CN105259322A - 一种研究口炎清或其他中药复方配伍关系筛选最优组方的方法 - Google Patents
一种研究口炎清或其他中药复方配伍关系筛选最优组方的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种研究口炎清制剂等复方中药方剂配伍关系,筛选最优组方的方法,包括以下步骤:首先按口炎清制剂等复方中药组方,以各组分的质量百分含量为变量因素,采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例的差异样品;再通过药效学研究获得各差异样品的药效数据;后运用数理统计方法分析各差异样品各组分含量与药效间的关联性,明确各组分对药效贡献及其主次关系,从而确定其组方配伍规律,筛选最优的配伍关系获得最佳组方。本发明基于口炎清颗粒原料药材与抗炎药效相关联,科学解读其组方中各味药材的作用及地位,阐明了其组方配伍关系,确证了原组方比例为最佳,为筛选最佳组方提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,特别涉及一种研究口炎清制剂或其他中药方剂配伍配伍关系,筛选最佳组方的方法。
背景技术
中医治病注重辨证论治,方剂配伍则注重君臣佐使,通过多味中药的相互配合来实现对机体失衡状态的修正。然而,由于东西方文化的差异,对于中药复杂体系来说,传统的“君臣佐使”理论,尚未被西方医学界接受。国内外通过药效实验科学解释中药组方配伍规律,尚处于发轫阶段。用量化的指标来研究“君臣佐使”理论,是实现方剂学发展的必然趋势。贺丰等选取张仲景《伤寒论》明方麻黄汤(由麻黄、桂枝、杏仁、甘草四味药材组成),以伪麻黄碱(PE)为指标,研究了不同配伍的麻黄汤给药后人体内PE的血药浓度动态变化过程,结果表明臣药桂枝、佐药杏仁、使药甘草对PE药代学参数具有显著影响,且三者间存在一定的交互作用,从而明确了麻黄汤方剂中臣佐使药在方中的地位和作用。该组方规律研究方法存在一些不足之处:(1)麻黄汤中方中麻黄的君药地位缺乏研究数据支持,仍然凭借经验确定;(2)只研究了麻黄中的单一效应成分,不能完全代表其余三味药材与麻黄药材间的相互作用;(3)无法具体阐述各味药材对处方整体药效贡献的主次关系,以及各味药材各自药效间的相互作用,科学筛选确证最佳组方配伍关系。
口炎清颗粒由山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材组成,可滋阴清热、解毒消肿,临床用于治疗阴虚火旺的口腔炎症疾病,收录在《国家基本药物目录》(2012年版),是6个治疗咽喉、口腔病的国家基本用药之一。目前,基于药效实验研究口炎清颗粒的组方规律,国内外尚无相关报道。本发明首次采用在体动物药效与原料药材含量相关联的方法,明确了口炎清颗粒中各味药材的药效贡献及其主次关系,揭示了其君臣佐使的组方规律,筛选并确证了其原有组方配伍为最佳,为临床用药提供参考。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足,提供了一种研究复方中药组方配伍规律用于筛选确证最佳中药配伍的方法,包括以下步骤:
(1)按复方中药组方,以各组分的质量百分含量为变量因素,采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例的差异样品;
(2)通过药效学研究获得各差异样品的药效数据;
(3)运用数理统计方法分析各差异样品各组分含量与药效间的关联性,明确各组分对药效贡献及其主次关系,从而确定其组方配伍规律,筛选最优的配伍关系。
该方法可于筛选和确证口炎清制剂抗炎药效组方配伍关系的研究,具体包括以下步骤:
(1)在口炎清制剂的组方配比的约束下,以各组分质量百分含量为因素,采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例,符合统计要求的若干差异样品;
(2)构建与口炎清制剂药效对应的体外炎症模型,进行差异样品药效学实验,检测其对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的影响,获得相关药效数据;
(3)利用灰色关联分析方法计算差异样品组分含量与药效间的关联性,明确各组分对药效作用及其主次关系,筛选最优的配伍关系。
所述的差异样品的制备方法为:按照《中华人民共和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备成浸膏待用。
所述的体外炎症模型构建方法为:用香烟提取物刺激人口腔黏膜角化细胞,构建急性口腔炎症模型。
所述香烟提取物的制备方法为:抽取适量充分燃烧的香烟烟雾,使其完全溶于无血清RPMI-1640培养基,用0.22μm滤膜过除菌,制备100%香烟烟雾提取物;所述构建急性口腔炎症模型的具体方法为:将人口腔黏膜角化细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中孵育;用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,接种到孔板;培养24h,待细胞长至80%密度时,以含对照标准品或供试品的无胎牛血清培养基替换原培养基,预处理30分钟后用6%的香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞造模,继续孵育24小时,终止培养,用孔内上清液进行检测所述炎症因子的水平。
所述的检测促炎症因子的方法为Elisa试剂盒检测法。
由于山银花组分与TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效指标间的关联度显著大于其余组分,应以山银花发为君药;由于组分玄参、天冬和麦冬与IL-6和IL-1β指标关联密切,与调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁移,以及促进白细胞迁移和黏附分子表达、引起炎症介质的释放相关;甘草与TNF-α指标关联密切,与诱导IL-1、IL-6等细胞因子及炎性介质的产生、促进炎细胞向病变组织移行相关,确认组分玄参、天冬、麦冬和甘草通过相互补充,起到增强山银花药效的作用。
本发明基于口炎清颗粒原料药材与抗炎药效相关联,科学解读其组方中各味药材的作用及地位,阐明了其组方配伍规律,确证了其组方比例为最佳。本发明的方法可用于筛选中药最佳配伍,对指导其临床用药,提升其科学内涵具有重要意义。本技术的实施应用可为其他复方中药制剂的组方规律研究提供范例。
附图说明
图1为口炎清颗粒各组分抗炎活性药效作用及其主次关系的示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明。
一、口炎清颗粒差异样品的构建及其药效学研究
1、实验材料
1.1实验药品与试剂
口炎清差异样品浸膏11批(批号:20140815)及口炎清浸膏(批号:20140515),均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供;牛黄解毒片(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,批号:13121398);地塞米松(中国药品生物制品检定所,批号:100129-201105);香烟(椰树牌,广东中烟工业有限公司);MTT(Sigma,M2128-1G);TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1βElisa试剂盒(武汉优尔生公司);RPMI-1640培养基(Hyclone)。
1.2实验仪器
净化工作台:苏州净化安泰技术有限公司HT-840型;光学显微镜:MoticAE21;CO2培养箱:FORMASeris303792-6714型;超低温冰箱:海尔BCD-568W;十万分之一电子天平:SartoriusBP211D;电热恒温水浴锅:上海一恒科学仪器有限公司130406887型;多孔超微量核酸蛋白分析仪:Botek;冷冻离心机:Eppendorf5430R。
2、实验方法
2.1差异样品的构建
(1)差异样品的构建
根据口炎清颗粒的处方组成比例,山银花:玄参:麦冬:天冬:甘草为26:21:21:21:11,进行配方约束下五因素十一水平的均匀设计,,每一水平表示相应药材占5味药材总量的百分比,其中山银花变化为16-36%,玄参0-42%,麦冬0-42%,天冬0-42%,甘草0-22%,见表1-1。
表1-1口炎清颗粒差异样品构建方案
差异样品 | 山银花% | 玄参% | 天冬% | 麦冬% | 甘草% |
S1 | 36 | 0 | 16.8 | 25.2 | 22 |
S2 | 34 | 4.2 | 37.8 | 4.2 | 19.8 |
S3 | 32 | 8.4 | 8.4 | 33.6 | 17.6 |
S4 | 30 | 12.6 | 29.4 | 12.6 | 15.4 |
S5 | 28 | 16.8 | 0 | 42 | 13.2 |
S6 | 26 | 21 | 21 | 21 | 11 |
S7 | 24 | 25.2 | 42 | 0 | 8.8 |
S8 | 22 | 29.4 | 12.6 | 29.4 | 6.6 |
S9 | 20 | 33.6 | 33.6 | 8.4 | 4.4 |
S10 | 18 | 37.8 | 4.2 | 37.8 | 2.2 |
S11 | 16 | 42 | 25.2 | 16.8 | 0 |
(2)差异样品的制备
基于差异样品构建方案表,委托广州白云山和记黄埔中药有限公司按照现有的口炎清颗粒标准生产工艺制备差异样品,各组浸膏的每味药材重量见表1-2。
表1-2口炎清颗粒差异样品浸膏的5味药材重量
差异样品 | 山银花g | 玄参g | 天冬g | 麦冬g | 甘草g |
S1 | 846.0 | 0 | 394.8 | 592.2 | 517.0 |
S2 | 799.0 | 98.7 | 888.3 | 98.7 | 465.3 |
S3 | 752.0 | 197.4 | 197.4 | 789.6 | 413.6 |
S4 | 705.0 | 296.1 | 690.9 | 296.1 | 361.9 |
S5 | 658.0 | 394.8 | 0 | 987.0 | 310.2 |
S6 | 611.0 | 493.5 | 493.5 | 493.5 | 258.5 |
S7 | 564.0 | 592.2 | 987.0 | 0 | 206.8 |
S8 | 517.0 | 690.9 | 296.1 | 690.9 | 155.1 |
S9 | 470.0 | 789.6 | 789.6 | 197.4 | 103.4 |
S10 | 423.0 | 888.3 | 98.7 | 888.3 | 51.7 |
S11 | 376.0 | 987.0 | 592.2 | 394.8 | 0 |
2.2差异样品药效学实验
(1)细胞培养
HOK细胞(人口腔黏膜角化细胞),购自广州吉妮欧生物科技有限公司。培养于RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL,pH7.2),在37℃、5%CO2培养箱中。
消化细胞,MTT测定时用完全培养基调整细胞密度为5×104个/mL,并铺96孔板,每孔100μL;ELISA测定时用完全培养基调整细胞密度为4×105个/mL,并铺24孔板,每孔0.5mL。细胞培养24h后,待密度至80%可给药。
(2)香烟烟雾提取物的制备及各药物的配制
1)香烟烟雾提取物制备
将2支燃烧的椰树牌香烟烟雾用装有10mL的RPMI-1640培养基(无血清)的50mL注射器连续抽吸6次,每次50mL,共300mL;摇动使其充分溶解,经0.22μm微孔膜过滤后,得到100%浓度的CSE溶液,用RPMI-1640培养基(无血清)稀释到需要的浓度后加入细胞,使CSE终浓度为5%,30min内用于实验。
2)药物的配制
各药物用RPMI-1640培养基(无血清)配制,口炎清1-11号差异样品终浓度为55.6μg/mL;地塞米松(Dex)终浓度为1μM;牛黄解毒片(NP)终浓度为10μg/mL,经0.22μm微孔膜过滤后使用。
(3)考察口炎清差异样品的细胞毒性
细胞铺板如前所述,24h贴壁后除去培养基,加入200μL口炎清差异样品溶液,空白对照组加入等量的RPMI-1640培养基(无血清),置于含5%CO2、37℃培养箱中培养24h后,按MTT方法进行测试。
(4)差异样品药效学实验
实验分成15组:空白对照组,模型组(5%CSE),阳性对照Dex组(1μM),阳性对照NP组(10μg/mL),和口炎清差异样品1-11组(55.6μg/mL)。
细胞铺板如前所述,24h贴壁后换成RPMI-1640培养基(无血清),继续培养一晚上;然后分别加入Dex、NP、口炎清差异样品,空白对照组和模型组给予等量的无血清培养基,于5%CO2、37℃培养箱培养,预保护1h;接着各组(除空白对照组外)加入终浓度为5%的CSE,空白对照组给予等量的无血清培养基,继续孵育24h;最后取细胞上清液,并釆用ELISA法检测TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β含量。
(5)数据分析方法
采用SPSS19.0软件,运用单因素方差分析(ANOVA)和T检验方法进行分析,结果均以表示,P值小于0.05或0.01被认为有统计学差异。
3、实验结果
3.1考察口炎清差异样品的细胞毒性
研究结果(表1-5):55.6μg/mL的口炎清1-11号差异样品对细胞的存活率均没有显著影响(P>0.05),即对细胞均无毒性。
表1-5细胞存活率
样品 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 |
存活率 | 0.912±0.007 | 0.923±0.013 | 0.926±0.027 | 0.908±0.006 | 0.890±0.023 | 0.903±0.033 |
样品 | S7 | S8 | S9 | S10 | S11 | ---- |
存活率 | 0.906±0.019 | 0.890±0.048 | 0.947±0.006 | 0.914±0.018 | 0.882±0.018 | ---- |
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
3.2细胞急性炎症的改善
(1)促炎因子TNF-α的含量
实验结果(表1-6):模型组TNF-α含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、Dex、差异样品1、4、5、6和11,均对TNF-α升高有显著抑制作用(P<0.01,P<0.05)。
表1-6差异样品对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的改善
组别 | TNF-α(pg/mL) | IL-8(pg/mL) | IL-6(pg/mL) | IL-1β(pg/mL) |
空白 | 1.20±0.02 | 215.11±9.52 | 2.14±0.05 | 11.63±0.93 |
模型 | 1.74±0.03** | 272.93±12.80** | 3.14±0.11** | 20.28±2.12** |
NP | 1.23±0.09## | 239.81±14.04## | 2.76±0.16 | 10.64±0.91## |
Dex | 1.37±0.02## | 230.85±3.72## | 2.60±0.27# | 15.21±1.15## |
S1 | 1.15±0.10## | 289.76±3.37 | 2.37±0.14## | 18.92±0.35 |
S2 | 1.64±0.19 | 265.53±13.31 | 2.53±0.19## | 18.06±2.73 |
S3 | 1.58±0.12 | 261.08±14.86 | 2.87±0.34 | 15.83±1.21## |
S4 | 1.22±0.07## | 341.33±14.79 | 2.53±0.16## | 14.72±1.57## |
S5 | 1.50±0.12# | 250.25±6.24# | 2.64±0.19# | 15.96±0.87## |
S6 | 1.12±0.14## | 237.00±10.85## | 2.53±0.16## | 12.62±1.15## |
S7 | 1.93±0.11 | 252.69±9.45 | 2.79±0.30 | 17.44±0.93 |
S8 | 1.77±0.02 | 341.92±7.89 | 2.14±0.14## | 13.11±1.40## |
S9 | 1.77±0.08 | 288.33±8.85 | 2.56±0.14## | 14.23±1.15## |
S10 | 1.89±0.11 | 259.30±2.87 | 2.60±0.22# | 14.35±1.39## |
S11 | 1.40±0.15## | 279.84±15.76 | 2.11±0.14## | 13.61±1.32## |
注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。
(2)促炎因子IL-8的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-8含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、Dex、差异样品5和6,均对IL8升高有显著抑制作用(P<0.01,P<0.05)。
(3)促炎因子IL-6的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-6含量显著升高(P<0.01),给药处理后,Dex、差异样品1、2、4、5、6、8、9、10和11,均对IL6升高有显著抑制作用(P<0.01,P<0.05)。
(4)促炎因子IL-1β的含量
实验结果(表1-6):模型组IL-1β含量显著升高(P<0.01),给药处理后,NP、Dex、差异样品3、4、5、6、8、9、10和11,均对IL1-β升高有显著抑制作用(P<0.01)。
4、小结
口炎清颗粒差异样品间化学成分差异明显,且通过考察TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效学指标获得的差异样品间生物活性差异明显。
二、口炎清颗粒的组方配伍规律研究
1、方法
采用灰色关联分析对口炎清颗粒的组方配伍规律进行研究。首先对负向药效指标参数进行正向化处理(取倒数);再对正向化的药效指标和差异样品中各药材含量进行无量纲化处理(均值化)。见表2-1、2-2、2-3。
表2-1口炎清差异样品药效结果正向化处理
组别 | TNF-α | IL-8 | IL-6 | IL-1β |
S1 | 0.87059 | 0.00345 | 0.42139 | 0.05285 |
S2 | 0.61003 | 0.00377 | 0.39588 | 0.05538 |
S3 | 0.63166 | 0.00383 | 0.34843 | 0.06316 |
S4 | 0.82057 | 0.00293 | 0.39588 | 0.06794 |
S5 | 0.66712 | 0.00400 | 0.37869 | 0.06267 |
S6 | 0.89233 | 0.00422 | 0.39588 | 0.07925 |
S7 | 0.51706 | 0.00396 | 0.35797 | 0.05734 |
S8 | 0.56641 | 0.00292 | 0.46647 | 0.07626 |
S9 | 0.56641 | 0.00347 | 0.38998 | 0.07030 |
S10 | 0.52857 | 0.00386 | 0.38425 | 0.06969 |
S11 | 0.71385 | 0.00357 | 0.47493 | 0.07349 |
表2-2口炎清差异样品药效结果正向化后的均值化处理
组别 | TNF-α | IL-8 | IL-6 | IL-1β |
S1 | 1.29682 | 0.94969 | 1.05114 | 0.79813 |
S2 | 0.90869 | 1.03635 | 0.98752 | 0.83638 |
S3 | 0.94092 | 1.05404 | 0.86915 | 0.95393 |
S4 | 1.22231 | 0.80621 | 0.98752 | 1.02604 |
S5 | 0.99374 | 1.09966 | 0.94463 | 0.94654 |
S6 | 1.32920 | 1.16114 | 0.98752 | 1.19694 |
S7 | 0.77020 | 1.08902 | 0.89294 | 0.86602 |
S8 | 0.84372 | 0.80483 | 1.16358 | 1.15180 |
S9 | 0.84371 | 0.95441 | 0.97280 | 1.06171 |
S10 | 0.78735 | 1.06125 | 0.95851 | 1.05256 |
S11 | 1.06334 | 0.98338 | 1.18471 | 1.10994 |
表2-3口炎清颗粒差异样品浸膏的5味药材重量的均值化处理
差异样品 | 山银花g | 玄参g | 天冬g | 麦冬g | 甘草g |
S1 | 1.38 | 0 | 0.80 | 1.20 | 2.00 |
S2 | 1.31 | 0.20 | 1.80 | 0.20 | 1.80 |
S3 | 1.23 | 0.40 | 0.40 | 1.60 | 1.60 |
S4 | 1.15 | 0.60 | 1.40 | 0.60 | 1.40 |
S5 | 1.08 | 0.80 | 0 | 2.00 | 1.20 |
S6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
S7 | 0.92 | 1.20 | 2.00 | 0 | 0.80 |
S8 | 0.85 | 1.40 | 0.60 | 1.40 | 0.60 |
S9 | 0.77 | 1.60 | 1.60 | 0.40 | 0.40 |
S10 | 0.69 | 1.80 | 0.20 | 1.80 | 0.20 |
S11 | 0.62 | 2.00 | 1.20 | 0.80 | 0 |
2、结果
2.1差异样品药效分析
本实验中,各组细胞(空白对照组除外)均接受造模处理,所以为了分析Dex、NP及口炎清1-11号差异样品的药物处理影响,将模型组的4个药效参数定义为参考数列,给药组(Dex、NP及差异样品1-11组)定义为比较数列;并利用灰关联分析方法计算两个数列间的相似度,相似度越低则药效越强,反之药效越差。见表2-4、2-5。
表2-4灰关联分析中的参考数列与比较数列
组别 | TNF-α | IL-8 | IL-6 | IL-1β |
a模型 | 0.84821 | 0.98382 | 0.81489 | 0.73637 |
bNP | 1.19553 | 1.11969 | 0.92793 | 1.40374 |
bDex | 1.07352 | 1.16317 | 0.98245 | 0.98170 |
bS1 | 1.28299 | 0.92666 | 1.07739 | 0.78929 |
bS2 | 0.89900 | 1.01123 | 1.01218 | 0.82712 |
bS3 | 0.93089 | 1.02849 | 0.89086 | 0.94337 |
bS4 | 1.20928 | 0.78667 | 1.01218 | 1.01468 |
bS5 | 0.98314 | 1.07301 | 0.96823 | 0.93606 |
bS6 | 1.31504 | 1.13299 | 1.01218 | 1.18369 |
bS7 | 0.76199 | 1.06262 | 0.91524 | 0.85643 |
bS8 | 0.83472 | 0.78532 | 1.19264 | 1.13905 |
bS9 | 0.83472 | 0.93128 | 0.99709 | 1.04995 |
bS10 | 0.77896 | 1.03552 | 0.98245 | 1.04091 |
bS11 | 1.05201 | 0.95954 | 1.21429 | 1.09765 |
注:a为参考数列,b为比较数列
表2-5给药组的灰关联分析结果
组别 | S2 | S3 | S7 | S9 | S10 | S5 | S1 |
关联度 | 0.8341 | 0.8102 | 0.8084 | 0.7770 | 0.7498 | 0.7314 | 0.7051 |
续表
组别 | S8 | Dex | S11 | S4 | NP | S6 |
关联度 | 0.6530 | 0.6475 | 0.6472 | 0.5937 | 0.5933 | 0.5628 |
由表2-5可知,各组药效作用由强到弱依次为S6>NP>S4>S11>Dex>S8>S1>S5>S10>S9>S7>S3>S2。
Dex和牛黄解毒片(NP)均具有抗炎作用,Dex可有效减少TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子的释放,抑制炎症反应;NP可有效抑制二甲苯致小鼠耳肿胀等,并可减少发热大鼠模型血清的IL-1β含量。Dex和NP的药效作用居前,与预期结果基本吻合。
根据差异样品构建方案表(表1-1)可知,药效最强的6号样品与口炎清颗粒的原配伍比例最为接近,且药效优于两个阳性药Dex和NP;1、4、5、8、11号差异样品与原配伍比例较接近或其中一味药材较少,药效居中;2、3、7、9、10号差异样品中其中两味药材含量较低,药效最差。因此,可推测口炎清中各味药材均对药效有贡献,缺一不可,而且配伍比例越接近原配伍比例,药效越强,体现了口炎清颗粒配伍比例的合理性。
2.2组方配伍规律探索
各差异样品中的山银花、玄参、麦冬、天冬、甘草5味药材含量具有差异,从而导致药效的差异,故利用灰色关联分析方法计算11批差异样品中各味药材的含量差异与每个药效指标的药效结果的关联度,而关联度越大,表明该药材对药效贡献越大,见表2-6。
表2-6差异样品各味药材与药效指标的灰关联分析结果
关联度 | IL-1β | IL-6 | IL-8 | TNF-α |
山银花 | 0.69 | 0.72 | 0.69 | 0.80 |
玄参 | 0.57 | 0.57 | 0.50 | 0.52 |
天冬 | 0.58 | 0.57 | 0.50 | 0.57 |
麦冬 | 0.54 | 0.56 | 0.50 | 0.56 |
甘草 | 0.54 | 0.55 | 0.50 | 0.62 |
TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β是参与炎症反应的重要介质,可促进炎性反应进程,具体表现为:TNF-α可诱导IL-1、IL-6等细胞因子以及多种炎性介质的产生,促进炎细胞向病变组织移行;IL-8有强烈的趋化作用,可激活和趋化中性粒细胞,以及趋化淋巴细胞和嗜碱性粒细胞等;IL-6调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁移;IL-1β可促进白细胞迁移和黏附分子表达,引起炎症介质的释放等。从表2-6可知,山银花与TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效指标间的关联度远远大于其余4味药材,为发挥抗炎药效的主要贡献者,印证了其在配伍中的君药地位;玄参、天冬、麦冬3味药材与IL-6和IL-1β指标关联密切,与调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁移,以及促进白细胞迁移和黏附分子表达、引起炎症介质的释放相关;甘草与TNF-α指标关联密切,与诱导IL-1、IL-6等细胞因子及炎性介质的产生、促进炎细胞向病变组织移行相关;玄参、天冬、麦冬、甘草4味药材通过相互补充,作为处方中的臣药及佐使药,起到增强山银花抗炎药效的作用,如图1所示。
综上所述,口炎清中君臣佐使5味药材相互辅佐,通过多靶点共同发挥良好的抗炎药效。本发明基于口炎清颗粒原料药材与抗炎药效相关联,科学解读其组方中各味药材的作用及地位,阐明了其组方配伍规律,为其他中药复方的组方规律研究提供了范例。
由此,我们可以筛选样品6的配伍关系为最佳组方,也与原方一致。
Claims (7)
1.一种研究中药复方配伍关系筛选最优组方的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)按复方中药组方,以各组分的质量百分含量为变量因素,采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例的差异样品;
(2)通过药效学研究获得各差异样品的药效数据;
(3)运用数理统计方法分析各差异样品各组分含量与药效间的关联性,明确各组分对药效贡献及其主次关系,从而确定其组方配伍规律,筛选最优的配伍关系。
2.一种研究口炎清制剂抗炎药效组方配伍关系的方法,所述口炎清制剂由组分山银花、玄参、天冬、麦冬和甘草制成,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在口炎清制剂的组方配比的约束下,以各组分质量百分含量为因素,采用均匀设计方法构建具有各组分不同投料比例,符合统计要求的若干差异样品;
(2)构建与口炎清制剂药效对应的体外炎症模型,进行差异样品药效学实验,检测其对促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β的影响,获得相关药效数据;
(3)利用灰色关联分析方法计算差异样品组分含量与药效间的关联性,明确各组分对药效作用及其主次关系,筛选最优的配伍关系。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的差异样品的制备方法为:按照《中华人民共和国药典》2010年版口炎清颗粒标准生产工艺制备成浸膏待用。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的体外炎症模型构建方法为:用香烟提取物刺激人口腔黏膜角化细胞,构建急性口腔炎症模型。
5.如权利要求5所述的方法,其特征在于:所述香烟提取物的制备方法为:抽取适量充分燃烧的香烟烟雾,使其完全溶于无血清RPMI-1640培养基,用0.22μm滤膜过滤,除菌,制备100%香烟烟雾提取物;所述构建急性口腔炎症模型的具体方法为:将人口腔黏膜角化细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,在37℃、5%CO2培养箱中孵育;用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,接种到孔板;培养24h,待细胞长至80%密度时,以含对照标准品或供试品的无胎牛血清培养基替换原培养基,预处理30分钟后用6%的香烟提取物刺激人口腔表皮样癌细胞造模,继续孵育24小时,终止培养,用孔内上清液进行检测所述炎症因子的水平。
6.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述的检测促炎症因子的方法为Elisa试剂盒检测法。
7.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述最优的配伍关系是由于山银花组分与TNF-α、IL-8、IL-6和IL-1β4个药效指标间的关联度显著大于其余组分,应以山银花发为君药;由于组分玄参、天冬和麦冬与IL-6和IL-1β指标关联密切,与调节多种炎症细胞的增殖、分化及迁移,以及促进白细胞迁移和黏附分子表达、引起炎症介质的释放相关;甘草与TNF-α指标关联密切,与诱导IL-1、IL-6等细胞因子及炎性介质的产生、促进炎细胞向病变组织移行相关,确认组分玄参、天冬、麦冬和甘草通过相互补充,起到增强山银花药效的作用。
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