CN109735499A - 新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用。所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT‑NBSC，其保藏编号CCTCC NO：C2018201。试验发现，hTERT‑NBSC可以连续传代65代以上，且生长增殖特性保持不变。该细胞系对接种ORFV较为敏感，可以高效增殖ORFV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞系所增殖的ORFV病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞相当，且细胞分种率高于NBSC，分种率可达1:3。同时利用该传代细胞系来制备疫苗，简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病疫苗的质量稳定。因此，本发明的提出对羊传染性脓疱病疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

Description

新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明涉及一种永生化细胞系及其建立方法和应用，特别涉及一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和在培养、增殖培养羊传染性脓疱病毒中的应用。本发明属于细胞工程技术领域。

背景技术

睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)是生精小管基膜上的上皮细胞，是生精小管内唯一的体细胞。在结构上为生精细胞的分化成熟提供支架，为生精细胞提供支持、营养和保护作用，被称为生精细胞的“保姆细胞”。在精子的分化成熟过程中，支持细胞不但向生精上皮传递促性腺激素，控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程，而且对精细胞具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能。其分泌的雄激素结合蛋白(androgen binding protein,ABP)、苗勒氏管抑制物质(mullerian inhibitingsubstance,MIS)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、转化生长因子β(TGFβ)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、白介素1和6(IL1，IL6)、生精生长因子(spermatogenic growth factor,SGF)、神经营养素3(neurotrophin3,NT3)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等，参与生精细胞的分化成熟并协调和保证精子的发生正常有序进行。

睾丸支持细胞强大的分泌功能和免疫豁免功能，已成为细胞联合培养、组织工程及器官移植领域的研究热点之一，在临床移植领域中也具有良好的应用前景。研究发现将大鼠胰岛细胞和大鼠睾丸支持细胞联合微囊化后培养11d，胰岛细胞和支持细胞联合微囊化组的胰岛功能明显好于胰岛细胞和支持细胞分别微囊化的共同培养组及胰岛单独微囊组。将这种联合培养的微囊胰岛置入门静脉可能是未来临床治愈糖尿病的重要途径。另外,发现支持细胞在体外对胰岛B细胞的增殖有显著的促进作用,同时可以使胰岛细胞由成熟状态逆转为幼稚状态,并使胰岛素的分泌水平显著高于对照组。近年有学者将睾丸支持细胞与干细胞体外共培养，结果发现睾丸支持细胞对体外培养的干细胞有促进干细胞的生长的作用。

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagious pustular dermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

该病最早发现于欧洲，目前，几乎所有养羊国家和地区均存在。现有流行病学调查研究资料显示，成年羊群中即使采用抗病毒药物以及抗生素治疗，发病率仍为60％，死亡率为24.7％，羔羊的死亡率高达93％。因此，该病一旦发生，将给养羊户造成重大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展，更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为感染者手背、指间和前臂部出现疱疹和破溃。例如2005年8月中国福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病,2013年6月云南省玉溪市江川县动物疾病预防与控制中心一名工作人员在给发病羊采样和拍照时不慎被羊咬伤手指而感染该病。因此，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。

对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以持续增殖该病毒的细胞是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。ORFV可在牛、羊的皮肤细胞、肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长，并产生细胞病变，但是病毒滴度低,据最近研究表明利用胎羊鼻甲骨粘膜上皮细胞(OFTu)分离羊传染性脓疱病毒具有细胞培养方便、分离病毒效率高、病毒增殖效价高等优点，但存在获取该细胞比较复杂(需要羊胚胎),在疫苗生产中需要大量的动物提供组织等问题。

在中国，虽然青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所已研制出羊传染性脓疱弱毒疫苗，但其制备工艺复杂、落后，繁殖羊传染性脓疱弱毒抗原必须用新生牛睾丸原代细胞。而制备这种细胞程序复杂，生产成本高，生产效率较低下，这给疫苗厂规模化生产羊传染性脓疱弱毒疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊口疮抗原所用的新生牛睾丸品种不一，这就很难保证生产的弱毒疫苗的质量稳定性，此外，新生牛睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此，研发一种适于羊传染性脓疱病毒增殖的传代细胞系，对疫苗企业具有非常重要的现实意义。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明发明人采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入前期已建立的有限传代细胞系—新生牛睾丸支持细胞系NBSC(保藏编号CCTCC NO：C201438)中，对新生牛睾丸支持细胞系NBSC进行永生化改造。获得新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系(hTERT-NBSC)。

在本发明中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号CCTCC NO：C2018201，保藏时间为2018年10月12日。

本发明的一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC是通过以下步骤制备得到的：

(1)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT分别导入前期已建立的有限传代细胞系—新生牛睾丸支持细胞系NBSC(保藏编号CCTCC NO：C201438)中，利用浓度为300μg/mL的G418进行筛选，得到抗G418阳性细胞克隆，从筛选的抗G418阳性细胞克隆中提取RNA，利用RT-PCR方法检测发现，检测代次的抗G418阳性细胞均表达了hTERT基因。表明hTERT基因成功的转入NBSC细胞中，并得到有效表达。该筛选得到的抗G418阳性细胞命名为hTERT-NBSC。

(2)通过有限稀释法将步骤(1)获得的hTERT-NBSC细胞传至96孔板中，挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔，再扩大培养到获得单克隆的hTERT-NBSC细胞株。

(3)将筛选获得的单克隆hTERT-NBSC细胞株进行细胞生物学特性测定。

其中，将筛选获得的hTERT-NBSC单克隆细胞株分别接种6孔板，观察细胞分种率，细胞长满单层时间；接种ORFV细胞毒各单克隆细胞株产生CPE情况。hTERT-NBSC单克隆细胞株，分种率为1:3，长满单层时间48小时左右，接种ORFV细胞强毒75％产生CPE所需时间均为65小时左右。

其中，将筛选获得的hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#，进行连续传代，记录每一代次细胞长满单层的时间。hTERT-NBSC单克隆细胞株每传5代，接种同一代次的ORFV细胞强毒(lgTCID₅₀≥6.0)，观察ORFV对hTERT-NBSC单克隆细胞株的CPE，并测定其TCID₅₀。试验证实，hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#在传代至65代时，细胞株仍保持旺盛的活力。且对ORFV病毒保持很高的增殖能力，细胞产生CPE比较规律，病毒滴度(lgTCID₅₀)均在6.20以上。由此证明，hTERT-NBSC永生化细胞系已建立成功。

其中，将筛选获得的hTERT-NBSC单克隆细胞株，用MTT法检测细胞血清依赖性发现，hTERT-NBSC 3#，5#和NBSC细胞均不能在无血清培养基中生长，换液后第2d开始有细胞变圆、漂浮、死亡。50ml/L FBS的促增殖作用较弱，而100ml/L和200ml/L FBS则可显著促进两种细胞的增殖(p<0.05)，其中200ml/L FBS对hTERT-NBSC的促增殖作用较100ml/L浓度的更为明显，两者间差异显著(p<0.05)。这提示hTERT-NBSC和NBSC相比对血清依赖性无明显改变。

其中，取对数生长期的NBSC和hTERT-NBSC细胞，加秋水仙素至浓度0.1μg/m L继续培养4～6h。2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心5min，弃上清。50mmol/L KCl重悬细胞沉淀，室温低渗处理40min。然后加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定液30min，重悬后4℃离心，弃上清。继续加入固定液，重悬混匀后将细胞悬液滴加在4℃预冷的洁净玻片上，空气干燥。姬姆萨染色10min左右，常规脱水封片，油镜下观察染色体带型。hTERT-NBSC和NBSC两种细胞均有60条染色体；且仍为二倍体细胞，染色体形态结构正常。

其中，将第60代hTERT-NBSC 3#，5#永生化单克隆细胞株和第16代NBSC细胞，作为试验细胞组，同时，以Hela细胞为阳性对照组，CEF(鸡胚成纤维细胞)为阴性对照组，进行裸鼠接种试验。试验证实，hTERT-NBSC 3#,5#永生化单克隆细胞株和第16代NBSC细胞接种裸鼠后，试验期内裸鼠无不良症状，背部无肿物形成。接种后2月取材，组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别。接种Hela细胞的活细胞组裸鼠，在接种后7天，在接种部位出现肿块，在接种后30天时肿块大小约10mm(图6)。组织病理切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，可见大量核分裂相。证明hTERT-NBSC和NBSC细胞均无致瘤性。

进一步的，本发明还提出了所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC在培养、增殖羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入NBSC细胞中，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命。本发明通过试验发现，本发明的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC可以连续传代65代以上，且生长增殖特性保持不变。该细胞系对接种羊传染性脓疱病毒较为敏感，可以高效增殖ORFV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞系所增殖的病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞NBSC相当，且细胞分种率高于NBSC，分种率可达1:3；同时利用该传代细胞系来制备疫苗，简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病疫苗的质量稳定。因此，本发明的提出对羊传染性脓疱病疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

附图说明

图1为pCI-neo-hTERT表达载体图谱；

图2A、B为hTERT-NBSC阳性克隆细胞；

图3为hTERT-NBSC细胞阳性克隆hTERT基因RT-PCR检测；

其中：M:DL2000marker；1:hTERT-NBSC阳性克隆细胞第3代；2:hTERT-NBSC阳性克隆细胞第8代；3:hTERT基因阳性对照；

图4A-F为筛选的部分hTERT-NBSC单克隆细胞的显微镜照片；

图5为hTERT-NBSC和NBSC细胞对血清依赖性；

图6为Hela细胞接种裸鼠；

其中：A:Hela细胞接种后7天；B:Hela细胞接种后30天；C:hTERT-NBSC细胞接种后30天；D:CEF细胞接种后30天；

图7A、B为Hela细胞接种裸鼠肿瘤组织病理切片(HE染色400×)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[实施例1]新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系(hTERT-NBSC)的建立

1.1 pCI-neo-hTERT质粒转染NBSC细胞

从新生牛睾丸原代细胞中分离、纯化得到可有限传代20代的新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C201438，该细胞系已记载在公开号为CN103952377A，发明名称为“一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用”的专利申请中。按Invitrogen公司的Lipofectamine2000Regent转染说明书要求，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导(载体图谱如图1所示)入建立的新生牛睾丸支持细胞系NBSC(第16代)中，对NBSC传代细胞系进行永生化改造。

1.2新霉素(G418)最佳筛选浓度的确定

将NBSC(第16代)细胞制备成细胞悬液以1×10⁵个/mL接种到24孔板内。将G418在100μg/m L～1 000μg/mL范围内按每50μg/mL一个梯度，每孔中加入不同浓度的筛选培养液。每个梯度作4个重复孔。根据细胞生长情况，每2d更液一次。筛选10d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

试验证明，发现接种的NBSC细胞全部死亡的最低浓度是300μg/mL。选用该浓度作为本实验中永生化细胞hTERT-NBSC的最佳筛选浓度。

1.3 hTERT-NBSC阳性细胞的获得

将转染pCI-neo-hTERT质粒的NBSC细胞汇合80％时，弃去培养上清，更换新的细胞培养液并加入G418，使其终浓度为300μg/mL，连续培养两周，每2d换相同浓度G418细胞培养液；同时设NBSC未转染细胞为空白对照，逐日观察细胞生长及死亡情况。直到阳性克隆可见为止。将抗G418阳性克隆细胞扩大培养。得到抗G418阳性克隆(图2A、B)，从筛选的抗G418阳性克隆中提取RNA，利用RT-PCR方法检测转染细胞中外源性hTERT的表达。

检测结果如图3显示，在抗G418阳性克隆的两个不同代次的细胞中均能扩增出约为400bp的特异性片段，片段长度与预期一致。筛选出阳性细胞表达了hTERT基因，表明hTERT基因成功的转入NBSC细胞中。并得到有效表达。将该筛选得到的抗G418阳性细胞命名为hTERT-NBSC。

1.4 hTERT-NBSC单克隆细胞筛选

通过有限稀释法将hTERT阳性的hTERT-NBSC(16代)细胞传至96孔板中，挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔，再扩大培养到24孔板、6孔板。共获得15株hTERT-NBSC单克隆细胞株，将其依次命名为hTERT-NBSC 1#～15#，部分单克隆株的显微镜照片如图4A-F所示。

[实施例2]hTERT-NBSC生物学特性测定

2.1 hTERT-NBSC单克隆细胞生长特性及病毒增殖情况

将实施例1筛选的hTERT-NBSC单克隆细胞株1#～15#分别接种6孔板，观察其分种率(指将1瓶细胞瓶内的原代细胞可接种到多少个相同体积的细胞瓶内进行传代培养)，细胞长满单层时间；再将长满单层的hTERT-NBSC单克隆株细胞1#～15#接种ORFV细胞强毒(lgTCID₅₀≥6.0)，观察病毒对细胞产生CPE情况，结果见表1。

表1 hTERT-NBSC单克隆细胞生长特性及病毒增殖情况

由表1可见hTERT-NBSC各单克隆细胞株生长特性稳定，生长速度及细胞分种率都很一致，对ORFV细胞强毒产生CPE比较规律。

2.2 hTERT-NBSC细胞的传代及其对ORFV的增殖试验

将实施例1筛选的hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#，进行连续传代，记录每一代次细胞长满单层的时间。hTERT-NBSC单克隆细胞株每传5代，接种同一代次的ORFV细胞强毒(lgTCID₅₀≥6.0)，观察ORFV对hTERT-NBSC单克隆细胞株的CPE，并测定其TCID₅₀。

试验证实，hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#在传代至65代时，细胞株仍保持旺盛的活力。且对ORFV病毒保持很高的增殖能力，细胞产生CPE比较规律，病毒滴度(lgTCID₅₀)均在6.20以上。由此证明，hTERT-NBSC永生化细胞系已建立成功(结果见表2)。

表2 hTERT-NBSC单克隆细胞3#细胞的传代及其对ORFV的增殖情况

2.3 hTERT-NBSC单克隆细胞血清依赖性

用MTT法检测细胞血清依赖性，具体如下：

(1)第60代的hTERT-NBSC 3#，5#和第16代NBSC细胞按1×10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板。

(2)接种后24h，分别用50m L/L FBS、100m L/L FBS、200m L/L FBS的DMEM/F12培养液更换细胞液。每个梯度做3个重复孔，同时设3个空白孔。

(3)置37℃、条件分数比为5％CO2饱和湿度培养箱中孵育14h。

(4)加入10μL MTT(10mg/m L)反应液，37℃继续孵育2～4h，直至在显微镜下可见明显的针尖状的紫色结晶。

(5)加100μL DMSO至各孔中，包括空白孔，轻轻混匀。

(6)避光作用2～4h，在酶联免疫检测仪上测定光吸收值，测定波长为490nm。以空白孔调零，并绘制曲线图。

hTERT-NBSC 3#，5#和NBSC细胞均不能在无血清培养基中生长，换液后第2d开始有细胞变圆、漂浮、死亡。50ml/L FBS的促增殖作用较弱，而100ml/L和200ml/L FBS则可显著促进两种细胞的增殖(p<0.05)，其中200ml/L FBS对hTERT-NBSC的促增殖作用较100ml/L浓度的更为明显，两者间差异显著(p<0.05)。这提示hTERT-NBSC和NBSC相比对血清依赖性无明显改变(图5)。

2.4 hTERT-NBSC和NBSC细胞染色体核型分析

取对数生长期的hTERT-NBSC和NBSC细胞，加秋水仙素至浓度0.1μg/m L继续培养4～6h。2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心5min，弃上清。50mmol/L KCl重悬细胞沉淀，室温低渗处理40min。然后加入甲醇/冰醋酸(3:1)固定液30min，重悬后4℃离心，弃上清。继续加入固定液，重悬混匀后将细胞悬液滴加在4℃预冷的洁净玻片上，空气干燥。姬姆萨染色10min左右，常规脱水封片，油镜下观察染色体带型。hTERT-NBSC和NBSC两种细胞均有60条染色体，且仍为二倍体细胞，染色体形态结构正常。

2.5裸鼠致瘤试验

将第60代hTERT-NBSC 3#，5#永生化单克隆细胞株和第16代NBSC细胞，作为试验细胞组，同时，以Hela细胞为阳性对照组，CEF(鸡胚成纤维细胞)为阴性对照组，进行裸鼠接种试验。所有试验用细胞均同代次制备两份，将其分为活细胞组和细胞冻融裂解组(细胞冻融裂解组，在试验前反复冻融3次，以保证所有细胞彻底裂解)。每组样品各接种10只裸鼠，雌雄各半，每个样品各接种裸鼠2组，其中活细胞1组，冻融细胞1组，每只裸鼠颈后或背部前1/3处皮下接种细胞悬液，接种剂量0.2ml/只，细胞浓度10⁶～10⁷/0.2ml。

接种细胞悬液(活细胞和冻融破碎细胞)后，逐日观察并详细记录裸鼠的精神、饮食、排便以及肿瘤生长情况，用游标卡尺测量肿块、结节的长度、宽度。观察14天后，检查有无结节或肿瘤形成。如有结节或可疑病灶，应继续观察1-2周后断颈处死、剖检，进行病理组织学观察。对未发现结节或可疑病灶的裸鼠，对其中的一半裸鼠观察12周后剖检，对另一半裸鼠观察12周断颈处死后、剖检，采集裸鼠各个脏器和淋巴结，经10％戊二醛固定后，做病理切片，并进行病理组织学观察。

hTERT-NBSC 3#,5#永生化单克隆细胞株和第16代NBSC细胞接种裸鼠后，试验期内裸鼠无不良症状，背部无肿物形成。接种后2月取材，组织学观察表明接种区组织结构与未接种部位无明显区别。接种Hela细胞的活细胞组裸鼠，在接种后7天，在接种部位出现肿块，在接种后30天时肿块大小约10mm(图6)。组织病理切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，可见大量核分裂相(图7)。证明hTERT-NBSC 3#,5#单克隆细胞株和NBSC细胞系均无为致瘤性。

综上所述，本发明成功的将人端粒酶逆转录酶基因导入NBSC细胞中，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命。牛睾丸支持永生化细胞系hTERT-NBSC仍保持其父本细胞(NBSC)正常的生物学特性，且可以高效增殖ORFV病毒。该细胞系已于2018年10月12日送交武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：C2018201。

Claims (2)

1.新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2018201，保藏时间为2018年10月12日。

2.权利要求1所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系在培养、增殖羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)中的应用。