CN105393976A - 一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用 - Google Patents

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余燕
马金友
祝勇
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Abstract

本发明公开了一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用，其方法具体是通过在受精蛋开始孵化的第五天至第十五天之间向卵白内注射至少一次ghrelin溶液。本发明实施方法简单，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌卫星细胞的增值能力和相对数量，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和骨骼肌的质量，增加肌纤维横截面积、促进肌纤维的分化，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的肌纤维的横截面积和质量。

Description

一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用
技术领域
本发明涉及提高新生雏鸡生长性能的方法,具体涉及一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用。
背景技术
肌肉是人类主要的食用产品，对于现代养禽业者来讲，获得最大的生产效益即是促进胴体的发育，尤其是胸肌和腿肌的产量，已有研究证明禽类肌纤维数目在出生前就已确定，出生后不会出现随着日龄的增加肌纤维数目增加的现象。因此，出生后肌纤维的生长发育主要是其直径的肥大、肌节的延长和肌纤维类型转变引起的。禽类出生后肌肉的生长发育主要表现为肌纤维面积的增加，形态上呈现出肌纤维肥大的变化。由于雏鸡出壳时的体重可作为市场出售时鸡重的一个重要指标，比如雏鸡出生时每增加1g，出售时增加8-13g，因而有学者开始研究多种方法来提高雏鸡出壳时肌纤维的数量、提高出壳时雏鸡的体重，比如胚胎期使用单色绿光照明。雏鸡的培育效果对育成鸡的生长发育和将来生产性能的发挥有极其重要的影响，现有技术中主要通过雏鸡出壳后的一系列方法来提高雏鸡的生产性能，例如，通过温度、消毒与防疫、饲养管理等方面入手。但是该类方法对于提高雏鸡的生产性能有一定的局限性，雏鸡的很多体质在出壳后已经确定，很难进行优化。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种利用ghrelin促进新生雏鸡生长性能的方法及应用。
本发明的技术方案是：一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，具体是通过在受精蛋开始孵化的第五天至第十五天之间向卵白内注射至少一次ghrelin溶液。
本发明的进一步改进包括：
所述ghrelin溶液的浓度为100-150ng/ul，每次每蛋注射量为0.1ml。
在受精蛋开始孵化的第五天和第十五天时，分别向卵白内注射一次ghrelin溶液。
在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
本发明所述的ghrelin来源优选是鼠。
本发明的另一目的在于，ghrelin在促进新生雏鸡生长性能中的应用。
本发明实施方法简单，通过卵内饲喂，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌肌卫星细胞的增值能力和相对数量，能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和骨骼肌的质量，增加肌纤维横截面积、促进肌纤维的分化能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的肌纤维的横截面积和质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
实验材料与方法
1试验材料
1.1实验动物
选用Ross肉鸡受精种蛋(新乡大用有限公司)称重，挑取重量在65-70g的蛋140枚，随机分成7组，每组20枚，分别为Control组(正常孵化倍，不做任何处理)、E5-100组、E5-150组、E5-醋酸组、E15-100组、E15-150组、E15-醋酸组。对各组蛋进行编号，记录。孵化条件：37.5±0.2℃，相对湿度55±2％。
1.2动物处理：卵内喂食ghrelin
Control组在整个孵化的过程中不做任何处理；
E5-100组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液0.1ml；
E5-150组在E5胚龄时每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液0.1ml，
E5-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0.1ml；
E15-100组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为100ng/ulghrelin溶液0.1ml，
E15-150组在E15胚龄时每枚蛋注射浓度为150ng/ulghrelin溶液0.1ml。
E15-醋酸组在E5胚龄时每枚蛋注射醋酸0.1ml；
ghrelin溶液的配方：鼠ghrelin粉末，用浓度为0.1％醋酸稀释。
卵内喂食的具体步骤：E5(开始孵化的第五天)胚龄时，通过照蛋器照蛋发现卵白的位置在气室的正下方，E15胚龄时，通过照蛋器照蛋，发现卵白的位置在气室的斜下方，标出注射位点。采用22G针头卵白注射ghrelin溶液，注射后，玻璃纸蜡封注射口，继续孵化，此时，孵化器摇蛋按钮关闭，24小时后，蜡封的口凝固后，重新打开摇蛋按钮，继续孵化。
1.3组织取材
雏鸡出壳后新生雏鸡称重，记录。按100㎎/100g体质量乌拉坦麻醉，然后颈椎脱臼处死，其中每组17只鸡取胸大肌、腓肠肌、用0.75％的生理盐水冲洗干净，用滤纸吸去多余的水分，再用万分之一的分析天平称重后置于4％的多聚甲醛磷酸缓冲液(PH7.4)中固定。每组另外3只鸡取胸大肌和腓肠肌称重，用于肌卫星细胞的培养。
2试验方法
2.1石蜡切片制作
将固定好的胸大肌、腓肠肌等组织置于水龙头下，流水冲洗24小时后置于梯度酒精脱水(50％酒精2h、60％酒精2h、70％酒精2h、80％酒精2h、90％酒精1h、100％酒精Ⅰ30min、100％酒精Ⅱ30min)，再放入二甲苯：无水酒精(1:1)Ⅰ、Ⅱ各1h，最后置于二甲苯中透明。透明后的组织顺次放入蜡Ⅰ、蜡Ⅱ各30min，最后放入蜡Ⅲ1h，包埋组织，制作蜡块。将组织蜡块切片机连续切片，厚度5μm，45℃水浴展片，捞片，55℃烤片机烤片，后置于37℃电热恒温干燥箱内24h备用。
2.2常规HE染色
(1)将脱蜡处理后的组织切片用蒸馏水洗涤干净；(2)苏木精溶液染色约10min；(3)用蒸馏水冲洗去多余的染液，0.5％盐酸乙醇溶液中1-3s(至镜检下细胞浆为无色时取出)；(4)蒸馏水洗涤3次，每次约5min，后自来水蓝化20min；(5)依次浸入50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、85％乙醇溶液，每级1-2min；(6)0.5％伊红乙醇溶液染色约2min；(7)依次浸入95％乙醇、无水乙醇中脱水(每级1-3min)；(8)二甲苯：无水乙醇(1:1)3min；(9)二甲苯透明处理10min，最后用中性树胶封片，封好后置于通风柜中晾干。
2.3PCNA(细胞增核抗原)免疫组化
1.石蜡切片经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各脱蜡5min，浓度递减梯度酒精3min，最后置蒸馏水中。
2.于0.01M的柠檬酸钠酸碱缓冲液中，微波修复(要求:调整火力使缓冲液温度保持在92-95℃，时间持续15min，冷却至室温)，暴露抗原。
3.0.01MPBS清洗3次，每次5min。
4.3％双氧水(用甲醇和30％双氧水配制)处理，置于湿盒室温避光孵育30min，封闭内源性的过氧化物酶。
5.0.01MPBS清洗3次，每次5min。
6.5％的山羊血清(用0.01PBS配制)处理，置于湿盒室温孵育30min，进一步抑制假阳性表达。
7.不清洗，甩去多余液体，加PCNA单抗(小鼠抗人，用0.01MPBS1:200倍稀释)，每张片上选择1-2片组织作为阴性对照，阴性对照加等量的0.01MPBS，4℃孵育过夜。
8.室温恒温1h。
9.0.01MPBS清洗3次，每次5min。
10.加二抗(山羊抗小鼠IgG，用0.01MPBS1:100倍稀释)，置于湿盒室温孵育2h。
11.0.01MPBS清洗3次，每次5min。
12.利用DAB显色试剂盒显色：1mL蒸馏水中，加入A试剂一滴，混匀，再依次加入B、C各一滴，混匀。滴加至切片上，置于湿盒室温避光孵育，显微镜下观察，控制显色时间(注意：在保证充分孵育的同时，又要防止背景颜色过深)，显色完成后，用蒸馏水漂洗干净。
13.苏木素复染2min，蒸馏水漂洗，自来水流水蓝化5min。
14.浓度递增梯度酒精脱水，梯度酒精3min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ5min，中性树胶封片。
15.结果判定：镜下PCNA免疫阳性细胞呈棕黄色或褐色。
16.利用Olympus显微照相系统拍照，IPP(Image-ProPlussoftware6.0)软件测量PCNA表达的光密度值。
2.4肌卫星细胞的培养与增值能力的测定
2.4.1肌卫星细胞的培养
按前述方法麻醉并处死雏鸡，在无菌条件下取胸大肌和腓肠肌，将脂肪、筋膜及结缔组织等去除，剪碎组织，胶原酶I37℃水浴35min，离心取上清，然后用0.25％胰蛋白酶37℃水浴消化25min，200目筛网过滤，收集滤液离心，先用基础培养基悬浮两次，离心后再用DMEM完全培养基重新悬浮细胞，将细胞悬液放置到未经粘片剂处理的细胞甁中，采用差速贴壁法1h去除夹杂的成纤维细胞，然后将细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养。
2.4.2卫星细胞数量与存活率的测定
1.细胞数目在显微镜下使用血球计数板统计4个大正方格内的细胞数目再除以4，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每mL中的细胞数量。
2.存活率台盼蓝染色，利用染料会渗入死细胞中呈现蓝色，活细胞因细胞膜完整而不会呈色的原理进行统计。
2.4.3卫星细胞增殖能力的测定
测定原理根据活细胞，特别是增殖期细胞可以通过线粒体能量代谢过程中的玻珀酸脱氢酶的作用，将淡黄色的四甲基偶氮哇盐(MTT)还原为蓝色的结晶沉积于细胞内或周围，蓝色结晶的量与细胞增殖程度呈现正相关。非增殖状态或增殖程度小的细胞能量代谢比活化的、处于增殖状态的细胞要弱，所以产生蓝色结晶的量也少，而活化的增殖细胞其能量代谢异常活跃，故产生蓝色结晶也多，通过比色法测定蓝色结晶的量即可判断细胞增殖情况。
操作步骤胸大肌卫星细胞增殖反应于96孔培养板每孔加入1×105个/mL分离的原代卫星细胞悬液，每孔加200μL，对照孔加入等体积的培养液。置5％CO2，37℃培养72h。在离培养结束前6h，每孔加入10μLMTT(初始浓度为5mg/mL)，继续培养细胞至培养结束，然后每孔加100μL的10％SDS-0.04MHCl溶液，继续培养2h，用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定OD值。
3数据统计
利用SAS8.01进行数据统计，One-wayANONA分析，结果用平均数±标准差(MEAN±SD)。
二、实验结果
表1.卵内喂食ghrelin对刚出壳雏鸡骨骼肌质量的影响
胸大肌(g) 腓肠肌(g)
Control 0.62±0.021c 0.24±0.002c
E5-100 0.90±0.019a 0.33±0.007a
E5-150 0.78±0.014b 0.26±0.005b
E5-醋酸 0.62±0.014c 0.24±0.001c
E15-100 0.81±0.015b 0.27±0.003b
E15-150 0.60±0.015c 0.22±0.006c
E15-醋酸 0.62±0.013c 0.23±0.004c
表1表明与对照组相比，鸡胚E5胚龄分别注射100和150ng/ul0.1ml以及E15胚龄注射100ng/ul0.1mlghrelin均能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的质量，但E5胚龄100ng/ul的浓度，提高的最多，但是E5胚龄和E15胚龄注射相同浓度的醋酸对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的影响不大，而E15胚龄注射150ng/ul0.1mlghrelin对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的质量有抑制作用，但与对照组相比，差异不显著。
2.卵内喂食ghrelin对刚出壳雏鸡肌纤维横截面积的影响
胸大肌(μm2) 腓肠肌(μm2)
Control 68.50±5.00c 70.88±4.57c
E5-100 91.87±3.42a 96.38±4.35a
E5-150 78.24±7.01b 94.89±5.4a
E5-醋酸 69.24±2.45c 77.85±3.24b
E15-100 82.39±4.52b 95.33±3.25a
E15-150 65.32±3.21c 69.54±4.22c
E15-醋酸 75.33±2.82bc 78.34±1.21b
表2表明，与对照组相比，鸡胚E5胚龄分别注射100和150ng/ul0.1ml以及E15胚龄注射100ng/ul0.1mlghrelin均能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的肌纤维的横截面积，但E5胚龄100ng/ul的浓度，提高的最多，但是E5胚龄和E15胚龄注射相同浓度的醋酸对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的影响不大，而E15胚龄注射150ng/ul0.1mlghrelin对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的横截面积有抑制作用，但与对照组相比，差异不显著。
3.卵内喂食ghrelin对刚出壳雏鸡肌纤维密度的影响
胸大肌(个/mm2) 腓肠肌(个/mm2)
Control 14.30±0.47a 14.66±0.27a
E5-100 9.98±0.44d 10.88±0.34d
E5-150 11.14±0.63c 12.95±0.65bc
E5-醋酸 12.89±0.22b 13.48±0.68b
E15-100 12.99±0.89b 11.14±0.52c
E15-150 12.62±0.74b 12.92±0.54bc
E15-醋酸 15.83±0.53a 15.54±0.23a
表3表明，与对照组相比，鸡胚E5胚龄分别注射100和150ng/ul0.1ml以及E15胚龄注射100ng/ul0.1mlghrelin在鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌的肌纤维的密度显著低于对照组，但E5胚龄100ng/ul的浓度，降低的最多，E5胚龄和E15胚龄注射相同浓度的醋酸对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的影响不大，而E15胚龄注射150ng/ul0.1mlghrelin对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的密度略高于对照组相比，但差异不显著。
结果1、2、3表明，在鸡胚发育的早期(E5胚龄)注射低浓度(100ng/ul)的ghrelin能极大提高鸡胚出壳时胸大肌和骨骼肌的质量，增加肌纤维横截面积、促进肌纤维的分化。而鸡胚发育晚期(E15胚龄)高浓度ghrelin(150ng/ul)则具有一定的抑制作用。
4.卵内喂食ghrelin对刚出壳雏鸡肌卫星细胞相对数量的影响
胸大肌(×104个/g) 腓肠肌((×104个/g))
Control 3.01±0.04c 3.23±0.01c
E5-100 5.12±0.03a 4.88±0.07a
E5-150 4.85±0.07a 4.72±0.10a
E5-醋酸 3.94±0.01c 3.54±0.02b
E15-100 4.57±0.09ab 4.75±0.08a
E15-150 2.95±0.06c 3.14±0.33c
E15-醋酸 3.95±0.09b 3.59±0.02b
表4表明，与对照组相比，鸡胚E5胚龄分别注射100和150ng/ul0.1ml以及E15胚龄注射100ng/ul0.1mlghrelin均能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌肌卫星细胞的相对数量，但E5胚龄100ng/ul的浓度，提高的最多；E5胚龄和E15胚龄注射相同浓度的醋酸对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的影响略小，而E15胚龄注射150ng/ul0.1mlghrelin对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌肌卫星细胞的相对数量有抑制作用，但与对照组相比，差异不显著。
5.卵内喂食ghrelin对刚出壳雏鸡肌卫星细胞增值能力的影响
胸大肌(OD值) 腓肠肌(OD值)
Control 0.31±0.011c 0.26±0.011d
E5-100 0.49±0.021a 0.40±0.014a
E5-150 0.45±0.032ab 0.36±0.013b
E5-醋酸 0.38±0.015b 0.29±0.007d
E15-100 0.44±0.022ab 0.33±0.022c
E15-150 0.29±0.011c 0.24±0.014d
E15-醋酸 0.38±0.014b 0.33±0.010c
表5表明，与对照组相比，鸡胚E5胚龄分别注射100和150ng/ul0.1ml以及E15胚龄注射100ng/ul0.1mlghrelin均能显著提高鸡胚出壳时胸大肌和腓肠肌肌卫星细胞的增值能力，但E5胚龄100ng/ul的浓度，提高的最多；E5胚龄和E15胚龄注射相同浓度的醋酸对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌的影响略小，而E15胚龄注射150ng/ul0.1mlghrelin对鸡胚出壳时胸大肌、腓肠肌肌卫星细胞增殖有抑制作用，但与对照组相比，差异不显著。
4、5表明，在发育的早期(E5胚龄)注射低浓度(100ng/ul)的ghrelin能极大提高鸡胚出壳时胸大肌和骨骼肌肌卫星细胞的增值能力和活性。而鸡胚发育晚期(E15胚龄)高浓度ghrelin(150ng/ul)则具有一定的抑制作用。
结论:由于鸡胚出壳时体重每增加1g，出售时就能增加8-10g，而胴体重量是肉鸡出售时一个重要指标，而且鸡胚出壳时卫星细胞数量直接影响雏鸡后期生长过程中骨骼肌的生长、维持和再生，因而以上的研究结果表明鸡胚E5胚龄注射100ng/ul)ghrelin能显著提高新生雏鸡的生长性能。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第五天至第十五天之间向卵白内注射至少一次ghrelin溶液。
2.根据权利要求1所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，所述ghrelin溶液的浓度为100-150ng/ul，每次每蛋注射量为0.1ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第五天和第十五天时，分别向卵白内注射一次ghrelin溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
6.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为100ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
7.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，在受精蛋开始孵化的第十五天时，每枚蛋注射浓度为150ng/ul的ghrelin溶液0.1ml。
8.根据权利要求1或2所述的一种利用ghrelin提高新生雏鸡生长性能的方法，其特征在于，所述的ghrelin来源是鼠。
9.ghrelin在促进新生雏鸡生长性能中的应用。
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