CN118006452A - 一种高通量分型检测的离心式数字pcr芯片及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，储液池采用弧形槽结构，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道、微滴生成池和油相收集池，微滴生成池的侧面设有。本发明通过多个相互独立且密封的引物室存放不同引物，实现样本与多种不同引物的自动分配混合。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片及其使用方法，属于微流控芯片技术领域。
背景技术
数字PCR（dPCR）是一种新兴的核酸检测技术,继承了 PCR 和荧光定量 PCR（qPCR）的优点,并开创了新的发展方向。dPCR 最独特之处在于,它可以在无需标准曲线的情况下,对核酸样本实现绝对定量分析，尤其适用于微量DNA检测与定量，从而实现高灵敏度检测。
尽管 dPCR 是基于微管或者微孔板开发的, 但随着微流体技术的成熟,dPCR 技术也有了很大提升。目前,根据稀释方法的不同，dPCR 平台主要分为两类，分别是微滴数字PCR（ddPCR）和微阵列芯片式数字 PCR（cdPCR）。ddPCR 是利用两种不互溶的流体，分别作为连续相（油）和分散相（水）反应，在两种流体的表面张力及剪切力的联合作用下，使分散相变成 μL 级的微小体积存在于连续相内，形成“油包水”的液滴 。cdPCR 则是通过设计芯片，在芯片上分割有上万个相同体积的微孔方阵，在试验时可以将 μL 的液体封闭在高通量的微池中,再在独立的微反应单元中进行后续的 PCR 扩增。
将数字PCR与微流控技术相结合的微滴式数字PCR技术，是近年来迅速发展起来的一种突破性的检测和定量核酸的技术。其中，液滴微流控技术是在微尺度下利用连续相的流体剪切力来破坏离散相的表面张力，将离散相分割成纳升级甚至皮升级液滴。基于流体剪切力生成液滴的方法包括T型通道法和流动聚焦法等。但上述方法中液滴尺寸和液滴生成过程高度依赖于毛细管数、两相流速、粘度比和通道几何形状，提高了系统控制的难度，且由于各个生成液滴结构的尺寸和流速误差，生成的液滴尺寸差异很大，影响样品的等量分配以及最终的精度和灵敏度。而阶梯乳化(Step emulsification)法则简化了流体控制，只需控制单一分散相的流动。阶梯乳化装置通常由分散相通道、连续相储液器和液滴生成喷嘴三部分组成，其喷嘴高度与储液池高度有明显差别。阶梯乳化生成液滴由界面张力驱动，液滴大小主要由通道尺寸决定。相比于T形通道法或流动聚焦法，阶梯乳化法对流速或压力波动不敏感，且易于实现多通道并行，可以有效节省芯片空间，并提高样品检测通量。
离心式微流控芯片又称微流控芯片实验室或者芯片实验室，作为众多微流控驱动手段之一，是一种以在微米尺度的空间中对流体进行操控为主要特色的技术。通过设计微流控通道、混合反应器，将各部件微型化，并引入离心力的驱动方式，解决了经典微流控芯片在阀控、流体分裂、分离、液滴形成和孵育中存在的泵和混合问题。
目前，临床上对于高通量样本检测具有较广泛的需求，在感染性疾病的快速准确诊断方面，传统的微生物培养技术通常耗时较长，且往往需要昂贵的设备和专业的技术人员，对检测环境要求高，而高通量分型检测技术可以快速、准确地检测出病原体，在短时间内提供更准确的结果，有助于医生及时制定治疗方案，这对于感染性疾病的早期诊断和治疗至关重要。
同时，在病原体耐药性的监测方面，高通量分型检测技术可以检测病原体的基因序列，从而确定其对药物的耐药性。这对于指导临床合理用药、避免无效治疗和耐药性的传播具有重要意义，还可以为研究病原体的进化、传播和流行趋势等提供思路。
总之，临床对于高通量病原体以及病毒、细菌耐药性的检测需求广泛，涉及到感染性疾病的诊断、治疗、预防和控制等多个方面。随着技术的不断发展和应用，高通量测序技术在临床上的应用将会越来越广泛。然而，目前用于微滴生成制备的离心式微流控芯片仅能实现样本与引物单一结合的功能，并不具备分区分型检测能力，难以满足当前临床上广泛存在的对多种病原体、不同种类细菌与病毒的耐药性基因高通量同时快速分检的需求。
发明内容
为满足当前临床上广泛存在的对多种病原体、不同种类细菌与病毒的耐药基因同时快速分检的需求，本发明提供一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片及其使用方法，以解决现有技术的微流控芯片不能实现分区分型检测的技术问题。
本发明采用如下技术方案：一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，所述储液池采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池的出口和储液池的进液口通过进液管道连通，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道和微滴生成池，第一微流控通道与储液池的出液口连接，且第一微流控通道的宽度小于储液池出液口的宽度，第二微流控通道的最大宽度小于第一微流控通道的宽度，所述引物室用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池的侧面设有与微滴生成池连通的油相收集池，初始时微滴生成池装满油相，油相收集池用于收集微滴生成池生成微滴后溢出的油相。
所述芯片本体上位于中轴安装孔的外周设有均匀分布的固定卡槽，固定卡槽位于缓液池和储液池之间。
所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元的数量均在4~8之间；每个储液池上的出液口的数量与每个扇形区域上的微滴生成单元的数量相等，每个微滴生成单元分别与每个出液口连通。
所述进液管道包括两段，进液管道的第一段与缓液池的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道的第二段连接，进液管道的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池的进液口连接。
所述弧形槽远离进液管道的一端连接有径向槽，径向槽的一端与弧形槽的端部连接、另一端朝向芯片本体外缘延伸；所述弧形槽由进液管道处向径向槽处宽度逐渐增大。
所述第一微流控通道采用十字形结构，十字形的上下两端分别连接在储液池的出液口和微滴生成池上。
所述第二微流控通道包括与引物室的出口连接的总管，总管上连接有支管，所述支管的数量为两级以上，沿液体流动方向，各级支管的数量逐级增多，最后一级支管与引物室的进口连接，各级支管连接在一起形成树形结构。
各级支管中，沿液体流动方向，支管的宽度逐级减小。
所述第一微流控通道的宽度为60~120μm；所述第二微流控通道的宽度为20~60μm。
用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片的检测方法，其是上述用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片进行：将芯片本体安装在转轴上，微滴生成池装满油相，引物室内装有引物冻干微球，向加样孔中加入样本，利用转轴带动芯片本体转动，样本在离心力的作用下由缓液池依次进入储液池和微滴生成单元，改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本分布到不同的微滴生成单元中，依次实现其与不同引物室中引物的结合以及与微滴生成池中油相的混合；调整转速为1500rad时，样本受离心力作用进入储液池；调整转速为2000rad时，样本通过第一微流控通道进入不同分区的引物室与引物充分混合；调整转速为2500rad时，样本引物结合物通过第二微流控通道进入微滴生成池，形成“油包水”的样本-引物结合微滴。
本发明的有益效果是：本发明通过设计相互独立且密封的微滴生成单元结构，每个微滴生成单元结构均包含有可存放不同引物冻干微球的引物室，通过离心操作，使样本均匀分配至不同分区的引物室，并实现与多种不同引物的自动结合。本发明在芯片本体上设置不同的分区可以满足一次加样即可完成样本与多种病原体基因引物的同时结合，具有分型检测功能的创新性优势，可实现高通量制备微滴的临床需求，而最终得到的样品与引物结合的“油包水”的微滴，可直接用于后续数字PCR扩增等操作，具有极大的操作简便性。
本发明能够通过离心力沿样本流动通道泵送液体，无需复杂的流体驱动设备，仅需使用普通的离心设备便能实现微流体的驱动，在不使用任何泵的情况下实现液滴的形成，使用阶梯乳化的液滴制备方式，利用离心力下的拉普拉斯力来简单快速地获得单分散液滴。通过设计微流控通道、混合反应器，将各部件微型化，并引入离心力的驱动方式，解决了经典微流控芯片在阀控、流体分裂、分离、液滴形成和孵育中存在的泵和混合问题。
综上所述，本样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片通过离心力驱动下的微流体控制，利用油水两相阶梯乳化液滴发生技术，通过设计相互独立且密封的引物室，可实现样本与多种不同引物的自动分配混合，同步高效生产不同种引物-样本结合型微液滴，满足了现有的高通量分型检测临床需求，将是未来微流控技术面向市场应用极具竞争力的形态与载体。
优选的，在芯片本体上设置卡槽，将转轴安装在芯片本体的中轴安装孔之后，利用卡槽将转轴与芯片本体固定连接，使得中轴带动芯片本体转动保证芯片本体在离心时保持稳定。
优选的，本发明的离心式数字PCR芯片设置四个扇形区，共有四个进样口，能满足四个样本的同时检测，提高检测效率；每个扇形区有4-8个微滴生成单元，因此每个芯片共包含均匀分布于圆周的相互独立且密封的16-32个微滴生成单元，即16-32个不同的分区，通过离心操作，使样本均匀分配至不同分区，并实现与多种不同引物的自动结合，具有分区检测特点，可实现高通量制备微滴的临床需求。
优选的，进液管道是两段式结构，采用向内弯折的设计增加通道流阻，可防止非离心状态下液体逆向流出，保证样品从缓液池顺利进入储液池内，达到无样品损耗而使液滴快速生成的最理想效果，在一定程度上节省芯片空间，提高通量。
优选的，储液池的一端与进液管道连接，另一端设有径向槽，径向槽可用于存储液体，这样能保证离心操作时，储液池内的样本能进入每个微滴生成单元中。
优选的，十字形的第一微流控通道可以存储微量样本，在芯片本体转动时，能将第一微流控通道中的样本离心到引物室内。
优选的，第二微流控通道包括多级支管，能使样本分配更加均匀。以树状分布、内径逐级减小的第二微流控通道连通相互独立且密封的微滴生成池，微流控通道内径逐级减小的设计使其具有一定流阻，保证液体在不同转速下分布于芯片不同区域，从而实现阶梯式离心功能，满足高通量分型检测需求。
附图说明
图1是本发明的一种实施例的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片的示意图；
图2是图1的平面俯视图；
图3是图1中一个微滴生成单元的放大图。
图1-3中附图标记：1-中轴安装孔；2-固定卡槽；3-加样口；4-缓液池；4.1-进液管道；5-储液池；5.1-径向槽；6-引物室；7-微滴生成池；8-油相收集池；9-第一微流控通道；10-第二微流控通道；10.1-总管，10.2-第一级支管，10.3-第二级支管，10.4-第三级支管。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
如图1至图3所示，本发明一种实施例的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔1，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池4、储液池5和微滴生成单元，缓液池4的进口处设有加样孔3，所述储液池5采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池5的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池4的出口和储液池5的进液口通过进液管道4.1连通，储液池5上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，所述进液管道4.1包括两段，进液管道4.1的第一段与缓液池4的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道4.2的第二段连接，进液管道4.1的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池5的进液口连接。所述弧形槽远离进液管道4.1的一端连接有径向槽5.1，径向槽5.1的一端与弧形槽的端部连接、另一端朝向芯片本体外缘延伸。所述弧形槽由进液管道4.1处向径向槽5.1处宽度逐渐增大。
每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道9、引物室6、第二微流控通道10和微滴生成池7，第一微流控通道9与储液池5的出液口连接，且第一微流控通道9的宽度小于储液池5出液口的宽度，第二微流控通道10的最大宽度小于第一微流控通道9的宽度，所述引物室6用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池7的侧面设有与微滴生成池7连通的油相收集池8，初始时微滴生成池7装满油相，样本引物混合后进入微滴生成池7开始生成微滴后，溢出的油相进入到油相收集池8中，从而防止仪器受到污染。微滴生成池7和油相收集池8的连接部位位于微滴生成池靠近芯片本体的中心处。
本实施例中，所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元均为5个；缓液池4采用圆角矩形结构，每个储液池5上的出液口有5个，每个微滴生成单元分别与出液口连通。所述芯片本体上位于中轴安装孔1的外周设有均匀分布的固定卡槽2，固定卡槽2位于缓液池4和储液池5之间。
所述第一微流控通道9的宽度为60~120μm；所述第二微流控通道10的宽度为20~60μm。所述第一微流控通道9采用十字形结构，十字形的上下两端分别连接在储液池5的出液口和微滴生成池7上。
所述第二微流控通道10包括与引物室6的出口连接的总管10.1，总管10.1上连接有支管，本实施例中，支管共有三级，三级支管沿液体流动方向数量逐级增多，第一级支管10.2与总管连接，第二级支管10.3与第一级支管10.2连接，第三级支管10.4与第二级支管10.3连接后，每个第三级支管10.4分别连接在每个锯齿形结构的进口上，三级支管连接在一起形成树形结构。各级支管中，沿液体流动方向，支管的宽度逐级减小。
如图1至图2所示，芯片本体上有4个加样口3、4个矩形缓液池4、4个储液池5和20个微滴生成单元，每个储液池5上分别连通5个相互独立且密封的微滴生成单元，每个微滴生成单元包括依次连通的第一微流控通道9、引物室6、第二微流控通道10、微滴生成池7和油相收集池8。中轴安装孔1用于安装旋转轴，加样口3均匀分布于中轴安装孔1外周，液滴生成单元分布在芯片本体靠外缘的圆周方向上。加样口3与缓液池4入口相连通，缓液池4出口通过进液管道4.1连通储液池5的进液口，进液管道4.1采用向内弯折的设计增加通道流阻，可防止非离心状态下液体逆向流出，保证样品从缓液池顺利进入储液池5内，达到无样品损耗而使液滴快速生成的最理想效果，在一定程度上节省芯片空间，提高通量。
本实施例的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片的使用方法具体如下：将芯片本体安装在转轴上，微滴生成池装满油相，引物室内装有引物冻干微球，向加样孔中加入样本，利用转轴带动芯片本体转动，样本在离心力的作用下由缓液池依次进入储液池和微滴生成单元，改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本分布到不同的微滴生成单元中，依次实现其与不同引物室中引物的结合以及与微滴生成池中油相的混合；调整转速为1500rad时，样本受离心力作用进入储液池；调整转速为2000rad时，样本通过第一微流控通道进入不同分区的引物室与引物充分混合；调整转速为2500rad时，样本引物结合物通过第二微流控通道进入微滴生成池，形成“油包水”的样本-引物结合微滴。
本实施例的离心式数字PCR芯片共包含均匀分布于圆周的相互独立且密封的20个微滴生成单元，即一个芯片上有20个不同分区，每个分区分别设计有可存放不同引物冻干微球的引物室，通过离心操作，使样本均匀分配至不同分区，并实现与多种不同引物的自动结合。本实施例的PCR数字芯片设置不同分区，可以满足一次加样即可完成样本与多种病原体基因引物的同时结合，具有高通量分区制备微滴，实现分型检测的创新性优势，可实现高通量制备微滴的临床需求，而最终得到的样品与不同引物结合的“油包水”的微滴，可直接用于后续数字PCR扩增等操作，具有极大的操作简便性。
本发明使用时采用阶梯乳化原理，可实现样本与引物的分区化自动结合，样品分区化速度更为高效、简便，同时可获得更多均一、稳定的微液滴。本实施例的样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片使用时设计了三级离心力梯度，即可通过改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本在不同分区的分布，依次实现其与不同分区引物的结合以及与油相的混合。即确定离心力大小，调整转速为1500rad时，样本受离心力作用进入储液池；调整转速为2000rad时，样本通过第一微流控通道进入不同分区的引物室与引物充分混合；调整转速为2500rad时，样本引物结合物通过第二微流控通道进入微滴生成池，形成“油包水”的样本-引物结合微滴，微滴生成池中溢出的油相进入油相收集池中。
此外，本发明设计的样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片设置20个相互独立且密封的微滴生成单元，即20个不同分区，每个分区设计有可存放不同引物冻干微球的引物室，以微流控通道代替了复杂的超净间加工流程，极大地降低了加工难度并减少了加工时间，还兼具良好的进样能力，采用密封结构有效地避免了其余混杂因素带来的影响，省去了以往依靠外部驱动液流的繁杂设计，同时离心力各项受力具有均匀性，能支持多单元结构的并行操作，可满足样本同时结合20个不同引物形成微液滴的需要，在生成液滴时，所有微流控通道同时制备液滴，可实现高通量分区液滴制备，为后续数字PCR扩增提供便利，极大提高了液滴制备效率。
本发明能够通过离心力沿样本流动通道泵送液体，无需复杂的流体驱动设备，仅需使用普通的电机便能实现微流体的驱动，在不使用任何泵的情况下实现液滴的形成，利用密度差和离心力的作用来简单快速地获得单分散液滴。通过设计两级微流控通道，引物室作为混合反应器，将各部件微型化，并引入离心力的驱动方式，解决了经典微流控芯片在阀控、流体分裂、分离、液滴形成和孵育中存在的泵和混合问题。
在本发明的其它实施例中，芯片本体上的扇形区域可以是2个以上的任意值，最好为偶数个；每个扇形区域上的微滴生成单元的数量也可以根据实际需要灵活设计，优选的每个扇形区域上的微滴生成单元的数量可在4~8之间。
在本发明的其它实施例中，第二微流控通道的总管上连接的支管的技术可以根据实际需要灵活设置，可以采用大于三级的多级结构，沿液体流动方向，各级支管的数量逐级增多，最后一级支管与引物室的进口连接，各级支管连接在一起形成树形结构。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，所述储液池采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池的出口和储液池的进液口通过进液管道连通，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道和微滴生成池，第一微流控通道与储液池的出液口连接，且第一微流控通道的宽度小于储液池出液口的宽度，第二微流控通道的最大宽度小于第一微流控通道的宽度，所述引物室用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池的侧面设有与微滴生成池连通的油相收集池，初始时微滴生成池装满油相，油相收集池用于收集微滴生成池生成微滴后溢出的油相。
2.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片本体上位于中轴安装孔的外周设有均匀分布的固定卡槽，固定卡槽位于缓液池和储液池之间。
3.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元的数量均在4~8之间；每个储液池上的出液口的数量与每个扇形区域上的微滴生成单元的数量相等，每个微滴生成单元分别与每个出液口连通。
4.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述进液管道包括两段，进液管道的第一段与缓液池的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道的第二段连接，进液管道的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池的进液口连接。
5.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述弧形槽远离进液管道的一端连接有径向槽，径向槽的一端与弧形槽的端部连接、另一端朝向芯片本体外缘延伸；所述弧形槽由进液管道处向径向槽处宽度逐渐增大。
6.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第一微流控通道采用十字形结构，十字形的上下两端分别连接在储液池的出液口和微滴生成池上。
7.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第二微流控通道包括与引物室的出口连接的总管，总管上连接有支管，所述支管的数量为两级以上，沿液体流动方向，各级支管的数量逐级增多，最后一级支管与引物室的进口连接，各级支管连接在一起形成树形结构。
8.根据权利要求7所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：各级支管中，沿液体流动方向，支管的宽度逐级减小。
9.根据权利要求7所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第一微流控通道的宽度为60~120μm；所述第二微流控通道的宽度为20~60μm。
10.用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片的使用方法，其是采用权利要求1-10中任意一项的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片进行，其特征在于：将芯片本体安装在转轴上，微滴生成池装满油相，引物室内装有引物冻干微球，向加样孔中加入样本，利用转轴带动芯片本体转动，样本在离心力的作用下由缓液池依次进入储液池和微滴生成单元，改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本分布到不同的微滴生成单元中，依次实现其与不同引物室中引物的结合以及与微滴生成池中油相的混合；调整转速为1500rad时，样本受离心力作用进入储液池；调整转速为2000rad时，样本通过第一微流控通道进入不同分区的引物室与引物充分混合；调整转速为2500rad时，样本引物结合物通过第二微流控通道进入微滴生成池，形成“油包水”的样本-引物结合微滴。
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