞染色检测观察后的得到的细胞染色图；

图5为本发明的实施例1经免疫荧光染色检测观察后的得到的细胞染色图；

图6为本发明的实施例1经炎症细胞因子检测得到的数据条形图；

图7为本发明的对比例5使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测得到的数据条形图；

图8为本发明的对比例5经LDH漏出检测得到的数据条形图；

图9为本发明的对比例5经活死细胞染色检测观察后的得到的细胞染色图；

图10为本发明的对比例5经免疫荧光染色检测观察后的得到的细胞染色图；

图11为本发明的对比例5经炎症细胞因子检测得到的数据条形图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。

本发明涉及一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养及其药物检测毒性评价方法，具体培养方法包括：

步骤一，芯片预处理

将微流控细胞芯片上设置的进液孔1-6列和排液孔7列以及8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1-8内灌注PBS缓冲液，之后将1-8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液300-350ul，密封后室温静置30-40min，使微流控芯片内部压力平衡，调整的适宜pH便于后续细胞培养完成，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗和灭菌处理，并准备胶垫，清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用，经过该步骤预处理的微流控芯片将用于后续的人肾小球内皮细胞的接种、培养以及观察等试验步骤。

步骤二，细胞接种

将步骤一中经过预处理的微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入浓度为1-5x10⁶cells/ml人肾小球内皮细胞溶液10-15ul，优选的，6号孔内加入浓度为2x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液15ul，使用该浓度以及体积的人肾小球内皮细胞溶液从6号孔上样可以使各孔细胞分布均匀，细胞密度适宜，有利于后续细胞生长和药物干预评价操作以及观察，如果细胞密度过大会容易在进样时造成管路堵塞，并且细胞会以成团的状态进入培养孔，即使没有堵塞管路，也会在进入培养室后细胞培养完成后出现细胞聚堆情况，导致细胞分布不均；而细胞溶液密度过小则会容易造成微流控细胞芯片第6列各孔中细胞密度不足，后续培养过程中，培养室内培养完成的人肾小球内皮细胞密度小，造成之后要毒性评价的试验难以观察清楚，或实验数据接近导致不准确。

同时向1号孔中加入含血清的培养基350ul，作为人肾小球内皮细胞生长和培养的基础物质，在向6号孔和1号孔分别加入细胞溶液和培养基后，使用微流控细胞芯片分析仪设定操作程序，选择细胞加样，向微流控细胞芯片施以0.25psi压力,加压8秒后，完成细胞向培养室的注入工作，准备开始对人肾小球内皮细胞进行培养步骤。

步骤三，细胞培养

使用微流控细胞芯片分析仪的微培养控制器可以精确调控细胞生长区域的温度和气体成分，使细胞培养时保持37℃的培养温度以及5％CO₂气体浓度的条件，对上一步骤中已经完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，在进行细胞培养的同时，此时微流控细胞芯片的1号孔向培养基通过重力自然保持持续灌流状态，为细胞培养保持养分供给，在细胞进行贴壁培养24h后备用，并且从开始培养人肾小球内皮细胞，在不同时间观察细胞生长状态。

如图1所示的观察结果，细胞能够正常贴壁生长，并随着培养时间的增加，可以观察到，人肾小球内皮细胞能够正常增殖形成肾小球内皮细胞层，培养成功后，使用成功培育完成人肾小球内皮细胞进行后续的要毒性评价试验。

区别于传统的细胞培养方式，使用微流控细胞芯片培养的人肾小球内皮细胞在用于药毒性评价的实验中，其药毒性评价的试验结果数据更趋向于理论数值，并且不会像使用传统96孔板培养的人肾小球内皮细胞做免疫荧光检测试验时出现细胞脱落的现象。

将上述步骤中培育成功的人肾小球内皮细胞进行药物肾毒性评价方法包括下列步骤：

步骤A，检测准备

将已经完成并且培养人肾小球内皮细胞成功的微流控细胞芯片的1号和2号孔中液体吸干，并且在2号孔中加入受试物350ul进行干预，具体的，受试物可以是大黄素或橙黄决明素，优选的，受试物在加入前先进行离心或过滤处理，药物选择离心处理则采用12000rpm状态下离心8-10min的离心条件；选择过滤处理则将药物用0.45μm过滤膜进行过滤，离心或过滤处理后药物状态不会发生改变，依然保持是澄清透明的液态，但过滤后，可以避免堵塞芯片管路，将2号孔进样压力设定为0.5-1psi，保持37℃的培养温度，在5％CO₂气体浓度的条件下持续培养48h后进行毒性指标检测，具体的，可以使用0.8psi的压力，在此压力值下，可以刚好满足48小时持续培养过程中培养液的需要量，本申请中以使用大黄素为例进行试验。

步骤B：检测LDH浓度

将上述步骤A中获得的人肾小球内皮细胞的培养液进行收集，将细胞培养液按照LDH试剂盒说明书方法检测LDH浓度，记录检测结果，检测LDH浓度可用于观察受试物对细胞的损伤程度，LDH表达水平越高，则表示受试物对细胞的损伤程度越高。

步骤C，活性检测

进行细胞活性检测，具体的，使用CCK-8试剂盒完成细胞活性检测工作，然后相应的，配制CCK8工作液加入3号孔，保持3psi的压力状态，在37℃的温度以及5％CO₂气体浓度的条件进行孵育1-4h，优选的，加入工作液后孵育时间为4h，此时细胞培养液吸收值在最佳线性范围内，之后将完成上述实验操作的细胞培养液转入细胞培养板中，将细胞培养板置于酶标仪待检，酶标仪吸光度设定为450nm进行检测并记录检测结果，CCK-8是由MTT衍生出来的一种方法，它可以被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

还可以使用活死细胞染色进行细胞活性评价，具体的，对步骤A中获得的人肾小球内皮细胞进行活死细胞染色，通过微流控平台控制压力和时间条件，微流控芯片压力设为2-3psi，染色30min，然后使用荧光显微镜观察，记录观察结果，通过该步骤，可以区分活死细胞数量，判断细胞损伤程度。

也可以使用免疫荧光染色进行细胞活性评价，免疫荧光染色是通过对紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光染色，然后观察细胞紧密连接情况和ZO-1表达变化，使用荧光显微镜观察拍照，并对试验结果进行观察，具体的，将上述步骤A中获得的人肾小球内皮细胞采用4％甲醛固定，封闭后加一抗和二抗孵育后进行荧光观察，此处加入的一抗浓度稀释比例为1：50，此时荧光染色效果最佳，可以清楚对实验结果进行观察，但实际上，免疫荧光染色时说明书推荐的一抗浓度稀释比例为1：100至1:1000(采用1％BSA溶液按体积比对一抗溶液进行稀释)，但在实际操作中，在微流控芯片上使用说明书推荐的稀释比例范围内未观察到理想的zo-1蛋白荧光。

另外还可以通过炎症细胞因子检测操作，检测细胞损伤状态，具体的，将上述步骤A活性检测中获得的细胞培养液进行收集，使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞培养液，检测如IL-6等炎症细胞因子的表达情况，可以分析工作液对细胞的损伤程度，本文中所指的微流控芯片可以是LNEYA生产的或Mesobiosystem生产的，也可以是密理博生产的MO4S-03哺乳动物细胞类微流控培养芯片(板)。

区别于传统的体内外药物毒性评价模型，经过微流控平台在微流控细胞芯片内培养建立的人肾小球内皮细胞模型能够更好的模拟人体微环境，使后续进行的药物评价试验效果更为精准，同时在这个过程中，始终可以使用显微镜对微流控细胞芯片的培养室内进行持续观察，方便对试验过程中细胞的变化进行记录。

实施例1

本实施例中具体实施步骤如下

步骤一，芯片预处理：将微流控细胞芯片的进液孔1-6列和排液孔7列、8列的孔内保湿液吸出，并向孔1-8内灌注PBS缓冲液，之后将1-8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液325ul，密封后室温静置35min，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗和灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用；

步骤二，细胞接种：将微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入浓度为2x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液15ul，同时向1号孔中加入含血清的培养基350ul，然后向微流控细胞芯片施以0.25psi的压力加压8秒，完成细胞向培养室的注入工作。

步骤三，细胞培养

以37℃、5％CO₂气体浓度的条件对步骤二完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，此时1号孔向培养基通过重力自然持续灌流，细胞进行贴壁培养24h后准备用于后续药物肾毒性评价检测。

步骤A：检测准备

完成细胞培养的微流控芯片，分别将1号、2号孔中液体吸干，在微流控芯片的2号孔中分别加入浓度为0、50、100和200μM的受试物350ul进行干预，且受试物经过12000rpm状态下离心处理9min，将2号孔进样压力设定为0.8psi，以37℃、5％CO₂气体浓度的条件下持续培养48h后进行毒性指标检测；

步骤B：检测LDH浓度，收集步骤A中的细胞培养液，将细胞培养液采用LDH试剂盒检测LDH浓度，观察药物对细胞的损伤程度。

步骤C：活性检测，采用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测，将CCK8工作液加入3号孔，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育4h，之后将产物转入96孔板中，将细胞培养板置于酶标仪待检，酶标仪吸光度设定为450nm，并记录检测结果。

活死细胞染色检测操作，对步骤A中获得的人肾小球内皮细胞进行活死细胞染色调节微流控的压力条件进行荧光观察，根据观察细胞活力，判断细胞损伤程度。

免疫荧光染色检测操作，检测细胞损伤状态，将步骤A中获得的人肾小球内皮细胞采用4％甲醛固定，封闭后加一抗和二抗孵育后进行荧光观察其中一抗浓度稀释比例为1:50，观察细胞紧密连接情况和ZO-1表达变化，然后使用荧光显微镜观察拍照，对试验结果进行观察。

炎症细胞因子检测操作，检测细胞损伤状态，具体的，将活性检测中获得的细胞培养液进行收集，使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞培养液，检测如IL-6等炎症细胞因子的表达情况，可以分析出药物对细胞的损伤程度。

实施例2

本实施例中，与实施例1不一样的是

步骤一，芯片与处理中，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液300ul，密封后室温静置40min；

步骤二，细胞接种中，向6号孔内加入浓度为1x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液14ul；

步骤A，检测准备中，受试物经过12000rpm状态下离心处理8min，且将2号孔进样压力设定为0.5psi；

步骤B，活性检测中，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育1h。

实施例3

本实施例中，与实施例1不一样的是

步骤一，芯片与处理中，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液350ul，密封后室温静置30min；

步骤二，细胞接种中，向6号孔内加入浓度为5x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液10ul；

步骤A，检测准备中，受试物经过12000rpm状态下离心处理10min，且将2号孔进样压力设定为1psi；

步骤B，活性检测中，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育4h。

实施例4

本实施例中，与实施例1不一样的是

步骤一，芯片与处理中，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液335ul，密封后室温静置25min；

步骤二，细胞接种中，向6号孔内加入浓度为2.5x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液12ul；

步骤A，检测准备中，将受试物用0.45μm过滤膜进行过滤处理，且将2号孔进样压力设定为0.7psi；

步骤B，活性检测中，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育3h。

对比例1

本对比例中，与实施例1不一样的是

步骤一，芯片预处理中，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液200ul，密封后室温静置50min；

步骤二，细胞接种中，向6号孔内加入浓度为7x10⁶cells/ml的人肾小球内皮细胞溶液7ul；

步骤A，检测准备中，将2号孔进样压力设定为1.5psi；

步骤B，活性检测中，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育8h。

对比例2

本对比例中，与实施例1不一样的是

步骤B，活性检测中，受试物没有经过离心或过滤处理。

对比例3

本对比例中，与实施例1不一样的是

步骤B，活性检测中，设定压力3psi，温度为37℃，在5％CO₂气体浓度的条件进行孵育8h。

对比例4

本对比例中，与实施例1不一样的是

使用免疫荧光检测细胞损伤状态时，ZO-1一抗浓度为1:500的常规染色浓度进行染色。

对比例5

本对比例使用常规96孔板培养的人肾小球内皮细胞，然后以实施例1中相同的药毒性评价方法对本对比例中培养的细胞做试验，但与实施例1不一样的是：本对比例中，步骤A：检测准备是细胞正常贴壁培养一天后，分别加入浓度为0、12.5、25、50和100μM的受试物200ul进行干预。

完成实验后，经过拍照观察以及记录，得到如下试验结果：

实施例1试验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，且人肾小球内皮细胞在微流控芯片的培养室内分布均匀，细胞贴壁生长效果明显。

检测结果：

1.CCK-8试剂盒检测，在使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值时，反应的活性细胞数量结果与实验初期预想相符，并且在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据基本保持相同，实验效果理想。

如图2所示，经多次实验取平均值后得到的试验结果的条形图，结果表明基于微流控培养的人肾小球细胞模型体系能够在初步评价大黄素的肾毒性作用时，完全可以起到初步评价的作用。

2.LDH漏出检测，在使用LDH漏出检测并在检测后统计相同浓度药物影响的细胞在测定细胞受损程度时，反应细胞受损程度的结果与实验初期预想相符，并且所检测的结果能够保持稳定，不会出现起伏的特别状况，试验效果理想并且稳定。

如图3所示，经多次实验取平均值后得到的试验结果的条形图，结果表明细胞经过大黄素干预后，LDH表达水平随着药物浓度增加而呈现增加趋势，根据条形图所显示的趋势，LDH表达水平效果呈阶梯状，试验效果理想。

3.活死细胞染色检测，在使用活死细胞染色检测细胞活性时，通过荧光显微镜观察，可以明显看到在不同浓度下活细胞表现的强绿色荧光，并且随着药物浓度的提升，细胞的绿色荧光表现显著变化，变得微弱，试验结果与实验初期预想相符，并且在无药物浓度下，观察细胞的荧光表现可以明显看出细胞分布均匀，非常有利于本检测方法的实施和准确性判断，并且在多次观察使用相同浓度的微流控芯片后，可以发现其表现性状基本保持一致，培养以及检测试验效果理想并且能够保持稳定。

如图4所示，可以区分活死细胞数量，判断出细胞损伤程度，随着受试物浓度的增大，细胞凋亡程度随之增加。

4.免疫荧光检测，在使用免疫荧光染色检测细胞活性时，使用荧光显微镜进行观察，可以清楚看到细胞分布均匀，有利于观察免疫荧光染色后的细胞表达状态，并且可明显看出随着药物浓度增加，细胞数量变少，并且紧密连接蛋白ZO-1的表达降低明显，可以在显微镜内明显看出细胞之间的连接被破坏，变的松弛，并且在多次观察使用相同浓度的微流控芯片后，可以发现其表现性状基本保持一致，培养以及检测试验效果理想并且能够保持稳定。

如图5所示，可以观察到细胞紧密连接情况和ZO-1表达变化，随着大黄素剂量的逐渐升高，内皮细胞数量逐渐减少，紧密连接蛋白ZO-1的表达呈下降趋势，细胞之间的连接被破坏，变得松弛。

5.炎症细胞因子检测，在使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞损伤程度时，在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据基本保持相同，实验效果理想。

如图6所示，结果表明，细胞经较低剂量的大黄素能够诱导细胞产生细胞因子IL-6，而高剂量的大黄素对细胞具有强烈的毒性作用可杀伤细胞而不诱导其活化，因此释放的细胞因子IL-6明显减少。

实施例2实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，但细胞分布不够均匀，细胞整体密度相对较低。

检测结果：

1.CCK-8试剂盒检测，在使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值时，反应的活性细胞数量结果与实验初期预想相符，在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据会存在有相差较大的情况，因为细胞分布不均匀，存在每次选择观察的位置细胞数量相差比较大的问题，导致实验效果不是最理想状态。

2.LDH漏出检测，在使用LDH漏出检测并在检测后统计相同浓度药物影响的细胞在测定细胞受损程度时，反应细胞受损程度的结果与实验初期预想相符，但是所检测的结果稳定性不足，会出现相同浓度药物下LDH表达值起伏较大的状况，试验效果不是最理想并且不够稳定。

3.活死细胞染色检测，在使用活死细胞染色检测细胞活性时，通过荧光显微镜观察，可以明显看到在不同浓度下活细胞表现的强绿色荧光，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度不足。

4.免疫荧光检测，在使用免疫荧光染色检测细胞活性时，使用荧光显微镜进行观察，可以清楚看到细胞分布均匀，有利于观察免疫荧光染色后的细胞表达状态，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度不足，试验表现的效果不是最理想状态。

5.炎症细胞因子检测，在使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞损伤程度时，在进行多次实验测定后，不同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据差值与试验结果推算值相比有存在差距，实验效果不够理想。

实施例3实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，但细胞分布不够均匀，细胞有部分聚堆情况

检测结果：

1.CCK-8试剂盒检测，在使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值时，反应的活性细胞数量结果与实验初期预想相符，在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据会存在有相差较大的情况，因为细胞分布不均匀，存在每次选择观察的位置细胞数量相差比较大的问题，导致实验效果不是最理想状态。

2.LDH漏出检测，在使用LDH漏出检测并在检测后统计相同浓度药物影响的细胞在测定细胞受损程度时，反应细胞受损程度的结果与实验初期预想相符，但是所检测的结果稳定性不足，会出现相同浓度药物下LDH表达值起伏的大状况，试验效果不是最理想并且不够稳定。

3.活死细胞染色检测，在使用活死细胞染色检测细胞活性时，通过荧光显微镜观察，可以明显看到在不同浓度下活细胞表现的强绿色荧光，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度不足。

4.免疫荧光检测，在使用免疫荧光染色检测细胞活性时，使用荧光显微镜进行观察，可以清楚看到细胞分布均匀，有利于观察免疫荧光染色后的细胞表达状态，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度不足，试验表现的效果不是最理想状态。

5.炎症细胞因子检测，在使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞损伤程度时，在进行多次实验测定后，不同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据差值与试验结果推算值相比有存在差距，实验效果不够理想。

实施例4实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，但细胞分布不够均匀

检测结果：

1.CCK-8试剂盒检测，在使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值时，反应的活性细胞数量结果与实验初期预想相符，在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据相差较小，但是存在个别微流控芯片培养的细胞因为分布不均匀的原因，活性状态与理想值存在差距，与实施例1相比不是最理想状态。

2.LDH漏出检测，在使用LDH漏出检测并在检测后统计相同浓度药物影响的细胞在测定细胞受损程度时，反应细胞受损程度的结果与实验初期预想相符，并且所检测的结果能够保持稳定，不会出现起伏的特别状况，试验效果与实施例1相比差距不明显。

3.活死细胞染色检测，在使用活死细胞染色检测细胞活性时，通过荧光显微镜观察，可以明显看到在不同浓度下活细胞表现的强绿色荧光，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度相比实施例1有差距。

4.免疫荧光检测，在使用免疫荧光染色检测细胞活性时，使用荧光显微镜进行观察，可以清楚看到细胞分布均匀，有利于观察免疫荧光染色后的细胞表达状态，因为细胞分布不均匀，细胞数量不稳定，不同浓度药物下，细胞株群表现的强绿色荧光相差区别的明显度不足，细胞株群表现的荧光效果相差区别的明显度相比实施例1有差距。

5.炎症细胞因子检测，在使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞损伤程度时，在进行多次实验测定后，相同浓度药物影响的细胞在测定细胞活性时最终得到的试验数据基本保持相同，实验效果理想。

对比例1实验结果

细胞培养成功，但细胞贴壁程度低，培养效果不理想，并且很不均匀，培养出的细胞无法用于后续检测工作。

对比例2实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，且培养人肾小球内皮细胞在微流控芯片的培养室内分布均匀，细胞贴壁成长效果明显。

检测结果：后续各个检测方法的试验结果与未注入药物试验表现相同，经后续检查发现在注入药物时堵塞芯片管路，无法进行后续检测。

对比例3实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，且培养人肾小球内皮细胞在微流控芯片的培养室内分布均匀，细胞贴壁成长效果明显。

检测结果：使用CCK-8试剂盒进行细胞活性的检测效果不理想，细胞培养液OD值超出检测的正常范围，无法进行细胞活性的判断。

对比例4实验结果

细胞培养结果：细胞培养成功，且培养人肾小球内皮细胞在微流控芯片的培养室内分布均匀，细胞贴壁成长效果明显。

检测结果：在荧光显微镜下未观察到zo-1蛋白的荧光染色结果。

对比例5实验结果

检测结果：

1.CCK-8试剂盒检测，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光值。

如图7所示，经多次实验取平均值后得到的试验结果的条形图，由图可以看到，使用常规96孔培养的细胞在大黄素浓度到达12.5μM时细胞活性就已经开始明显下降，在浓度至50μM时细胞活性就已经降低至50％以下，而采用微流控芯片培养细胞时，大黄素浓度在50μM时细胞活性降低幅度很小，且在多次实验后发现，细胞活性的检测结果的变化幅度较小，由于微流控芯片培养细胞的过程更接近实际的细胞在人体中代谢的过程，所以其检测的数据结果也更接近理论值，相较于常规96孔板细胞培养方式，微流控细胞模型对药物毒性评价更可靠。

2.LDH漏出检测

如图8所示，经多次实验取平均值后得到的试验结果的条形图，结果表明细胞经过大黄素干预后，LDH表达水平在没有加入大黄素的情况下就已经有明显的表达，并且表达数值与微流控细胞芯片培养的细胞在50μM浓度大黄素的状态下表达的水平基本持平，而在50μM浓度大黄素干预时，其表达数值是同浓度微流控细胞芯片表达数值的4倍左右，且常规使用96孔板的检测数值偏差较大，而微流控的检测数值在多次实验后结果变化小，结果数值表达更为清晰可靠；常规使用96孔板培养的细胞，培养环境处于静止状态，细胞代谢产物以及死亡破损细胞无法排出培养皿，从而造成检测结果值有可能较实际值偏大，试验效果不理想。

3.活死细胞染色检测，在使用活死细胞染色检测细胞活性时，通过荧光显微镜观察。

如图9所示，在两种方式培养的细胞均没有大黄素进行干预的情况下，可以看到常规96孔培养的细胞粘连明显，而微流控芯片培养的细胞，可以看到明显的独立细胞以及细胞株群，被染色的细胞也表现的更明显，利于观察，并且通过不同大黄素浓度下干预的细胞检测试验可以看到，细胞凋亡程度微流控芯片培养低于96孔板培养方式。

4.免疫荧光检测，在使用免疫荧光染色检测细胞活性时，使用荧光显微镜进行观察。

如图10所示，在图中无法观察到免疫荧光染色后的细胞表达状态，并且紧密连接蛋白ZO-1的表达也无法看到，原因是因为肾小球细胞经过大黄素干预后贴壁松弛，96孔板培养方式进行免疫荧光染色实验，细胞脱落严重，无法进行后续评价试验观察，最终该细胞活性检测实验失败。

5.炎症细胞因子检测，使用炎症细胞因子酶联免疫试剂盒检测细胞损伤程度，进行多次实验测定。

具体的，如图11所示，相同的大黄素浓度干预下，96孔板培养方式下50μM大黄素就对细胞产生强烈的毒性作用杀伤细胞而不诱导其活化，因此释放的细胞因子IL-6明显减少，而微流控芯片培养方式下，100μM大黄素作用下才开始有IL-6减少趋势，且多次实验后结果无明显差别，结果数值表达可靠性更强；这也与使用96孔板的培养环境在培养细胞时处于静止状态，无法将细胞代谢产物以及死亡破损细胞排出培养皿，从而造成96孔板培养的细胞所反应的药物毒性效果比微流控芯片培养的细胞更大，导致检测试验效果不理想。

显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：

步骤一，芯片预处理

将微流控细胞芯片、芯片盖板进行灭菌处理，并准备胶垫清洁灭菌超静干燥后置于微流控细胞芯片备用；

所述步骤一中微流控细胞芯片上设置有进液孔1-6列，排液孔7列、8列，将孔内保湿液吸出，并向孔1-8内灌注PBS缓冲液，之后将1-8号孔内的PBS缓冲液吸弃，再次将1-6号孔内加入PBS缓冲液300-350ul，密封后室温静置30-40min，最后将微流控细胞芯片和芯片盖板盖合后对微流控细胞芯片进行冲洗，之后放置备用；

步骤二，细胞接种

将所述微流控细胞芯片的6号孔中液体排空，之后向6号孔内加入人肾小球内皮细胞溶液10-15ul，浓度为1-5x10⁶cells/ml；

将1号孔中加入含血清的培养基350ul；

向微流控细胞芯片施以0.25psi,8秒的加压条件，完成细胞向培养室的注入工作。

步骤三，细胞培养

以37℃、5％CO₂气体浓度的条件对步骤二完成细胞注入工作的微流控细胞芯片进行培养，此时1号孔向培养基通过重力自然持续灌流，细胞进行贴壁培养24h后备用。

2.根据权利要求1中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤二中向6号孔内加入的人肾小球内皮细胞溶液浓度为2x10⁶cells/ml。

3.根据权利要求1中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤二中人肾小球内皮细胞溶液的加入量为15ul。

4.一种使用权利要求1-3中培育的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，该评价方法包括下列步骤：

步骤A：检测准备，将1号、2号孔中液体吸干，在2号孔中加入受试物350ul进行干预，将2号孔进样压力设定为0.5-1psi，以37℃、5％CO₂气体浓度的条件下持续培养48h后进行毒性指标检测；

步骤B：检测LDH浓度，将步骤一中获得的细胞培养液进行收集，将细胞培养液置于LDH试剂盒，检测LDH浓度，记录检测结果；

步骤C：活性检测，加入CCK-8检测工作液，以3psi、37℃、5％CO₂气体浓度的条件进行孵育1-4h，将产物转入细胞培养板中，将细胞培养板置于酶标仪待检，酶标仪吸光度设定为450nm，检测，记录检测结果。

5.根据权利要求4中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行离心处理。

6.根据权利要求4中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，所述步骤A中受试物在加入2号孔前进行过滤处理。

7.根据权利要求4中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，所述步骤C中检测孵育时间为4h。

8.根据权利要求4中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，该药物肾毒性评价方法还包括：活死细胞染色，将步骤A中细胞加入活死细胞染料，调节微流控芯片压力为2-3psi，染色30min后进行荧光观察，记录观察结果。

9.根据权利要求4中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，该药物肾毒性评价方法还包括：免疫荧光染色，将步骤A中细胞加入4％甲醛固定细胞，封闭后加一抗和二抗孵育后进行荧光观察，记录观察结果。

10.根据权利要求9中所述的基于微流控芯片的人肾小球内皮细胞药物检测毒性评价方法，其特征在于，所述一抗浓度为1:50。

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