JP6964068B2 - 上皮細胞のエキソビボ増殖 - Google Patents
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Description
この特許出願は、2015年4月3日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PVとして指定される米国仮特許出願第62/142,851号の利益を主張する。この特許出願はまた、2015年9月11日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV2として指定される米国仮特許出願第62/217,406号の利益を主張する。この特許出願はまた、2016年2月12日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV3として指定される米国仮特許出願第62/294,896号の利益を主張する。本文、表および図面全体を含む上記出願の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
本技術は、部分的には、上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物に関する。
器官(例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚)は、とりわけ、器官特異的上皮細胞の存在によって特徴付けられ得る。上皮細胞は、各々のこのような器官の1種もしくはこれより多くの特異的機能によって規定され得る。特異的機能としては、例えば、肺におけるガス交換、腎臓における濾過、肝臓における解毒および抱合、膵島細胞におけるインスリン生成、または皮膚による環境中の有害状態からの保護が挙げられ得る。このような器官の疾患または変性はしばしば、衰弱させるかまたは生命を脅かすものである。なぜなら変性または喪失した器官構造は、容易には置き換えられず、かつ1つの器官の特殊化された細胞は一般に、別の器官の機能を肩代わりすることはできないからである。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
方法である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
分化した組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、20回以下の集団倍加が可能である、
方法。
(項目2)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、
方法。
(項目3)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、
方法。
(項目4)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、
方法。
(項目5)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、第1の薬剤であり、
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、そして
前記コントロール培養条件は、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、
項目1に記載の方法。
(項目6)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む。項目2、3または4に記載の方法。
(項目7)
前記起源上皮細胞集団を単離する工程を包含する、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記起源上皮細胞集団は、分化した組織から単離される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞(iPSC)培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目11)
前記起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される、項目7に記載の方法。
(項目12)
前記サンプルは、組織生検材料、血液、尿、糞便、口内スワブ、および羊水のうちの1種もしくはこれより多くから選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記起源上皮細胞集団および/または前記拡大した上皮細胞集団は、胚性幹細胞を含まない、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1種もしくはこれより多くを発現する、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、Lgr5を発現しない、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/またはトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、項目27または28に記載の方法。
(項目30)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R 1 、R 2 およびR 3 は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R 4 、R 5 およびR 6 は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
項目27〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、項目27〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞骨格構造を調節する薬剤は、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1種もしくはこれより多くを含む、項目1〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記Rhoキナーゼインヒビターは、Rho関連プロテインキナーゼ1(ROCK 1)インヒビターおよびRho関連プロテインキナーゼ2(ROCK 2)インヒビターから選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記Rho関連プロテインキナーゼインヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連プロテインキナーゼインヒビターを含む、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記1種もしくはこれより多くのRho関連プロテインキナーゼインヒビターは、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、PAK1インヒビター、PAK2インヒビター、PAK3インヒビターおよびPAK4インヒビターから選択される、項目32〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターは、IPA3を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記ミオシンIIインヒビターは、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目32〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、ブレビスタチンを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤をさらに含む、項目1〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤は、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストは、イソプロテレノールを含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記拡大培養条件は、無血清培養条件である、項目1〜44のいずれか1項に記載の方法。
(項目46)
前記拡大培養条件は、規定された無血清培養条件である、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記拡大培養条件は、ゼノフリー培養条件である、項目1〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
前記拡大培養条件は、規定されたゼノフリー培養条件である、項目1〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記拡大培養条件は、300μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記拡大培養条件は、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記カルシウムは、約90μMの濃度で存在する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、項目1〜51のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子は、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記拡大培養条件は、異質な成分を含む細胞外マトリクスを含まない、項目1〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、30回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目56)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、50回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目57)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、80回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目58)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、100回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
前記方法は、連続して増殖している上皮幹細胞および/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団を選択する工程を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
前記起源上皮細胞集団は、連続して増殖している上皮幹細胞を含まないおよび/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団に由来する細胞を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を単離する工程をさらに包含する、項目1〜60のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに包含する、項目1〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
項目1〜62のいずれか1項に記載の方法によって生成される、エキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
(項目64)
遺伝子改変された細胞の生成のための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目65)
被験体に対する1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目66)
被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目67)
被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞(例えば、エキソビボで増殖させた上皮細胞)はしばしば、フィーダー細胞の集団と共培養されるおよび/またはフィーダー細胞由来の馴化培地中で培養される。しかし、フィーダー細胞を拠り所にすることには、上皮細胞をどこでおよびどのようにして培養するかに制限があり得、そして上皮細胞を培養するコストを顕著に増大し得る。フィーダー細胞に由来する規定されていない生物学的因子によって引き起こされる細胞培養物の変動性に起因して、フィーダー細胞の使用は問題ともなり得る。変動性は、一貫しない結果をもたらし得、これは、再現性の欠如に起因してデータ解釈を困難にする。フィーダー細胞はまた、望ましくない因子(例えば、レトロウイルス、他の病原体、および免疫原性の非ヒトシアル酸(例えば、Neu5Gc))を培養上皮細胞の中に導入する可能性を有する。このような培養条件は、ある特定の適用(例えば、移植のような)に望ましくない可能性がある。
上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞、または上皮は、代表的には、中空の器官を裏打ちする細胞、ならびに腺および身体の外表面を構成する細胞をいう。上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞または移行上皮細胞を含み得る。上皮細胞は、器官および位置に依存して、単層で配置され得るか、または複数層で配置され得る。
細胞培養のための方法および組成物が本明細書で提供される。特に、拡大培養条件が本明細書で提供される。細胞培養、または培養は、代表的には、人工的なインビトロ環境における細胞の維持、または外部のエキソビボ環境(すなわち、生物の外側)における細胞の維持をいい、個々の細胞および組織の培養を包含し得る。本明細書で記載されるある特定の細胞培養システムは、エキソビボ環境および/またはインビトロ環境であり得る。いくつかの実施形態において、初代細胞が単離される。いくつかの実施形態において、初代細胞は、単一針生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、組織生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、引き抜いた毛髪から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、尿または体腔の流体のような体液から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、被験体の循環から単離され得る。
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
F=2n 方程式B
細胞は、フィーダー細胞ありまたはなしで培養され得る。一般に、フィーダー細胞は、ある特定の細胞培養システムのために他の細胞タイプと共培養される細胞である。フィーダー細胞は、代表的には、増殖していない細胞であり、ときおり、増殖を阻害するように処理され、しばしば、生存して代謝的に活性な状態で維持される。例えば、フィーダー細胞は、γ線照射で照射され得るおよび/またはマイトマイシンC(これは、細胞分裂を停止し得ると同時に、代謝的に活性な状態でフィーダー細胞を維持し得る)で処理され得る。
細胞は、代表的には、細胞培養培地の存在下で培養される。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、無血清培地;血清含有培地;血清低減培地;タンパク質非含有培地;化学的に規定された培地;タンパク質非含有の化学的に規定された培地;ペプチド非含有タンパク質非含有の化学的に規定された培地;動物性タンパク質非含有培地;ゼノフリー(xeno−free)培地のような培地のうちのいずれかのタイプを含み得る。細胞培養培地は、代表的には、水性ベースの培地であり、例えば、ダルベッコ改変必須培地(DMEM)、ノックアウト−DMEM(KODMEM)、ハムF12培地、DMEM/ハムF12、改良型DMEM/ハムF12、ハムF−10培地、RPMI 1640、イーグル基礎培地(EBM)、イーグル最小必須培地(MEM)、グラスゴー最小必須培地(G−MEM)、199培地、ケラチノサイト−SFM(KSFM;Gibco/Thermo−Fisher)、前立腺上皮増殖培地(PrEGM;Lonza)、CHO細胞培養培地、PER.C6培地、293培地、ハイブリドーマ培地などのような市販のおよび/または古典的な培地のうちのいずれか、ならびにこれらの組み合わせが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する工程を包含する。TGF−βシグナル伝達は、種々の細胞タイプにおいて増殖、細胞分化、および他の機能を制御し、細胞周期制御、免疫系の調節、およびある特定の細胞タイプにおける発生において役割を果たし得る。TGF−βシグナル伝達の阻害は、任意のTGF−βシグナル伝達経路および/またはTGF−βスーパーファミリーのメンバー(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック(decapentaplegic)およびVg−1のようなリガンド;TGF−βタイプIレセプター、TGF−βタイプIIレセプター、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8のようなレセプター;ならびにR−SMADおよび他のSMADタンパク質(例えば、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5)のような下流のエフェクターが挙げられる)の阻害を含み得る。
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程を包含する。PAKタンパク質、セリン/スレオニンp21活性化キナーゼのファミリーは、PAK1、PAK2、PAK3およびPAK4を含み、そして一般に、GTPaseのRhoファミリーを細胞骨格再組織化および核シグナル伝達に関連させるように機能する。これらタンパク質は、Cdc42およびRacに関する標的であり、種々の生物学的活動において機能し得る。PAK1は、例えば、細胞運動性および形態を調節し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてPAK1の活性を阻害する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))の活性を阻害する工程を包含する。ミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))は、ATP依存性モータータンパク質のファミリーのメンバーであり、筋収縮および他の運動性プロセス(例えば、アクチンベースの運動性)において役割を果たす。非筋肉ミオシンII(NM II)は、アクチン架橋および収縮特性を有し、その軽鎖および重鎖のリン酸化によって調節されるアクチン結合タンパク質である。収束性シグナル伝達経路の下流にあるその位置のおかげで、非筋肉ミオシンII(NM II)は、細胞接着、細胞移動および組織構築の制御に関与する。より高次の真核生物において、非筋肉ミオシンIIは、Ser19/Thr18においてその調節性軽鎖(MLC)のリン酸化によって活性化される。MLCリン酸化は、アクトミオシン収縮装置のアセンブリおよびその収縮性の両方を制御する。酵素の2つの群が、一般に、MLCリン酸化を制御する。一方の群は、MLCをリン酸化し、活性を促進するキナーゼ(MLCキナーゼ)を含む。他方は、MLCを脱リン酸化し、活性を阻害するホスファターゼである。いくつかのキナーゼは、インビトロで、ある場合にはインビボで、Ser19/Thr18においてMLCをリン酸化し得る。これらは、例えば、MLCK、ROCK、PAK(p21活性化キナーゼ)、シトロンキナーゼ、ILK(インテグリン結合キナーゼ)、MRCK(筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ関連、cdc42結合キナーゼ)およびDAPK(ZIPKを含む細胞死関連プロテインキナーゼ(death−associated protein kinase))を含む。平滑筋細胞および非筋細胞に存在する主要なミオシンホスファターゼは、3つのサブユニットを含む:130kDaの大きなサブユニット(ミオシンホスファターゼ標的化サブユニットMYPT1といわれる(M130/133、M110またはMBSとも称される))、38kDaの触媒サブユニット(タイプ1プロテインホスファターゼのδアイソフォーム、PP1c)および20kDaの小さいサブユニット。Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)は、MYPT1を阻害することによって、およびMLCを直接リン酸化することによって、ミオシンIIを活性化し得る。PAK1は、異型プロテインキナーゼC(aPKCζ)のリン酸化を通じてミオシンIIを活性化し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含しない。Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)は、タンパク質のRho GTPaseファミリーに属し、このファミリーは、Rho、Rac1およびCdc42キナーゼを含む。Rhoのエフェクター分子は、ROCKであり、これは、RhoのGTP結合形態に結合するセリン/スレオニンキナーゼである。ROCKの触媒性キナーゼドメインは、セリン/スレオニンキナーゼに特徴的な保存されたモチーフを含み、N末端において見出される。ROCKタンパク質はまた、中心のコイルドコイルドメインを有し、これは、Rho結合ドメイン(RBD)を含む。そのC末端は、プレクストリン相同(PH)ドメインと内部システインリッチドメインとを含む。上記コイルドコイルドメインは、他のαらせんタンパク質と相互作用すると考えられる。RBD(上記コイルドコイルドメイン内に位置する)は、活性化したRho GTPase(RhoA、RhoB、およびRhoCを含む)と相互作用する。上記PHドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンのような脂質メディエーターと相互作用すると考えられ、タンパク質局在化において役割を果たし得る。上記PHドメインおよびRBDとキナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害ループを生じる。さらに、上記キナーゼドメインは、RhoEへの結合に関与し、これはROCK活性の負の調節因子である。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ある特定の時間量の後に、上記で記載される培養条件から除去され得、その後の環境へと置かれ得る。上記で記載される成分のうちのいずれも、その後の環境に存在しなくてもよい。いくつかの実施形態において、上記の1種もしくはこれより多くのインヒビターは、その後の環境に存在しない。例えば、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、ROCKインヒビター、PAK1インヒビターおよびミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)のうちの1種もしくはこれより多くは、その後の環境に存在しなくてもよい。
ある特定の実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、ある特定の生物医学的使用および実験使用(例えば、生体分子生成(例えば、タンパク質発現)、診断剤(例えば、異常な上皮細胞の同定)および/または治療剤(例えば、候補治療剤のスクリーニング;細胞療法(例えば、細胞療法のための遺伝子改変された細胞))のようなのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、自家適用(例えば、自家移植)のために使用され得、そしてある特定の場合には、拡大した上皮細胞集団は、非自家適用(例えば、薬物スクリーニング)のために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、集められ得るおよび/または単離され得るおよび/または貯蔵され得る(例えば、細胞バンクのために)。
この実施例に示される材料および方法を、別段注記される場合は除いて、実施例2〜9に記載される細胞培養および他のアッセイを行うために使用した。
上皮細胞(前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞)を、実施例2〜5および図1〜17に示されるように、培養培地を使用して組織培養容器の中に3,000〜10,000個の生細胞/cm2でプレーティングし、37℃において5% CO2とともにインキュベートした。上記培地を2日または3日ごとに交換した。細胞が約70〜90% コンフルエントになった場合に、それらを、標準的トリプシン処理法を使用して継代培養した。総細胞数を、製造業者の説明書に従って、Countess II Automated Cell Counter(Life Technologies,AMQAX1000)を使用して決定した。
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
ここでn=所定の継代培養の最後の最終PD数、Y=採取時点での細胞収量、I=その継代培養を始めるために接種物として使用される細胞数、およびX=定量している継代培養を開始するために使用される接種物の倍加レベル。
総RNAを、TRIzol(登録商標) Plus RNA Purification Kit(Life Technologies、12183−555)およびPureLink(登録商標) RNA Mini Kit(Life Technologies, 12183018A)を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。100ナノグラムの総RNAを、TaqMan(登録商標) RNA−to−CTTM 1−Step Kit(Life Technologies, 4392938)を使用して、供給元によって提供されたプロトコルに従って、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)発現の決定のために使用した。使用したhTERTプライマーおよびTaqmanプローブは、以下のとおりであった:正方向プライマー、5’−TGACACCTCACCTCACCCAC−3’(配列番号1)、逆方向プライマー、5’−CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC−3’(配列番号2)およびTaqmanプローブ、5’−ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG−3’(配列番号3)。
この実施例において、前立腺上皮細胞(PrEC)および気管支上皮細胞(HBEC)を、従来の細胞培養培地(すなわち、コントロール培養条件)中で増殖させて、インビトロおよび/またはエキソビボでの上皮細胞増殖のある特定の特性を示した。
この実施例において、上皮細胞におけるhTERT発現を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、またはその両方の存在下で評価した。hTERT遺伝子の発現を、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムPCRによって試験した。上記細胞を、ALK5インヒビター、A83−01、またはRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、Y−27632、またはその両方のインヒビターで、KSFM中の種々の継代において処理した。A83−01は、以下で記載されるように、上皮細胞におけるhTERT発現を迅速に誘導しかつ持続させた。
この実施例において、上皮細胞プレーティング効率、すなわち、細胞培養表面に効率的に付着して、分裂し、コロニーへと増殖し続ける細胞の数を、種々の条件下で調べた。
この実施例において、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
この実施例において、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
ウシ下垂体抽出物を、KSFM中のおよび多くの無血清細胞培養培地中の有糸分裂促進性補充物として使用する。その有糸分裂促進性活性に加えて、BPEは、種々の規定されていないタンパク質、脂質およびホルモンを含む。上皮細胞が増殖し得る1種もしくはこれより多くの規定された培地組成物を同定するために、さらなる培養培地組成物を試験した。具体的には、上皮細胞を、ALK5インヒビターおよびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)を含む種々の規定された培地組成物の中で増殖させ、これら細胞集団の増殖を評価した。規定された培地組成物は、M*(MCDB−153(改変)培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1、この製剤は、ワールドワイドウェブアドレス bioind.com/page_16682および以下の表2Bにおいて見出され得る)+表皮増殖因子(EGF)+酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)+A83−01+Y−27632);脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma、A8806);イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン(rHA; Sigma、A9731);脂質ミックス(Chemically Defined Lipid Concentrate;Gibco、11905−031);およびALBUMAX I Lipid−Rich BSA(Gibco, 11020−039)から選択される1種もしくはこれより多くの成分を含んだ。MCDB−153(Sigma Aldrich、M7403)および改変MCDB−153(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)中のある特定の成分、ならびにそれらの濃度を、以下の表2Aおよび2Bに示す。この脂質ミックスは、エチルアルコールおよび以下の表3に列挙される成分を含む。ALBUMAXは、BSAおよび以下の脂肪酸を各々、1g BSAあたり約0.5〜2.2mgの間で含む:α−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸。
この実施例において、遺伝子発現プロフィールを、種々の無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
この実施例において、ある特定の特徴を、種々のフィーダーなしかつ無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した継代2のヒト気管支上皮細胞を、KSFM+A+Y条件から除去し、単一細胞としてマトリゲル(登録商標)中に埋め込み、CloneticsTM B−ALITM 気相液相界面培地(高カルシウム分化培地、Lonza)中で14日間培養した。図31は、気管支球状物へと分化した気管支上皮細胞を示す。図31の上パネルは、低倍率(4×)で見た細胞を示し、図31の下パネルは、高倍率(20×)で見た細胞を示す。目に見える内腔を有する大きな気管支球状物は、図31の下パネルに示される。
ドーム様構造は、高濃度のCaCl2の存在下で、ケラチノサイトおよび気管支上皮細胞培養物中で形成した。具体的には、低CaCl2(90μM)において1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した後期継代のヒト気管支上皮細胞(HBEC)および後期継代のヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、6ウェルプレート中でコンフルエントに達するようにした。上記細胞を、KSFM+A+Y条件の中に残し、CaCl2濃度を、上皮細胞の分化を誘導するために1.5mMへと上昇させた。多くのドーム様構造が7〜10日後に形成された。これを図32A〜図32Dに示す。
単一細胞クローニングおよびケラチノサイトの拡大を調べた。具体的には、後期継代での単一ヒト包皮ケラチノサイト(HFK)(KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で予め培養)を、コラーゲンIを被覆した384ウェルプレートの上にプレーティングし、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で培養した。10日間にわたって、細胞は1000個より多くの細胞へと分裂し、図36に示されるようにコロニーを形成した。
種々の組織に由来する上皮細胞を培養して、種々の培養培地中での拡大に関するそれらの能力を評価した。上記細胞を、ThermoFisher/Gibco(HFKnおよびHEKa)またはLonza(HMEC、PrEC、HBEC、SAECおよびDHBE−CF)から得た。式F=2n(ここでF=n回の集団倍加後の拡大の倍数)を使用して倍数拡大を計算した。その結果を以下の表5に示す。
実施例10: 実施形態の例
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法。
A2.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法。
A3.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A3〜A3.3のいずれか1つの方法。
A4.1 (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態A2〜A3.4のいずれか1つの方法。
a)フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程
b)前記分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程
b)前記以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程
b)前記系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.3 TGF−βシグナル伝達が(b)において阻害される、実施形態A5、A5.1またはA5.2の方法。
A5.4 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態A1〜A5.3のいずれか1つの方法。
A5.5 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態A1〜A5.4のいずれか1つの方法。
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態A16〜A18のいずれか1つの方法。
A24.1 前記方法が、前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態A1〜A24のいずれか1つの方法。
A24.2 前記方法が、
a)前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
b)前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程
を含む、実施形態A1〜A24.1のいずれか1つの方法。
A37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A37の方法。
A37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態A37またはA37.1の方法。
A37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態A37.2の方法。
A37.4. 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態A37.2またはA37.3の方法。
A39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態A39の方法。
A40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態A40の方法。
A40.2 前記被験体がヒトである、実施形態A40の方法。
A40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態A40.3の方法。
A40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態A41〜A43のいずれか1つの方法。
A45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態A45の方法。
A48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態A53の方法。
A54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態A49〜A54のいずれか1つの方法。
A54.2 1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態A54.1の方法。
A54.3 1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態A54.1またはA54.2の方法。
A54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態A54.1〜A54.3のいずれか1つの方法。
A54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態A49〜A54.4のいずれか1つの方法。
A54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態A54.5の方法。
A54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態A49〜A54.6のいずれか1つの方法。
A54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態A54.7の方法。
A54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態A54.8の方法。
A56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態A56.1またはA56.2の方法。
A59.1 有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態A1〜A57のいずれか1つの方法。
A60.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態A1〜A60のいずれか1つの方法。
A70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の方法。
A78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態A76の方法。
A91.1 前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態A1〜A90のいずれか1つの方法。
A93.1 前記上皮細胞は連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態A1〜A93のいずれか1つの方法。
A93.2 前記上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態A1〜A93.1のいずれか1つの方法。
A93.3 連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.2のいずれか1つの方法。
A93.4 腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.3のいずれか1つの方法。
A93.5 LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.4のいずれか1つの方法。
A94.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態A40〜A94のいずれか1つの方法。
A94.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.1のいずれか1つの方法。
A94.3 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.2のいずれか1つの方法。
A94.4 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態A40〜A94.3のいずれか1つの方法。
A94.5 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態A40〜A94.4のいずれか1つの方法。
A95.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態A40〜A95のいずれか1つの方法。
A95.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態A40〜A94.5のいずれか1つの方法。
B1.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.3 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.4 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.5 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.6 規定された無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.7 ゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.8 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B2.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびPAK1インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B3.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3の細胞培養培地。
B3.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびミオシンIIインヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B3.3 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3.2の細胞培養培地。
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態B14またはB15の細胞培養培地。
B25.1 Rhoキナーゼインヒビターおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含まない、実施形態B1〜B20のいずれか1つの細胞培養培地。
B29.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、実施形態B29の細胞培養培地。
B30.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態B30の細胞培養培地。
B31.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態B31の細胞培養培地。
B32.1 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態B32の細胞培養培地。
B32.2 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態B32.1の細胞培養培地。
B32.3 前記上皮細胞が、初代細胞を含む、実施形態B32〜B32.2のいずれか1つの細胞培養培地。
B35.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態B32〜B34のいずれか1つの細胞培養培地。
B36.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態B36の細胞培養培地。
B39.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B39.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B43.1 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、実施形態B43の細胞培養培地。
B44.1 緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態B1〜B44のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態B44.1の細胞培養培地。
B44.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態B44.1またはB44.2の細胞培養培地。
B44.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態B44.1〜B44.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.5 アルブミンを含む、実施形態B1〜B44.4のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態B44.5の細胞培養培地。
B44.7 1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態B1〜B44.6のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態B44.7の細胞培養培地。
B46.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態B45の細胞培養培地。
B46.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態B46.1またはB46.2の細胞培養培地。
B50.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTのうちの1つまたは複数から選択される成分を含まない、実施形態B1〜B50のいずれか1つの細胞培養培地。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.1
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.2
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C2.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C3.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C3〜C3.3のいずれか1つの上皮細胞。
C5.1 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態C1〜C5のいずれか1つの上皮細胞。
C5.2 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態C1〜C5.1のいずれか1つの上皮細胞。
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態C16〜C18のいずれか1つの上皮細胞。
C30.1 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態C1〜C24のいずれか1つの上皮細胞。
C37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C37の上皮細胞。
C37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態C37またはC37.1の上皮細胞。
C37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態C37.2の上皮細胞。
C37.4 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態C37.2またはC37.3の上皮細胞。
C39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態C39の上皮細胞。
C40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態C40の上皮細胞。
C40.2 前記被験体がヒトである、実施形態C40の上皮細胞。
C40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態C40.3の上皮細胞。
C40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態C41〜C43のいずれか1つの上皮細胞。
C45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態C45の上皮細胞。
C48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態C53の上皮細胞。
C54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースのうちの1つまたは複数とを含む、実施形態C49〜C54のいずれか1つの上皮細胞。
C54.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態C54.1の上皮細胞。
C54.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態C54.1またはC54.2の上皮細胞。
C54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態C54.1〜C54.3のいずれか1つの上皮細胞。
C54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態C49〜C54.4のいずれか1つの上皮細胞。
C54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態C54.5の上皮細胞。
C54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態C49〜C54.6のいずれか1つの上皮細胞。
C54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態C54.7の上皮細胞。
C54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態C54.8の上皮細胞。
C56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態C56.1またはC56.2の上皮細胞。
C59.1 前記方法が、有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態C1〜C57のいずれか1つの上皮細胞。
C60.1 前記方法が、noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態C1〜C60のいずれか1つの上皮細胞。
C70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C91.1 複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態C1〜C90のいずれか1つの上皮細胞。
C93.1 連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態C1〜C93のいずれか1つの上皮細胞。
C93.2 静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態C1〜C93.1のいずれか1つの上皮細胞。
C93.3 方法が、連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.2のいずれか1つの上皮細胞。
C93.4 方法が、腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.3のいずれか1つの上皮細胞。
C93.5 方法が、LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.4のいずれか1つの上皮細胞。
C94.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態C40〜C94のいずれか1つの上皮細胞。
C94.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.1のいずれか1つの上皮細胞。
C94.3 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.2のいずれか1つの上皮細胞。
C94.4 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態C40〜C94.3のいずれか1つの上皮細胞。
C94.5 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態C40〜C94.4のいずれか1つの上皮細胞。
C95.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態C40〜C95のいずれか1つの上皮細胞。
C95.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態C40〜C94.5のいずれか1つの上皮細胞。
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、拡大培養条件下で培養した場合に25回またはそれより多くの集団倍加をすることができ;
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養した場合に20回以下の集団倍加が可能である、方法。
E1.1 エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、方法。
E1.2 :
集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤が第1の薬剤であり、
前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、
前記コントロール培養条件が、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、実施形態E1の方法。
E1.3 前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む、実施形態E1.1の方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する
、実施形態E1〜E4のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1つまたは複数を発現する、実施形態E1〜E5のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E6のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、Lgr5を発現しない、実施形態E1〜E7のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E8のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E9のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E10のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E11のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E12のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E13のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態E1〜E14のいずれか1つの方法。
Claims (26)
- 上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くのトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達インヒビターと、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)インヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1種もしくはこれより多くとを含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含み、前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5、ALK4および/またはALK7インヒビターである、
方法。 - 上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くのトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達インヒビターと、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)インヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1種もしくはこれより多くとを含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含み、前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5、ALK4および/またはALK7インヒビターである、
方法。 - 前記上皮細胞集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程を含む、請求項1、1または2に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団を分化した組織から単離する工程を包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離され、前記サンプルは、組織生検材料、血液、尿、糞便、口内スワブ、および羊水のうちの1種もしくはこれより多くから選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、羊水組織から単離される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種もしくはこれより多くのALK5、ALK4および/またはALK7インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1種もしくはこれより多くのALK5、ALK4および/またはALK7インヒビターは、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記Rho関連プロテインキナーゼインヒビターは、Rho関連プロテインキナーゼ1(ROCK 1)インヒビターおよびRho関連プロテインキナーゼ2(ROCK 2)インヒビターから選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Rho関連プロテインキナーゼインヒビターは、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、PAK1インヒビター、PAK2インヒビター、PAK3インヒビターおよびPAK4インヒビターから選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、IPA3を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記ミオシンIIインヒビターは、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、ブレビスタチンを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記拡大培養条件は、前記集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤をさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤は、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストは、イソプロテレノールを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記拡大培養条件は、300μM未満の濃度でカルシウムを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拡大培養条件は、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子は、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして前記起源上皮細胞集団は、コントロール培養条件下で培養される場合に、20回以上の集団倍加が可能である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、30回以上の集団倍加が可能である、請求項22に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、50回以上の集団倍加が可能である、請求項22に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、80回以上の集団倍加が可能である、請求項22に記載の方法。
- 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、100回以上の集団倍加が可能である、請求項22に記載の方法。
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