CN104611295A - 一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，包括步骤：取食蟹猴睾丸组织，获取高比例的睾丸间质细胞，完全培养基培养20～28h后更换新鲜培养液，继续培养，传代至形态均一的呈现成纤维状生长的睾丸间质细胞；利用携带Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染睾丸间质细胞，然后进行荧光标记细胞筛选，传代至稳定表达Egfp的细胞株；再筛选稳定表达Egfp的细胞株，鉴定出睾丸间质祖细胞以后，继续传代50代以上，最终建立了食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。转入Large T的睾丸间质祖细胞细胞系体外传代已超过62代，表达睾丸间质细胞标志蛋白CYP11A1，CYP17A1和STAR，同时也表达Pdgfral和Lifr等间质干细胞的标记基因，细胞外形维持成纤维状，证明了获得了特征的睾丸间质祖细胞系。

Description

一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系建立用培养液及使用培养液建立食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的方法和应用。

背景技术

成年动物睾丸组织内存在各级的间质细胞(leydig cells，LCs)和生精细胞、支持细胞、类肌细胞、血管和淋巴管等类型细胞。体外利用各类物理化学和免疫方法分离出单一类型的细胞是仍然很难做到，这在研究细胞生物学性质以及药物筛选等方面造成了一定困难。细胞系是研究细胞生物学性质和药物筛选的重要材料，建立细胞系是各类研究的首要基础。

睾丸间质类细胞包括睾丸间质干细胞(stem leydig cells，SLCs)、间质祖细胞(progenitor leydig cells，PLCs)、未成熟间质细胞(immatureleydig cells，ILCs)和具有分泌睾酮功能的成熟型的间质细胞(adultleydig cell，ALCs)组成。

自然状态下，真核细胞自发永生化几率非常小。利用转基因的方式将外源病毒的基因(SV40病毒、人乳头瘤病毒和EB病毒抗原)、原癌基因(Myc、Jun、Ras和Mdm2)和抑癌基因突变体(p53和pRB)等整合到细胞的基因组内，稳定表达以后，促使细胞周期和端粒发生改变，而获得体外无限增殖的能力。SV40Large T抗原几乎可以使任何一种细胞发生永生化，是建立永生化细胞系的最常用的方法。

目前，大鼠和小鼠间质细胞永生系已建立成功，而大动物和人的睾丸间质类细胞系还未建立，尤其是具有干性的SLCs和PLCs还未见相关报道。所以食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立对于研究睾丸间质细胞分化、间质类干细胞性质，以及男性睾酮分泌功能障碍相关疾病研究具有重要意义。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系建立用的培养液、以及用该培养液建立食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的方法和永生系的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系建立用的培养液，所述培养液为：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巯基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，0.8～1.2％非必需氨基酸，45～55μg/mL维生素C，950～1050IU/mL白血病抑制因子，15～25ng/mL重组人血小板衍生生长因子-BB和0.8～1.2％双抗的DMEM培养基。所述核苷酸为几种核苷酸的混合物；所述非必须氨基酸为几种非必须氨基酸的混合物。

在其中一个实施例中，所述培养液为：添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，50μg/mL维生素C，1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)，20ng/mL重组人血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)和含1％双抗的DMEM培养基。

本发明还提供了一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，0括以下步骤：

1)、取食蟹猴睾丸组织，根据间质细胞贴壁快的特征，获取高比例间质类细胞，并用完全培养基贴壁培养20～28h后更换新鲜培养液，继续培养，随后传代至细胞形态均一的呈成纤维状的睾丸间质细胞；

2)、利用携带LargeT和Egfp基因的慢病毒液侵染呈成纤维状生长、形态均一的睾丸间质细胞，进行细胞荧光标记筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；

3)将稳定表达Egfp的细胞株，利用单细胞培养方法进一步筛选出表达睾丸间质祖细胞标记的细胞系，然后所述的培养液传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。

在其中一个实施例中，步骤2)中所述传代的代数为7代。

在其中一个实施例中，步骤3)中所述细胞生物学检测为生长曲线绘制、细胞凋亡分析、细胞核型分析、特异性蛋白分析和致瘤性分析。

本发明还提供了上述建立方法建立的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。

本发明还提供了食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系在制备治疗男性睾酮分泌功能障碍相关疾病药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用慢病毒转基因方法，将LargeT和Egfp基因稳定整合到食蟹猴睾丸PLCs基因组内，通过大量培养体系统优化试验，最后获得能支持睾丸PLCs稳定增殖的培养体系，促使细胞体外稳定增殖传代，维持了未分化状态。此细胞系体外传代已超过62代，利用RT-PCR和免疫荧光技术检测，证明该细胞系表达PLCs Pdgfra、Lifr、Cyp11a1、Cyp17a1和Star的标记，不表达生殖细胞标记基因Vasa和Dazl，也不表达支持细胞标记基因Sox9、Fasl和Gdnf和类肌细胞标记a-SMA，也不表达ILCs的3β-Hsd的标记，证明了细胞系是比较单一的PLCs系。食蟹猴PLCs转入LargeT基因以后获得了永生，传代次数超过了62代，表达睾丸间质细胞标志蛋白CYP11A1，CYP17A1和STAR，同时也表达Pdgfra1和Lifr等间质干细胞的标记基因，细胞外形维持成纤维状，呈现出特征的间质祖细胞生物学特征。对比原代食蟹猴睾丸间质祖细胞，该细胞系显示出了快速增殖和维持干细胞的未分化状态；而原代的细胞在培养第2代开始分化，无法维持未分化状态，再超过7代以后开始发生退化。

附图说明

图1是本发明实施例1的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法流程图；

图2是本发明实施例1中获取相对高比例的原代睾丸间质细胞培养的形态学观察结果，其中，A：F1代食蟹猴睾丸成纤维细胞；B：F3代食蟹猴睾丸细胞；C：F4代食蟹猴睾丸间质细胞；D：F9代食蟹猴睾丸间质细胞；

图3是本发明实施例1中LargeT慢病毒包装与食蟹猴睾丸间质细胞侵染的检测结果，其中，A：F5代293FT细胞；B：慢病毒质粒系统共转293FT细胞24h后观察；C：F3代食蟹猴睾丸间质细胞病毒侵染后的白光图；D：F3代食蟹猴睾丸间质细胞病毒侵染后荧光图；E、F、G、H、I和J：依次为1μL、0.1μL、0.01μL、0.001μL、0.0001μL和0.00001μL浓缩病毒液侵染293FT 48h结果；

图4是本发明实施例1中食蟹猴PLCs的生长特征，其中，A、C、E和H：分别为F16、F27、F38和F48代食蟹猴PLCs白光下的照片；B、D、F和H：为对应荧光下照片；

图5是本发明实施例1中表达LargeTF52代食蟹猴间质祖细胞基因表达分析结果；

图6是本发明实施例1中表达LargeT食蟹猴间质祖细胞永生系免疫荧光检测结果，其中，A、E和I：白光下照片；B、F和J：蛋白免疫荧光照片；C、G和K：Hochest33342细胞核染色；D、H和L：细胞叠加结果；

图7是本发明实施例1中食蟹猴间质祖细胞永生系的生物学特征检测结果；其中，A：转入LargeT基因前后间质祖细胞生长曲线；B：永生食蟹猴PLCs凋亡分析结果；C：永生食蟹猴PLCs核型分析；D：永生食蟹猴PLCs致瘤性分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。

以下实施例中，所使用的抗体来源于：CYP11A1(兔源)和CYP17A1(兔源)单克隆抗体购于联科公司；STAR(兔源)购于(cellsignaling technology，CST)公司；Alexa Fluor 568荧光标记羊抗兔二抗购于Invitrogen公司；Hoechst 33342染细胞核试剂购于MolecularProbes公司；FBS，β-巯基乙醇，ITS，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，DMEM和双抗购于GIBICO公司；重组人血小板衍生生长因子-BB购于Peprotech公司，白血病抑制因子(LIF)和核苷酸购于Millipore公司，维生素C购于Sigma公司。

实施例1

请参阅图1，为本发明的一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法的路线图，包括以下具体步骤：

1)利用差速贴壁法获取相对高比例的睾丸间质细胞

将穿刺方法获取的食蟹猴睾丸组织经过两步消化法得到单细胞悬液，差速贴壁获得高比例食蟹猴睾丸间质细胞，原代食蟹猴睾丸间质细胞生长旺盛，折光性强，细胞核明显(如图2A)；完全培养基培养到F3代细胞开始出现分化，细胞形态也发生转变，由早期的梭形，三角形生长变成椭圆形，向成熟睾丸间质细胞转变，无法维持未分化状态(如图2B和2C)；到F9代以后，细胞铺开成树叶状，无法继续传代(如图2D)。

2)LargeT慢病毒包装与食蟹猴睾丸间质细胞侵染

F5代293FT细胞(如图3A)和携带Egfp穿梭质粒均购于购于Invitrogen公司。通过RT-PCR扩取293FT细胞的LargeT基因开放阅读框，然后构建到携带Egfp穿梭质粒，抽提好包装质粒和穿梭质粒，进行包装病毒，24h后观察，细胞转染率大于90％以上(如图3B)，48h和72h收获慢病毒液，通过超速离心机80000g离心2.5h收集病毒；通过荧光法测定病毒滴度，发现添加0.00001μL病毒液仍可见荧光，病毒滴度达到10⁸TU/mL(如图3J)。添加6μg/mLpolybrene病毒侵染细胞形态均一的食蟹猴睾丸间质细胞，侵染两次后细胞达到了几乎100％的感染率(如图3C和3D)，表达绿色荧光蛋白Egfp。

3)食蟹猴PLCs的生长特征

筛选出表达食蟹猴PLCs标记(Pdgfra、Lifr、Cyp11a1、Cyp17a1和Star)的细胞以后，优化培养液(添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，50μg/mL维生素C，1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)，20ng/mL重组人血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)和含1％双抗的DMEM培养基)，继续传代培养，体外传代次数超过62代，细胞保持快速增长的状态，表达Egfp，形态始终保持PLCs特征的成纤维状(如图4A、4C、4E和4H分别为F16、F27、F38和F48)。

4)表达LargeTF52代食蟹猴间质祖细胞基因表达分析

对比F3代的睾丸间质细胞，稳定表达LargeT的PLCs保持表达Pdgfra、Lifr、Cyp11a1、Cyp17a1和Star等间质祖细胞的标记，保持了间质祖细胞的基因表达特征，并保持未分化状态。未转入largeT的F3代间质细胞不能维持干细胞未分化状态，出现了分化(如图5)。

5)表达LargeT食蟹猴间质祖细胞永生系免疫荧光检测

利用表1的引物对进行RT-PCR扩增，结果显示，稳表达LargeT的食蟹猴PLCs表达类固醇代谢相关的酶基因。运用蛋白免疫荧光技术检测发现，食蟹猴PLCs细胞系表达CYP11A1，CYP17A1和STAR等蛋白(如图6)，20μLPCR扩增体系中包含：Premix(TAKARA)10μL，Primer F 0.4μL，Primer R 0.4μL，cDNA模板4μL，ddH₂O 5.2μL。在PCR仪内95℃变性3min后，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次以后72℃再延伸10min，降低4℃后进行电泳检测。

表1食蟹猴基因(Macaca fascicularis)RT-PCR检测引物信息

注：所有引物退火温度均设计在60℃

6)食蟹猴间质祖细胞永生系生物学特征检测

食蟹猴PLCs转入LargeT基因以后获得了永生，保持了干细胞特征，体外稳定增殖(如图7A)。利用磷脂结合蛋白V(Annexin V)-PI双染色法对食蟹猴PLCs进行凋亡分析发现凋亡比例低于5％(如图7B)，且染色体数目正常(2n＝42)(如图7C)，注射裸鼠时未出现畸胎瘤(如图7D)。而原代细胞在F2代开始分化，无法维持未分化状态，超过F7代发生退化。这些结果都证明获得了特征的睾丸PLCs永生系。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系建立用的培养液，其特征在于，所述培养液为：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巯基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，0.8～1.2％非必需氨基酸，45～55μg/mL维生素C，950～1050IU/mL白血病抑制因子，15～25ng/mL重组人血小板衍生生长因子-BB和0.8～1.2％双抗的DMEM培养基。

2.根据权利要求1所述的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系建立用的培养液，其特征在于，所述培养液为：添加了15％FBS，55μMβ-巯基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，1％非必需氨基酸，50μg/mL维生素C，1000IU/mL白血病抑制因子，20ng/mL重组人血小板衍生生长因子-BB和含1％双抗的DMEM培养基。

3.一种食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、取食蟹猴睾丸组织，获取高比例间质类细胞，并用完全培养基贴壁培养20～28h后更换新鲜培养液，继续培养，随后传代至细胞形态均一的呈成纤维状的睾丸间质细胞；

2)、利用携带Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染形态均一的呈成纤维状生长的睾丸间质细胞，进行细胞荧光标记筛选，传代至得到稳定表达Egfp的细胞株；

3)将稳定表达Egfp的细胞株，利用单细胞培养方法进一步筛选出表达睾丸间质祖细胞标记的细胞系，然后使用权利要求1或2所述的培养液传代50代以上，经细胞生物学分析检测，获得食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。

4.根据权利要求3所述的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，其特征在于，步骤2)中所述传代的代数为7代。

5.根据权利要求3所述的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系的建立方法，其特征在于，步骤3)中所述细胞生物学检测为生长曲线绘制、细胞凋亡分析、细胞核型分析、特异性蛋白分析和致瘤性分析。

6.权利要求1～5任一项所述的建立方法建立的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系。

7.权利要求6所述的食蟹猴睾丸间质祖细胞永生系在制备治疗男性睾酮分泌功能障碍相关疾病药物中的应用。