JP2020120686A - 上皮細胞のエキソビボ増殖 - Google Patents
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Abstract
【課題】上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物を提供すること。【解決手段】ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。【選択図】なし
Description
(関連特許出願)
この特許出願は、2015年4月3日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PVとして指定される米国仮特許出願第62/142,851号の利益を主張する。この特許出願はまた、2015年9月11日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV2として指定される米国仮特許出願第62/217,406号の利益を主張する。この特許出願はまた、2016年2月12日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV3として指定される米国仮特許出願第62/294,896号の利益を主張する。本文、表および図面全体を含む上記出願の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
この特許出願は、2015年4月3日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PVとして指定される米国仮特許出願第62/142,851号の利益を主張する。この特許出願はまた、2015年9月11日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV2として指定される米国仮特許出願第62/217,406号の利益を主張する。この特許出願はまた、2016年2月12日に出願され、EX VIVO PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLSとの表題であり、発明者としてChengkang Zhangが名を連ね、そして代理人管理番号PPG−2001−PV3として指定される米国仮特許出願第62/294,896号の利益を主張する。本文、表および図面全体を含む上記出願の完全な内容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。
(分野)
本技術は、部分的には、上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物に関する。
本技術は、部分的には、上皮細胞のエキソビボでの増殖および拡大のための方法および組成物に関する。
(背景)
器官(例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚)は、とりわけ、器官特異的上皮細胞の存在によって特徴付けられ得る。上皮細胞は、各々のこのような器官の1種もしくはこれより多くの特異的機能によって規定され得る。特異的機能としては、例えば、肺におけるガス交換、腎臓における濾過、肝臓における解毒および抱合、膵島細胞におけるインスリン生成、または皮膚による環境中の有害状態からの保護が挙げられ得る。このような器官の疾患または変性はしばしば、衰弱させるかまたは生命を脅かすものである。なぜなら変性または喪失した器官構造は、容易には置き換えられず、かつ1つの器官の特殊化された細胞は一般に、別の器官の機能を肩代わりすることはできないからである。
器官(例えば、肺、腎臓、肝臓、膵臓および皮膚)は、とりわけ、器官特異的上皮細胞の存在によって特徴付けられ得る。上皮細胞は、各々のこのような器官の1種もしくはこれより多くの特異的機能によって規定され得る。特異的機能としては、例えば、肺におけるガス交換、腎臓における濾過、肝臓における解毒および抱合、膵島細胞におけるインスリン生成、または皮膚による環境中の有害状態からの保護が挙げられ得る。このような器官の疾患または変性はしばしば、衰弱させるかまたは生命を脅かすものである。なぜなら変性または喪失した器官構造は、容易には置き換えられず、かつ1つの器官の特殊化された細胞は一般に、別の器官の機能を肩代わりすることはできないからである。
ある特定のタイプの上皮細胞は、インビボでは回復および/または再生するのが難しい可能性があり、身体におけるそれらの状況から一旦取り出されると、維持するのは困難であり得る。ある特定のタイプの上皮細胞(例えば、被験体から採取された器官特異的上皮細胞、多能性幹細胞に由来する系統拘束された上皮細胞、および/または分化した上皮細胞)は、インビトロで増殖および拡大させることは困難であり得、そして代表的には、培養物中での寿命は、非常に制限されている。上皮細胞をインビトロまたはエキソビボで研究するために、ある形態の遺伝子操作(例えば、ウイルス癌遺伝子または細胞癌遺伝子を挿入すること)はしばしば、細胞が数回の継代より長く生存することを可能にするために必要とされる。しかし、これら遺伝子操作は、上記細胞の遺伝的バックグラウンドおよび生理を変更し、その結果、これら細胞が通常の上皮細胞に似ていないかまたは通常の上皮細胞のように機能しない可能性がある。さらに、これら遺伝子改変された細胞は、動物への移植のための候補にならない。
上皮細胞(例えば、被験体から採取された細胞、幹細胞に由来する細胞)を長期間にわたって、その細胞を遺伝的に変化させることなく培養および拡大するための方法は、種々の目的(研究適用、個別化医療適用、および移植が挙げられる)のために有用である。
(要旨)
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程;およびb)(a)の培養する工程の間に系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程;b)(a)の培養する工程の間に上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程;およびc)(a)の培養する工程の間に上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程を含む方法である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程;b)(a)の培養する工程の間に上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程;およびc)(a)の培養する工程の間に上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程を含む方法である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程;b)分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程;b)以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、a)フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程;b)系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)からなる低分子インヒビターを含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび1種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび1種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのテロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび1種もしくはこれより多くの細胞骨格構造調節剤を含む無血清細胞培養培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、フィーダー細胞なしの条件下でエキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、テロメラーゼ逆転写酵素アクチベーターおよび細胞骨格構造調節剤からなる低分子を含む無血清細胞培養培地である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)および1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターを含む培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)およびPAK1インヒビターからなる低分子(例えば、低分子インヒビター)を含む培地である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)および1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターを含む培地である。ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下において上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、この培地は、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)およびミオシンIIインヒビターからなる低分子(例えば、低分子インヒビター)を含む培地である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養し、増殖させる工程;およびb)(a)の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養し、増殖させる工程;およびb)(a)の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養し、増殖させる工程;およびb)(a)の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養し、増殖させる工程;b)(a)の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程;およびc)(a)の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養し、増殖させる工程;b)(a)の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程;およびc)(a)の培養し、増殖させる工程の間に上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞および/または系統拘束された上皮細胞である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養し、増殖させる工程;b)(a)の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)(a)の培養し、増殖させる工程の間に分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養し、増殖させる工程;b)(a)の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)(a)の培養し、増殖させる工程の間に以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書において提供されるのは、a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養し、増殖させる工程;b)(a)の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;およびc)(a)の培養し、増殖させる工程の間に系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた(例えば、拡大した)上皮細胞の集団である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、およびRhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連タンパク質キナーゼインヒビター)を含む細胞培養組成物である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、およびRhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連タンパク質キナーゼインヒビター)からなる細胞培養組成物である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、Rhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連タンパク質キナーゼインヒビター)、およびβアドレナリン作動性アゴニスト(例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)を含む細胞培養組成物である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、Rhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連タンパク質キナーゼインヒビター)、およびβアドレナリン作動性アゴニスト(例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)からなる細胞培養組成物である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、20回以下の集団倍加が可能である、
方法である。
方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、方法である。ある特定の実施形態において、拡大培養条件は集団における細胞骨格構造を調節する第2の薬剤を含み、コントロール培養条件はこの第2の薬剤を含まない。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、分化した組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、20回以下の集団倍加が可能である、方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞上皮細胞を含む、方法である。
ある特定の態様において本明細書においてまた提供されるのは、上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を包含し、ここで:前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、方法である。
ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面においてさらに記載される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
分化した組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、20回以下の集団倍加が可能である、
方法。
(項目2)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、
方法。
(項目3)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、
方法。
(項目4)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、
方法。
(項目5)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、第1の薬剤であり、
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、そして
前記コントロール培養条件は、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、
項目1に記載の方法。
(項目6)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む。項目2、3または4に記載の方法。
(項目7)
前記起源上皮細胞集団を単離する工程を包含する、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記起源上皮細胞集団は、分化した組織から単離される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞(iPSC)培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目11)
前記起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される、項目7に記載の方法。
(項目12)
前記サンプルは、組織生検材料、血液、尿、糞便、口内スワブ、および羊水のうちの1種もしくはこれより多くから選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記起源上皮細胞集団および/または前記拡大した上皮細胞集団は、胚性幹細胞を含まない、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1種もしくはこれより多くを発現する、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、Lgr5を発現しない、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/またはトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、項目27または28に記載の方法。
(項目30)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
項目27〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、項目27〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞骨格構造を調節する薬剤は、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1種もしくはこれより多くを含む、項目1〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記Rhoキナーゼインヒビターは、Rho関連プロテインキナーゼ1(ROCK 1)インヒビターおよびRho関連プロテインキナーゼ2(ROCK 2)インヒビターから選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記Rho関連プロテインキナーゼインヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連プロテインキナーゼインヒビターを含む、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記1種もしくはこれより多くのRho関連プロテインキナーゼインヒビターは、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、PAK1インヒビター、PAK2インヒビター、PAK3インヒビターおよびPAK4インヒビターから選択される、項目32〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターは、IPA3を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記ミオシンIIインヒビターは、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目32〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、ブレビスタチンを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤をさらに含む、項目1〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤は、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストは、イソプロテレノールを含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記拡大培養条件は、無血清培養条件である、項目1〜44のいずれか1項に記載の方法。
(項目46)
前記拡大培養条件は、規定された無血清培養条件である、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記拡大培養条件は、ゼノフリー培養条件である、項目1〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
前記拡大培養条件は、規定されたゼノフリー培養条件である、項目1〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記拡大培養条件は、300μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記拡大培養条件は、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記カルシウムは、約90μMの濃度で存在する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、項目1〜51のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子は、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記拡大培養条件は、異質な成分を含む細胞外マトリクスを含まない、項目1〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、30回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目56)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、50回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目57)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、80回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目58)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、100回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
前記方法は、連続して増殖している上皮幹細胞および/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団を選択する工程を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
前記起源上皮細胞集団は、連続して増殖している上皮幹細胞を含まないおよび/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団に由来する細胞を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を単離する工程をさらに包含する、項目1〜60のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに包含する、項目1〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
項目1〜62のいずれか1項に記載の方法によって生成される、エキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
(項目64)
遺伝子改変された細胞の生成のための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目65)
被験体に対する1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目66)
被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目67)
被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
分化した組織、胚性幹(ES)細胞、または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの拡大培養条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、25回以上の集団倍加が可能であり;そして
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養される場合に、20回以下の集団倍加が可能である、
方法。
(項目2)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大された上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、分化した上皮細胞を含む、
方法。
(項目3)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、
方法。
(項目4)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法であって、前記方法は、
起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程
を包含し、ここで:
前記拡大培養条件は、前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;そして
前記起源上皮細胞集団は、系統拘束された上皮細胞を含む、
方法。
(項目5)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/または前記集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、第1の薬剤であり、
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、そして
前記コントロール培養条件は、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、
項目1に記載の方法。
(項目6)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む。項目2、3または4に記載の方法。
(項目7)
前記起源上皮細胞集団を単離する工程を包含する、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記起源上皮細胞集団は、分化した組織から単離される、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞(iPSC)培養物から単離される、項目7に記載の方法。
(項目11)
前記起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される、項目7に記載の方法。
(項目12)
前記サンプルは、組織生検材料、血液、尿、糞便、口内スワブ、および羊水のうちの1種もしくはこれより多くから選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記起源上皮細胞集団および/または前記拡大した上皮細胞集団は、胚性幹細胞を含まない、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1種もしくはこれより多くを発現する、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、Lgr5を発現しない、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1種もしくはこれより多くを発現しない、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
は、静止した上皮細胞および/または以前は静止していた上皮細胞を含む、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するおよび/またはトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤は、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、項目27または28に記載の方法。
(項目30)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
項目27〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターは、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB 431542から選択される、項目27〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞骨格構造を調節する薬剤は、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1種もしくはこれより多くを含む、項目1〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記Rhoキナーゼインヒビターは、Rho関連プロテインキナーゼ1(ROCK 1)インヒビターおよびRho関連プロテインキナーゼ2(ROCK 2)インヒビターから選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記Rho関連プロテインキナーゼインヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連プロテインキナーゼインヒビターを含む、項目32または33に記載の方法。
(項目35)
前記1種もしくはこれより多くのRho関連プロテインキナーゼインヒビターは、Y−27632、SR 3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、PAK1インヒビター、PAK2インヒビター、PAK3インヒビターおよびPAK4インヒビターから選択される、項目32〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターは、IPA3を含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記ミオシンIIインヒビターは、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目32〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターは、ブレビスタチンを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記拡大培養条件は、前記集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤をさらに含む、項目1〜41のいずれか1項に記載の方法。
(項目43)
前記細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤は、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストは、イソプロテレノールを含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記拡大培養条件は、無血清培養条件である、項目1〜44のいずれか1項に記載の方法。
(項目46)
前記拡大培養条件は、規定された無血清培養条件である、項目1〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記拡大培養条件は、ゼノフリー培養条件である、項目1〜46のいずれか1項に記載の方法。
(項目48)
前記拡大培養条件は、規定されたゼノフリー培養条件である、項目1〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記拡大培養条件は、300μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記拡大培養条件は、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、項目1〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記カルシウムは、約90μMの濃度で存在する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記拡大培養条件は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、項目1〜51のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子は、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記拡大培養条件は、異質な成分を含む細胞外マトリクスを含まない、項目1〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、30回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目56)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、50回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目57)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、80回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目58)
前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養される場合に、100回以上の集団倍加が可能である、項目1〜54のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
前記方法は、連続して増殖している上皮幹細胞および/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団を選択する工程を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
前記起源上皮細胞集団は、連続して増殖している上皮幹細胞を含まないおよび/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団に由来する細胞を含まない、項目1〜58のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を単離する工程をさらに包含する、項目1〜60のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに包含する、項目1〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
項目1〜62のいずれか1項に記載の方法によって生成される、エキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
(項目64)
遺伝子改変された細胞の生成のための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目65)
被験体に対する1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目66)
被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
(項目67)
被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、項目63に記載のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
図面は、本技術のある特定の実施形態を例証するのであって、限定するのではない。明瞭性および例証の容易さのために、図面は、一定の拡大縮小比で作られておらず、場合によっては、種々の局面が、特定の実施形態の理解を容易にするために、誇張または拡大して示され得る。
(詳細な説明)
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞(例えば、エキソビボで増殖させた上皮細胞)はしばしば、フィーダー細胞の集団と共培養されるおよび/またはフィーダー細胞由来の馴化培地中で培養される。しかし、フィーダー細胞を拠り所にすることには、上皮細胞をどこでおよびどのようにして培養するかに制限があり得、そして上皮細胞を培養するコストを顕著に増大し得る。フィーダー細胞に由来する規定されていない生物学的因子によって引き起こされる細胞培養物の変動性に起因して、フィーダー細胞の使用は問題ともなり得る。変動性は、一貫しない結果をもたらし得、これは、再現性の欠如に起因してデータ解釈を困難にする。フィーダー細胞はまた、望ましくない因子(例えば、レトロウイルス、他の病原体、および免疫原性の非ヒトシアル酸(例えば、Neu5Gc))を培養上皮細胞の中に導入する可能性を有する。このような培養条件は、ある特定の適用(例えば、移植のような)に望ましくない可能性がある。
上皮細胞をエキソビボで増殖させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞(例えば、エキソビボで増殖させた上皮細胞)はしばしば、フィーダー細胞の集団と共培養されるおよび/またはフィーダー細胞由来の馴化培地中で培養される。しかし、フィーダー細胞を拠り所にすることには、上皮細胞をどこでおよびどのようにして培養するかに制限があり得、そして上皮細胞を培養するコストを顕著に増大し得る。フィーダー細胞に由来する規定されていない生物学的因子によって引き起こされる細胞培養物の変動性に起因して、フィーダー細胞の使用は問題ともなり得る。変動性は、一貫しない結果をもたらし得、これは、再現性の欠如に起因してデータ解釈を困難にする。フィーダー細胞はまた、望ましくない因子(例えば、レトロウイルス、他の病原体、および免疫原性の非ヒトシアル酸(例えば、Neu5Gc))を培養上皮細胞の中に導入する可能性を有する。このような培養条件は、ある特定の適用(例えば、移植のような)に望ましくない可能性がある。
上皮細胞は、代表的には、血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS))を補充した培地中で培養される。しかし、ある特定の場合には、血清は、規定されないマイトジェンの供給源になり得、ロット間変動がしばしば観察される。さらに、血清は、マイコプラズマおよびウイルスのような感染因子で汚染されている可能性がある。従って、血清は、培養培地の規定されていないかつ変動性の成分であり得、血清の使用は、ある特定の培養細胞に関する規定された栄養およびホルモン要件をはっきりさせることを妨げ得る。
上皮細胞は、フィーダー細胞なしの条件下で、1種もしくはこれより多くの増殖因子および1種もしくはこれより多くの規定されていない動物器官抽出物がしばしば補充されている無血清培地で培養され得る。しかし、これらの条件下で培養された上皮細胞は、代表的には、数回の継代後に増殖を停止して、非常に制限された寿命を有し、一般には、エキソビボで大規模には拡大できない。
フィーダー細胞またはフィーダー細胞由来馴化培地を使用することなく、およびある特定の実施形態では、血清を使用することなく、上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および培地組成物が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、規定された細胞培養条件下で上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および培地組成物がまた、本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、増殖および拡大させた上皮細胞の集団がまた、本明細書で提供される。
上皮細胞
上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞、または上皮は、代表的には、中空の器官を裏打ちする細胞、ならびに腺および身体の外表面を構成する細胞をいう。上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞または移行上皮細胞を含み得る。上皮細胞は、器官および位置に依存して、単層で配置され得るか、または複数層で配置され得る。
上皮細胞をエキソビボで増殖および拡大させるための方法および組成物が、本明細書で提供される。上皮細胞、または上皮は、代表的には、中空の器官を裏打ちする細胞、ならびに腺および身体の外表面を構成する細胞をいう。上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞または移行上皮細胞を含み得る。上皮細胞は、器官および位置に依存して、単層で配置され得るか、または複数層で配置され得る。
本明細書で記載される上皮細胞は、ケラチノサイト(KE)上皮細胞または非ケラチノサイト(NKE)上皮細胞を含み得る。ケラチノサイトは、解剖学的部位(例えば、皮膚、眼の表面、口腔粘膜、食道および子宮頸部)において見出される扁平上皮を形成する。ケラチノサイトは、平らな、高度に角化した、保護バリアを形成することによって環境および感染からの保護を助ける非生存細胞へと最終分化する。ケラチノサイト上皮細胞の例としては、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
NKE細胞は、乳房、前立腺、肝臓、気道、網膜および消化管において見出されるような、身体の上皮を形成する。NKE細胞は、代表的には、例えば、吸収および/または分泌において機能する、機能的な生きている細胞へと分化する。これら細胞は、代表的には、扁平上皮細胞に特徴的な高度に角化した構造を形成しない。
本明細書で記載される方法において使用するためのNKE細胞は、起源が任意のタイプまたは組織であり得る。NKE細胞の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞(sebaceous epithelial cell)および毛包細胞。いくつかの実施形態において、NKE細胞は、腸上皮細胞を含まない。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。基底上皮細胞は、一般に、重層上皮および多層上皮の最深部層にある細胞である。基底上皮細胞は、多列上皮における基底板の近くに核が位置する細胞であり得る。場合によっては、基底上皮細胞は、(例えば、非対称細胞分裂または対称細胞分裂によって)分裂して、他の基底細胞および/または他の上皮細胞タイプ(例えば、重層上皮、多層上皮または多列上皮の中の他の細胞タイプ)を生じ得る。ある上皮の中の基底上皮細胞の割合は、終生の自己再生能力を有し得、他の上皮細胞タイプおよび基底細胞を生じ得、ときおり、上皮幹細胞と見做される。終生の自己再生能力を有し、上皮幹細胞と見做される基底上皮細胞の割合は、種々の組織の中で変動する。
上皮細胞は、被験体および/または細胞供給源から得られ得る。被験体および/または細胞供給源から得られる細胞は、起源上皮細胞集団(originating epithelial cell population)といわれ得る。起源上皮細胞集団は、本明細書で記載される培養条件(例えば、拡大培養条件、フィーダー細胞なしの拡大条件)によって拡大するための上皮細胞の投入集団である。細胞供給源は、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)などの集団を含み得る。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、胚または胚に由来する幹細胞培養物から単離される。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、人工多能性幹細胞(iPSC)培養物から単離される。起源上皮細胞集団は、種々の様式で被験体から得られ得る(例えば、生きている組織から採取される(例えば、生検、引き抜いた毛包、尿または体腔流体のような体液)か、または循環から単離される)。被験体は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトのような任意の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない任意の動物を含み得る。ある特定の実施形態において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、被験体は、子宮環境中にある胚より長く懐胎されている動物またはヒトであり、しばしば、出生後のヒトまたは出生後の動物(例えば、新生児のヒト、新生仔の動物、成人および成体動物)である。代表的には、被験体は、胚ではない。被験体は、ときおり、若年の動物、若年のヒト、成体動物または成人である。
いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、被験体由来のサンプルから単離される。サンプルは、被験体またはその一部から単離または得られる任意の標本を含み得る。標本の非限定的な例としては、被験体由来の流体または組織(血液または血液製品(例えば、血清、血漿など)、臍帯血、骨髄、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液(例えば、気管支肺胞、胃、腹腔、管、耳、関節鏡)、生検サンプルまたは組織生検材料、口内スワブ、体腔穿刺(celocentesis)サンプル、雌性の生殖路の洗浄物、尿、糞便、痰、唾液、鼻腔粘液、前立腺液、洗浄物、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、硬組織(例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、または卵巣)などまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。用語血液は、全血、血液製品または任意の血液画分(例えば、血清、血漿、バフィーコートまたは従来定義されたとおりの類似物)を包含する。血漿は、抗凝固薬で処理した血液の遠心分離から生じる全血の画分をいう。血清は、血液サンプルが凝固した後に残る流体の水分の多い部分をいう。いくつかの実施形態において、胎児細胞は、母体サンプル(例えば、母体血液、羊水)から単離される。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、通常の健康な細胞(例えば、病的でない細胞)を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、遺伝的に変化していない細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、病的なおよび/または遺伝的に変化したものを含み得る。病的な上皮細胞としては、疾患を引き起こす変異を有する被験体に由来する細胞(例えば、CFTR遺伝子に遺伝子変異を有する上皮細胞)が挙げられ得る。病的な上皮細胞は、異常な組織に由来する(例えば、新形成、過形成、悪性腫瘍または良性腫瘍に由来する)細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、腫瘍細胞でない細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、被験体の循環から単離された細胞(例えば、循環腫瘍細胞(CTC))を含み得る。ある特定の実施形態において、病的な上皮細胞は、身体サンプル(例えば、尿、精液、便(糞便)など)から単離された細胞を含み得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、初代細胞を含む。初代上皮細胞は、生きている組織(例えば、生検、引き抜いた毛包、身体のサンプル(例えば、便サンプル、尿、精液または体腔の流体のような体液など))から直接採取されるか、または循環から単離される。ある特定の場合には、初代細胞は、継代されていない。ある特定の場合には、初代細胞は、一度継代されている。初代細胞は、分化した組織から単離(例えば、種々の器官の上皮から単離)され得る。代表的には、初代細胞は、例えば、組織消化を通じて新たに単離され、プレーティングされている。初代細胞は、凍結されてもされなくてもよいし、その後に解凍されてもされなくてもよい。さらに、初代細胞が単離された組織は、処理する直前に、ある他の様式で凍結または保存されてもよいし、そうでなくてもよい。代表的には、細胞が1回より多く継代された後には、上記細胞はもはや初代細胞ではない。1回以上継代されかつ継代後に直ぐ凍結された細胞も、解凍された場合には、初代細胞と見做されない。ある特定の実施形態において、上皮細胞は、最初は初代細胞であり、本明細書で記載される方法の使用を通じて、継代後に非初代細胞になる。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団の細胞は、分化した組織から上記細胞が単離された後かつ上記起源上皮細胞集団と本明細書で記載される培養条件(例えば、本明細書で記載される拡大培養条件)とを接触させる前に、細胞培養物中で維持または増殖させられる。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、非初代細胞(例えば、樹立された細胞株、形質転換された細胞、以前に凍結されたコレクションから解凍された細胞などに由来する細胞)を含む。ある特定の実施形態において、上皮細胞は、二次的細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、樹立された細胞株に由来する細胞を全く含まない。
いくつかの実施形態において、培養組成物は、同じ組織または同じ組織区画に由来する上皮細胞の異質な集団を含む(例えば、上皮幹細胞、上皮前駆細胞(epithelial progenitor)、上皮前駆体細胞(epithelial precursor cell)、系統拘束された上皮細胞、遷移増殖中の(transit−amplifying)上皮細胞、分化中の上皮細胞、分化した上皮細胞、および最終分化した上皮細胞のような細胞タイプおよび/または分化状態の混合物を含む)。いくつかの実施形態において、培養組成物は、同じ組織または同じ組織区画に由来する上皮細胞の同質の集団を含む(例えば、細胞タイプおよび/または分化状態の混合物を含まない)。いくつかの実施形態において、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび/または同じ分化状態で存在する、少なくとも約90%の上皮細胞を含む。例えば、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび/または同じ分化状態で存在する、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の上皮細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞の同質の集団は、同じ細胞タイプであるおよび/または同じ分化状態で存在する、約100%の上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞の同質の集団である。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、異質であってもよいし、同質であってもよい。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、異質であってもよいし、同質であってもよい。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮細胞の集団に含まれるか、または上記集団にはない、細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、起源上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このような細胞特徴付けは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、特定の細胞タイプおよび/または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態である少なくとも約50%の上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、特定の細胞タイプおよび/または分化状態を含む上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態である少なくとも約90%の上皮細胞を含む。例えば、特定の細胞タイプおよび/または分化状態を含む上皮細胞は、特定のタイプおよび/または分化状態である少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の上皮細胞を含み得る。一般に、特定の細胞タイプおよび/または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態である約10%未満の細胞を含む。例えば、特定の細胞タイプおよび/または分化状態を含まない上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態である約10%未満、約9%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、または約1%未満の細胞を含み得る。
ある特定の実施形態において、培養組成物または集団は、「多数派の細胞(majority cell)」と本明細書以降でいわれる上皮細胞の特定のタイプから本質的になる。このような培養組成物は、「少数派の細胞(minority cell)」と本明細書以降でいわれる1種もしくはこれより多くの他のタイプの上皮細胞を少量含み得る。少数派の細胞は、代表的には、多数派の細胞と同じ組織に由来するかまたはこの組織から得られ、しばしば、この多数派の細胞と同じ組織区画に由来するかまたはこの組織区画から得られる。多数派の細胞は、組成において全細胞のうちの50%超、60%超、70%超、または80%超であり得、しばしば、組成において全細胞のうちの約90%もしくはこれより多く、ときおり、組成または集団において全細胞のうちの約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%もしくはこれより多い。
いくつかの実施形態において、培養組成物は、種々の細胞周期のフェーズ(例えば、M期、G1期、S期、G2期、ならびに老化および静止状態を含むG0期)にある上皮細胞の異質な集団を含む。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団は、種々の細胞周期のフェーズ(例えば、M期、G1期、S期、G2期、ならびに老化および静止状態を含むG0期)にある上皮細胞の異質な集団を含む。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、種々の細胞周期のフェーズ(例えば、M期、G1期、S期、G2期、ならびに老化および静止状態を含むG0期)にある上皮細胞の異質な集団を含む。特定の細胞周期のフェーズにある上皮細胞は、その集団のうちの1〜100%を構成し得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、1種もしくはこれより多くの分化ステージにある細胞を含む。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、起源上皮細胞集団について記載され得る。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、拡大した上皮細胞集団について記載され得る。いくつかの実施形態において、このような分化ステージは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団について記載され得る。例えば、上皮細胞(または上皮細胞の集団)は、上皮幹細胞、上皮前駆細胞、系統限定された上皮前駆細胞、上皮前駆体細胞、系統拘束された上皮細胞、遷移増殖中の上皮細胞、増殖中の上皮細胞、分化中の上皮細胞、分化した上皮細胞、静止した上皮細胞、以前は静止していた上皮細胞、増殖していない上皮細胞、および最終分化した上皮細胞(例えば、組織および器官において見出される細胞)を含み得る。上皮細胞はまた、多能性幹細胞(胚性幹(ES)細胞または人工多能性幹細胞(iPSC))から分化したおよび/または由来した、系統拘束された上皮細胞を含み得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞を含む。分化した上皮細胞は、分裂し得るが、代表的には、無期限に自己再生する能力は有しない。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、複数の組織タイプへと分化する能力を獲得しない。本明細書で記載される条件において培養した分化した上皮細胞は、一般に、未分化細胞(例えば、幹細胞(胚性または成体)、前駆細胞、前駆体細胞)よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。分化した上皮細胞は、一般に、幹細胞(胚性または成体)も前駆細胞も前駆体細胞も含まない。ある特定の場合には、分化した上皮細胞は、「組織特異的」および/または「系統拘束された」上皮細胞といわれ得る。ある特定の場合には、分化した上皮細胞は、組織特異的なおよび/または系統拘束された上皮細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、分化した上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、静止したまたは以前は静止していた細胞を含む。静止した細胞は、一般に、増殖していない細胞(すなわち、周期がまわっていない細胞、細胞周期から離れた細胞、休止細胞)であり、可逆的に増殖が停止しているとして特徴付けられ得る。ある特定の条件下では、静止した細胞は、増殖するように誘導され得る。静止した細胞は、細胞周期のG0期に存在するとして特徴付けられ得る。増殖するように誘導された静止した細胞は、以前は静止していた細胞といわれ得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、器官特異的上皮細胞を含む。器官特異的上皮細胞は、ときおり、組織特異的上皮細胞といわれる。いくつかの実施形態において、器官特異的上皮細胞は、所定の器官内でより特異的な細胞タイプへと分化し得るが、一般には、他のタイプの器官の細胞へと分化する能力を有しないかまたは獲得しない。器官特異的上皮細胞は、一般に、未分化細胞(例えば、幹細胞(胚性または成体))よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。器官特異的上皮細胞は、一般に、胚性幹細胞を含まない。器官特異的上皮細胞は、成体幹細胞(例えば、成体上皮幹細胞)を含んでいてもいなくてもよく、器官特異的上皮細胞は、前駆細胞または前駆体細胞を含んでいてもいなくてもよい。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、系統拘束された上皮細胞を含む。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性幹細胞(例えば、胚性幹(ES)細胞および人工多能性幹細胞(iPSC))から分化した系統拘束された上皮細胞を含み得る。系統拘束された上皮細胞は、分裂し得るが、代表的には、無期限に自己再生する能力は有しない。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、所定の細胞系統(例えば、呼吸系統、消化系統または外皮系統)内の種々の細胞タイプへと分化し得るが、一般には、異なる細胞系統の細胞へと分化する能力は有しないかまたは獲得しない(例えば、外皮系統拘束された上皮細胞は、一般には、血球へは分化しない)。系統拘束された上皮細胞は、一般に、未分化の多能性幹細胞よりは分化しており、かつ最終分化した細胞よりは分化していない。系統拘束された上皮細胞は、一般に、多能性幹細胞(胚性または人工多能性)を含まない。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、前駆細胞または前駆体細胞を含む。いくつかの実施形態において、系統拘束された上皮細胞は、基底上皮細胞を含む。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した上皮細胞を含まない。最終分化した上皮細胞は、一般に分裂せず、特定の機能に拘束されている。最終分化した上皮細胞は一般に、細胞周期から最終的に逸脱していることによって特徴付けられ、代表的には、増殖するように誘導できない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、有糸分裂後細胞を含まない。有糸分裂後細胞は一般に、細胞分裂の能力がないか、またはもはや細胞分裂できない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、老化した細胞を含まない。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞から分化しているおよび/または由来している。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胚性幹細胞に由来しない。一般に、胚性幹細胞は、無期限に再生するかまたは自己再生する能力を有する未分化細胞である。胚性幹細胞は、ときおり、多能性と見做され(すなわち、成体の生物の多くのまたは全ての細胞タイプへと分化し得る)、ときおり、全能性と見做される(すなわち、胎盤組織を含む全ての細胞タイプへと分化し得る)。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)から分化しているおよび/または由来している。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)に由来しない。一般に、人工多能性幹細胞(iPSC)は、成体の細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の1タイプである。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、全能性細胞を含まない。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞は、代表的には、分化した細胞、器官特異的細胞または系統拘束された細胞よりは分化しておらず、かつ胚性幹細胞よりは分化している。成体幹細胞は、幹細胞、未分化幹細胞、前駆体細胞および/または前駆細胞といわれ得、成体幹細胞は胚から単離されないので、胚性幹細胞と見做されない。成体上皮幹細胞は、上皮幹細胞、未分化上皮幹細胞、上皮前駆体細胞および/または上皮前駆細胞細胞といわれ得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、成体幹細胞または成体幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮幹細胞または上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性上皮幹細胞または多能性上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、前駆細胞または前駆細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、前駆体細胞または前駆体細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、連続して増殖している(例えば、インビボで連続して増殖している)上皮幹細胞(例えば、腸陰窩細胞;Lgr5+細胞)または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない。いくつかの実施形態において、起源細胞、または起源細胞が採取された組織は、連続して増殖している上皮幹細胞(例えば、腸陰窩細胞;Lgr5+細胞)を含まず、本明細書中の方法は、このような細胞タイプを選択する工程を包含しなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、連続して増殖している上皮幹細胞を選択する工程および/または連続して増殖している上皮幹細胞のインビボ集団(すなわち、採取前に被験体の中で連続して増殖している上皮幹細胞の集団)を選択する工程を包含しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、オルガノイドを形成する能力を獲得しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最初の単離およびプレーティングの際に、完全に未分化の細胞ではない。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上記細胞が1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有するかおよび/またはある特定のマーカーの測定可能なレベルを有しないか、もしくはその低レベルを有するかによって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、起源上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。いくつかの実施形態において、このようなマーカー特徴付けは、起源上皮細胞集団および拡大した上皮細胞集団に適用可能であり得る。
ある特定の場合には、発現(例えば、mRNA発現)のレベルは、マーカーに関して決定される。mRNA発現のレベルは、mRNA発現を検出および測定するための任意の適した方法を使用して決定され得る。例えば、発現レベルは、Ct遺伝子値に従って定量的逆転写PCRによって決定され得る。ここでCt遺伝子は、規定された(例えば、検出可能な)閾値を横切るために、定量的PCR反応の蛍光シグナルのために必要とされるサイクル数である。一般に、マーカーの発現は、Ct遺伝子が35より高い場合には、存在しないとみなされる。マーカーの発現レベルは、Ct遺伝子が35より小さく30より大きいかまたはこれに等しい場合に、低いと見做される。マーカーの発現レベルは、Ct遺伝子が29より小さく22より大きいかまたはこれに等しい場合に、中程度または適度と見做される。マーカーの発現レベルは、Ct遺伝子が22より小さい場合に高いと見做される。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態と代表的には関連するマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態と代表的には関連するマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有しない。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、特定の細胞タイプおよび/または分化状態と代表的には関連しないマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、未分化幹細胞と代表的には関連しないマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、気道上皮細胞および/またはケラチノサイト細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する。マーカーの中程度レベルから高レベルは、場合によっては存在し得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、ある特定の細胞タイプ(例えば、多能性幹細胞、最終分化した上皮細胞、老化細胞、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵臓上皮細胞、線維芽細胞、および/または腸杯細胞のような)と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞接着および/またはストレス応答と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。
いくつかの実施形態において、器官特異的上皮細胞は、他の器官に由来する細胞タイプと代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。例えば、気道上皮細胞は、胃上皮細胞、腸上皮細胞、膵臓上皮細胞、線維芽細胞、および/または腸杯細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)の測定可能なレベルを有さなくてもよいか、または低レベルを有し得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、基底上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のような)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、分化した上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、KRT4、KRT6およびKRT8のような)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、気道上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、HEY2、NGFRおよびBMP7のような)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、ケラチノサイト細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、ZFP42のような)を有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)を有する(例えば、CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3およびIGFBP5のような)。このようなマーカーの中程度のレベルから高レベルが、場合によっては存在し得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、上皮幹細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、LGR5のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、多能性幹細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、最終分化した上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞老化と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、AKT1、ATM、CDKN2A、GADD45A、GLB1、PLAU、SERPINE1およびSOD2のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞接着と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、接着分子FN1およびTHBS1のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、細胞フィラメントと代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、中間フィラメントタンパク質ビメンチン(VIM)のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、胃上皮細胞、腸上皮細胞、または膵臓上皮細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、線維芽細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、ZEB1およびZEB2のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、腸杯細胞と代表的には関連する1種もしくはこれより多くのマーカー(例えば、細胞表面マーカー、mRNA、タンパク質、エピジェネティックシグネチャー)(例えば、KRT20のような)の測定可能なレベルを有しないかまたは低レベルを有する。
細胞培養
細胞培養のための方法および組成物が本明細書で提供される。特に、拡大培養条件が本明細書で提供される。細胞培養、または培養は、代表的には、人工的なインビトロ環境における細胞の維持、または外部のエキソビボ環境(すなわち、生物の外側)における細胞の維持をいい、個々の細胞および組織の培養を包含し得る。本明細書で記載されるある特定の細胞培養システムは、エキソビボ環境および/またはインビトロ環境であり得る。いくつかの実施形態において、初代細胞が単離される。いくつかの実施形態において、初代細胞は、単一針生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、組織生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、引き抜いた毛髪から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、尿または体腔の流体のような体液から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、被験体の循環から単離され得る。
細胞培養のための方法および組成物が本明細書で提供される。特に、拡大培養条件が本明細書で提供される。細胞培養、または培養は、代表的には、人工的なインビトロ環境における細胞の維持、または外部のエキソビボ環境(すなわち、生物の外側)における細胞の維持をいい、個々の細胞および組織の培養を包含し得る。本明細書で記載されるある特定の細胞培養システムは、エキソビボ環境および/またはインビトロ環境であり得る。いくつかの実施形態において、初代細胞が単離される。いくつかの実施形態において、初代細胞は、単一針生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、組織生検を使用して単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、引き抜いた毛髪から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、尿または体腔の流体のような体液から単離され得る。いくつかの実施形態において、初代細胞は、被験体の循環から単離され得る。
単離後、細胞材料は洗浄され得る(例えば、生理食塩水および/またはPBS溶液で)。細胞材料は、酵素溶液(例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼおよび/またはトリプシンのような)で処理されて、組織マトリクスからの細胞の解離を促進し得る。例えば、ディスパーゼは、上皮をその下にある組織から解離するために使用され得る。次に、インタクトな上皮は、例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼで処理され得る。このような消化工程はしばしば、解離した細胞および組織マトリクスを含むスラリーを生じる。このスラリーは、次いで、スラリーの残りから細胞を分離するために十分な力で遠心分離され得る。細胞ペレットは、次いで、除去され得、緩衝液および/または生理食塩水および/または細胞培養培地で洗浄され得る。この遠心分離および洗浄は、任意の回数、反復され得る。次いで、最後の洗浄後、細胞は、任意の適切な細胞培養培地で洗浄され得る。ある特定の場合には、消化および洗浄工程は、上記細胞が、単離の際にその下にある組織から十分に分離される場合にはおこなわれなくてもよい(例えば、循環からまたは針生検を使用して単離された細胞に関して)。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞のような細胞は、被験体の循環から単離され得る。ある特定の実施形態において、腫瘍細胞は、ある特定のタイプの腫瘍細胞上で特異的に発現される細胞マーカーに従って単離され得る(例えば、Lu. J.,ら, Int’l. J. Cancer, 126(3):669−683 (2010)およびYu, M.,ら, J. Cell Biol., 192(3): 373−382 (2011)を参照のこと。これらは、参考として援用される)。細胞を、電子式細胞計数器(例えば、コールターカウンター)を使用して計数されてもそうでなくてもよいか、またはそれらは、血球計算板を使用して手動で計数されてもよい。
細胞播種密度は、ある特定の望ましい培養条件に従って調節され得る。例えば、約1×103 細胞/cm2から約1〜10×105 細胞/cm2までの初期播種密度が、使用され得る。いくつかの実施形態において、約1〜10から約1〜10×105 細胞/cm2までの初期播種密度が使用され得る。ある特定の場合には、1×106 細胞が、75cm2 培養フラスコ中で培養され得る。細胞密度は、任意の継代で必要とされる場合には変化させられ得る。
細胞は、約37℃において通常の大気圧で、細胞インキュベーター中で培養され得る。このインキュベーター雰囲気は加湿され得、空気中約3〜10% 二酸化炭素を含み得る。場合によっては、このインキュベーター雰囲気は、約0.1〜30% 酸素を含み得る。温度、圧力、ならびに二酸化炭素および酸素濃度は、必要に応じて変化させられ得る。培養培地pHは、約7.1〜約7.6、または約7.1〜約7.4、または約7.1〜約7.3の範囲の中にあり得る。
細胞培養培地は、1〜2日ごと、または必要に応じてより高頻度もしくは低頻度で交換され得る。細胞が培養容器中でコンフルエントに近づいたとき、それらは、継代され得る。細胞継代は、細胞を分割または分配し、その細胞の一部を新しい培養容器または培養環境へと移すことである。細胞培養表面に接着している細胞は、剥離を要し得る。接着性の細胞を培養容器の表面から剥離するための方法は、周知であり、トリプシンのような酵素の使用を包含し得る。
単一継代とは、細胞を一度分割または手動で分配し、少数の細胞を新しい容器または環境へと移すことをいう。継代する場合、細胞を任意の比で分割し得、その細胞が付着および増殖することを可能にする。例えば、単一継代において、上記細胞は、1:2の比、1:3の比、1:4の比、1:5の比などで分割され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約1回〜少なくとも約300回継代される。例えば、細胞は、少なくとも約2回、5回、10回、20回、30回、40回、50回、60回、70回、80回、90回、100回、200回または300回、継代され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約15回継代される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約25回継代される。
細胞増殖は、一般に、1個の母細胞が2個の娘細胞へと分裂するような細胞分裂に言及する。細胞増殖は、細胞拡大といわれ得る。細胞増殖は、本明細書では一般に、細胞の実際のサイズ(例えば、直径、体積)の増大には言及しない。細胞増殖の刺激は、細胞集団(例えば、細胞集団倍加)を経時的にプロットすることによって評価され得る。より勾配が大きい増殖曲線を有する細胞集団は、一般に、より勾配が小さい曲線を有する細胞集団より増殖が早いと見做される。増殖曲線は、同じ細胞タイプの間で種々の処理に関して比較され得るか、または増殖曲線は、例えば、同じ条件で異なる細胞タイプに関して比較され得る。
細胞の集団を拡大することは、集団倍加として表され得る。細胞集団倍加は、細胞数が倍加するように、培養物中の細胞が分裂する場合に起こる。場合によっては、細胞は、細胞の集団がいくつかの他の要因によって倍加したか、3倍になったか、または複数倍になったか否かを決定するために計数される。集団倍加の数は、細胞培養物が継代される回数に等しくなくてもよい。例えば、1:3比でさらなる培養のために細胞を継代し、それらを分割することは、3倍になった細胞集団に等しくなくてもよい。集団倍加(PD)の計算に使用され得る式は、方程式Aで表される:
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
ここでn=採取されるかまたは継代される場合の細胞培養の最終PD数、Y=採取時または継代時の細胞収量、I=その細胞培養を開始するために接種物として使用される細胞数、およびX=継代培養を開始するために使用される起源細胞培養のPD数。
細胞の集団は、ある特定の期間にわたってある特定の回数、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、ある特定の期間にわたって、少なくとも約1回〜少なくとも約500回倍加し得るかまたは倍加する。例えば、細胞の集団は、少なくとも約2回、5回、10回、20回、30回、40回、50回、60回、70回、80回、90回、100回、110回、120回、130回、140回、150回、160回、170回、180回、190回、200回、250回、300回、350回、400回、450回または500回倍加し得るかまたは倍加するものであってよい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも20回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも50回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも60回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも70回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも80回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも90回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも100回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも120回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも150回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、少なくとも200回倍加し得るかまたは倍加する。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約1日〜約500日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。例えば、細胞の集団は、約2日、5日、10日、20日、30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、110日、120日、130日、140日、150日、160日、170日、180日、190日、200日、250日、300日、350日、400日、450日または500日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得るものであってよい。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約50日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約100日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約150日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、約200日の期間にわたってある特定の回数、倍加するか、倍加し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞の集団を拡大する工程を包含する。細胞の集団を拡大する工程は、細胞の集団を増殖させる工程ともいわれ得る。細胞の集団を拡大する工程は、細胞数の増大倍数(fold increase)として表され得る。集団倍加の関数として増大倍数の計算に使用され得る式は、方程式Bで表される:
F=2n 方程式B
F=2n 方程式B
ここでF=n回の集団倍加後の細胞数における増大倍数。例えば、1回の(1)集団の倍加の後、細胞数は、2倍増大し、2回の(2)集団の倍加の後、細胞数は、4(22=4)倍増大し、3回の(3)集団の倍加の後、細胞数は、8(23=8)倍増大するなど。よって、20回の(20)集団の倍加の後、細胞数は、100万倍より大きく(220=1,048,576)増大し、30回の(30)集団の倍加の後、細胞数は、10億倍より大きく(230=1,073,741,824)増大し、40回の(40)集団の倍加の後、細胞数は、1兆倍より大きく(240=1,099,511,627,776)増大するなど。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、少なくとも約2倍〜少なくとも約1兆倍、拡大されるか、または拡大され得る。例えば、細胞の集団は、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約1,000倍、少なくとも約10,000倍、少なくとも約100,000倍、少なくとも約100万倍、少なくとも約10億倍、または少なくとも約1兆倍、拡大され得る。特定の倍数拡大(fold expansion)は、例えば、2日間、3日間、4日間、5日間、10日間、20日間、30日間、40日間、50日間、100日間もしくはこれより長くのような培養中のある特定の期間にわたって起こり得る。
細胞は、連続して増殖され得るかまたは連続して培養され得る。連続増殖または連続培養とは、細胞が連続して分裂し、細胞培養容器中でコンフルエントに達するかまたは近づき、その結果、上記細胞がそれらの健康を維持するために、継代および新鮮な培地の添加を要することをいう。連続して増殖した細胞または連続して培養された細胞は、不死化細胞に類似しているか、または不死化細胞と同じである特徴を有し得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約5継代〜少なくとも約300継代にわたって、増殖および分裂し続ける。例えば、細胞は、少なくとも約10継代、少なくとも約20継代、少なくとも約30継代、少なくとも約40継代、少なくとも約50継代、少なくとも約60継代、少なくとも約70継代、少なくとも約80継代、少なくとも約90継代、少なくとも約100継代、少なくとも約200継代または少なくとも約300継代にわたって、増殖および分裂し続け得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初期の収集およびプレーティングの際には、上皮細胞の異質な集団であり、1回もしくはこれより多くの継代後に、上皮細胞の均質な集団になる。例えば、上皮細胞の異質な集団は、2継代後、3継代後、4継代後、5継代後、10継代後、20継代後、30継代後、40継代後、50継代後、または100継代後、もしくはより多くの継代後に、上皮細胞の均質な集団になり得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、初期の収集およびプレーティングのときに、上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、1回もしくはこれより多くの継代後の上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられる。例えば、上皮細胞は、2継代後、3継代後、4継代後、5継代後、10継代後、20継代後、30継代後、40継代後、50継代後、または100継代後、もしくはこれより多くの継代後に、上皮細胞の集団中に含まれるか、またはこの集団にない、細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、起源上皮細胞集団中に含まれる細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、拡大した上皮細胞集団中に含まれる細胞タイプおよび/または分化状態によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間の分化を受けない。例えば、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、最終分化した細胞または他の細胞タイプへと分化しなくてもよい。いくつかの実施形態において、特定の器官または系統の細胞は、異なる器官または系統の細胞へと分化しない。例えば、気道上皮細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、線維芽細胞、腸上皮細胞、腸杯細胞、胃上皮細胞、または膵臓上皮細胞へと分化しなくてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、ある程度の分化を受ける。例えば、系統拘束された上皮細胞は、所定の系統内の細胞タイプへと分化し得るおよび/または器官特異的上皮細胞は、拡大、連続増殖または連続培養の間に、所定の器官内の他の細胞タイプへと分化し得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞のある特定の集団は、上記細胞が細胞周期を出て、分裂を停止したG0休止期にあり得る。このG0休止期は、静止状態および老化状態の両方を含む。上皮細胞のある特定の割合は、G1期にあり得る。この期において上記細胞は、サイズが増大し、DNA合成の準備をする。上皮細胞のある特定の割合は、S期にあり得、この期においてDNA複製が起こる。上皮細胞のある特定の割合は、G2期にあり得、この期において上記細胞は増殖し続け、M(有糸分裂)期に入って分裂する準備をする。上皮細胞のある特定の割合は、M(有糸分裂)期にあり得、細胞分裂を完了する。
いくつかの実施形態において、細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、起源上皮細胞集団中の細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、拡大した上皮細胞集団中の細胞は、テロメア長によって特徴付けられる。代表的には、テロメア長は、細胞が分裂するときに短くなる。細胞は通常、テロメアの平均長がある特定の長さ、例えば、4kbに減少したときに分裂を停止し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される培地および/または培養条件において培養された細胞の平均テロメア長は、約10kb未満の長さに減少し得、上記細胞は、分裂し続け得る。例えば、本明細書で記載される培地および/または培養条件において培養された細胞の平均テロメア長は、約9kb未満、約8kb未満、約7kb未満、約6kb未満、約5kb未満、約4kb未満、約3kb未満、約2kb未満、または約1kb未満の長さに減少し得、上記細胞は、分裂し続け得る。平均テロメア長は、ときおり、中央(mean)テロメア長またはメジアンテロメア長として表される。平均テロメア長は、テロメア長を決定するための任意の適した方法を使用して決定され得、細胞タイプに従って変動し得る。いくつかの実施形態において、平均テロメア長は、単一コピー遺伝子のテロメア反復に対するテロメア反復の相対的存在量として決定される。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞の核型を変化させることなく、ある特定の継代数にわたって、拡大されるか、連続して増殖されるか、または連続して培養される。例えば、細胞の核型の変化は、染色体もしくはその一部の重複または欠失および/あるいは一方の染色体の一部の、別の染色体への転座を含み得る。核型は、ある特定の継代数の後に、細胞の集団に関してアッセイされ得る。これは、継代する前の同じ起源の細胞の集団と比較され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも約5継代〜少なくとも約300継代後に変化しない核型を有する。例えば、細胞は、少なくとも約10継代、少なくとも約20継代、少なくとも約30継代、少なくとも約40継代、少なくとも約50継代、少なくとも約60継代、少なくとも約70継代、少なくとも約80継代、少なくとも約90継代、少なくとも約100継代、少なくとも約200継代または少なくとも約300継代後に、変化しない核型を有し得る。ある特定の場合には、ある特定の継代数の後に変化しない核型を有する細胞は、条件付き不死化細胞(conditionally immortalized cell)といわれ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞外マトリクス(ECM)の使用を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、細胞外マトリクスの使用を含まない。ECMは、ある特定のポリサッカリド、水、エラスチン、およびある特定の糖タンパク質(例えば、コラーゲン、エンタクチン(ニドジェン)、フィブロネクチン、およびラミニンのような)を含み得る。ECMは、ECM生成細胞を培養し、および必要に応じてこれら細胞を、上皮細胞をプレーティングする前に除去することによって生成され得る。ECM生成細胞の例としては、コラーゲンおよびプロテオグリカンを生成する軟骨細胞;IV型コラーゲン、ラミニン、間質性プロコラーゲンおよびフィブロネクチンを生成する線維芽細胞;ならびにコラーゲン(I型、III型、およびV型)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、およびテネイシン−Cを生成する結腸筋線維芽細胞が挙げられる。ECMはまた、商業的に提供され得る。市販の細胞外マトリクスの例としては、細胞外マトリクスタンパク質(Invitrogen)、Engelbreth−Holm−Swarm(EHS)マウス肉腫細胞由来の基底膜調製物(例えば、マトリゲルTM(BD Biosciences))、および合成細胞外マトリクス材料(例えば、ProNectin(Sigma Z378666))が挙げられる。細胞外マトリクス材料の混合物は、ある特定の場合には使用され得る。細胞外マトリクスは、均質であってもよいし(本質的に単一の成分を含む)、異質であってもよい(複数の成分を含む)。異質な細胞外マトリクスは、一般に、例えば、複数の糖タンパク質および増殖因子を含む、ECM成分の混合物を含む。異質な細胞外マトリクスの例としては、Engelbreth−Holm−Swarm(EHS)マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物(例えば、マトリゲルTM)が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、異質な細胞外マトリクスの使用を含まない。細胞外マトリクスは、規定されていてもよいし(全てまたは実質的に全ての成分およびその量が既知である)、規定されていなくてもよい(全てまたは実質的に全ての成分およびその量が既知でない)。規定されていない細胞外マトリクスの例としては、Engelbreth−Holm−Swarm(EHS)マウス肉腫細胞に由来する基底膜調製物(例えば、マトリゲルTM)が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、規定されていない細胞外マトリクスの使用を含まない。
いくつかの実施形態において、細胞は、被覆を含む容器の中で培養される。例えば、細胞は、1種もしくはこれより多くの付着因子を含む培養容器の表面上にプレーティングされ得る。いくつかの実施形態において、細胞は、付着因子なしの培養容器の表面上にプレーティングされる。付着因子が使用される実施形態において、培養容器は、天然の、組換えの、または合成の付着因子またはこれらのペプチドフラグメント(例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよび天然のもしくは合成のこれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない)で予め被覆され得る。いくつかの実施形態において、培養容器は、コラーゲンで予め被覆される。いくつかの実施形態において、培養容器は、基底膜マトリクスで予め被覆される。いくつかの実施形態において、培養容器は、均質なおよび/または規定された細胞外マトリクスで予め被覆される。
上記細胞は、培養プロセス全体を通じて1種もしくはこれより多くの機能的特徴を維持し得る。いくつかの実施形態において、機能的特徴は、天然の機能的特徴であり得る。天然の機能的特徴としては、一般に、所定の細胞タイプがその天然の環境の中にある間(例えば、細胞培養のために抽出される前の被験体の身体内にある細胞)に有する形質が挙げられる。天然の機能的特徴の例としては、気道上皮細胞におけるガス交換能力、肝臓上皮細胞における解毒能力、腎臓上皮細胞における濾過能力、ならびに膵島細胞におけるインスリン生成および/またはグルコース応答性が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は、培養プロセス全体を通じて1種もしくはこれより多くの機能的特徴を維持しない。
培養物中の細胞の特徴は、ときおり、培養物中の細胞の集団全体に関して決定される。例えば、平均テロメア長、倍加時間、増殖速度、分裂速度、遺伝子レベルまたはマーカーレベルのような特徴は、例えば、培養物中の細胞の集団に関して決定される。特徴はしばしば、その集団中の細胞の代表であり、その特徴は、培養物中の特定の細胞に関しては変動し得る。例えば、培養物中の細胞の集団が4kbの平均テロメア長を示す場合、その集団中の細胞の一部は、4kbのテロメア長を有し得、細胞の一部は、4kbより長いテロメア長を有し得、そして細胞の一部は、4kb未満のテロメア長を有し得る。別の例において、細胞の集団が、特定の遺伝子またはマーカーの高レベルを発現すると特徴付けられる場合、その集団における全ての細胞は、特定の遺伝子またはマーカーをいくつかの実施形態では高レベルで発現し、そしてある特定の実施形態では、その集団中の細胞の一部(例えば、細胞のうちの少なくとも75%)は、その特定の遺伝子またはマーカーを高レベルで発現し、その細胞のうちの小さい方の割合が、その特定の遺伝子を中程度のレベル、低レベル、または検出不能なレベルで発現する。別の例において、細胞の集団が、特定の遺伝子またはマーカーを発現しないか、またはその低レベルを発現すると特徴付けられる場合、その集団中の細胞は、その特定の遺伝子またはマーカーをいくつかの実施形態では検出可能なレベルで全く発現せず、そしてある特定の実施形態では、その集団中の細胞の一部(例えば、細胞のうちの10%未満)は、その特定の遺伝子またはマーカーを検出可能なレベルで発現する。
培養物中の細胞の特徴(例えば、集団倍加、マーカー発現)はときおり、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察されるその同じ特徴と比較される。しばしば、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察される特徴を比較する場合、その同じ供給源に由来する細胞の等しいかまたは実質的に等しい量が、ある特定の培養条件におよびコントロール培養条件に添加される。コントロール培養条件は、同じ基礎培地(例えば、無血清基礎培地)、および1種もしくはこれより多くの薬剤(例えば、TGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)、ROCKインヒビター、ミオシンIIインヒビター、PAKインヒビター)のうちの1種もしくはこれより多く)を含まないさらなる成分を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養条件は、本質的に、コントロール培養条件において培養された細胞に関して観察されるその同じ特徴と比較して、培養物中の細胞の1種もしくはこれより多くの特徴(例えば、集団倍加、マーカー発現)を達成するために必要なある特定の成分からなる。細胞培養条件がある特定の成分から本質的になる場合、さらなる成分または特徴が含まれ得、これら成分または特徴は、コントロール培養条件と比較した場合に、培養物中の細胞の1種もしくはこれより多くの特徴(例えば、集団倍加,マーカー発現)に対して顕著な影響を有しない。このようなさらなる成分または特徴は、本質的でない成分といわれ得、塩、ビタミン、アミノ酸、ある特定の増殖因子、脂肪酸などのような代表的な細胞培養成分を含み得る。
フィーダー細胞
細胞は、フィーダー細胞ありまたはなしで培養され得る。一般に、フィーダー細胞は、ある特定の細胞培養システムのために他の細胞タイプと共培養される細胞である。フィーダー細胞は、代表的には、増殖していない細胞であり、ときおり、増殖を阻害するように処理され、しばしば、生存して代謝的に活性な状態で維持される。例えば、フィーダー細胞は、γ線照射で照射され得るおよび/またはマイトマイシンC(これは、細胞分裂を停止し得ると同時に、代謝的に活性な状態でフィーダー細胞を維持し得る)で処理され得る。
細胞は、フィーダー細胞ありまたはなしで培養され得る。一般に、フィーダー細胞は、ある特定の細胞培養システムのために他の細胞タイプと共培養される細胞である。フィーダー細胞は、代表的には、増殖していない細胞であり、ときおり、増殖を阻害するように処理され、しばしば、生存して代謝的に活性な状態で維持される。例えば、フィーダー細胞は、γ線照射で照射され得るおよび/またはマイトマイシンC(これは、細胞分裂を停止し得ると同時に、代謝的に活性な状態でフィーダー細胞を維持し得る)で処理され得る。
フィーダー細胞は、任意の哺乳動物に由来し得、そのフィーダー細胞の動物供給源は、培養されている細胞と同じ動物供給源である必要はない。例えば、フィーダー細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトのフィーダー細胞であり得るが、これらに限定されない。フィーダー細胞のタイプとしては、脾細胞(spleenocyte)、マクロファージ、胸腺細胞および/または線維芽細胞が挙げられ得る。フィーダー細胞のタイプは、それらが支持する同じ細胞タイプであってもよい。フィーダー細胞のタイプは、それらが支持する同じ細胞タイプでなくてもよい。J2細胞は、ある特定の細胞培養システムのためのフィーダー細胞として使用され、樹立されたSwiss 3T3細胞株に由来するマウス線維芽細胞のサブクローンである。
いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞の非存在下で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞によって馴化された培地中で培養されない(すなわち、馴化培地中で培養されない)。いくつかの実施形態において、細胞は、分画されたフィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒状および/もしくは可溶性画分の存在下で培養されない。上記の培養条件(すなわち、フィーダー細胞の非存在下で培養される;馴化培地中で培養されない;分画されたフィーダー細胞、またはフィーダー細胞の粒状物および/もしくは可溶性画分の存在下で培養されない)のうちのいずれか1つまたは全ては、フィーダー細胞なしの条件またはフィーダーなしの条件といわれ得る。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、フィーダー細胞なしの培養条件である。
培地および細胞培養組成物
細胞は、代表的には、細胞培養培地の存在下で培養される。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、無血清培地;血清含有培地;血清低減培地;タンパク質非含有培地;化学的に規定された培地;タンパク質非含有の化学的に規定された培地;ペプチド非含有タンパク質非含有の化学的に規定された培地;動物性タンパク質非含有培地;ゼノフリー(xeno−free)培地のような培地のうちのいずれかのタイプを含み得る。細胞培養培地は、代表的には、水性ベースの培地であり、例えば、ダルベッコ改変必須培地(DMEM)、ノックアウト−DMEM(KODMEM)、ハムF12培地、DMEM/ハムF12、改良型DMEM/ハムF12、ハムF−10培地、RPMI 1640、イーグル基礎培地(EBM)、イーグル最小必須培地(MEM)、グラスゴー最小必須培地(G−MEM)、199培地、ケラチノサイト−SFM(KSFM;Gibco/Thermo−Fisher)、前立腺上皮増殖培地(PrEGM;Lonza)、CHO細胞培養培地、PER.C6培地、293培地、ハイブリドーマ培地などのような市販のおよび/または古典的な培地のうちのいずれか、ならびにこれらの組み合わせが挙げられ得る。
細胞は、代表的には、細胞培養培地の存在下で培養される。本明細書で提供される拡大培養条件は、代表的には、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、無血清培地;血清含有培地;血清低減培地;タンパク質非含有培地;化学的に規定された培地;タンパク質非含有の化学的に規定された培地;ペプチド非含有タンパク質非含有の化学的に規定された培地;動物性タンパク質非含有培地;ゼノフリー(xeno−free)培地のような培地のうちのいずれかのタイプを含み得る。細胞培養培地は、代表的には、水性ベースの培地であり、例えば、ダルベッコ改変必須培地(DMEM)、ノックアウト−DMEM(KODMEM)、ハムF12培地、DMEM/ハムF12、改良型DMEM/ハムF12、ハムF−10培地、RPMI 1640、イーグル基礎培地(EBM)、イーグル最小必須培地(MEM)、グラスゴー最小必須培地(G−MEM)、199培地、ケラチノサイト−SFM(KSFM;Gibco/Thermo−Fisher)、前立腺上皮増殖培地(PrEGM;Lonza)、CHO細胞培養培地、PER.C6培地、293培地、ハイブリドーマ培地などのような市販のおよび/または古典的な培地のうちのいずれか、ならびにこれらの組み合わせが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、血清含有培地である。血清としては、例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、ウシ胎仔血清(fetal calf serum)、ヤギ血清またはヒト血清が挙げられ得る。一般に、血清は、上記培地の約1体積%〜約30体積%の間で存在する。場合によっては、血清は、上記培地の約0.1体積%〜約30体積%の間で存在する。いくつかの実施形態において、培地は、血清代替物を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、無血清培地である。無血清培地は一般に、いかなる動物血清をも(例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、ウシ胎仔血清、ヤギ血清もしくはヒト血清)含まないが、ある特定の動物由来製品(例えば、血清アルブミン(例えば、血液から精製)、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物および/または付着因子)を含み得る。いくつかの実施形態において、無血清細胞培養培地は、ケラチノサイト−SFM(KSFM; Gibco/Thermo−Fisher)を含む。KSFMは、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードサイロニン(T3)を含み得る。KSFM基礎培地の代表的製剤は、例えば、米国特許第6692961号に記載される。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、規定された無血清培地である。規定された無血清培地(ときおり、化学的に規定された無血清培地といわれる)は一般に、既知の濃度で存在する同定された成分を含み、一般に、動物器官抽出物(例えば、下垂体抽出物)または他の規定されていない動物由来製品(例えば、定量化されていない量の血清アルブミン(例えば、血液から精製)、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物および/または付着因子)のような規定されていない成分を含まない。規定された培地は、アミノ酸、ビタミン、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物、緩衝液(例えば、HEPES)、抗酸化物質およびエネルギー源(例えば、グルコース)のうちの1種もしくはこれより多くを含む、例えば、DMEM、F12、またはRPMI 1640のような基礎培地を含み得;そして組換えアルブミン、組換え増殖因子、化学的に規定された脂質、組換えインスリンおよび/または亜鉛、組換えトランスフェリンまたは鉄、セレンおよび抗酸化チオール(例えば、2−メルカプトエタノールもしくは1−チオグリセロール)のうちの1種もしくはこれより多くが補充され得る。組換えアルブミンおよび/または増殖因子は、例えば、非動物供給源(例えば、イネまたはE.coli)に由来し得、ある特定の場合には、合成化学物質が、規定された培地に添加される(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)/ヒト血清アルブミン(HSA)の機能のいくらかを再現し得るポリマーポリビニルアルコール)。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、MCDB 153培地(Sigma−Aldrich M7403)、改変MCDB 153培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)、MCDB 105培地(Sigma−Aldrich M6395)、MCDB 110培地(Sigma−Aldrich M6520)、MCDB 131培地(Sigma−Aldrich
M8537)、MCDB 201培地(Sigma−Aldrich M6670)、およびこれらの改変バージョンから選択され得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、MCDB 153培地(Sigma−Aldrich M7403)である。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、改変MCDB 153培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)である。
M8537)、MCDB 201培地(Sigma−Aldrich M6670)、およびこれらの改変バージョンから選択され得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、MCDB 153培地(Sigma−Aldrich M7403)である。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、改変MCDB 153培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)である。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ゼノフリー無血清培地である。ゼノフリーは一般に、培養されている細胞が由来する動物以外の動物に由来する成分を全く有しないことを意味する。例えば、ゼノフリー培養は、ヒト細胞が培養される場合には、非ヒト動物起源の成分を全く有しない。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、規定されたゼノフリー無血清培地である。規定されたゼノフリー無血清培地は、ときおり化学的に規定されたゼノフリー無血清培地といわれ、一般に、既知の濃度で存在する同定された成分を含み、一般に、動物器官抽出物(例えば、下垂体抽出物)または他の規定されていない動物由来製品(例えば、血清アルブミン(例えば、血液から精製)、増殖因子、ホルモン、キャリアタンパク質、加水分解物、および/または付着因子)のような規定されていない成分を含まない。規定されたゼノフリー無血清培地は、動物供給源(例えば、非ヒト供給源)に由来する脂質および/または組換えタンパク質(例えば、組換えアルブミン、組換え増殖因子、組換えインスリンおよび/または組換えトランスフェリンのような)を含んでいてもよいし、そうでなくてもよい。組換えタンパク質は、例えば、植物(例えば、イネ)または細菌(例えば、E.coli)のような非動物供給源に由来してもよいし、ある特定の場合には、合成化学物質が、規定された培地に添加される(例えば、ポリマー(例えば、ポリビニルアルコール))。この合成化学物質は、ウシ血清アルブミン(BSA)/ヒト血清アルブミン(HSA)の機能のいくらかを再現し得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、市販のゼノフリー血清代替品(例えば、XF−KOSRTM(Invitrogen)のような)を含み得る。いくつかの実施形態において、規定された無血清培地は、市販のゼノフリー基礎培地(例えば、mTeSR2TM(Stem Cell Technologies)、NutriStemTM(StemGent)、X−Vivo 10TMもしくはX−Vivo 15TM(Lonza Biosciences)、またはHEScGROTM(Millipore)のような)を含み得る。
さらなる成分は、本明細書中の細胞培養培地に添加され得る。例えば、このようなさらなる成分としては、アミノ酸、ビタミン、無機塩、無機酸、アデニン、エタノールアミン、D−グルコース、ヘパリン、N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸](HEPES)、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸、メタバナジン酸アンモニウム、モリブデン酸、ケイ酸塩、アルカリケイ酸塩(例えば、メタケイ酸ナトリウム)、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物、緩衝液(例えば、HEPES)、抗酸化物質、チオクト酸、トリヨードサイロニン(T3)、チミジンおよびトランスフェリンを含み得る。ある特定の場合には、インスリンおよび/またはトランスフェリンは、クエン酸鉄(III)または硫酸鉄(II)キレート化合物によって置き換えられ得る。アミノ酸としては、以下が挙げられ得る:例えば、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシンおよびL−バリン。ビタミンとしては、以下が挙げられ得る:例えば、ビオチン、D−ビオチン、塩化コリン、D−Ca+2−パントテン酸、D−パントテン酸、葉酸、i−イノシトール、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミンおよびビタミンB12。無機塩としては、以下が挙げられ得る:例えば、カルシウム塩(例えば、CaCl2)、CuSO4、FeSO4、KCI、およびマグネシウム塩(例えば、MgCl2、MgSO4)、マンガン塩(例えば、MnCl2)、酢酸ナトリウム、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4、およびある特定の微量元素のイオン(セレン、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、スズおよび亜鉛が挙げられる)。これらの微量元素は、種々の形態で提供され得、それらとしては、塩の形態が挙げられる:例えば、Na2SeO3、Na2SiO3、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4、SnClおよびZnSO。さらなる成分としては、以下が挙げられ得る:例えば、ヘパリン、表皮増殖因子(EGF)、細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる少なくとも1種の薬剤、少なくとも1種の線維芽細胞増殖因子(FGF)、酸性FGF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)(ユニプロットアクセッション番号P04141)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)(ユニプロットアクセッション番号P09919)、肝細胞増殖因子(HGF)(ユニプロットアクセッション番号P14210)、ニューレグリン1(NRG1)(ユニプロットアクセッション番号Q61CV5)、ニューレグリン2(NRG2)(ユニプロットアクセッション番号Q3MI86)、ニューレグリン3(NRG3)(ユニプロットアクセッション番号B9EGV5)、ニューレグリン4(NRG4)(ユニプロットアクセッション番号QOP6N6)、エピレグリン(ERG)(ユニプロットアクセッション番号014944)、ベータセルリン(BC)(ユニプロットアクセッション番号Q86UF5)、インターロイキン−11(IL11)(ユニプロットアクセッション番号P20809)、コラーゲンおよびヘパリン結合EGF様増殖因子(HB−EGF)(ユニプロットアクセッション番号Q14487)。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、カルシウムを含む。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約2mMの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、2mM未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約1mMの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、1mM未満の濃度で存在する。例えば、カルシウムは、2mM未満、1mM未満、900μM未満、800μM未満、700μM未満、600μM未満、500μM未満、400μM未満、300μM未満、200μM未満、100μM未満、90μM未満、80μM未満、70μM未満、60μM未満、50μM未満、40μM未満、30μM未満、20μM未満または10μM未満の濃度で存在し得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、500μM未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、300μM未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、100μM未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、20μM未満の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、カルシウムは、約90μMの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、アルブミン(例えば、血清アルブミン)を含む。アルブミンは、脊椎動物の血液中に概して豊富にあるタンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ウシ血清アルブミン(BSA)を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ヒト血清アルブミン(HSA)を含む。アルブミンは、精製されていてもよいし(例えば、ヒトまたはウシ血清から)、組換え生成されていてもよい(例えば、植物(例えば、イネ)、細菌(例えば、E.coli)、または酵母(例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae)の中でのように)。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、組換えヒト血清アルブミン(rHSA)を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、イネにおいて生成された組換えヒト血清アルブミン(rHSA)を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くの脂質を含む。脂質は一般に、油、脂肪、ろう、ステロール、脂溶性ビタミン(例えば、ビタミンA、D、E、およびK)、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質(saccharolipid)、ポリケチド、プレノール脂質(prenol lipid)などに言及し、脂質の混合物(例えば、化学的に規定された脂質混合物)を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質は、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸、ポリソルベート80(TWEEN
80)、TWEEN 20、タラ肝油脂肪酸(メチルエステル)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、D−α−トコフェロールアセテートから選択され得る。いくつかの実施形態において、脂質は、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸のうちの1種もしくはこれより多くを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販の脂質ミックスであり得る(例えば、Chemically Defined Lipid Concentrate(Gibco,11905−031); Lipid Mixture(Sigma−Aldrich L5146); Lipid Mixture 1、Chemically Defined(Sigma−Aldrich L0288))。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販のアルブミンが補充された脂質の混合物(例えば、AlbuMAX(登録商標) I Lipid−Rich BSA(Gibco, 11020−039))を含み得る。
80)、TWEEN 20、タラ肝油脂肪酸(メチルエステル)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、D−α−トコフェロールアセテートから選択され得る。いくつかの実施形態において、脂質は、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸のうちの1種もしくはこれより多くを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販の脂質ミックスであり得る(例えば、Chemically Defined Lipid Concentrate(Gibco,11905−031); Lipid Mixture(Sigma−Aldrich L5146); Lipid Mixture 1、Chemically Defined(Sigma−Aldrich L0288))。いくつかの実施形態において、脂質ミックスは、市販のアルブミンが補充された脂質の混合物(例えば、AlbuMAX(登録商標) I Lipid−Rich BSA(Gibco, 11020−039))を含み得る。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む。例えば、有糸分裂促進性増殖因子としては、表皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、インスリン様増殖因子I(IGF−I)、インスリン様増殖因子II(IGF−II)、および/またはケラチノサイト増殖因子(KGF)が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、培地は、有糸分裂促進性増殖因子を含まない。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物を含む。例えば、有糸分裂促進性補充物としては、ウシ下垂体抽出物(BPE;Gibco/Thermo−Fisher)、B27(Gibco/Thermo−Fisher)、N−アセチルシステイン(Sigma)、GEM21 NEUROPLEX(Gemini Bio−Products)、およびN2 NEUROPLEX(Gemini Bio−Products)が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、有糸分裂促進性補充物を含まない。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる1種もしくはこれより多くの薬剤を含む。例えば、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニスト(例えば、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)を含み得る。βアドレナリン作動性アゴニスト(例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)は一般に、βアドレナリンレセプター(例えば、β−1アドレナリン作動性レセプター、β−2アドレナリン作動性レセプター、β−3アドレナリン作動性レセプター)を活性化する交感神経作用薬のクラスである。βアドレナリンレセプターの活性化は、アデニル酸シクラーゼを活性化し、これは、環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)の活性化をもたらす。βアドレナリン作動性アゴニスト(例えば、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)としては、以下が挙げられ得る:例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、ドブタミン、キサモテロール、サルブタモール(アルブテロール)、レボサルブタモール(レバルブテロール)、フェノテロール、ホルモテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、クレンブテロール、イソエタリン(isoetarine)、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、アルブタミン、ベフノロール、ブロモアセチルアルプレノロールメンタン(bromoacetylalprenololmenthane)、ブロキサテロール(broxaterol)、シマテロール(cimaterol)、シラゾリン(cirazoline)、デノパミン、ドペキサミン、エチレフリン、ヘキソプレナリン、ヒゲナミン(higenamine)、イソクスプリン、マブテロール、メトキシフェナミン、ニリドリン、オキシフェドリン、プレナルテロール、ラクトパミン(ractopamine)、レプロテロール、リミテロール、トレトキノール、ツロブテロール、ジルパテロール(zilpaterol)およびジンテロール。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、イソプロテレノールを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、約0.5μM〜約20μMの間の濃度でイソプロテレノールを含む。例えば、イソプロテレノールは、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約1μM、約1.25μM、約1.5μM、約1.75μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μM、約11μM、約12μM、約13μM、約14μM、または約15μMの濃度で存在し得る。
細胞内cAMPレベルを増大させる他の薬剤としては、細胞内cAMPレベルの直接的増大を誘導する薬剤(例えば、ジブチリルcAMP)、細胞Gプロテインとの相互作用によって細胞内cAMPレベルの増大を引き起こす薬剤(例えば、コレラ毒素およびホルスコリン)、およびcAMPホスホジエステラーゼの活性を阻害することによって細胞内cAMPレベルの増大を引き起こす薬剤(例えば、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)およびテオフィリン)が挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、以下のうちの1種もしくはこれより多くを含まない:Wntアゴニスト、β−カテニンアゴニスト、Noggin、DAN、Cerberus、Gremlin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZ、DAPT、インターロイキン−6(IL6)、またはエフリンA5(EfnA5)。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのインヒビターを含む。インヒビターとしては、以下が挙げられ得る:例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)、1種もしくはこれより多くのp21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)、および1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのRho関連プロテインキナーゼインヒビター)。インヒビターのこのようなクラスは、以下でさらに詳細に考察される。インヒビターは、低分子インヒビター(例えば、小型有機分子)、抗体、RNAi分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、天然もしくは改変された基質、酵素、レセプター、ペプチド摸倣物、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーなどならびにこれらの構造的または機能的摸倣物の形態にあり得る。インヒビターは、競合的に、非競合的に、不競合的にまたは混合型の阻害によって、作用し得る。例えば、ある特定の実施形態において、インヒビターは、標的キナーゼ(例えば、プロテインキナーゼ)のATP結合ポケットの競合的インヒビターであり得る。いくつかの実施形態において、インヒビターは、1種もしくはこれより多くのレセプターの活性を破壊する。いくつかの実施形態において、インヒビターは、1種もしくはこれより多くのレセプター−リガンド相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、インヒビターは、その標的に結合し、その活性を低減し得る。いくつかの実施形態において、インヒビターは、その標的に結合し得、その標的の活性を、コントロールと比較して約10%もしくはこれより多く低減し得る。例えば、インヒビターは、その標的に結合し得、その標的の活性を、コントロールと比較して、約20%もしくはこれより多く、約30%もしくはこれより多く、約40%もしくはこれより多く、約50%もしくはこれより多く、約60%もしくはこれより多く、約70%もしくはこれより多く、約80%もしくはこれより多く、約90%もしくはこれより多く、約95%もしくはこれより多く、または約99%もしくはこれより多く低減し得る。阻害は、例えば、細胞アッセイを使用して評価され得る。
いくつかの実施形態において、インヒビターは、キナーゼインヒビター(例えば、プロテインキナーゼインヒビター)である。その標的の生物学的または生化学的機能を阻害するキナーゼインヒビターの有効性は、IC50値として表され得る。IC50は一般に、特定のインヒビターが、キナーゼを50%阻害するためにどの程度必要とされるかを示す。いくつかの実施形態において、インヒビターは、1000nM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、100nM以下、50nM以下、20nM以下、もしくは10nM以下のIC50値を有する。
いくつかの実施形態において、インヒビターは、1種もしくはこれより多くの細胞の活性、機能または特徴に直接的にまたは間接的に影響を及ぼし得る。例えば、インヒビターは、培養された細胞において、例えば、TGF−βシグナル伝達経路の阻害を通じて、テロメラーゼ逆転写酵素発現を誘導し得る。ある特定の実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。ある特定の実施形態において、ALK5インヒビターは、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。ある特定の実施形態において、A83−01は、培養された細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素発現を活性化する。別の例では、インヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を、例えば、Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)、p21活性化キナーゼ(PAK)、および/またはミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))の阻害を通じて調節し得る。細胞骨格構造の調節は、例えば、アクチンミクロフィラメント、チューブリン微小管、および中間フィラメントを含む細胞骨格構造のうちのいずれかの局面における改変、破壊もしくは変化;または分子モーター、架橋剤、キャップ形成タンパク質および核生成促進因子のような任意の関連タンパク質との相互作用を含み得る。ある特定の実施形態において、ROCKインヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、Y−27632は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、PAK1インヒビターは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、IPA3は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)は、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。ある特定の実施形態において、ブレビスタチンは、培養された細胞内の細胞骨格構造を調節する。
TGF−βインヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する工程を包含する。TGF−βシグナル伝達は、種々の細胞タイプにおいて増殖、細胞分化、および他の機能を制御し、細胞周期制御、免疫系の調節、およびある特定の細胞タイプにおける発生において役割を果たし得る。TGF−βシグナル伝達の阻害は、任意のTGF−βシグナル伝達経路および/またはTGF−βスーパーファミリーのメンバー(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック(decapentaplegic)およびVg−1のようなリガンド;TGF−βタイプIレセプター、TGF−βタイプIIレセプター、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8のようなレセプター;ならびにR−SMADおよび他のSMADタンパク質(例えば、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5)のような下流のエフェクターが挙げられる)の阻害を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する工程を包含する。TGF−βシグナル伝達は、種々の細胞タイプにおいて増殖、細胞分化、および他の機能を制御し、細胞周期制御、免疫系の調節、およびある特定の細胞タイプにおける発生において役割を果たし得る。TGF−βシグナル伝達の阻害は、任意のTGF−βシグナル伝達経路および/またはTGF−βスーパーファミリーのメンバー(TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック(decapentaplegic)およびVg−1のようなリガンド;TGF−βタイプIレセプター、TGF−βタイプIIレセプター、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8のようなレセプター;ならびにR−SMADおよび他のSMADタンパク質(例えば、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5)のような下流のエフェクターが挙げられる)の阻害を含み得る。
いくつかの実施形態において、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターの活性は、阻害される。いくつかの実施形態において、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用は、阻害される。いくつかの実施形態において、TGF−βタイプIレセプターは、阻害される。TGF−βタイプIレセプターとしては、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8のうちの1種もしくはこれより多くが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、TGF−βレセプターは、ALK5である。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター)を含む。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターに結合する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのSMADタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターおよび1種もしくはこれより多くのTGF−βリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターおよび1種もしくはこれより多くのSMADタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−SMAD相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、TGF−βレセプターのリン酸化または自己リン酸化をブロックする。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターの脱リン酸化を促進する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのSMADタンパク質のリン酸化をブロックする。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのSMADタンパク質の脱リン酸化を促進する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターのユビキチン媒介性分解を促進する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、1種もしくはこれより多くのSMADタンパク質のユビキチン媒介性分解を促進する。いくつかの実施形態において、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、SMADの核トランスロケーション、SMADの核シャフリング、SMADとコアクチベーターとの相互作用などに影響を及ぼす。ある特定の場合には、TGF−βシグナル伝達は、SMADレポーターアッセイによって測定され得る。
TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)は、いくつかの実施形態において、ALK5インヒビターであり得る。ALK5インヒビターは、ALK5または1種もしくはこれより多くのALK5リガンドまたはその両方に結合し得る。ALK5インヒビターは、ALK5または1種もしくはこれより多くの下流のSMADタンパク質またはその両方に結合し得る。ALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くのALK5−リガンド相互作用を破壊し得るか、または1種もしくはこれより多くのALK5−SMAD相互作用を破壊し得る。いくつかの実施形態において、ALK5インヒビターは、SMAD2のリン酸化をブロックする。
ALK5インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含み得る。いくつかの実施形態において、ALK5インヒビターは、ATPアナログである。いくつかの実施形態において、ALK5インヒビターは、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして 前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして 前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。
ALK5インヒビターとしては、以下が挙げられ得る:例えば、A83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、GW788388(4−[4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−2−ピリジニル]−N−(テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)−ベンズアミド)、RepSox(2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン)、およびSB 431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)。いくつかの実施形態において、ALK5インヒビターは、A83−01である。
p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程を包含する。PAKタンパク質、セリン/スレオニンp21活性化キナーゼのファミリーは、PAK1、PAK2、PAK3およびPAK4を含み、そして一般に、GTPaseのRhoファミリーを細胞骨格再組織化および核シグナル伝達に関連させるように機能する。これらタンパク質は、Cdc42およびRacに関する標的であり、種々の生物学的活動において機能し得る。PAK1は、例えば、細胞運動性および形態を調節し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてPAK1の活性を阻害する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程を包含する。PAKタンパク質、セリン/スレオニンp21活性化キナーゼのファミリーは、PAK1、PAK2、PAK3およびPAK4を含み、そして一般に、GTPaseのRhoファミリーを細胞骨格再組織化および核シグナル伝達に関連させるように機能する。これらタンパク質は、Cdc42およびRacに関する標的であり、種々の生物学的活動において機能し得る。PAK1は、例えば、細胞運動性および形態を調節し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてPAK1の活性を阻害する工程を包含する。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターを含む。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、PAK1タンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、1種もしくはこれより多くのPAK1アクチベーター(例えば、Cdc42、Rac)に結合する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、1種もしくはこれより多くの、PAK1の下流のエフェクターに結合する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、PAK1タンパク質および1種もしくはこれより多くのPAK1アクチベーター(例えば、Cdc42、Rac)に結合する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、1種もしくはこれより多くのPAK1−アクチベーター相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、1種もしくはこれより多くのPAK1−エフェクター相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、自己調節機構を標的化し、PAK1の不活性コンホメーションを促進する。
PAK1インヒビターは、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含み得る。PAK1インヒビターとしては、以下が挙げられ得る:例えば、IPA3(1,1’−ジチオジ−2−ナフトール)、AG−1478(N−(3−クロロフェニル)−6,7−ジメトキシ−4−キナゾリンアミン(quinazolinanine))、FRAX597(6−[2−クロロ−4−(1,3−チアゾール−5−イル)フェニル]−8−エチル−2−[4−(4−メチルピペラジン−1−イル)アニリノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7−オン)、FRAX486(6−(2,4−ジクロロフェニル)−8−エチル−2−[[3−フルオロ−4−(1−ピペラジニル)フェニル]アミノ]ピリド[2,3−d]ピリミジン−7(8H)−オン)、およびPF−3758309((S)−N−(2−(ジメチルアミノ)−1−フェニルエチル)−6,6−ジメチル−3−((2−メチルチエノ[3,2−d]ピリミジン−4−イル)アミノ)−4,6−ジヒドロピロロ[3,4−c]ピラゾール−5(1H)−カルボキサミド)。いくつかの実施形態において、PAK1インヒビターは、IPA3である。
ミオシンIIインヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))の活性を阻害する工程を包含する。ミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))は、ATP依存性モータータンパク質のファミリーのメンバーであり、筋収縮および他の運動性プロセス(例えば、アクチンベースの運動性)において役割を果たす。非筋肉ミオシンII(NM II)は、アクチン架橋および収縮特性を有し、その軽鎖および重鎖のリン酸化によって調節されるアクチン結合タンパク質である。収束性シグナル伝達経路の下流にあるその位置のおかげで、非筋肉ミオシンII(NM II)は、細胞接着、細胞移動および組織構築の制御に関与する。より高次の真核生物において、非筋肉ミオシンIIは、Ser19/Thr18においてその調節性軽鎖(MLC)のリン酸化によって活性化される。MLCリン酸化は、アクトミオシン収縮装置のアセンブリおよびその収縮性の両方を制御する。酵素の2つの群が、一般に、MLCリン酸化を制御する。一方の群は、MLCをリン酸化し、活性を促進するキナーゼ(MLCキナーゼ)を含む。他方は、MLCを脱リン酸化し、活性を阻害するホスファターゼである。いくつかのキナーゼは、インビトロで、ある場合にはインビボで、Ser19/Thr18においてMLCをリン酸化し得る。これらは、例えば、MLCK、ROCK、PAK(p21活性化キナーゼ)、シトロンキナーゼ、ILK(インテグリン結合キナーゼ)、MRCK(筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ関連、cdc42結合キナーゼ)およびDAPK(ZIPKを含む細胞死関連プロテインキナーゼ(death−associated protein kinase))を含む。平滑筋細胞および非筋細胞に存在する主要なミオシンホスファターゼは、3つのサブユニットを含む:130kDaの大きなサブユニット(ミオシンホスファターゼ標的化サブユニットMYPT1といわれる(M130/133、M110またはMBSとも称される))、38kDaの触媒サブユニット(タイプ1プロテインホスファターゼのδアイソフォーム、PP1c)および20kDaの小さいサブユニット。Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)は、MYPT1を阻害することによって、およびMLCを直接リン酸化することによって、ミオシンIIを活性化し得る。PAK1は、異型プロテインキナーゼC(aPKCζ)のリン酸化を通じてミオシンIIを活性化し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))の活性を阻害する工程を包含する。ミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))は、ATP依存性モータータンパク質のファミリーのメンバーであり、筋収縮および他の運動性プロセス(例えば、アクチンベースの運動性)において役割を果たす。非筋肉ミオシンII(NM II)は、アクチン架橋および収縮特性を有し、その軽鎖および重鎖のリン酸化によって調節されるアクチン結合タンパク質である。収束性シグナル伝達経路の下流にあるその位置のおかげで、非筋肉ミオシンII(NM II)は、細胞接着、細胞移動および組織構築の制御に関与する。より高次の真核生物において、非筋肉ミオシンIIは、Ser19/Thr18においてその調節性軽鎖(MLC)のリン酸化によって活性化される。MLCリン酸化は、アクトミオシン収縮装置のアセンブリおよびその収縮性の両方を制御する。酵素の2つの群が、一般に、MLCリン酸化を制御する。一方の群は、MLCをリン酸化し、活性を促進するキナーゼ(MLCキナーゼ)を含む。他方は、MLCを脱リン酸化し、活性を阻害するホスファターゼである。いくつかのキナーゼは、インビトロで、ある場合にはインビボで、Ser19/Thr18においてMLCをリン酸化し得る。これらは、例えば、MLCK、ROCK、PAK(p21活性化キナーゼ)、シトロンキナーゼ、ILK(インテグリン結合キナーゼ)、MRCK(筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ関連、cdc42結合キナーゼ)およびDAPK(ZIPKを含む細胞死関連プロテインキナーゼ(death−associated protein kinase))を含む。平滑筋細胞および非筋細胞に存在する主要なミオシンホスファターゼは、3つのサブユニットを含む:130kDaの大きなサブユニット(ミオシンホスファターゼ標的化サブユニットMYPT1といわれる(M130/133、M110またはMBSとも称される))、38kDaの触媒サブユニット(タイプ1プロテインホスファターゼのδアイソフォーム、PP1c)および20kDaの小さいサブユニット。Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)は、MYPT1を阻害することによって、およびMLCを直接リン酸化することによって、ミオシンIIを活性化し得る。PAK1は、異型プロテインキナーゼC(aPKCζ)のリン酸化を通じてミオシンIIを活性化し得る。
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)を含む。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシンIIタンパク質に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシン頭部構造に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシン−ADP−Pi複合体に結合する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシンII ATPase活性を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシンIIへの結合に関してATPと競合する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシンサブフラグメント−1に結合するヌクレオチドと競合する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシンII−アクチン結合を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ミオシン頭部とアクチンおよび/または基質との相互作用を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ATP誘導性アクトミオシン解離を破壊する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ホスフェート放出プロセスに干渉する。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、堅いアクトミオシン架橋を妨げる。
ミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)は、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビター(例えば、低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)を含み得る。ミオシンIIインヒビターとしては、以下が挙げられ得る:例えば、ブレビスタチン((±)−1,2,3,3a−テトラヒドロ−3a−ヒドロキシ−6−メチル−1−フェニル−4H−ピロロ[2,3−b]キノリン−4−オン)およびそのアナログ(例えば、パラ−ニトロブレビスタチン、(S)−ニトロ−ブレビスタチン、S−(−)−7−デスメチル−8−ニトロブレビスタチンなど)、BTS(N−ベンジル−p−トルエンスルホンアミド)、ならびにBDM(2,3−ブタンジオンモノオキシム)。いくつかの実施形態において、ミオシンIIインヒビターは、ブレビスタチンである。
ROCK(Rho関連プロテインキナーゼ)インヒビター
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含しない。Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)は、タンパク質のRho
GTPaseファミリーに属し、このファミリーは、Rho、Rac1およびCdc42キナーゼを含む。Rhoのエフェクター分子は、ROCKであり、これは、RhoのGTP結合形態に結合するセリン/スレオニンキナーゼである。ROCKの触媒性キナーゼドメインは、セリン/スレオニンキナーゼに特徴的な保存されたモチーフを含み、N末端において見出される。ROCKタンパク質はまた、中心のコイルドコイルドメインを有し、これは、Rho結合ドメイン(RBD)を含む。そのC末端は、プレクストリン相同(PH)ドメインと内部システインリッチドメインとを含む。上記コイルドコイルドメインは、他のαらせんタンパク質と相互作用すると考えられる。RBD(上記コイルドコイルドメイン内に位置する)は、活性化したRho GTPase(RhoA、RhoB、およびRhoCを含む)と相互作用する。上記PHドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンのような脂質メディエーターと相互作用すると考えられ、タンパク質局在化において役割を果たし得る。上記PHドメインおよびRBDとキナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害ループを生じる。さらに、上記キナーゼドメインは、RhoEへの結合に関与し、これはROCK活性の負の調節因子である。
いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書中の方法は、培養された上皮細胞においてRhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程を包含しない。Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)は、タンパク質のRho
GTPaseファミリーに属し、このファミリーは、Rho、Rac1およびCdc42キナーゼを含む。Rhoのエフェクター分子は、ROCKであり、これは、RhoのGTP結合形態に結合するセリン/スレオニンキナーゼである。ROCKの触媒性キナーゼドメインは、セリン/スレオニンキナーゼに特徴的な保存されたモチーフを含み、N末端において見出される。ROCKタンパク質はまた、中心のコイルドコイルドメインを有し、これは、Rho結合ドメイン(RBD)を含む。そのC末端は、プレクストリン相同(PH)ドメインと内部システインリッチドメインとを含む。上記コイルドコイルドメインは、他のαらせんタンパク質と相互作用すると考えられる。RBD(上記コイルドコイルドメイン内に位置する)は、活性化したRho GTPase(RhoA、RhoB、およびRhoCを含む)と相互作用する。上記PHドメインは、アラキドン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンのような脂質メディエーターと相互作用すると考えられ、タンパク質局在化において役割を果たし得る。上記PHドメインおよびRBDとキナーゼドメインとの相互作用は、自己阻害ループを生じる。さらに、上記キナーゼドメインは、RhoEへの結合に関与し、これはROCK活性の負の調節因子である。
ROCKファミリーは、ROCK1(ROK−βまたはp160ROCKとしても公知)およびROCK2(ROK−αとしても公知)を含む。ROCK1は、長さが約1354アミノ酸であり、ROCK2は、長さが約1388アミノ酸である。ヒトROCK1およびヒトROCK2のアミノ酸配列は、それぞれ、UniProt Knowledgebase(UniProtKB)アクセッション番号Q13464および075116において見出され得る。ヒトROCK1およびROCK2のヌクレオチド配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号NM_005406.2およびNM_004850において見出され得る。種々の動物に由来するROCK1およびROCK2タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、UniProtおよびGenBank両方のデータベースにおいて見出され得る。
両方のROCKアイソフォームが、組織において遍在的に発現されているが、それらは、いくつかの組織では異なる強度を示す。例えば、ROCK2は、脳および骨格筋ではより優勢である一方で、ROCK1は、肝臓、精巣および腎臓において、より豊富である。両方のアイソフォームが血管平滑筋および心臓において発現される。休止状態では、ROCK1およびROCK2の両方は、主にサイトゾルにあるが、Rho活性化の際には、膜へとトランスロケーションされる。Rho依存性ROCK活性化は、高度に細胞タイプ依存性であり、ROCK活性は、収縮性、細胞透過性、アポトーシスへの移動および増殖における変化を含む、いくつかの異なる機構によって調節される。いくつかのROCK基質は、同定されている(例えば、Hu and Lee, Expert Opin. Ther. Targets 9:715−736(2005); Loirand et
al, Cir. Res. 98:322−334(2006);およびRiento and Ridley, Nat. Rev. Mol. Cell Bioi. 4:446−456(2003)を参照のこと(これらは全て参考として援用される))。場合によっては、ROCKは、GTP結合したRhoの結合を介して活性化された後に、LIMキナーゼおよびミオシン軽鎖(MLC)ホスファターゼをリン酸化する。
al, Cir. Res. 98:322−334(2006);およびRiento and Ridley, Nat. Rev. Mol. Cell Bioi. 4:446−456(2003)を参照のこと(これらは全て参考として援用される))。場合によっては、ROCKは、GTP結合したRhoの結合を介して活性化された後に、LIMキナーゼおよびミオシン軽鎖(MLC)ホスファターゼをリン酸化する。
Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程は、その活性を低減する工程、その機能を低減する工程、またはROCK1もしくはROCK2のうちの少なくとも一方の発現を低減する工程を包含し得る。上記活性、機能または発現は、完全に抑制され得る(すなわち、活性、機能または発現が全くない)か;あるいは上記活性、機能または発現は、処理していない細胞に対して処理した細胞において低い可能性がある。いくつかの実施形態において、Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程は、ROCK1および/またはROCK2経路の上流のエフェクター(例えば、GTP結合したRho)をブロックし、その結果、ROCK1および/またはROCK2が活性化されないか、またはその活性は、処理されていない細胞と比較して低減される工程を包含する。他の上流エフェクターとしては、インテグリン、増殖因子レセプター(TGF−βおよびEGFRが挙げられるが、これらに限定されない)、カドヘリン、Gプロテイン共役レセプターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程は、ROCK1および/またはROCK2が、いかなるシグナルをも伝達できないか、または処理されていない細胞と比較して低減したシグナルしか伝達することができないように、活性化されたROCK1および/またはROCK2の下流のエフェクター分子の活性、機能または発現をブロックする工程を包含する。下流のエフェクターとしては、ビメンチン、LIMK、ミオシン軽鎖キナーゼ、NHEl、コフィリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、Rhoキナーゼ(例えば、Rho関連プロテインキナーゼ)の活性を阻害する工程は、1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くのRho関連プロテインキナーゼインヒビター)の使用を包含し得る。Rhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)は、1種もしくはこれより多くの低分子Rhoキナーゼインヒビター(例えば、1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)を含み得る。分子、Rhoキナーゼインヒビター(例えば、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)の例としては、以下が挙げられる:例えば、Y−27632((R)−(+)−trans−4−(1−アミノエチル)−N−(4−ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド)、SR 3677(N−[2−[2−(ジメチルアミノ)エトキシ]−4−(1H−ピラゾール−4−イル)フェニル−2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−2−カルボキサミドジヒドロクロリド)、チアゾビビン(N−ベンジル−[2−(ピリミジン−4−イル)アミノ]チアゾール−4−カルボキサミド)、HA1100ヒドロクロリド(1−[(1,2−ジヒドロ−1−オキソ−5−イソキノリニル)スルホニル]ヘキサヒドロ−1H−1,4−ジアゼピンヒドロクロリド)、HA1077(ファスジルヒドロクロリド)、およびGSK−429286(4−[4−(トリフルオロメチル)フェニル]−N−(6−フルオロ−1H−インダゾール−5−イル)−2−メチル−6−オキソ−1,4,5,6−テトラヒドロ−3−ピリジンカルボキサミド)(これらの各々は、市販されている)。さらなる低分子Rhoキナーゼインヒビター(例えば、低分子Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)としては、例えば、国際特許出願公開番号WO 03/059913、WO 03/064397、WO 05/003101、WO 04/112719、WO 03/062225およびWO 03/062227に記載されるもの、ならびに米国特許第7,217,722号および同第7,199,147号、ならびに米国特許出願公開番号2003/0220357、2006/0241127、2005/0182040および2005/0197328に記載されるもの(これらの全ての内容は、参考として援用される)が挙げられる。
その後の環境
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ある特定の時間量の後に、上記で記載される培養条件から除去され得、その後の環境へと置かれ得る。上記で記載される成分のうちのいずれも、その後の環境に存在しなくてもよい。いくつかの実施形態において、上記の1種もしくはこれより多くのインヒビターは、その後の環境に存在しない。例えば、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、ROCKインヒビター、PAK1インヒビターおよびミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)のうちの1種もしくはこれより多くは、その後の環境に存在しなくてもよい。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、ある特定の時間量の後に、上記で記載される培養条件から除去され得、その後の環境へと置かれ得る。上記で記載される成分のうちのいずれも、その後の環境に存在しなくてもよい。いくつかの実施形態において、上記の1種もしくはこれより多くのインヒビターは、その後の環境に存在しない。例えば、TGF−βインヒビター(例えば、TGF−βシグナル伝達インヒビター)、ROCKインヒビター、PAK1インヒビターおよびミオシンIIインヒビター(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)のうちの1種もしくはこれより多くは、その後の環境に存在しなくてもよい。
その後の環境は、上記細胞の分化を促進する環境であり得る。その後の環境は、上記細胞が元々由来した器官または組織に類似または同一であるインビボ環境であり得る(例えば、自家移植物)。その後の環境は、上記細胞が元々由来した器官または組織のある特定の生化学的または生理学的特性に厳密に似たインビトロ環境またはエキソビボ環境であり得る。その後の環境は、インビトロまたはエキソビボで分化を促進することが公知の因子が上記細胞培養物に添加されるような合成の環境であり得る。例えば、カルシウムまたはさらなるカルシウムは、分化を促進するために上記細胞培養物に添加され得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、分化を促進するために、上記細胞培養培地のカルシウム濃度が少なくとも約1mMであるように添加され得る。例えば、上記細胞培養培地中のカルシウム濃度は、少なくとも約1mM、少なくとも約1.1mM、少なくとも約1.2mM、少なくとも約1.3mM、少なくとも約1.4mM、少なくとも約1.5mM、少なくとも約1.6mM、少なくとも約1.7mM、少なくとも約1.8mM、少なくとも約1.9mMまたは少なくとも約2.0mMであり得る。いくつかの実施形態において、カルシウムは、分化を促進するために、上記細胞培養培地中のカルシウム濃度が約1.5mMであるように細胞培養物に添加される。
いくつかの実施形態において、細胞は、上記細胞が元々由来した器官または組織の細胞へと、細胞の分化を刺激するために特異的であるその後の環境に置かれる。いくつかの実施形態において、細胞は、透過性の膜の一方の側に播種され得る。いくつかの実施形態において、透過性の膜の一方の側で培養された細胞は、上記細胞が、透過性の膜の他方の側から栄養を受け取る間に空気に曝され得、そしてこのような培養は、気相液相界面といわれ得る。場合によっては、細胞は、気相液相界面分化の間に経膜電気抵抗(TEER)の増大を発生させる。いくつかの実施形態において、細胞は、天然のまたは合成の三次元細胞培養表面の中またはその上へとその後の環境において播種され得る。三次元表面の非限定的な例は、マトリゲル(登録商標)被覆培養表面である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、マトリゲル(登録商標)または他のヒドロゲルの中に埋め込まれ得る。他の三次元培養環境としては、コラーゲンゲルおよび/または任意の構成の合成生体ポリマー物質(例えば、ヒドロゲルのような)を含む表面が挙げられる。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中で密着結合を形成する。密着結合は一般に、細胞膜を一緒に結合して、流体に対して不透過または実質的に不透過なバリアを形成する部分である。密着結合の形成は、例えば、密着結合タンパク質(例えば、ZO−1)の免疫蛍光染色によって可視化され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、密着結合を培養物中で形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、ある特定の濃度のカルシウムに曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約1mMもしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、約1mM、約1.1mM、約1.2mM、約1.3mM、約1.4mM、約1.5mM、約1.6mM、約1.7mM、約1.8mM、約1.9mM、約2.0mMまたはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約1.5mMのカルシウム濃度に曝された場合に密着結合を形成するように誘導され得る。
いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中でドームまたはドーム様構造を形成する。ドームは一般に、培養物中の極性化上皮に特有の多細胞性嚢胞様構造(multicellular hemicyst structure)であり、経上皮溶質輸送を伴う分化した上皮に機能的に等しい可能性がある。ドームは、細胞がコンフルエントな間に小さな領域で散発的に存在し得、しばしば、機能的上皮単層の初期分化プロセスを特徴付け得る。ある特定の場合には、ドーム形成は、密着結合タンパク質の発現、不透過性の基層形成(impermeable substratum formation)、および下にある支持体に対する細胞接着の減少(例えば、細胞層と下にある支持体との間の液体蓄積の結果として)のうちの1種もしくはこれより多くを含み得る。ドーム形成は、例えば、形態として極性化した細胞に関する経上皮輸送システムの発生の間に起こり得る(例えば、Suら(2007) J. Biol. Chem. 282(13):9883−9894を参照のこと)。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、培養物中でドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、ある特定の濃度のカルシウムに曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約1mMもしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。例えば、上皮細胞は、約1mM、約1.1mM、約1.2mM、約1.3mM、約1.4mM、約1.5mM、約1.6mM、約1.7mM、約1.8mM、約1.9mM、約2.0mM、もしくはこれより高いカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。いくつかの実施形態において、上皮細胞は、約1.5mMのカルシウム濃度に曝された場合にドームまたはドーム様構造を形成するように誘導され得る。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ROCKが阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、PAK1が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびROCKが阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびPAK1が阻害されないその後の環境へと置かれる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))が阻害されないその後の環境へと置かれる。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ROCKが阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、PAK1が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびROCKが阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびPAK1が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、TGF−βシグナル伝達およびミオシンII(例えば、非筋肉ミオシンII(NM II))が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する。
拡大された細胞の使用
ある特定の実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、ある特定の生物医学的使用および実験使用(例えば、生体分子生成(例えば、タンパク質発現)、診断剤(例えば、異常な上皮細胞の同定)および/または治療剤(例えば、候補治療剤のスクリーニング;細胞療法(例えば、細胞療法のための遺伝子改変された細胞))のようなのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、自家適用(例えば、自家移植)のために使用され得、そしてある特定の場合には、拡大した上皮細胞集団は、非自家適用(例えば、薬物スクリーニング)のために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、集められ得るおよび/または単離され得るおよび/または貯蔵され得る(例えば、細胞バンクのために)。
ある特定の実施形態において、拡大した上皮細胞集団は、ある特定の生物医学的使用および実験使用(例えば、生体分子生成(例えば、タンパク質発現)、診断剤(例えば、異常な上皮細胞の同定)および/または治療剤(例えば、候補治療剤のスクリーニング;細胞療法(例えば、細胞療法のための遺伝子改変された細胞))のようなのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、自家適用(例えば、自家移植)のために使用され得、そしてある特定の場合には、拡大した上皮細胞集団は、非自家適用(例えば、薬物スクリーニング)のために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、集められ得るおよび/または単離され得るおよび/または貯蔵され得る(例えば、細胞バンクのために)。
一例では、拡大した上皮細胞集団は、タンパク質発現、ウイルス/ワクチン製造などのために使用され得る。場合によっては、拡大した上皮細胞集団は、目的のタンパク質(例えば、治療用タンパク質)を発現するために遺伝子改変され得る。場合によっては、上皮細胞または細胞の群は、遺伝子改変され得、次いで、本明細書で記載される拡大条件を使用して拡大され得る。上記細胞のこのような遺伝子改変は一般に、細胞拡大を増大することが意図された改変ではない。むしろ、上記細胞のこのような遺伝子改変は、例えば、特定のタンパク質をコードする導入遺伝子(例えば、疾患修飾導入遺伝子(disease−modifying transgene))を挿入するように設計される。導入遺伝子によって発現されるタンパク質は、失われているタンパク質もしくは欠陥タンパク質の機能的バージョンとして作用し得るか、または遺伝子または他のタンパク質のサプレッサーまたはインヒビターとして作用し得る。特定のタンパク質を発現する細胞は、次いで、細胞がインビボで上記タンパク質を生成するように、その後の環境(例えば、患者への自家移植のような)に置かれ得る。
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、異常なまたは病的な上皮細胞の存在によって特徴付けられる状態を有する被験体のための候補処置を同定するために有用であり得る。このような状態は、例えば、新形成、過形成、および悪性腫瘍もしくは良性腫瘍が挙げられ得る。場合によっては、被験体から得られる異常な上皮細胞は、異常な上皮細胞のインビトロ集団を生成するために、本明細書で記載される拡大条件のうちのいずれかに従って拡大され得る。例えば、循環腫瘍細胞(CTC)は、被験体の循環から単離され得、本明細書中の拡大条件は、さらなる分析(例えば、上記細胞の機能的、表現型的および/または遺伝的特徴付けのような)のために十分な数の細胞を得るために利用され得る。
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体のための1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するために有用であり得る。例えば、拡大した上皮細胞集団は、応答プロフィールを生成するためにアッセイされ得る。応答プロフィールは、代表的には、特定の処置が、例えば、正常なまたは異常な上皮細胞において、所望の応答を生成する可能性を示し得る、1種もしくはこれより多くのデータ点の集まりである。治療剤への応答としては、例えば、細胞死(例えば、壊死、毒性、アポトーシスなどによる)、および/または上記細胞の増殖速度の減少が挙げられ得る。治療剤への応答を評価するための方法は、以下を含む:例えば、用量応答曲線、細胞生存曲線、治療指数などを決定する工程。例えば、鼻または気管の上皮細胞は、CFTR遺伝子における変異を有する被験体から単離され得、本明細書中の拡大条件は、さらなる分析(例えば、治療剤(例えば、薬物および/または抗体)への応答プロフィールを生成するためのアッセイ)のために、十分な数の細胞を得るために利用され得る。
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するために有用であり得る。例えば、少なくとも1種の候補の異常な上皮細胞は、本明細書で記載される拡大条件のうちのいずれかに従って拡大され得る。上記細胞が一旦拡大された後、例えば、組織起源プロフィールは、ありそうな起源組織を決定するために、細胞に関して(例えば、mRNAおよび/またはタンパク質発現をアッセイする、組織学的評価、免疫組織化学的染色によって)決定され得る。上記細胞の少なくとも1つの特徴は、同じ組織起源に由来する正常な上皮細胞の同じ特徴と比較され得る。比較され得る細胞特徴としては、例えば、細胞増殖特徴、コロニー形成、プロテオームプロフィール、代謝プロフィールおよびゲノムプロフィールが挙げられる。上記候補の異常な上皮細胞および正常な上皮細胞において検出される差異は、上記候補の異常な上皮細胞が、正常な上皮細胞と比較して異常であることを示し得る。
別の例では、拡大した上皮細胞集団は、被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするために有用であり得る。疾患の進行をモニターする工程は一般に、異常な状態が進行しつつある(増悪しつつある)のか、退縮しつつある(改善しつつある)のか、または静的なままである(検出可能な変化なし)のかを決定するために、被験体における異常な状態を周期的にチェックすることを意味する。被験体由来の拡大した上皮細胞は、進行または退縮の種々のマーカーに関してアッセイされ得る。疾患の進行をモニターする工程はまた、1種もしくはこれより多くの処置の効力をモニターする工程を包含し得る。
以下に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するのであって、本技術を限定するのではない。
実施例1:材料および方法
この実施例に示される材料および方法を、別段注記される場合は除いて、実施例2〜9に記載される細胞培養および他のアッセイを行うために使用した。
この実施例に示される材料および方法を、別段注記される場合は除いて、実施例2〜9に記載される細胞培養および他のアッセイを行うために使用した。
細胞培養および集団倍加の決定
上皮細胞(前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞)を、実施例2〜5および図1〜17に示されるように、培養培地を使用して組織培養容器の中に3,000〜10,000個の生細胞/cm2でプレーティングし、37℃において5% CO2とともにインキュベートした。上記培地を2日または3日ごとに交換した。細胞が約70〜90% コンフルエントになった場合に、それらを、標準的トリプシン処理法を使用して継代培養した。総細胞数を、製造業者の説明書に従って、Countess II Automated Cell Counter(Life Technologies,AMQAX1000)を使用して決定した。
上皮細胞(前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞)を、実施例2〜5および図1〜17に示されるように、培養培地を使用して組織培養容器の中に3,000〜10,000個の生細胞/cm2でプレーティングし、37℃において5% CO2とともにインキュベートした。上記培地を2日または3日ごとに交換した。細胞が約70〜90% コンフルエントになった場合に、それらを、標準的トリプシン処理法を使用して継代培養した。総細胞数を、製造業者の説明書に従って、Countess II Automated Cell Counter(Life Technologies,AMQAX1000)を使用して決定した。
これらのアッセイに使用した細胞および培地は、以下を含んだ:PrEC前立腺上皮細胞(Lonza CC−2555);正常ヒト気管支上皮細胞(Lonza CC−2540);LNCapクローンFGC細胞株(Sigma−Aldrich、D−073);PrEBM基礎培地およびPrEGM SingleQuot Kit Supplements & Growth Factors(Lonza CC−3166)を含むPrEGM BulletKit;ならびに事前に選定された(prequalified)ヒト組換え表皮増殖因子1−53(EGF 1−53、0.2ng/mLで使用)およびウシ下垂体抽出物(BPE、30μg/mLで使用)を供給したケラチノサイト−SFM(Gibco/Thermo−Fisher 17005−042)。細胞培養材料は、Corning(登録商標) BioCoatTM Cellware, Collagen Type I, T−25フラスコ(Corning、356484)を含んだ。
集団倍加(PD)を計算するために使用される式は、方程式Aに表される:
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
ここでn=所定の継代培養の最後の最終PD数、Y=採取時点での細胞収量、I=その継代培養を始めるために接種物として使用される細胞数、およびX=定量している継代培養を開始するために使用される接種物の倍加レベル。
n=3.32×(logY−logI)+X 方程式A
ここでn=所定の継代培養の最後の最終PD数、Y=採取時点での細胞収量、I=その継代培養を始めるために接種物として使用される細胞数、およびX=定量している継代培養を開始するために使用される接種物の倍加レベル。
この研究において使用されるある特定の化学物質のストックを、DMSO中に10mMへと溶解することによって調製した。上記化学物質ストックを、実施例2〜5に記載されかつ図1〜17に示されるように、細胞培養を開始した時点から、所望の最終濃度になるように培養培地に添加した。使用したある特定の化合物を、以下の表1に列挙する。
定量的RT−PCR
総RNAを、TRIzol(登録商標) Plus RNA Purification Kit(Life Technologies、12183−555)およびPureLink(登録商標) RNA Mini Kit(Life Technologies, 12183018A)を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。100ナノグラムの総RNAを、TaqMan(登録商標) RNA−to−CTTM 1−Step Kit(Life Technologies, 4392938)を使用して、供給元によって提供されたプロトコルに従って、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)発現の決定のために使用した。使用したhTERTプライマーおよびTaqmanプローブは、以下のとおりであった:正方向プライマー、5’−TGACACCTCACCTCACCCAC−3’(配列番号1)、逆方向プライマー、5’−CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC−3’(配列番号2)およびTaqmanプローブ、5’−ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG−3’(配列番号3)。
総RNAを、TRIzol(登録商標) Plus RNA Purification Kit(Life Technologies、12183−555)およびPureLink(登録商標) RNA Mini Kit(Life Technologies, 12183018A)を使用して、製造業者の説明書に従って調製した。100ナノグラムの総RNAを、TaqMan(登録商標) RNA−to−CTTM 1−Step Kit(Life Technologies, 4392938)を使用して、供給元によって提供されたプロトコルに従って、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)発現の決定のために使用した。使用したhTERTプライマーおよびTaqmanプローブは、以下のとおりであった:正方向プライマー、5’−TGACACCTCACCTCACCCAC−3’(配列番号1)、逆方向プライマー、5’−CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC−3’(配列番号2)およびTaqmanプローブ、5’−ACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG−3’(配列番号3)。
実施例2:従来の細胞培養培地(すなわち、コントロール培養条件)での上皮細胞の増殖
この実施例において、前立腺上皮細胞(PrEC)および気管支上皮細胞(HBEC)を、従来の細胞培養培地(すなわち、コントロール培養条件)中で増殖させて、インビトロおよび/またはエキソビボでの上皮細胞増殖のある特定の特性を示した。
この実施例において、前立腺上皮細胞(PrEC)および気管支上皮細胞(HBEC)を、従来の細胞培養培地(すなわち、コントロール培養条件)中で増殖させて、インビトロおよび/またはエキソビボでの上皮細胞増殖のある特定の特性を示した。
前立腺上皮細胞(PrEC)を、前立腺上皮細胞を培養するために一般に使用される標準の培養培地の2タイプのうちの一方で培養した:1)前立腺上皮細胞増殖培地(PrEBM基礎培地およびPrEGM SingleQuot Kit Supplements & Growth Factors(Lonza CC−3166)を含むPrEGM BulletKit)、または2)KSFM(ケラチノサイト−SFM(Gibco/Thermo−Fisher 17005−042)(事前に選定されたヒト組換え表皮増殖因子1−53(EGF 1−53、0.2ng/mLで使用)およびウシ下垂体抽出物(BPE、30μg/mLで使用)を補充した)。各継代における細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした(図1、上パネル)。両方の培地タイプにおいて、前立腺上皮細胞は、老化に入る前にわずか10〜20回の集団倍加という制限された細胞複製を示した。KSFM中で培養された前立腺上皮細胞は、集団倍加18(PD 18; 図1、下パネル)において、細胞老化に特徴的な形態を示した。
気管支上皮細胞(HBEC)を、KSFM中で培養した。各継代における上記細胞の集団倍加を計算し、総集団倍加を、培養日数に対してプロットした(図2、上パネル)。上記気管支上皮細胞は、細胞老化に入る前にわずか11回の集団倍加の間に活発な複製を示した。KSFM中で培養した気管支上皮細胞は、集団倍加11(PD 11; 図2、下パネル)において、細胞老化の特徴的な形態を示した。
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子の発現を、種々の継代での気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムPCRによって試験した。染色体の末端は、テロメアといわれるDNA構造の反復セグメントから構成される。テロメアは、異常に一緒にくっつくまたは壊れる(分解する)ことから染色体を保護する。正常な上皮細胞では、テロメアは、代表的には、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)の発現の欠如に起因して、細胞が分裂するにつれて徐々に短くなる。テロメラーゼは一般に、幹細胞において活性であり、大部分のがん細胞(これは、制限なく増殖および分裂する)において異常に活性である。hTERT発現のレベルを、LNCaP細胞(ヒト前立腺がん細胞株(Sigma−Aldrich、D−073))と比較した。LNCaP細胞を、hTERT発現の陽性コントロールとして使用した。気管支上皮細胞は、早期継代(p3)または後期継代(p5)のいずれにおいてもhTERTを発現しなかった。早期継代(p2)での前立腺上皮細胞は、hTERTの極めて低いレベルを発現し、これは、継代3には迅速に減少し、継代5までには検出不能になった(図3Aおよび図3B)。これらの知見から、PrECおよびHBECの両方が正常な上皮細胞であることが確認された。
ある特定の細胞マーカーの発現を、培養した前立腺上皮細胞において試験した。これらの細胞は、免疫蛍光染色によって試験した場合、上皮幹細胞マーカー、Lgr5を発現しなかった(図4、下パネル)。代わりに、全ての細胞は、TP63発現に関して陽性に染色された(図4、中央パネル)。このTP63遺伝子、転写因子は、基底上皮細胞のマーカーであり、一般には、上皮組織の正常な機能に必要とされる。細胞核を、DAPI染色を使用して可視化した(図4、上パネル)。ポリクローナルLgr5抗体(抗GPR49/LGR5抗体、LifeSpan Biosciences、LS−A1235)を、1:50希釈で使用した。モノクローナル抗TP63抗体(Santa Cruz Biotechnology、sc−25268)を、1:50希釈で使用した。
従って、上記の実験は、従来の細胞培養培地(すなわち、コントロール培養条件)で培養した上皮細胞が、インビトロおよび/またはエキソビボで制限された増殖能、テロメラーゼ逆転写酵素遺伝子の極めて低いまたは検出されない発現を有し、上皮幹細胞に代表的なタンパク質マーカーを発現しない(すなわち、上皮幹細胞マーカーLGR5を発現しない)ことを示した。
実施例3:ALK5インヒビターの存在下でのヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)発現
この実施例において、上皮細胞におけるhTERT発現を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、またはその両方の存在下で評価した。hTERT遺伝子の発現を、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムPCRによって試験した。上記細胞を、ALK5インヒビター、A83−01、またはRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、Y−27632、またはその両方のインヒビターで、KSFM中の種々の継代において処理した。A83−01は、以下で記載されるように、上皮細胞におけるhTERT発現を迅速に誘導しかつ持続させた。
この実施例において、上皮細胞におけるhTERT発現を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、またはその両方の存在下で評価した。hTERT遺伝子の発現を、気管支上皮細胞および前立腺上皮細胞において定量的リアルタイムPCRによって試験した。上記細胞を、ALK5インヒビター、A83−01、またはRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、Y−27632、またはその両方のインヒビターで、KSFM中の種々の継代において処理した。A83−01は、以下で記載されるように、上皮細胞におけるhTERT発現を迅速に誘導しかつ持続させた。
図5Aおよび図5Bに示されるように、気管支上皮細胞は、KSFM中での早期継代(p3)および後期継代(p5)の両方においてhTERTを発現しなかった。ALK5インヒビターA83−01は、気管支上皮細胞において早期継代(p3)でhTERT発現を強く誘導し、後期継代(p6)で測定可能なhTERT発現を持続させた。Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、気管支上皮細胞において早期継代(p3)でhTERT発現を僅かに誘導した;しかし、それは後期継代(p6)で検出不能になった。A83−01およびY−27632の両方の存在下では、hTERT発現は、後期継代(p6)で気管支上皮細胞において誘導および持続した。
図6Aおよび図6Bに示されるように、早期継代(p2)での前立腺上皮細胞は、低レベルのhTERTを発現し、これは、継代3で迅速に減少し、継代5で検出不能になった。ALK5インヒビターA83−01は、前立腺上皮細胞において早期継代(p2)でhTERT発現を迅速に誘導し、後期継代(p5)で測定可能なhTERT発現を持続させた。Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、前立腺上皮細胞において早期継代(p2)でhTERT発現を誘導した;しかし、それは、後期継代(p5)で検出不能になった。A83−10およびY−27632の両方の存在下で、hTERT発現は、早期継代(p2)の前立腺上皮細胞において有意に誘導され、後期継代(p5)においてすら高レベルで持続した。hTERT発現のこのレベルは、3T3−J2フィーダー細胞(J2)と共培養した前立腺上皮細胞におけるhTERT発現のレベルと匹敵した。
実施例4:上皮細胞プレーティング効率
この実施例において、上皮細胞プレーティング効率、すなわち、細胞培養表面に効率的に付着して、分裂し、コロニーへと増殖し続ける細胞の数を、種々の条件下で調べた。
この実施例において、上皮細胞プレーティング効率、すなわち、細胞培養表面に効率的に付着して、分裂し、コロニーへと増殖し続ける細胞の数を、種々の条件下で調べた。
図7に示されるように、ALK5インヒビターA83−01は、標準の組織培養表面(すなわち、被覆されていない)上でKSFM中での前立腺上皮細胞プレーティング効率に干渉した。ALK5インヒビターA83−01の存在下では、大部分の前立腺上皮細胞は、3日後ですら、標準の組織培養表面に付着しなかった。しかし、付着した少数の細胞は、増殖し続けた。8日目まで、細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的な形態を示した。
図8に示されるように、ALK5インヒビターA83−01は、標準の組織培養表面(すなわち、被覆されていない)上で、KSFM中での気管支上皮細胞プレーティング効率に干渉した。ALK5インヒビターA83−01の存在下では、大部分の気管支上皮細胞は、3日後ですら、標準の組織培養表面に付着しなかった。しかし、付着した少数の細胞は、増殖し続けた。大部分の細胞は、7日目で活発に分裂している細胞の特徴的な形態を示した。
図9に示されるように、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、KSFM中のA83−01によって引き起こされた前立腺上皮細胞の低いプレーティング効率を改善した。多くの前立腺上皮細胞は、プレーティング後2日目で、A83−01およびY−27632の両方の存在下で標準の組織培養表面に付着した。上記細胞は増殖し続け、大部分の細胞は、7日目で活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
図10に示されるように、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、KSFM中のA83−01によって引き起こされた気管支上皮細胞の低いプレーティング効率を改善した。多くの気管支上皮細胞は、プレーティング後2日目でA83−01およびY−27632の両方の存在下で標準の組織培養表面に付着した。上記細胞は増殖し続け、大部分の細胞は、7日目で活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
図11に示されるように、コラーゲンIを被覆した組織培養表面の使用は、KSFM中のA83−01およびY−27632の存在下での前立腺上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大部分の細胞は、プレーティング後1日目で上記表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。5日目までに、上記細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
図12に示されるように、コラーゲンIを被覆した組織培養表面の使用は、KSFM中のA83−01およびY−27632の存在下での気管支上皮細胞のプレーティング効率を劇的に増大させた。大部分の細胞は、プレーティング後1日目で上記表面に効率的に付着し、迅速に増殖した。6日目までに、上記細胞を継代した場合に、大部分の細胞は、活発に分裂している細胞の特徴的形態を示した。
実施例5:上皮細胞増殖に対するALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター、および他の化合物を含む化合物の効果
この実施例において、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
この実施例において、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞を、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632の存在下で、KSFM中で増殖させた。図13に示されるように、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の両方は、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632の連続使用にも拘わらず、後期継代において老化に入った。8日目および9日目までに、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の後期継代は、平らなかつ拡張した細胞形状のような細胞老化の特徴的な形態を示した。従って、これを単独で使用した場合、Y−27632は、前立腺上皮細胞または気管支上皮細胞の増殖を促進しなかった。
さらなるインビトロおよび/またはエキソビボ増殖条件の効果を試験するために、前立腺上皮細胞を、培地単独、ALK5インヒビターA83−01、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632、またはその両方(コラーゲンありまたはなし)の存在下で、KSFMまたはPrEGM中で増殖させた。図14に示されるように、前立腺上皮細胞は、PrEGMまたはKSFM中での10〜20回の集団倍加後に老化に入った。Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、前立腺上皮細胞の総集団倍加を僅かに増大させたが、上記細胞は、PD20超に達してまもなくなお老化に入った。A83−01はまた、総集団倍加を増大させた;しかし、A83−01は、標準の組織培養表面上でのプレーティング効率に干渉し得る(実施例4を参照のこと)ので、細胞数の増大は、遅い。A83−01およびY−27632の両方のKSFMへの添加は、標準の組織培養容器およびコラーゲンを被覆した組織培養容器の両方の上で、遙かに早いペースで前立腺上皮細胞の総集団倍加を有意に増大させた。従って、前立腺上皮細胞の総集団倍加は、ALK5インヒビターA83−01およびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632を組み合わせて使用した場合に有意に増大した。
上記の実験に類似して、気管支上皮細胞を、培地単独、ALK5インヒビターA83−01、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632、またはその両方(コラーゲンありまたはなし)の存在下で、KSFM中で増殖させた。図15に示されるように、気管支上皮細胞は、KSFM中での11回の集団倍加後に老化に入った。Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、気管支上皮細胞の総集団倍加を僅かに増大させたが、上記細胞は、PD13超に達してまもなくなお老化に入った。A83−01はまた、総集団倍加を増大させた;しかし、A83−01は、標準の組織培養表面上でのプレーティング効率に干渉し得る(実施例4を参照のこと)ので、細胞数の増大は遅い。A83−01およびY−27632の両方のKSFMへの添加は、標準の組織培養表面およびコラーゲンを被覆した組織培養表面の両方の上で、遙かに早いペースで気管支上皮細胞の総集団倍加を有意に増大させた。そのうちの後者は、さらに速いペースで示した。従って、気管支上皮細胞の総集団倍加は、ALK5インヒビターA83−01およびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632を組み合わせて使用した場合に有意に増大した。
別の実験では、後期継代の前立腺上皮細胞を、KSFM+図16中で示されるとおりの個々の化合物の中で培養し、上記個々の化合物は、種々の濃度で試験した(すなわち、5μM、黒い棒;1μM、市松模様の棒;および0.2μM、白い棒)。化合物を添加しなかったコントロール実験では、5日後に細胞数の最小限の増大が存在した。Y−27632、SR 3677、GSK 429286およびチアゾビビンのようなRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)は、総細胞数の僅かな増大をもたらす。対照的に、ALK5インヒビター(例えば、A83−01、SB
431542、GW 788388およびRepSox)は、5日後に総細胞数の顕著な増大を生じた。PAK1インヒビターIPA−3もミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)ブレビスタチンも、細胞増殖のいかなる増大をも生じず、IPA−3は、試験した最高濃度(5μM)でほぼ全ての細胞死を引き起こした。従って、単独で使用した場合には、ALK5インヒビターは、KSFM中の後期継代の前立腺上皮細胞の増殖を有意に増大させた;単独で使用した場合には、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)は、増殖を僅かに増大させた;そして単独で使用した場合には、PAK1インヒビターまたはミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)は、増殖を増大させなかった。
431542、GW 788388およびRepSox)は、5日後に総細胞数の顕著な増大を生じた。PAK1インヒビターIPA−3もミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)ブレビスタチンも、細胞増殖のいかなる増大をも生じず、IPA−3は、試験した最高濃度(5μM)でほぼ全ての細胞死を引き起こした。従って、単独で使用した場合には、ALK5インヒビターは、KSFM中の後期継代の前立腺上皮細胞の増殖を有意に増大させた;単独で使用した場合には、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)は、増殖を僅かに増大させた;そして単独で使用した場合には、PAK1インヒビターまたはミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)は、増殖を増大させなかった。
さらなる実験では、後期継代の前立腺上皮細胞を、KSFM、またはA83−01+図17に示されるとおりの個々の化合物を補充したKSFM中で培養し、上記個々の化合物を、種々の濃度で試験した(5μM、黒い棒;1μM、市松模様の棒;および0.2μM、白い棒)。インヒビターがKSFMに添加されなかったコントロール実験では、5日後に細胞数の最小限の増大が存在した。A83−01は、後期継代の前立腺上皮細胞増殖を有意に増大させた一方で、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632は、細胞増殖の僅かな増大をもたらす。A83−01およびY−27632の両方を使用した場合、それらは、前立腺上皮細胞の増殖を相乗効果的に増大させた。このような相乗効果はまた、他のRhoキナーゼインヒビター(例えば、SR 3677、GSK 429286およびチアゾビビン)についても観察された。PAK1インヒビターIPA−3およびミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)ブレビスタチンはまた、KSFM中でA83−01と一緒に使用した場合に、前立腺上皮細胞増殖を相乗効果的に増大させた。対照的に、他のALK5インヒビター(例えば、GW 788388、SB 431542またはRepSox)をA83−01と一緒に使用した場合には、前立腺上皮細胞増殖のさらなる増大はほとんど存在しなかった。従って、細胞骨格の完全性を調節するいくつかのクラスのインヒビターは、これらをA83−01と一緒に使用した場合、KSFM中での後期継代の前立腺細胞増殖を相乗効果的に増大させた。上記のように、これらは、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)(例えば、Y−27632、SR 3677、GSK 429286およびチアゾビビン);PAK1インヒビターIPA−3;およびミオシンIIインヒビター(すなわち、非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビター)ブレビスタチンを含む。
実施例6:上皮細胞増殖および他の特性に対するALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター、および他の化合物を含む化合物の効果に関するさらなる研究
この実施例において、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
この実施例において、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞、および気管支上皮細胞の増殖を、ALK5インヒビター、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)、および他の化合物を含む化合物の存在下で評価した。
包皮ケラチノサイト(図18)、前立腺上皮細胞(図19)、および気管支上皮細胞(図20)を、コラーゲンを被覆した培養容器上で、KSFM単独、または1μM ALK5インヒビターA83−01および5μM Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632を補充したKSFMのいずれかの中で培養した。各継代における上記細胞の集団倍加を評価し、総集団倍加を培養日数に対してプロットした(図18、19および20)。KSFM中、上記上皮細胞は、増殖を止める前に、わずか10〜20回の集団倍加にわたる制限された細胞複製を示した。KSFMとA83−01およびY−27632においては、上記上皮細胞は、40〜60回のさらなる集団倍加にわたって増殖し続けた。従って、包皮ケラチノサイト、前立腺上皮細胞および気管支上皮細胞の集団倍加は、ALK5インヒビターA83−01およびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632が一緒に使用された場合に有意に増大し、これは、A83−01およびY−27632が一緒に、培養物中の種々の上皮細胞の寿命を有意に延ばすことを示す。
さらなる調査では、上皮細胞増殖を、βアドレナリン作動性アゴニスト(すなわち、βアドレナリン作動性レセプターアゴニスト)の存在下で評価した。ヒト包皮ケラチノサイト(HFK)およびヒト気管支上皮細胞(HBEC)を、漸増濃度のイソプロテレノール(環状cAMPレベルを増大させるβアドレナリン作用性レセプターアゴニスト)を補充した、KSFM+1μM A83−01および5μM Y−27632中で培養した。細胞数を6日後に計数して、コントロールに対する細胞増殖を計算した。図30に示されるように、イソプロテレノールは、KSFM+A83−01およびY−27632中での上皮細胞増殖をさらに増大させた。
安定なトランスジェニック細胞株を、核局在化赤色蛍光タンパク質(nRFP)を発現するレンチウイルスベクターを使用して、種々の上皮細胞(すなわち、ヒト包皮ケラチノサイト(HFK)、前立腺上皮細胞(PrEC)、およびヒト気管支上皮細胞(HBEC))について樹立した。このようなトランスジェニック細胞株(例えば、図24に示される)は、nRFPレポーター遺伝子を遍在的に発現し、標準的抗生物質選択を通じて選択する。HFK/nRFP、PrEC/nRFPおよびHBEC/nRFP細胞を、図23に示されるように、KSFMとA83−01およびY−27632中で長期間培養した。
KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した種々の上皮細胞に関する核型を、早期継代および後期継代において評価した。具体的には、核型分析は、継代3(13.5回の集団倍加)および継代19(62.0回の集団倍加)でのヒト包皮ケラチノサイト(HFK);継代4(11.1回の集団倍加)および継代16(45.1回の集団倍加)でのヒト気管支上皮細胞(HBEC);ならびに継代3(13.5回の集団倍加)および継代13(41.1回の集団倍加)での前立腺上皮細胞(PrEC)に対して、中期染色体スプレッドを使用して行った。核型分析の結果を、図21に示す。上記細胞は、A83−01およびY−27632の存在下での長期間の培養後に、肉眼で見える核型の異常性がない、46本の正常な染色体を示した。図21、左下パネルは、早期継代(p3)でのHFK細胞の代表的中期染色体スプレッドを示し、図21、右下パネルは、後期継代(p19)でのHFK細胞の代表的中期染色体スプレッドを示す。
平均テロメア長を、数回の集団倍加にわたって、KSFM単独またはKSFM+A83−01およびY−27632の中で培養した細胞に関して評価した。具体的には、KSFM単独またはKSFM+A83−01およびY−27632中で培養した包皮ケラチノサイトにおける平均テロメア長を、定量的PCRアッセイを使用して決定し、図22においてT/S比(T、テロメア;S、単一コピー遺伝子)として表す。KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した包皮ケラチノサイトにおけるテロメアの平均長は、培養物の集団倍加が増大するにつれて着実に減少した。
ある特定の遺伝子の発現を、KSFM単独またはKSFM+A83−01およびY−27632中で培養した上皮細胞に関して種々の継代で評価した。図27は、発現レベルがKSFM+A83−01およびY−27632中でダウンレギュレートまたはアップレギュレートされる代表的遺伝子のリストを提供する。総RNAを、KSFM単独、またはKSFM+A83−01およびY−27632中で、種々の継代で培養した包皮ケラチノサイトから抽出した。遺伝子発現レベルを、RT2 ProfilerTM PCR Ar
ray Human Cellular Senescenceアッセイ(Qiagen, PAHS−050Z)を使用する定量的PCRによって分析した。ストレス応答および老化に関与するいくつかの遺伝子は、上記細胞がKSFM中、6回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した(すなわち、AKT1、ATM、CDKN2A、GADD45A、GLB1、PLAU、SERPINE1およびSOD2)一方で、これら遺伝子の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中では抑制された。同様に、接着分子遺伝子(FN1、THBS1)および中間フィラメントタンパク質(VIM)遺伝子は、上記細胞がKSFM中、6回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した一方で、これらの遺伝子の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中で抑制された。ある特定の遺伝子、CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3およびIGFBP5の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中で、特に、後期継代において有意にアップレギュレートされた。従って、細胞の老化とときおり関連するいくつかの遺伝子(例えば、CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3およびIGFBP5)は、KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した後期継代の上皮細胞集団において増大した発現を示した。KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した後期継代の正常な上皮細胞において観察される正常な核型およびより短いテロメアとともに、これは、KSFM+A83−01およびY−27632中で拡大した正常な上皮細胞が起源上皮細胞集団とは異なるが、それらが異常な細胞に形質転換されないような特徴を獲得したことを示す。
ray Human Cellular Senescenceアッセイ(Qiagen, PAHS−050Z)を使用する定量的PCRによって分析した。ストレス応答および老化に関与するいくつかの遺伝子は、上記細胞がKSFM中、6回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した(すなわち、AKT1、ATM、CDKN2A、GADD45A、GLB1、PLAU、SERPINE1およびSOD2)一方で、これら遺伝子の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中では抑制された。同様に、接着分子遺伝子(FN1、THBS1)および中間フィラメントタンパク質(VIM)遺伝子は、上記細胞がKSFM中、6回目の継代で老化に入った場合に増大した発現を示した一方で、これらの遺伝子の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中で抑制された。ある特定の遺伝子、CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3およびIGFBP5の発現は、KSFM+A83−01およびY−27632中で、特に、後期継代において有意にアップレギュレートされた。従って、細胞の老化とときおり関連するいくつかの遺伝子(例えば、CDKN2B、CITED2、CREG1、ID1、MAP2K6、IGFBP3およびIGFBP5)は、KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した後期継代の上皮細胞集団において増大した発現を示した。KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した後期継代の正常な上皮細胞において観察される正常な核型およびより短いテロメアとともに、これは、KSFM+A83−01およびY−27632中で拡大した正常な上皮細胞が起源上皮細胞集団とは異なるが、それらが異常な細胞に形質転換されないような特徴を獲得したことを示す。
細胞挙動に対する培養培地カルシウム含有量の効果を、KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した上皮細胞に関して評価した。ヒト気管支上皮細胞を、KSFM(90μM CaCl2あり)+A83−01およびY−27632中で増殖させた。これらの細胞は、培養容器全体にわたって拡がり(図28、左パネル)、いくらかの細胞は、それらが互いに直ぐ近くに存在した場合にすら、細胞間連結を形成した。高濃度(1mM)のCaCl2をKSFM+A83−01およびY−27632の中への添加は、気管支上皮細胞を密な塊へと凝集させた(図28、右パネル)。パッチの中央にある細胞は、積み重なる傾向にあり、個々の細胞間の境界は概して認識できなかった。ある特定の場合には、異常な伸長が塊の間で形成された。
さらなる調査では、細胞間結合に対する培養培地カルシウム含有量の効果を、KSFM+A83−01およびY−27632中で培養した気管支上皮細胞に関して評価した。細胞間結合を、経上皮電気抵抗(TEER)によって測定した場合に、イオンの傍細胞流に従って評価した。図29(上パネル)に示されるように、気管支上皮細胞は、KSFM+A83−01およびY−27632中の高濃度(1mM)のCaCl2の存在下でTEERを増大させることによって示されるように、イオンの傍細胞流を最小限にした密な細胞間結合を確立した。対照的に、気管支上皮細胞は、KSFM+A83−01およびY−27632中の低濃度(90μM)のCaCl2の下では、密な細胞間結合を確立しなかった。気管支上皮細胞を、多孔性膜支持体(TRANSWELL、Corning、354474)上にプレーティングし、膜が培養培地で覆われていた7日間にわたって維持した(液内相、図29、上パネルの灰色のボックス)。8日目に、その培地を膜の先端側から除去し、その細胞を空気に曝して、さらなる分化を誘導した。さらに、図29(下パネル)に示されるように、気管支上皮細胞は、KSFM+A83−01およびY−27632中の高濃度(1mM)のCaCl2の存在下で経時的に経膜電気抵抗(TEER)の増大を確立した。気管支上皮細胞を、多孔性膜支持体(TRANSWELL、Corning、354474)上にプレーティングし、その膜を培養培地で上記培養の継続期間にわたって覆って24日間維持した。経上皮電気抵抗(TEER)は、培養期間全体の間に高レベルのままであった。図29(下パネル)における各トレースは、1つの多孔性膜を横切るTEERの測定値を示す。
実施例7:上皮細胞増殖のための規定された培地組成物の同定
ウシ下垂体抽出物を、KSFM中のおよび多くの無血清細胞培養培地中の有糸分裂促進性補充物として使用する。その有糸分裂促進性活性に加えて、BPEは、種々の規定されていないタンパク質、脂質およびホルモンを含む。上皮細胞が増殖し得る1種もしくはこれより多くの規定された培地組成物を同定するために、さらなる培養培地組成物を試験した。具体的には、上皮細胞を、ALK5インヒビターおよびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)を含む種々の規定された培地組成物の中で増殖させ、これら細胞集団の増殖を評価した。規定された培地組成物は、M*(MCDB−153(改変)培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1、この製剤は、ワールドワイドウェブアドレス bioind.com/page_16682および以下の表2Bにおいて見出され得る)+表皮増殖因子(EGF)+酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)+A83−01+Y−27632);脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma、A8806);イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン(rHA; Sigma、A9731);脂質ミックス(Chemically Defined Lipid Concentrate;Gibco、11905−031);およびALBUMAX I Lipid−Rich BSA(Gibco, 11020−039)から選択される1種もしくはこれより多くの成分を含んだ。MCDB−153(Sigma Aldrich、M7403)および改変MCDB−153(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)中のある特定の成分、ならびにそれらの濃度を、以下の表2Aおよび2Bに示す。この脂質ミックスは、エチルアルコールおよび以下の表3に列挙される成分を含む。ALBUMAXは、BSAおよび以下の脂肪酸を各々、1g BSAあたり約0.5〜2.2mgの間で含む:α−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸。
ウシ下垂体抽出物を、KSFM中のおよび多くの無血清細胞培養培地中の有糸分裂促進性補充物として使用する。その有糸分裂促進性活性に加えて、BPEは、種々の規定されていないタンパク質、脂質およびホルモンを含む。上皮細胞が増殖し得る1種もしくはこれより多くの規定された培地組成物を同定するために、さらなる培養培地組成物を試験した。具体的には、上皮細胞を、ALK5インヒビターおよびRhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)を含む種々の規定された培地組成物の中で増殖させ、これら細胞集団の増殖を評価した。規定された培地組成物は、M*(MCDB−153(改変)培地(Biological Industries、カタログ番号01−059−1、この製剤は、ワールドワイドウェブアドレス bioind.com/page_16682および以下の表2Bにおいて見出され得る)+表皮増殖因子(EGF)+酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)+A83−01+Y−27632);脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma、A8806);イネにおいて発現された組換えヒト血清アルブミン(rHA; Sigma、A9731);脂質ミックス(Chemically Defined Lipid Concentrate;Gibco、11905−031);およびALBUMAX I Lipid−Rich BSA(Gibco, 11020−039)から選択される1種もしくはこれより多くの成分を含んだ。MCDB−153(Sigma Aldrich、M7403)および改変MCDB−153(Biological Industries、カタログ番号01−059−1)中のある特定の成分、ならびにそれらの濃度を、以下の表2Aおよび2Bに示す。この脂質ミックスは、エチルアルコールおよび以下の表3に列挙される成分を含む。ALBUMAXは、BSAおよび以下の脂肪酸を各々、1g BSAあたり約0.5〜2.2mgの間で含む:α−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸。
HFK細胞およびHBEC細胞を、M*;M*+ALBUMAX(1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5 μμg/mL、31.3μg/mLおよび15.6μg/mLで);M*+BSA+脂質ミックス(1:50希釈、1:100希釈、1:200希釈、1:400希釈、1:800希釈、1:1600希釈、および1:3200希釈で);またはM*+rHA+脂質ミックス(1:50希釈、1:100希釈、1:200希釈、1:400希釈、1:800希釈、1:1600希釈、および1:3200希釈で)の中で増殖させた。上記細胞集団の増殖を評価した。その結果をHFK細胞については図25で、およびHBEC細胞については図26で、細胞数の倍数増大として示す。その結果は、アルブミンおよび脂質混合物が、ウシ下垂体抽出物(BPE)補充の必要性なしに上皮細胞増殖を支持するために使用され得ることを示す。
実施例8:上皮細胞遺伝子発現プロフィール
この実施例において、遺伝子発現プロフィールを、種々の無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
この実施例において、遺伝子発現プロフィールを、種々の無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
総RNAを、継代2および継代6においてKSFM中で、または継代2、継代13および継代23においてKSFM+A83−01(1μM)およびY−27632(5μM)中で培養したヒト包皮ケラチノサイト;および継代2および継代8においてKSFM+A83−01(1μM)およびY−27632(5μM)中で培養した気道上皮細胞から抽出した。気道上皮細胞のための細胞培養培地はまた、イソプロテレノール(3μM)を含んだ。遺伝子発現レベルを、特注のRT2 ProfilerTM PCR Array
(Qiagen)を使用する定量的RT−PCRによって分析した。ヒト小腸または肺組織に由来する総RNA(Clontech)を、コントロールとして含めた。アクチンBに対する遺伝子発現レベルを、2^(CtアクチンB−Ct遺伝子)を使用して計算した(ここでCtアクチンBまたはCt遺伝子は、規定された閾値を横切るために、定量的PCR反応の蛍光シグナルに必要とされるサイクル数である)。CtアクチンBは、概して18あたりであった。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が35より高い場合に検出不能(ND)と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が35未満でありかつ30以上である場合に低いと見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が29未満でありかつ22以上である場合に中程度または適度と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が22未満である場合に高いと見做した。
(Qiagen)を使用する定量的RT−PCRによって分析した。ヒト小腸または肺組織に由来する総RNA(Clontech)を、コントロールとして含めた。アクチンBに対する遺伝子発現レベルを、2^(CtアクチンB−Ct遺伝子)を使用して計算した(ここでCtアクチンBまたはCt遺伝子は、規定された閾値を横切るために、定量的PCR反応の蛍光シグナルに必要とされるサイクル数である)。CtアクチンBは、概して18あたりであった。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が35より高い場合に検出不能(ND)と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が35未満でありかつ30以上である場合に低いと見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が29未満でありかつ22以上である場合に中程度または適度と見做した。遺伝子の発現レベルを、Ct遺伝子が22未満である場合に高いと見做した。
以下の表4に示されるように、KSFM+A83−01およびY−27632中で増殖させた上皮細胞は、代表的には、基底上皮細胞において発現される遺伝子(ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63)の高レベルを発現した。これら細胞はまた、ある特定の多能性幹細胞マーカー(例えば、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2)の発現を欠いており、KLF4の中程度のレベルを発現した。上記細胞はまた、代表的には、最終分化した上皮細胞において発現される遺伝子(CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDが挙げられる)を発現しなかったか、またはその非常に低いレベルを発現した。胃、腸、または膵臓の上皮細胞において高度に発現される遺伝子は、KSFM+A83−01およびY−27632中で増殖させた細胞において全く検出されなかった(CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133が挙げられる)。
実施例9:培養物中の上皮細胞の特徴付け
この実施例において、ある特定の特徴を、種々のフィーダーなしかつ無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
この実施例において、ある特定の特徴を、種々のフィーダーなしかつ無血清培地条件で増殖させた上皮細胞について記載する。
気管支球状物への気管支上皮細胞の分化
1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した継代2のヒト気管支上皮細胞を、KSFM+A+Y条件から除去し、単一細胞としてマトリゲル(登録商標)中に埋め込み、CloneticsTM B−ALITM 気相液相界面培地(高カルシウム分化培地、Lonza)中で14日間培養した。図31は、気管支球状物へと分化した気管支上皮細胞を示す。図31の上パネルは、低倍率(4×)で見た細胞を示し、図31の下パネルは、高倍率(20×)で見た細胞を示す。目に見える内腔を有する大きな気管支球状物は、図31の下パネルに示される。
1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した継代2のヒト気管支上皮細胞を、KSFM+A+Y条件から除去し、単一細胞としてマトリゲル(登録商標)中に埋め込み、CloneticsTM B−ALITM 気相液相界面培地(高カルシウム分化培地、Lonza)中で14日間培養した。図31は、気管支球状物へと分化した気管支上皮細胞を示す。図31の上パネルは、低倍率(4×)で見た細胞を示し、図31の下パネルは、高倍率(20×)で見た細胞を示す。目に見える内腔を有する大きな気管支球状物は、図31の下パネルに示される。
高カルシウム濃度への曝露後の上皮細胞の特徴付け
ドーム様構造は、高濃度のCaCl2の存在下で、ケラチノサイトおよび気管支上皮細胞培養物中で形成した。具体的には、低CaCl2(90μM)において1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した後期継代のヒト気管支上皮細胞(HBEC)および後期継代のヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、6ウェルプレート中でコンフルエントに達するようにした。上記細胞を、KSFM+A+Y条件の中に残し、CaCl2濃度を、上皮細胞の分化を誘導するために1.5mMへと上昇させた。多くのドーム様構造が7〜10日後に形成された。これを図32A〜図32Dに示す。
ドーム様構造は、高濃度のCaCl2の存在下で、ケラチノサイトおよび気管支上皮細胞培養物中で形成した。具体的には、低CaCl2(90μM)において1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で培養した後期継代のヒト気管支上皮細胞(HBEC)および後期継代のヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、6ウェルプレート中でコンフルエントに達するようにした。上記細胞を、KSFM+A+Y条件の中に残し、CaCl2濃度を、上皮細胞の分化を誘導するために1.5mMへと上昇させた。多くのドーム様構造が7〜10日後に形成された。これを図32A〜図32Dに示す。
密着結合形成が、高濃度のCaCl2に曝した後にケラチノサイト間で観察された。具体的には、1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で、低CaCl2(90μM)において培養した後期継代のヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、コンフルエントに達するようにした。上記細胞を、KSFM+A+Y条件の中に残し、そのCaCl2濃度を、分化を誘導するために1.5mMへと上昇させた。細胞間密着結合の存在を、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合体化したモノクローナル抗体(ThermoFisher, 339188)を使用して、密着結合タンパク質ZO−1を免疫蛍光染色することによって明らかにした。これを図33に示す。
ケラチノサイトは、KSFM+A83−01およびY−27632中の高濃度(1.5mM)のCaCl2の存在下で、気相液相界面分化において経時的に経膜電気抵抗(TEER)の増大を確立した。具体的には、1μM A83−01および5μM Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で低CaCl2(90μM)において予め培養したヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、多孔性膜支持体(TRANSWELL、Corning、354474)上にプレーティングし、14日間維持した。上記細胞を、培養培地(KSFM+A+Yおよび1.5mMのCaCl2)によって初日の間は覆って(液内相、図34の灰色のボックス)、残りの日数にわたって空気に曝した。図34に示されるように、経上皮電気抵抗(TEER)は、培養期間全体にわたって非常に高レベルに達した。
ケラチノサイトは、KSFM+A83−01およびY−27632中の高濃度(1.5mM)のCaCl2の存在下で、気相液相界面分化において経時的に表皮様構造を形成した。具体的には、低CaCl2(90μM)において1μM A83−01および5μM
Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で予め培養したヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、多孔性膜支持体(TRANSWELL、Corning、354474)上にプレーティングし、14日間維持した。上記細胞を、培養培地(KSFM+A+Yおよび1.5mMのCaCl2)で初日の間は覆って、残りの日数にわたって空気に曝した。実験の最後に(すなわち、14日目に)、培養物を4% パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)のために切片にして、その構造を明らかにした。図35に示されるように、上記細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に似た層を有する多層構造へと分化した。
Y−27632を補充したKSFM(KSFM+A+Y)中で予め培養したヒト包皮ケラチノサイト(HFK)を、多孔性膜支持体(TRANSWELL、Corning、354474)上にプレーティングし、14日間維持した。上記細胞を、培養培地(KSFM+A+Yおよび1.5mMのCaCl2)で初日の間は覆って、残りの日数にわたって空気に曝した。実験の最後に(すなわち、14日目に)、培養物を4% パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)のために切片にして、その構造を明らかにした。図35に示されるように、上記細胞は、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層に似た層を有する多層構造へと分化した。
上皮細胞培養物のさらなる特徴付け
単一細胞クローニングおよびケラチノサイトの拡大を調べた。具体的には、後期継代での単一ヒト包皮ケラチノサイト(HFK)(KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で予め培養)を、コラーゲンIを被覆した384ウェルプレートの上にプレーティングし、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で培養した。10日間にわたって、細胞は1000個より多くの細胞へと分裂し、図36に示されるようにコロニーを形成した。
単一細胞クローニングおよびケラチノサイトの拡大を調べた。具体的には、後期継代での単一ヒト包皮ケラチノサイト(HFK)(KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で予め培養)を、コラーゲンIを被覆した384ウェルプレートの上にプレーティングし、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で培養した。10日間にわたって、細胞は1000個より多くの細胞へと分裂し、図36に示されるようにコロニーを形成した。
細胞形態における異質性は、単一細胞に由来するケラチノサイト子孫について観察された。具体的には、上記で記載されかつ図36に示される単一細胞由来コロニーを、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で、T−25フラスコの中でさらに拡大した。細胞形態(例えば、細胞サイズ)における異質性が観察された。これを図37に示す。有糸分裂細胞を、特徴的な丸い形態、明るいハローの位相(phase bright halo)、および中央の暗いバンド(凝縮した染色体を示す)によって同定した。
単一細胞コロニー形成効率を、KSFM+A83−01、Y−27632およびイソプロテレノール中で培養したある特定の上皮細胞タイプに関して試験した。具体的には、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で予め培養した後期継代のヒト包皮ケラチノサイト(HFK)およびヒト気管支上皮細胞(HBEC)を、コラーゲンを被覆した384ウェルプレート上に1細胞/ウェルで播種し、KSFM+1μM A83−01、5μM Y−27632および3μM イソプロテレノール中で10日間増殖させた。10日目に、各ウェル中の細胞数を決定した。20個未満の細胞を有する、21〜100個の細胞を有する、101〜500個の細胞を有する、または500個より多くの細胞を有するウェル(すなわち、コロニー)の数を記録およびプロットした。その結果を図38に示す。
種々の培地条件で培養した上皮細胞の拡大
種々の組織に由来する上皮細胞を培養して、種々の培養培地中での拡大に関するそれらの能力を評価した。上記細胞を、ThermoFisher/Gibco(HFKnおよびHEKa)またはLonza(HMEC、PrEC、HBEC、SAECおよびDHBE−CF)から得た。式F=2n(ここでF=n回の集団倍加後の拡大の倍数)を使用して倍数拡大を計算した。その結果を以下の表5に示す。
種々の組織に由来する上皮細胞を培養して、種々の培養培地中での拡大に関するそれらの能力を評価した。上記細胞を、ThermoFisher/Gibco(HFKnおよびHEKa)またはLonza(HMEC、PrEC、HBEC、SAECおよびDHBE−CF)から得た。式F=2n(ここでF=n回の集団倍加後の拡大の倍数)を使用して倍数拡大を計算した。その結果を以下の表5に示す。
HFKn、新生児ヒト包皮ケラチノサイト。HEKa、成体ヒト表皮ケラチノサイト。HMEC、ヒト乳腺上皮細胞(女性)。PrEC、ヒト前立腺上皮細胞。HBEC、ヒト気管支上皮細胞。SAEC、ヒト小気道上皮細胞。DHBE−CF、嚢胞性線維症患者に由来する病的ヒト気管支上皮細胞。
*は、細胞培養を、KSFM中より遙かに高い拡大の倍数を達成した後に自発的に一時停止し、その集団は、実験を一時停止した場合になお活発な分裂を受けていたことを注記する。
KSFM、ケラチノサイト−SFM(Gibco/Thermo Fisher)。PrGM、前立腺上皮細胞増殖培地(Lonza)。A、ALK5インヒビターA83−01。Y、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)Y−27632。B、ミオシンIIインヒビターブレビスタチン。IPA、グループI p21活性化キナーゼ(PAK1)インヒビター。GSK、Rhoキナーゼインヒビター(すなわち、Rho関連プロテインキナーゼインヒビター)GSK−429286。
実施例10: 実施形態の例
実施例10: 実施形態の例
以下に示される例は、ある特定の実施形態を例示するのであって、本技術を限定するものではない。
A1. エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A1.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法。
A2. エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法。
A2.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法。
A2.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A2.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A2の方法。
A3. エキソビボで上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法。
A3.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A3〜A3.3のいずれか1つの方法。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法。
A3.1 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.2 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.3 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態A3の方法。
A3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A3〜A3.3のいずれか1つの方法。
A4. (a)の培養する工程は、血清含有培地の存在下で行われる、実施形態A2〜A3.4のいずれか1つの方法。
A4.1 (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態A2〜A3.4のいずれか1つの方法。
A4.1 (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態A2〜A3.4のいずれか1つの方法。
A5. エキソビボで分化した上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程
b)前記分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程
b)前記以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程
b)前記系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.3 TGF−βシグナル伝達が(b)において阻害される、実施形態A5、A5.1またはA5.2の方法。
A5.4 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態A1〜A5.3のいずれか1つの方法。
A5.5 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態A1〜A5.4のいずれか1つの方法。
a)フィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程
b)前記分化した上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記分化した上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.1 エキソビボで以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程
b)前記以前は静止していた上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記以前は静止していた上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.2 エキソビボで系統拘束された上皮細胞を増殖させるための方法であって、方法は、
a)フィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程
b)前記系統拘束された上皮細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
c)前記系統拘束された上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程、を含む方法。
A5.3 TGF−βシグナル伝達が(b)において阻害される、実施形態A5、A5.1またはA5.2の方法。
A5.4 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態A1〜A5.3のいずれか1つの方法。
A5.5 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態A1〜A5.4のいずれか1つの方法。
A6. 1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターの活性が(b)において阻害される、実施形態A1〜A5.5のいずれか1つの方法。
A7. 1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用が(b)において阻害される、実施形態A6の方法。
A8. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターが、TGF−βタイプIレセプターを含む、実施形態A6またはA7の方法。
A9. 前記TGF−βタイプIレセプターが、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8から選択される、実施形態A8の方法。
A10. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターが、ALK5を含む、実施形態A8の方法。
A11. TGF−βシグナル伝達を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターの使用を含む、実施形態A1〜A10のいずれか1つの方法。
A12. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターまたは1種もしくはこれより多くのTGF−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態A11の方法。
A13. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態A11またはA12の方法。
A14. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態A11、A12またはA13の方法。
A15. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、Noggin、DAN、CerberusまたはGremlinを含まない、実施形態A11〜A14のいずれか1つの方法。
A16. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、実施形態A11〜A15のいずれか1つの方法。
A17. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、実施形態A16の方法。
A18. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、実施形態A17の方法。
A19. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態A16〜A18のいずれか1つの方法。
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態A16〜A18のいずれか1つの方法。
A20. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB431542から選択される、実施形態A16〜A19のいずれか1つの方法。
A21. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01を含む、実施形態A20の方法。
A22. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、ALK5または1種もしくはこれより多くのALK5リガンドあるいは両方に結合する、実施形態A16〜A21のいずれか1つの方法。
A23. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5−リガンド相互作用を破壊する、実施形態A16〜A22のいずれか1つの方法。
A24. 前記方法が、前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程を含む、実施形態A1〜A23のいずれか1つの方法。
A24.1 前記方法が、前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態A1〜A24のいずれか1つの方法。
A24.2 前記方法が、
a)前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
b)前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程
を含む、実施形態A1〜A24.1のいずれか1つの方法。
A24.1 前記方法が、前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態A1〜A24のいずれか1つの方法。
A24.2 前記方法が、
a)前記上皮細胞のテロメラーゼ逆転写酵素を活性化する工程;および
b)前記上皮細胞において細胞骨格構造を調節する工程
を含む、実施形態A1〜A24.1のいずれか1つの方法。
A25. (a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態A1〜A24.2のいずれか1つの方法。
A26. Rhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼが、Rhoキナーゼ1(ROCK1)およびRhoキナーゼ2(ROCK2)から選択される、実施形態A25の方法。
A27. Rhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターの使用を含む、実施形態A25またはA26の方法。
A28. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子Rhoキナーゼインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態A27の方法。
A29. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632、SR3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、実施形態A28の方法。
A30. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632を含む、実施形態A29の方法。
A30.1 (a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態A1〜A24のいずれか1つの方法。
A31. (a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態A1〜A30.1のいずれか1つの方法。
A32. 前記PAKが、PAK1、PAK2、PAK3およびPAK4から選択される、実施形態A31の方法。
A33. 前記PAKがPAK1である、実施形態A32の方法。
A34. PAK1の活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターの使用を含む、実施形態A33の方法。
A35. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、実施形態A34の方法。
A36. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、IPA3を含む、実施形態A35の方法。
A37. (a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態A1〜A36のいずれか1つの方法。
A37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A37の方法。
A37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態A37またはA37.1の方法。
A37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態A37.2の方法。
A37.4. 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態A37.2またはA37.3の方法。
A37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態A37の方法。
A37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態A37またはA37.1の方法。
A37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態A37.2の方法。
A37.4. 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態A37.2またはA37.3の方法。
A38. (a)の培養する工程の間に上皮細胞における細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させることをさらに含む、実施形態A1〜A37.4のいずれか1つの方法。
A39. 細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる工程が、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストの使用を含む、実施形態A38の方法。
A39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態A39の方法。
A39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態A39の方法。
A40. 前記上皮細胞は、(a)の前に被験体から得られる、実施形態A1〜A39.1のいずれか1つの方法。
A40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態A40の方法。
A40.2 前記被験体がヒトである、実施形態A40の方法。
A40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態A40.3の方法。
A40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態A40の方法。
A40.2 前記被験体がヒトである、実施形態A40の方法。
A40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態A40.3の方法。
A40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態A40〜A40.2のいずれか1つの方法。
A41. 前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含む、実施形態A40〜A40.5のいずれか1つの方法。
A42. 前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含まない、実施形態A40〜A40.5のいずれか1つの方法。
A43. 前記上皮細胞が、被験体由来の腫瘍細胞を含む、実施形態A40〜A42のいずれか1つの方法。
A44. 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態A41〜A43のいずれか1つの方法。
A44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態A41〜A43のいずれか1つの方法。
A44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態A41〜A43のいずれか1つの方法。
A45. 被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態A41〜A44.1のいずれか1つの方法。
A45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態A45の方法。
A45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態A45の方法。
A46. 被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態A41〜A44のいずれか1つの方法。
A47. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態A46の方法。
A48. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態A46またはA47の方法。
A48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態A1〜A47のいずれか1つの方法。
A49. (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態A1〜A48.2のいずれか1つの方法。
A49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態A49の方法。
A50. 前記無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態A49〜A49.3のいずれか1つの方法。
A51. 前記無血清培地が、1mM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態A50の方法。
A52. 前記無血清培地が、500μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態A50の方法。
A53. 前記無血清培地が、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態A50の方法。
A53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態A53の方法。
A53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態A53の方法。
A54. 前記無血清培地が、20μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態A50の方法。
A54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態A49〜A54のいずれか1つの方法。
A54.2 1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態A54.1の方法。
A54.3 1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態A54.1またはA54.2の方法。
A54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態A54.1〜A54.3のいずれか1つの方法。
A54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態A49〜A54.4のいずれか1つの方法。
A54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態A54.5の方法。
A54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態A49〜A54.6のいずれか1つの方法。
A54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態A54.7の方法。
A54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態A54.8の方法。
A54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態A49〜A54のいずれか1つの方法。
A54.2 1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態A54.1の方法。
A54.3 1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態A54.1またはA54.2の方法。
A54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態A54.1〜A54.3のいずれか1つの方法。
A54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態A49〜A54.4のいずれか1つの方法。
A54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態A54.5の方法。
A54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態A49〜A54.6のいずれか1つの方法。
A54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態A54.7の方法。
A54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態A54.8の方法。
A55. 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子の使用を含む、実施形態A1〜A54.9のいずれか1つの方法。
A56. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態A56.1またはA56.2の方法。
A56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態A55の方法。
A56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態A56.1またはA56.2の方法。
A57. 有糸分裂促進性増殖因子の使用を含まない、実施形態A1〜A54.9のいずれか1つの方法。
A58. 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物の使用を含む、実施形態A1〜A57のいずれか1つの方法。
A59. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物(BPE)を含む、実施形態A58の方法。
A59.1 有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態A1〜A57のいずれか1つの方法。
A59.1 有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態A1〜A57のいずれか1つの方法。
A60. Wntアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態A1〜A59.1のいずれか1つの方法。
A60.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態A1〜A60のいずれか1つの方法。
A60.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態A1〜A60のいずれか1つの方法。
A61. 細胞外マトリクスの使用を含まない、実施形態A1〜A60.1のいずれか1つの方法。
A62. (a)の培養する工程が被覆を含む容器の中で行われる、実施形態A1〜A60.1のいずれか1つの方法。
A63. 前記被覆が、コラーゲンを含む、実施形態A62の方法。
A64. 前記被覆が、基底膜マトリクスを含む、実施形態A62の方法。
A65. (a)の培養する工程が、前記上皮細胞を拡大する工程を含む、実施形態A1〜A64のいずれか1つの方法。
A66. 前記上皮細胞は少なくとも約2倍拡大される、実施形態A65の方法。
A67. 前記上皮細胞は少なくとも約5倍拡大される、実施形態A65の方法。
A68. 前記上皮細胞は少なくとも約10倍拡大される、実施形態A65の方法。
A69. 前記上皮細胞は少なくとも約15倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70. 前記上皮細胞は少なくとも約20倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の方法。
A70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の方法。
A71. 前記上皮細胞は約4日間培養される、実施形態A65〜A70.7のいずれか1つの方法。
A72. 前記上皮細胞は約5日間培養される、実施形態A65〜A70.7のいずれか1つの方法。
A73. 前記上皮細胞は連続して増殖している、実施形態A1〜A72のいずれか1つの方法。
A74. 少なくとも15回前記上皮細胞を継代することを含む、実施形態A1〜A73のいずれか1つの方法。
A75. 少なくとも25回前記上皮細胞を継代することを含む、実施形態A1〜A73のいずれか1つの方法。
A76. 前記上皮細胞の集団はある期間にわたって倍加する、実施形態A1〜A75のいずれか1つの方法。
A77. 前記上皮細胞集団は少なくとも20回倍加する、実施形態A76の方法。
A78. 前記上皮細胞集団は少なくとも50回倍加する、実施形態A76の方法。
A78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態A76の方法。
A78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態A76の方法。
A79. 前記上皮細胞集団は少なくとも100回倍加する、実施形態A76の方法。
A80. 前記上皮細胞集団は少なくとも120回倍加する、実施形態A76の方法。
A81. 前記上皮細胞集団は少なくとも150回倍加する、実施形態A76の方法。
A82. 前記上皮細胞集団は少なくとも200回倍加する、実施形態A76の方法。
A83. 前記期間は約50日間である、実施形態A76〜A82のいずれか1つの方法。
A84. 前記期間は約100日間である、実施形態A76〜A82のいずれか1つの方法。
A85. 前記期間は約150日間である、実施形態A76〜A82のいずれか1つの方法。
A86. 前記期間は約200日間である、実施形態A76〜A82のいずれか1つの方法。
A87. 前記上皮細胞が、(b)の間に1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持する、実施形態A1〜A86のいずれか1つの方法。
A88. 前記上皮細胞が、(b)の間に1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持しない、実施形態A1〜A86のいずれか1つの方法。
A89. 前記上皮細胞が、(b)の後に、TGF−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれる、実施形態A1〜A88のいずれか1つの方法。
A90. 前記上皮細胞が、TGF−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する、
実施形態A89の方法。
実施形態A89の方法。
A91. 前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化するように誘導され得る、実施形態A1〜A90のいずれか1つの方法。
A91.1 前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態A1〜A90のいずれか1つの方法。
A91.1 前記上皮細胞が、複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態A1〜A90のいずれか1つの方法。
A92. 前記上皮細胞が、オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態A1〜A91.1のいずれか1つの方法。
A93. 前記上皮細胞は胚性幹細胞に由来するものではない、実施形態A1〜A92のいずれか1つの方法。
A93.1 前記上皮細胞は連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態A1〜A93のいずれか1つの方法。
A93.2 前記上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態A1〜A93.1のいずれか1つの方法。
A93.3 連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.2のいずれか1つの方法。
A93.4 腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.3のいずれか1つの方法。
A93.5 LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.4のいずれか1つの方法。
A93.1 前記上皮細胞は連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態A1〜A93のいずれか1つの方法。
A93.2 前記上皮細胞は、静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態A1〜A93.1のいずれか1つの方法。
A93.3 連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.2のいずれか1つの方法。
A93.4 腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.3のいずれか1つの方法。
A93.5 LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態A1〜A93.4のいずれか1つの方法。
A94. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、連続して増殖している上皮幹細胞または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態A40〜A93.5のいずれか1つの方法。
A94.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態A40〜A94のいずれか1つの方法。
A94.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.1のいずれか1つの方法。
A94.3 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.2のいずれか1つの方法。
A94.4 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態A40〜A94.3のいずれか1つの方法。
A94.5 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態A40〜A94.4のいずれか1つの方法。
A94.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態A40〜A94のいずれか1つの方法。
A94.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.1のいずれか1つの方法。
A94.3 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態A40〜A94.2のいずれか1つの方法。
A94.4 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態A40〜A94.3のいずれか1つの方法。
A94.5 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態A40〜A94.4のいずれか1つの方法。
A95. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の均質な集団である、実施形態A40〜A94.5のいずれか1つの方法。
A95.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態A40〜A95のいずれか1つの方法。
A95.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態A40〜A94.5のいずれか1つの方法。
A95.1 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態A40〜A95のいずれか1つの方法。
A95.2 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態A40〜A94.5のいずれか1つの方法。
A96. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、最終分化した細胞より分化しておらず、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化している、実施形態A40〜A95.2のいずれか1つの方法。
A97. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態A40〜A96のいずれか1つの方法。
A98. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1つまたは複数を発現する、実施形態A40〜A97のいずれか1つの方法。
A99. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態A40〜A98のいずれか1つの方法。
A100. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、Lgr5を発現しない、実施形態A40〜A99のいずれか1つの方法。
A101. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態A40〜A100のいずれか1つの方法。
A102. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態A40〜A101のいずれか1つの方法。
A103. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態A40〜A102のいずれか1つの方法。
A104. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態A40〜A103のいずれか1つの方法。
A105. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態A40〜A104のいずれか1つの方法。
A106. 被験体から得られた前記上皮細胞および/または培養物中の前記上皮細胞が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態A40〜A105のいずれか1つの方法。
A107. エキソビボで増殖させた上皮細胞の集団を単離する工程をさらに含む、実施形態A1〜A106のいずれか1つの方法。
A108. エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに含む、実施形態A1〜A107のいずれか1つの方法。
A109. 実施形態A1〜A108のいずれか1つに従う方法によって生産されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
A110. 遺伝子改変された細胞の生産のための実施形態A109のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
A111. 被験体のための1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための実施形態A109のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
A112. 被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための実施形態A109のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
A113. 被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための実施形態A109のエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団の使用。
B1. エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.3 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.4 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.5 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.6 規定された無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.7 ゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.8 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.3 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.4 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.5 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を増殖させるための無血清細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、無血清細胞培養培地。
B1.6 規定された無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.7 ゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B1.8 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地である、実施形態B1〜B1.5のいずれか1つの無血清細胞培養培地。
B2. エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター、および1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターを含む、細胞培養培地。
B2.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびPAK1インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B2.1 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびPAK1インヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B3. エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビター、および1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターを含む、細胞培養培地。
B3.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3の細胞培養培地。
B3.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびミオシンIIインヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B3.3 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3.2の細胞培養培地。
B3.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3の細胞培養培地。
B3.2 エキソビボでフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を増殖させるための細胞培養培地であって、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビターおよびミオシンIIインヒビターからなる低分子インヒビターを含む、細胞培養培地。
B3.3 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態B3.2の細胞培養培地。
B4. 前記上皮細胞が、分化した上皮細胞を含む、実施形態B2〜B3.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B4.1 前記上皮細胞が、以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態B2〜B3.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B4.2 前記上皮細胞が、系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態B2〜B3.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B5. 血清含有培地である、実施形態B2〜B4のいずれか1つの細胞培養培地。
B5.1 無血清培地である、実施形態B2〜B4のいずれか1つの細胞培養培地。
B5.2 規定された無血清培地である、実施形態B5.1の細胞培養培地。
B5.3 ゼノフリー無血清培地である、実施形態B5.1の細胞培養培地。
B5.4 規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態B5.1の細胞培養培地。
B6. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターまたは1種もしくはこれより多くのTGF−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態B1〜B5.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B7. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態B1〜B6のいずれか1つの細胞培養培地。
B8. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態B1〜B7のいずれか1つの細胞培養培地。
B9. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、Noggin、DAN、CerberusまたはGremlinを含まない、実施形態B1〜B8のいずれか1つの細胞培養培地。
B10. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターインヒビターを含む、実施形態B1〜B9のいずれか1つの細胞培養培地。
B11. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターインヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βタイプIレセプターインヒビターを含む、実施形態B10の細胞培養培地。
B12. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βタイプIレセプターインヒビターが、ALK1インヒビター、ALK2インヒビター、ALK3インヒビター、ALK4インヒビター、ALK5インヒビター、ALK6インヒビター、ALK7インヒビター、およびALK8インヒビターから選択される、実施形態B11の細胞培養培地。
B13. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βタイプIレセプターインヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、実施形態B12の細胞培養培地。
B14. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、実施形態B13の細胞培養培地。
B15. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、実施形態B15の細胞培養培地。
B16. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、
−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態B14またはB15の細胞培養培地。
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、
−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態B14またはB15の細胞培養培地。
B17. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB431542から選択される、実施形態B14、B15またはB16の細胞培養培地。
B18. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01を含む、実施形態B17の細胞培養培地。
B19. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、ALK5または1種もしくはこれより多くのALK5リガンドあるいは両方に結合する、実施形態B13〜B18のいずれか1つの細胞培養培地。
B20. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5−リガンド相互作用を破壊する、実施形態B13〜B19のいずれか1つの細胞培養培地。
B21. 1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターをさらに含む、実施形態B1〜B20のいずれか1つの細胞培養培地。
B22. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Rhoキナーゼ1(ROCK1)インヒビターおよびRhoキナーゼ2(ROCK2)インヒビターから選択される、実施形態B21の細胞培養培地。
B23. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子Rhoキナーゼインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態B21またはB22の細胞培養培地。
B24. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632、SR3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、実施形態B23の細胞培養培地。
B25. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632を含む、実施形態B14の細胞培養培地。
B25.1 Rhoキナーゼインヒビターおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含まない、実施形態B1〜B20のいずれか1つの細胞培養培地。
B25.1 Rhoキナーゼインヒビターおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含まない、実施形態B1〜B20のいずれか1つの細胞培養培地。
B26. 1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターをさらに含む、実施形態B1〜B25.1のいずれか1つの細胞培養培地。
B27. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、実施形態B26の細胞培養培地。
B28. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、IPA3を含む、実施形態B27の細胞培養培地。
B29. 1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターをさらに含む、実施形態B1〜B28のいずれか1つの細胞培養培地。
B29.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、実施形態B29の細胞培養培地。
B29.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、実施形態B29の細胞培養培地。
B30. 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態B29またはB29.1の細胞培養培地。
B30.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態B30の細胞培養培地。
B30.1 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態B30の細胞培養培地。
B31. 1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストをさらに含む、実施形態B1〜B30.1のいずれか1つの細胞培養培地。
B31.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態B31の細胞培養培地。
B31.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態B31の細胞培養培地。
B32. 前記上皮細胞が被験体に由来する、実施形態B1〜B31.1のいずれか1つの細胞培養培地。
B32.1 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態B32の細胞培養培地。
B32.2 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態B32.1の細胞培養培地。
B32.3 前記上皮細胞が、初代細胞を含む、実施形態B32〜B32.2のいずれか1つの細胞培養培地。
B32.1 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態B32の細胞培養培地。
B32.2 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態B32.1の細胞培養培地。
B32.3 前記上皮細胞が、初代細胞を含む、実施形態B32〜B32.2のいずれか1つの細胞培養培地。
B33. 前記上皮細胞が、初代細胞を含まない、実施形態B32〜B32.2のいずれか1つの細胞培養培地。
B34. 前記上皮細胞が、腫瘍細胞を含む、実施形態B32〜B33のいずれか1つの細胞培養培地。
B35. 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態B32〜B34のいずれか1つの細胞培養培地。
B35.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態B32〜B34のいずれか1つの細胞培養培地。
B35.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態B32〜B34のいずれか1つの細胞培養培地。
B36. 被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態B32〜B35.1のいずれか1つの細胞培養培地。
B36.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態B36の細胞培養培地。
B36.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態B36の細胞培養培地。
B37. 被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態B32〜B35のいずれか1つの細胞培養培地。
B38. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態B37の細胞培養培地。
B39. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態B37またはB38の細胞培養培地。
B39.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B39.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B39.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B39.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態B1〜B39のいずれか1つの細胞培養培地。
B40. カルシウムを含む、実施形態B1〜B39.2のいずれか1つの細胞培養培地。
B41. 前記カルシウムが、1mM未満の濃度で存在する、実施形態B40の細胞培養培地。
B42. 前記カルシウムが、500μM未満の濃度で存在する、実施形態B40の細胞培養培地。
B43. 前記カルシウムが、100μM未満の濃度で存在する、実施形態B40の細胞培養培地。
B43.1 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、実施形態B43の細胞培養培地。
B43.1 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、実施形態B43の細胞培養培地。
B44. 前記カルシウムが、20μM未満の濃度で存在する、実施形態B40の細胞培養培地。
B44.1 緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態B1〜B44のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態B44.1の細胞培養培地。
B44.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態B44.1またはB44.2の細胞培養培地。
B44.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態B44.1〜B44.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.5 アルブミンを含む、実施形態B1〜B44.4のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態B44.5の細胞培養培地。
B44.7 1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態B1〜B44.6のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態B44.7の細胞培養培地。
B44.1 緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースから選択される1種もしくはこれより多くの成分とを含む、実施形態B1〜B44のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態B44.1の細胞培養培地。
B44.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態B44.1またはB44.2の細胞培養培地。
B44.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態B44.1〜B44.3のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.5 アルブミンを含む、実施形態B1〜B44.4のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態B44.5の細胞培養培地。
B44.7 1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態B1〜B44.6のいずれか1つの細胞培養培地。
B44.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態B44.7の細胞培養培地。
B44.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態B44.8の細胞培養培地。
B45. 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、実施形態B1〜B44.9のいずれか1つの細胞培養培地。
B46. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFを含む、実施形態B45の細胞培養培地。
B46.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態B45の細胞培養培地。
B46.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態B45の細胞培養培地。
B46.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態B46.1またはB46.2の細胞培養培地。
B46.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態B45の細胞培養培地。
B46.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態B46.1またはB46.2の細胞培養培地。
B47. 有糸分裂促進性増殖因子を含まない、実施形態B1〜B44.9のいずれか1つの細胞培養培地。
B48. 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物を含む、実施形態B1〜B47のいずれか1つの細胞培養培地。
B49. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物(BPE)を含む、実施形態B48の細胞培養培地。
B49.1 有糸分裂促進性補充物を含まない、実施形態B1〜B47のいずれか1つの細胞培養培地。
B50. Wntアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストを含まない、実施形態B1〜B49.1のいずれか1つの細胞培養培地。
B50.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTのうちの1つまたは複数から選択される成分を含まない、実施形態B1〜B50のいずれか1つの細胞培養培地。
B50.1 noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTのうちの1つまたは複数から選択される成分を含まない、実施形態B1〜B50のいずれか1つの細胞培養培地。
B51. 細胞外マトリクスを含まない、実施形態B1〜B50.1のいずれか1つの細胞培養培地。
C1.
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程、およびb)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.1
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.2
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で分化した上皮細胞を培養する工程、およびb)(a)の培養する工程の間に前記分化した上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.1
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で以前は静止していた上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記以前は静止していた上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C1.2
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で系統拘束された上皮細胞を培養する工程、および
b)(a)の培養する工程の間に前記系統拘束された上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C2.
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C2.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
a)フィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C2.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C2.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C2のいずれか1つの上皮細胞。
C3.
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C3.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C3〜C3.3のいずれか1つの上皮細胞。
a)無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で上皮細胞を培養する工程
b)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてTGF−βシグナル伝達を阻害する工程、および
c)(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程、を含む方法によって生成されたエキソビボで増殖させた上皮細胞の集団。
C3.1 分化した上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.2 以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.3 系統拘束された上皮細胞を含む、実施形態C3の上皮細胞。
C3.4 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C3〜C3.3のいずれか1つの上皮細胞。
C4. (a)の培養する工程は、血清含有培地の存在下で実施される、実施形態C2〜C3.4のいずれか1つの上皮細胞。
C5. (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態C2〜C3.4のいずれか1つの上皮細胞。
C5.1 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態C1〜C5のいずれか1つの上皮細胞。
C5.2 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態C1〜C5.1のいずれか1つの上皮細胞。
C5.1 (a)および(b)が同時に行われる;または(a)、(b)および(c)が同時に行われる、実施形態C1〜C5のいずれか1つの上皮細胞。
C5.2 前記上皮細胞が(a)の前に凍結および解凍される、実施形態C1〜C5.1のいずれか1つの上皮細胞。
C6. 1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターの活性が(b)において阻害される、実施形態C1〜C5.2のいずれか1つの上皮細胞。
C7. 1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用が(b)において阻害される、実施形態C6の上皮細胞。
C8. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターが、TGF−βタイプIレセプターを含む、実施形態C6またはC7の上皮細胞。
C9. 前記TGF−βタイプIレセプターが、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6、ALK7およびALK8から選択される、実施形態C8の上皮細胞。
C10. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターが、ALK5を含む、実施形態C8の上皮細胞。
C11. TGF−βシグナル伝達を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターの使用を含む、実施形態C1〜C10のいずれか1つの上皮細胞。
C12. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプターまたは1種もしくはこれより多くのTGF−βリガンドあるいは両方に結合する、実施形態C11の上皮細胞。
C13. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのTGF−βレセプター−リガンド相互作用を破壊する、実施形態C11またはC12の上皮細胞。
C14. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、組換えタンパク質を含まない、実施形態C11、C12またはC13の上皮細胞。
C15. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、Noggin、DAN、CerberusまたはGremlinを含まない、実施形態C11〜C14のいずれか1つの上皮細胞。
C16. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、実施形態C11〜C15のいずれか1つの上皮細胞。
C17. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、実施形態C16の上皮細胞。
C18. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのATPアナログを含む、実施形態C17の上皮細胞。
C19. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターのうちの少なくとも1種は、式A:
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態C16〜C18のいずれか1つの上皮細胞。
の構造を含み、ここで:
X、YおよびZは、N、CおよびOから独立して選択され;
R1、R2およびR3は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;
nは、0または1であり;
R4、R5およびR6は、水素、C1−C10アルキル、置換されたC1−C10アルキル、C1−C10アルコキシ、置換されたC1−C10アルコキシ、C1−C6アルカノイル、C1−C6アルコキシカルボニル、置換されたC1−C6アルカノイル、置換されたC1−C6アルコキシカルボニル、C3−C9シクロアルキル、置換されたC3−C9シクロアルキル、C5−C10アリール、置換されたC5−C10アリール、C5−C10シクロアリール、置換されたC5−C10シクロアリール、C5−C9複素環式、置換されたC5−C9複素環式、C5−C9ヘテロシクロアリール、置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール、−リンカー−(C3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(置換されたC3−C9シクロアルキル)、−リンカー−(C5−C10アリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10アリール)、−リンカー−(C5−C10シクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C10シクロアリール)、−リンカー−(C5−C9複素環式)、−リンカー−(置換されたC5−C9複素環式)、−リンカー−(C5−C9ヘテロシクロアリール)、−リンカー−(置換されたC5−C9ヘテロシクロアリール)から独立して選択され;そして
前記置換されたアルキル、アルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニルシクロアルキル、アリール、シクロアリール、複素環式またはヘテロシクロアリール基上の置換基は、ヒドロキシル、C1−C10アルキル、ヒドロキシルC1−C10アルキレン、C1−C6アルコキシ、C3−C9シクロアルキル、C5−C9複素環式、C1−6アルコキシ、C1−6アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである、
実施形態C16〜C18のいずれか1つの上皮細胞。
C20. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB431542から選択される、実施形態C16〜C19のいずれか1つの上皮細胞。
C21. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01を含む、実施形態C20の上皮細胞。
C22. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、ALK5または1種もしくはこれより多くのALK5リガンドあるいは両方に結合する、実施形態C16〜C21のいずれか1つの上皮細胞。
C23. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5−リガンド相互作用を破壊する、実施形態C16〜C22のいずれか1つの上皮細胞。
C24. 前記方法が、前記上皮細胞においてテロメラーゼを活性化する工程および/または細胞骨格構造を調節する工程を含む、実施形態C16〜C23のいずれか1つの上皮細胞。
C25. 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態C1〜C24のいずれか1つの上皮細胞。
C26. Rhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼが、Rhoキナーゼ1(ROCK1)およびRhoキナーゼ2(ROCK2)から選択される、実施形態C25の上皮細胞。
C27. Rhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターの使用を含む、実施形態C25またはC26の上皮細胞。
C28. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子Rhoキナーゼインヒビターを含む、実施形態C27の上皮細胞。
C29. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632、SR3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、実施形態C28の上皮細胞。
C30. 前記1種もしくはこれより多くのRhoキナーゼインヒビターおよび/または前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632を含む、実施形態C29の上皮細胞。
C30.1 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態C1〜C24のいずれか1つの上皮細胞。
C30.1 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてRhoキナーゼおよび/またはRho関連タンパク質キナーゼの活性を阻害する工程を含まない、実施形態C1〜C24のいずれか1つの上皮細胞。
C31. 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてp21活性化キナーゼ(PAK)の活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態C1〜C30.1のいずれか1つの上皮細胞。
C32. 前記PAKが、PAK1、PAK2、PAK3およびPAK4から選択される、実施形態C31の上皮細胞。
C33. 前記PAKがPAK1である、実施形態C32の上皮細胞。
C34. PAK1の活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターの使用を含む、実施形態C33の上皮細胞。
C35. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、実施形態C34の上皮細胞。
C36. 前記1種もしくはこれより多くのPAK1インヒビターが、IPA3を含む、実施形態C35の上皮細胞。
C37. 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞においてミオシンIIの活性を阻害する工程をさらに含む、実施形態C1〜C36のいずれか1つの上皮細胞。
C37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C37の上皮細胞。
C37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態C37またはC37.1の上皮細胞。
C37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態C37.2の上皮細胞。
C37.4 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態C37.2またはC37.3の上皮細胞。
C37.1 前記ミオシンIIが非筋肉ミオシンII(NM II)である、実施形態C37の上皮細胞。
C37.2 ミオシンIIの活性を阻害する工程が、1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターの使用を含む、実施形態C37またはC37.1の上皮細胞。
C37.3 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ミオシンIIインヒビターを含む、実施形態C37.2の上皮細胞。
C37.4 前記1種もしくはこれより多くのミオシンIIインヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態C37.2またはC37.3の上皮細胞。
C38. 前記方法が、(a)の培養する工程の間に前記上皮細胞において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させることをさらに含む、実施形態C1〜C37.4のいずれか1つの上皮細胞。
C39. 細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる工程が、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストの使用を含む、実施形態C38の上皮細胞。
C39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態C39の上皮細胞。
C39.1 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性アゴニストおよび/または前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストがイソプロテレノールを含む、実施形態C39の上皮細胞。
C40. 前記上皮細胞は、(a)の前に被験体から得られる、実施形態C1〜C40のいずれか1つの上皮細胞。
C40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態C40の上皮細胞。
C40.2 前記被験体がヒトである、実施形態C40の上皮細胞。
C40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態C40.3の上皮細胞。
C40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C40.1 前記被験体が哺乳動物である、実施形態C40の上皮細胞。
C40.2 前記被験体がヒトである、実施形態C40の上皮細胞。
C40.3 前記上皮細胞が被験体由来の組織に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C40.4 前記上皮細胞が被験体由来の分化した組織に由来する、実施形態C40.3の上皮細胞。
C40.5 前記上皮細胞が被験体由来の循環細胞に由来する、実施形態C40〜C40.2のいずれか1つの上皮細胞。
C41. 前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含む、実施形態C40〜C40.5のいずれか1つの上皮細胞。
C42. 前記上皮細胞が、被験体由来の初代細胞を含まない、実施形態C40〜C40.5のいずれか1つの上皮細胞。
C43. 前記上皮細胞が、被験体由来の腫瘍細胞を含む、実施形態C40〜C42のいずれか1つの上皮細胞。
C44. 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞から選択される、実施形態C41〜C43のいずれか1つの上皮細胞。
C44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態C41〜C43のいずれか1つの上皮細胞。
C44.1 被験体に由来する上皮細胞が、扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺腫様上皮細胞および移行上皮細胞のうちの1つまたは複数を含む、実施形態C41〜C43のいずれか1つの上皮細胞。
C45. 被験体に由来する上皮細胞が、ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態C41〜C44.1のいずれか1つの上皮細胞。
C45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態C45の上皮細胞。
C45.1 前記ケラチノサイト上皮細胞が、皮膚ケラチノサイト、眼の上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、食道上皮細胞、および子宮頸部上皮細胞から選択される、実施形態C45の上皮細胞。
C46. 被験体に由来する上皮細胞が、非ケラチノサイト上皮細胞を含む、実施形態C41〜C44のいずれか1つの上皮細胞。
C47. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、腺上皮細胞を含む、実施形態C46の上皮細胞。
C48. 前記非ケラチノサイト上皮細胞が、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、肝臓上皮細胞、胆管上皮細胞、胆嚢細胞、膵島細胞、膵臓β細胞、膵管上皮細胞、肺上皮細胞、気道上皮細胞、鼻腔上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、尿道上皮細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、卵管上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、下垂体細胞、腺細胞、羊膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、汗腺上皮細胞、脂腺上皮細胞および毛包細胞から選択される、実施形態C46またはC47の上皮細胞。
C48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C48.1 前記上皮細胞が、基底上皮細胞を含む、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C48.2 前記上皮細胞は腸上皮細胞ではない、実施形態C1〜C48のいずれか1つの上皮細胞。
C49. (a)の培養する工程は、無血清培地の存在下で行われる、実施形態C1〜C48.2のいずれか1つの上皮細胞。
C49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.1 前記無血清培地が規定された無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.2 前記無血清培地がゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C49.3 前記無血清培地が規定されたゼノフリー無血清培地である、実施形態C49の上皮細胞。
C50. 前記無血清培地が、カルシウムを含む、実施形態C49〜C49.3のいずれか1つの上皮細胞。
C51. 前記無血清培地が、1mM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態C50の上皮細胞。
C52. 前記無血清培地が、500μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態C50の上皮細胞。
C53. 前記無血清培地が、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態C50の上皮細胞。
C53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態C53の上皮細胞。
C53.1 前記無血清培地が、約90μMの濃度でカルシウムを含む、実施形態C53の上皮細胞。
C54. 前記無血清培地が、20μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態C50の上皮細胞。
C54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースのうちの1つまたは複数とを含む、実施形態C49〜C54のいずれか1つの上皮細胞。
C54.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態C54.1の上皮細胞。
C54.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態C54.1またはC54.2の上皮細胞。
C54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態C54.1〜C54.3のいずれか1つの上皮細胞。
C54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態C49〜C54.4のいずれか1つの上皮細胞。
C54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態C54.5の上皮細胞。
C54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態C49〜C54.6のいずれか1つの上皮細胞。
C54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態C54.7の上皮細胞。
C54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態C54.8の上皮細胞。
C54.1 前記無血清培地が、緩衝液と、無機酸、無機塩、アルカリケイ酸塩、アミノ酸、ビタミン、プリン、ピリミジン、ポリアミン、α−ケト酸、有機イオウ化合物およびグルコースのうちの1つまたは複数とを含む、実施形態C49〜C54のいずれか1つの上皮細胞。
C54.2 前記1種もしくはこれより多くの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムから選択される、実施形態C54.1の上皮細胞。
C54.3 前記1種もしくはこれより多くのアミノ酸が、アルギニンおよびグルタミンから選択される、実施形態C54.1またはC54.2の上皮細胞。
C54.4 前記緩衝液がHEPES緩衝液である、実施形態C54.1〜C54.3のいずれか1つの上皮細胞。
C54.5 前記無血清培地が、アルブミンを含む、実施形態C49〜C54.4のいずれか1つの上皮細胞。
C54.6 前記アルブミンが、ウシ血清アルブミンおよび組換えヒト血清アルブミンから選択される、実施形態C54.5の上皮細胞。
C54.7 前記無血清培地が、1種もしくはこれより多くの脂質を含む、実施形態C49〜C54.6のいずれか1つの上皮細胞。
C54.8 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、アラキドン酸、コレステロール、DL−α−トコフェロールアセテート、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、プルロニックF−68、ステアリン酸およびポリソルベート80から選択される、実施形態C54.7の上皮細胞。
C54.9 前記1種もしくはこれより多くの脂質が、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸から選択される、実施形態C54.8の上皮細胞。
C55. 前記方法が、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子の使用を含む、実施形態C1〜C54のいずれか1つの上皮細胞。
C56. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態C56.1またはC56.2の上皮細胞。
C56.1 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、FGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.2 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGFおよびFGFを含む、実施形態C55の上皮細胞。
C56.3 前記FGFが、酸性FGFを含む、実施形態C56.1またはC56.2の上皮細胞。
C57. 前記方法が、有糸分裂促進性増殖因子の使用を含まない、実施形態C1〜C54.9のいずれか1つの上皮細胞。
C58. 前記方法が、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物の使用を含む、実施形態C1〜C57のいずれか1つの上皮細胞。
C59. 前記1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性補充物が、ウシ下垂体抽出物(BPE)を含む、実施形態C58の上皮細胞。
C59.1 前記方法が、有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態C1〜C57のいずれか1つの上皮細胞。
C59.1 前記方法が、有糸分裂促進性補充物の使用を含まない、実施形態C1〜C57のいずれか1つの上皮細胞。
C60. 前記方法が、Wntアゴニストまたはβ−カテニンアゴニストの使用を含まない、実施形態C1〜C59.1のいずれか1つの上皮細胞。
C60.1 前記方法が、noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態C1〜C60のいずれか1つの上皮細胞。
C60.1 前記方法が、noggin、R−spondin、Wnt−3a、EGF、ニコチンアミド、FGF10、ガストリン、p38インヒビター、SB202190、DHT、notchインヒビター、ガンマセクレターゼインヒビター、DBZおよびDAPTから選択される成分のうちの1つまたは複数の使用を含まない、実施形態C1〜C60のいずれか1つの上皮細胞。
C61. 前記方法が、細胞外マトリクスの使用を含まない、実施形態C1〜C60.1のいずれか1つの上皮細胞。
C62. (a)の培養する工程が被覆を含む容器の中で行われる、実施形態C1〜C60.1のいずれか1つの上皮細胞。
C63. 前記被覆が、コラーゲンを含む、実施形態C62の上皮細胞。
C64. 前記被覆が、基底膜マトリクスを含む、実施形態C62の上皮細胞。
C65. (a)の培養する工程が、前記上皮細胞を拡大する工程を含む、実施形態C1〜C64のいずれか1つの上皮細胞。
C66. 前記上皮細胞は少なくとも約2倍拡大される、実施形態C65の上皮細胞。
C67. 前記上皮細胞は少なくとも約5倍拡大される、実施形態C65の上皮細胞。
C68. 前記上皮細胞は少なくとも約10倍拡大される、実施形態C65の上皮細胞。
C69. 前記上皮細胞は少なくとも約15倍拡大される、実施形態C65の上皮細胞。
C70. 前記上皮細胞は少なくとも約20倍拡大される、実施形態C65の上皮細胞。
C70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.1 前記上皮細胞は少なくとも約100倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.2 前記上皮細胞は少なくとも約1,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.3 前記上皮細胞は少なくとも約10,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.4 前記上皮細胞は少なくとも約100,000倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.5 前記上皮細胞は少なくとも約100万倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.6 前記上皮細胞は少なくとも約10億倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C70.7 前記上皮細胞は少なくとも約1兆倍拡大される、実施形態A65の上皮細胞。
C71. 前記上皮細胞は約4日間培養される、実施形態C65〜C70.7のいずれか1つの上皮細胞。
C72. 前記上皮細胞は約5日間培養される、実施形態C65〜C70.7のいずれか1つの上皮細胞。
C73. 前記上皮細胞は連続して増殖している、実施形態C1〜C72のいずれか1つの上皮細胞。
C74. 前記方法が、前記上皮細胞を少なくとも15回継代する工程を含む、実施形態C1〜C73のいずれか1つの上皮細胞。
C75. 前記方法が、前記上皮細胞を少なくとも25回継代する工程を含む、実施形態C1〜C73のいずれか1つの上皮細胞。
C76. 前記上皮細胞の集団はある期間にわたって倍加する、実施形態C1〜C75のいずれか1つの上皮細胞。
C77. 前記上皮細胞集団は少なくとも20回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C78. 前記上皮細胞集団は少なくとも50回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C78.1 前記上皮細胞集団は少なくとも80回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C79. 前記上皮細胞集団は少なくとも100回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C80. 前記上皮細胞集団は少なくとも120回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C81. 前記上皮細胞集団は少なくとも150回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C82. 前記上皮細胞集団は少なくとも200回倍加する、実施形態C76の上皮細胞。
C83. 前記期間は約50日間である、実施形態C76〜C82のいずれか1つの上皮細胞。
C84. 前記期間は約100日間である、実施形態C76〜C82のいずれか1つの上皮細胞。
C85. 前記期間は約150日間である、実施形態C76〜C82のいずれか1つの上皮細胞。
C86. 前記期間は約200日間である、実施形態C76〜C82のいずれか1つの上皮細胞。
C87. (b)の間に1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持する、実施形態C1〜C86のいずれか1つの上皮細胞。
C88. (b)の間に1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持しない、実施形態C1〜C86のいずれか1つの上皮細胞。
C89. (b)の後に、TGF−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれる、実施形態C1〜C88のいずれか1つの上皮細胞。
C90. TGF−βシグナル伝達が阻害されない細胞培養環境へと置かれた後に、1種もしくはこれより多くの天然の機能的特徴を維持または再獲得する、実施形態C89の上皮細胞。
C91. 複数の組織タイプに分化するように誘導され得る、実施形態C1〜C90のいずれか1つの上皮細胞。
C91.1 複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態C1〜C90のいずれか1つの上皮細胞。
C91.1 複数の組織タイプに分化する能力を獲得しない、実施形態C1〜C90のいずれか1つの上皮細胞。
C92. オルガノイドを形成する能力を獲得しない、実施形態C1〜C91.1のいずれか1つの上皮細胞。
C93. 胚性幹細胞に由来するものではない、実施形態C1〜C92のいずれか1つの上皮細胞。
C93.1 連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態C1〜C93のいずれか1つの上皮細胞。
C93.2 静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態C1〜C93.1のいずれか1つの上皮細胞。
C93.3 方法が、連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.2のいずれか1つの上皮細胞。
C93.4 方法が、腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.3のいずれか1つの上皮細胞。
C93.5 方法が、LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.4のいずれか1つの上皮細胞。
C93.1 連続して増殖している上皮幹細胞に由来するものではない、実施形態C1〜C93のいずれか1つの上皮細胞。
C93.2 静止した上皮細胞を含む上皮組織に由来する、実施形態C1〜C93.1のいずれか1つの上皮細胞。
C93.3 方法が、連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.2のいずれか1つの上皮細胞。
C93.4 方法が、腸陰窩細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.3のいずれか1つの上皮細胞。
C93.5 方法が、LGR5+細胞を選択することを含まない、実施形態C1〜C93.4のいずれか1つの上皮細胞。
C94. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、連続して増殖している上皮幹細胞または連続して増殖している上皮幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態C40〜C93.5のいずれか1つの上皮細胞。
C94.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態C40〜C94のいずれか1つの上皮細胞。
C94.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.1のいずれか1つの上皮細胞。
C94.3 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.2のいずれか1つの上皮細胞。
C94.4 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態C40〜C94.3のいずれか1つの上皮細胞。
C94.5 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態C40〜C94.4のいずれか1つの上皮細胞。
C94.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、多能性幹細胞または多能性幹細胞に由来する細胞を含まない、実施形態C40〜C94のいずれか1つの上皮細胞。
C94.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.1のいずれか1つの上皮細胞。
C94.3 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、胃上皮細胞、腸上皮細胞、および/または膵臓上皮細胞を含まない、実施形態C40〜C94.2のいずれか1つの上皮細胞。
C94.4 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、腸陰窩細胞を含まない、実施形態C40〜C94.3のいずれか1つの上皮細胞。
C94.5 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、LGR5+細胞を含まない、実施形態C40〜C94.4のいずれか1つの上皮細胞。
C95. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の均質な集団である、実施形態C40〜C94.5のいずれか1つの上皮細胞。
C95.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態C40〜C95のいずれか1つの上皮細胞。
C95.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態C40〜C94.5のいずれか1つの上皮細胞。
C95.1 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、基底上皮細胞の均質な集団である、実施形態C40〜C95のいずれか1つの上皮細胞。
C95.2 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、上皮細胞の異質な集団である、実施形態C40〜C94.5のいずれか1つの上皮細胞。
C96. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、最終分化した細胞より分化しておらず、胚性幹細胞または成体幹細胞より分化している、実施形態C40〜C95.2のいずれか1つの上皮細胞。
C97. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する、実施形態C40〜C96のいずれか1つの上皮細胞。
C98. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1つまたは複数を発現する、実施形態C40〜C97のいずれか1つの上皮細胞。
C99. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態C40〜C98のいずれか1つの上皮細胞。
C100. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、Lgr5を発現しない、実施形態C40〜C99のいずれか1つの上皮細胞。
C101. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態C40〜C100のいずれか1つの上皮細胞。
C102. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態C40〜C101のいずれか1つの上皮細胞。
C103. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態C40〜C102のいずれか1つの上皮細胞。
C104. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態C40〜C103のいずれか1つの上皮細胞。
C105. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態C40〜C104のいずれか1つの上皮細胞。
C106. 被験体および/またはエキソビボで増殖させた細胞の前記集団から得られた細胞が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態C40〜C105のいずれか1つの上皮細胞。
C107.遺伝子改変された細胞の生産のための、実施形態C1〜C106のいずれか1つの上皮細胞の使用。
C108. 被験体のための1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための、実施形態C1〜C106のいずれか1つの上皮細胞の使用。
C109. 被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための、実施形態C1〜C106のいずれか1つの上皮細胞の使用。
C110. 被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための、実施形態C1〜C106のいずれか1つの上皮細胞の使用。
D1. 規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
D2. 規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
D3. 規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
D4. 規定された無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
D5. ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
D6. ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
D7. ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
D8. ゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
D9. 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む細胞培養組成物。
D10. 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、およびRhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビターからなる細胞培養組成物。
D11. 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む細胞培養組成物。
D12. 規定されたゼノフリー無血清細胞培養培地、脂質ミックス、EGF、FGF、アルブミン、TGF−βインヒビターまたはTGF−βシグナル伝達インヒビター、RhoキナーゼインヒビターまたはRho関連タンパク質キナーゼインヒビター、およびβアドレナリン作動性アゴニストまたはβアドレナリン作動性レセプターアゴニストからなる細胞培養組成物。
E1. エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、拡大培養条件下で培養した場合に25回またはそれより多くの集団倍加をすることができ;
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養した場合に20回以下の集団倍加が可能である、方法。
E1.1 エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、方法。
E1.2 :
集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤が第1の薬剤であり、前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、
前記コントロール培養条件が、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、実施形態E1の方法。
E1.3 前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む、実施形態E1.1の方法。
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、フィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、拡大培養条件下で培養した場合に25回またはそれより多くの集団倍加をすることができ;
前記起源上皮細胞集団は、前記薬剤を含まないコントロール培養条件下で培養した場合に20回以下の集団倍加が可能である、方法。
E1.1 エキソビボで上皮細胞を増殖させる方法であって、
分化した組織に由来する起源上皮細胞集団中の細胞数を、無血清かつフィーダー細胞なしの条件下で拡大し、それによって、拡大した上皮細胞集団を生成する工程を含み、ここで、
前記拡大培養条件は、集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤を含み;
前記起源上皮細胞集団は、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、方法。
E1.2 :
集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/または集団においてトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤が第1の薬剤であり、前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する第2の薬剤をさらに含み、
前記コントロール培養条件が、前記第1の薬剤および前記第2の薬剤を含まない、実施形態E1の方法。
E1.3 前記拡大培養条件が、集団において細胞骨格構造を調節する薬剤をさらに含む、実施形態E1.1の方法。
E2. 分化した組織分化した組織に由来する起源上皮細胞集団を単離する工程を含む、実施形態E1〜E1.3のいずれか1つの方法。
E3. 細胞培養物中の前記起源上皮細胞集団の細胞を、前記細胞が単離された後かつ前記起源上皮細胞集団を前記フィーダー細胞なしの拡大培養条件に接触させる前に、維持するまたは増殖させる工程を包含する、実施形態E1〜E2のいずれか1つの方法。
E4. 前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団が胚性幹細胞を含まない、実施形態E1〜E3のいずれか1つの方法。
E5.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する
、実施形態E1〜E4のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの基底上皮細胞マーカーを発現する
、実施形態E1〜E4のいずれか1つの方法。
E6.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1つまたは複数を発現する、実施形態E1〜E5のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、ITGA6、ITGB4、KRT14、KRT15、KRT5およびTP63のうちの1つまたは複数を発現する、実施形態E1〜E5のいずれか1つの方法。
E7.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E6のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの上皮幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E6のいずれか1つの方法。
E8.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、Lgr5を発現しない、実施形態E1〜E7のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、Lgr5を発現しない、実施形態E1〜E7のいずれか1つの方法。
E9.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E8のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの多能性幹細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E8のいずれか1つの方法。
E10.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E9のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、LIN28A、NANOG、POU5F1/OCT4およびSOX2のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E9のいずれか1つの方法。
E11.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団が、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E10のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団が、1種もしくはこれより多くの最終分化した上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E10のいずれか1つの方法。
E12.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E11のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CFTR、FOXJ1、IVL、KRT1、KRT10、KRT20、LOR、MUC1、MUC5AC、SCGB1A1、SFTPBおよびSFTPDのうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E11のいずれか1つの方法。
E13.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E12のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、1種もしくはこれより多くの胃上皮細胞マーカー、1種もしくはこれより多くの腸上皮細胞マーカー、および/または1種もしくはこれより多くの膵臓上皮細胞マーカーを発現しない、実施形態E1〜E12のいずれか1つの方法。
E14.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E13のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、CD34、HNF1A、HNF4A、IHH、KIT、LGR5、PDX1、およびPROM1/CD133のうちの1つまたは複数を発現しない、実施形態E1〜E13のいずれか1つの方法。
E15.
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態E1〜E14のいずれか1つの方法。
前記起源上皮細胞集団、または
前記拡大した上皮細胞集団、または
前記起源上皮細胞集団および前記拡大した上皮細胞集団
が、静止したおよび/または以前は静止していた上皮細胞を含む、実施形態E1〜E14のいずれか1つの方法。
E16. 集団においてテロメラーゼ逆転写酵素を活性化するかつ/またはトランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)シグナル伝達を阻害する薬剤が、1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターを含む、実施形態E1〜E15のいずれか1つの方法。
E17. 前記1種もしくはこれより多くのTGF−βシグナル伝達インヒビターが、1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターを含む、実施形態E16の方法。
E18. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子ALK5インヒビターを含む、実施形態E17の方法。
E19. 前記1種もしくはこれより多くのALK5インヒビターが、A83−01、GW788388、RepSox、およびSB431542から選択される、実施形態E17の方法。
E20. 集団において細胞骨格構造を調節する薬剤が、Rho関連タンパク質キナーゼインヒビター、p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビター、およびミオシンIIインヒビターのうちの1つまたは複数を含む、実施形態E1〜E19のいずれか1つの方法。
E21. 前記Rhoキナーゼインヒビターが、Rho関連タンパク質キナーゼ1(ROCK1)インヒビターおよびRho関連タンパク質キナーゼ2(ROCK2)インヒビターから選択される、実施形態E20の方法。
E22. 前記Rho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子Rho関連タンパク質キナーゼインヒビターを含む、実施形態E20またはE21の方法。
E23. 前記1種もしくはこれより多くのRho関連タンパク質キナーゼインヒビターが、Y−27632、SR3677、チアゾビビン、HA1100ヒドロクロリド、HA1077およびGSK−429286から選択される、実施形態E22の方法。
E24. 前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターが、PAK1インヒビター、PAK2インヒビター、PAK3インヒビターおよびPAK4インヒビターから選択される、実施形態E20〜E23のいずれか1つの方法。
E25. 前記p21活性化キナーゼ(PAK)インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターを含む、実施形態E24の方法。
E26. 前記1種もしくはこれより多くの低分子PAK1インヒビターが、IPA3を含む、実施形態E25の方法。
E27. 前記ミオシンIIインヒビターが、1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、実施形態E20〜E26のいずれか1つの方法。
E28. 前記1種もしくはこれより多くの非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターが、1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターを含む、実施形態E27の方法。
E29. 前記1種もしくはこれより多くの低分子非筋肉ミオシンII(NM II)インヒビターが、ブレビスタチンを含む、実施形態E28の方法。
E30. 前記拡大培養条件が、集団において細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤をさらに含む、実施形態E1〜E29のいずれか1つの方法。
E31. 細胞内環状アデノシンモノホスフェート(cAMP)レベルを増大させる薬剤が、1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む、実施形態E30の方法。
E32. 前記1種もしくはこれより多くのβアドレナリン作動性レセプターアゴニストが、イソプロテレノールを含む、実施形態E31の方法。
E33. 前記拡大培養条件が、無血清培養条件である、実施形態E1〜E32のいずれか1つの方法。
E34. 前記拡大培養条件が、規定された無血清培養条件である、実施形態E1〜E33のいずれか1つの方法。
E35. 前記拡大培養条件が、ゼノフリー培養条件である、実施形態E1〜E34のいずれか1つの方法。
E36. 前記拡大培養条件が、規定されたゼノフリー培養条件である、実施形態E1〜E35のいずれか1つの方法。
E37. 前記拡大培養条件が、100μM未満の濃度でカルシウムを含む、実施形態E1〜E36のいずれか1つの方法。
E38. 前記カルシウムが、約90μMの濃度で存在する、実施形態E37の方法。
E39. 前記拡大培養条件が、1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子を含む、実施形態E1〜E38のいずれか1つの方法。
E40. 1種もしくはこれより多くの有糸分裂促進性増殖因子が、EGF、FGF、またはEGFおよびFGFを含む、実施形態E39の方法。
E41. 前記拡大培養条件が、細胞外マトリクスを含まない、実施形態E1〜E40のいずれか1つの方法。
E42. 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に30回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態E1〜E41のいずれか1つの方法。
E43. 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に50回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態E1〜E41のいずれか1つの方法。
E44. 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に80回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態E1〜E41のいずれか1つの方法。
E45. 前記起源上皮細胞集団は、前記拡大培養条件下で培養した場合に100回またはそれより多くの集団倍加し得る、実施形態E1〜E41のいずれか1つの方法。
E46. 前記方法が、前記起源上皮細胞集団において連続して増殖している上皮幹細胞を選択することを含まない、実施形態E1〜E45のいずれか1つの方法。
E47. 前記起源上皮細胞集団が、連続して増殖している上皮幹細胞を含まない、実施形態E1〜E45のいずれか1つの方法。
E48. エキソビボで拡大した上皮細胞を単離する工程をさらに含む、実施形態E1〜E47のいずれか1つの方法。
E49. エキソビボで拡大した上皮細胞の集団を細胞バンクで貯蔵する工程をさらに含む、実施形態E1〜E48のいずれか1つの方法。
E50. 実施形態E1〜E49のいずれか1つに従う方法によって生産されたエキソビボで拡大した上皮細胞の集団。
E51. 遺伝子改変された細胞の生産のための実施形態E50のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
E52. 被験体のための1種もしくはこれより多くの候補処置を同定するための実施形態E50のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
E53. 被験体において1種もしくはこれより多くの異常な上皮細胞を同定するための実施形態E50のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
E54. 被験体における疾患の進行または疾患の処置をモニターするための実施形態E50のエキソビボで拡大した上皮細胞の集団の使用。
本明細書で言及される各特許、特許出願、刊行物および文書の全体は、本明細書に参考として援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のうちのいずれかが、関連のある先行技術であるという承認でもなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して、任意の承認を構成するものでもない。それらの引用は、関連する開示に関する検索の表示ではない。上記文書の日付または内容に関する全ての陳述は、入手可能な情報に基づき、それらの精度または正確性に関する承認ではない。
改変は、本技術の基本的局面から逸脱することなく、前述に対して行われ得る。本技術は、1種もしくはこれより多くの具体的実施形態を参照して実質的に詳細に記載されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示される実施形態に対して変更が行われ得るが、これら改変および改善は、本技術の範囲および趣旨内にあることを認識する。
本明細書で適切に例証として記載される技術は、本明細書で具体的に開示されないいかなる要素の非存在下でも実施され得る。従って、例えば、本明細書での各場合において、用語「含む、包含する(comprising)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」、および「からなる(consisting of)」のうちのいずれかが、他方の2つの用語のうちのいずれかと置き換わり得る。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されるのであって、限定の用語として使用されているのではなく、このような用語および表現の使用は、示されかつ記載される特徴のいかなる均等物またはその一部をも排除せず、種々の改変は、特許請求される本技術の範囲内で考えられる。用語「1つの、ある(a)」または「1つの、ある(an)」は、その要素のうちの1つまたはその要素のうちの1つより多くのいずれかが記載されることが、文脈上明らかでなければ、その用語が修飾する要素のうちの1つまたは複数に言及し得る(例えば、「1種の試薬」は、1種もしくはこれより多くの試薬を意味し得る)。用語「約」は、本明細書で使用される場合、その基礎にあるパラメーターの10%以内の値(すなわち、±10%)に言及し、一連の値の始まりにおける用語「約」の使用は、それら値の各々を修飾する(すなわち、「約1、2および3」とは、約1、約2および約3をいう)。例えば、「約100グラム」という重量は、90グラム〜110グラムの間の重量を含み得る。さらに、値のリストが本明細書で記載される場合(例えば、約50%、60%、70%、80%、85%または86%)、そのリストは、その全ての中間値および小数値を含む(例えば、54%、85.4%)。従って、本技術は、代表的実施形態および選択肢的な特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書で開示される概念の改変およびバリエーションは、当業者によって求められ得るものであり、このような改変およびバリエーションは、この技術の範囲内にあると見做されることは、理解されるものとする。
本技術のある特定の実施形態は、以下に続く特許請求の範囲に示される。
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- 本明細書に記載の発明。
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