JPWO2018047941A1 - 幹細胞培養用培地、幹細胞の培養方法、幹細胞の増殖促進剤、並びに細胞組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、未分化状態を維持しつつ、分化能を有する幹細胞を、安定、安価かつ安全に培養するための技術を提供することを目的とする。本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である幹細胞培養用培地、該培地を用いた幹細胞の培養方法、幹細胞の増殖促進剤、並びに幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物およびその製造方法に関する。

Description

本発明は、幹細胞培養用培地、該培地を用いた幹細胞の培養方法、幹細胞の増殖促進剤、並びに幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物およびその製造方法に関する。より詳しくは、増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である培地に幹細胞を効率よく培養することができる化合物を添加することを特徴とする、幹細胞培養用の培地等に関する。

幹細胞の培養は、一般的に、代替血清因子ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ−Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）等の増殖因子を添加した培地と、マウス胎児組織由来線維芽細胞等をフィーダー細胞として用いて行われる。あるいは、フィーダー細胞を用いず、マトリジェル、ビトロネクチン、ラミニン若しくはファイブロネクチン等の細胞外マトリックス、または組換えタンパク質等を培養容器にコーティングして、フィーダー細胞を培養した培養上清に繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の増殖因子を添加した培地で培養されている。これらの培養では、異種由来成分が混入し、また未知成分が未知の濃度で混入してしまう恐れがある。

このように異種由来成分が混入すると、培養が不安定となる要因となり、さらに人畜共通のウイルスまたは病原体による感染または異種抗原となり得るため、培養中から除かれることが好ましい。

そのため、現在では、出来るだけ幹細胞を安全に培養するために、ビトロネクチン、ラミニン若しくはファイブロネクチン等の細胞外マトリックス成分またはその組換え体を足場材料として用い、培地として、その構成成分のすべてが既知である無血清培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）が用いられている。当該培地としては、ＴｅＳＲ１培地、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地、ＳＴＥＭＰＲＯ培地、ｈＥＳＦ９またはｈＥＳＦ−ＦＸ培地等が挙げられる。

これらの培地の主な組成は、高グルコース含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）を基礎培地として、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、糖類または微量成分等を含み、さらにインシュリン、トランスフェリン、アルブミン、脂質群等、増殖因子等またはメルカプトエタノール等を加えたものとなっている。

培地に添加される増殖因子としては、例えば、ＦＧＦファミリーに属する塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属するＴＧＦβ（ＴＧＦβ_１）（特許文献１）およびアクチビン（特許文献２）、ニューレグリンファミリーに属するヘレグリン−β−１およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリーに属するＩＦＧ−１（非特許文献１）、Ｗｎｔファミリーに属するＷｎｔ３aが知られている。

国際公開第２００４／０５５１５５号 日本国特開２０１２−１４３２２９号公報

Wang, L., et al. (2007). Blood 110, 4111-4119

上述したような増殖因子は高価であり、メーカーまたは由来によって生物活性が異なり、培地が安定しない要因となりうる。また、このような増殖因子は、その製造工程等において異種由来成分または病原体等の混入の可能性があり、医療応用する場合には、生物由来起源の確認が必要となる。そのため、増殖因子をタンパク質以外の成分で代替するか、またはできるだけ低減するか、あるいは除去することが好ましい。

したがって、本発明は、未分化状態を維持しつつ、分化能を有する幹細胞を、安定、安価かつ安全に培養するための技術を提供することを目的とする。

本発明者らは、増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である培地に、特定の化合物を加えた培地を用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２０）に関する。
（１）ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤、ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である幹細胞用培地。
（２）増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である、（１）に記載の幹細胞培養用培地。
（３）塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度が２ｎｇ／ｍＬ以下である、（２）に記載の幹細胞培養用培地。
（４）塩基性繊維芽細胞増殖因子を含まない、（２）に記載の幹細胞培養用培地。
（５）増殖因子がアクチビンである、（１）に記載の幹細胞培養用培地。
（６）アクチビンの濃度が３ｎｇ／ｍＬ以下である、（５）に記載の幹細胞培養用培地。
（７）アクチビンを含まない、（５）に記載の幹細胞培養用培地。
（８）幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である（１）〜（７）のいずれか１に記載の幹細胞培養用培地。
（９）（１）〜（８）のいずれか１に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養することにより、幹細胞の未分化状態を維持しながら、分化能を有する幹細胞を増殖させることを特徴とする、幹細胞の培養方法。
（１０）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（９）に記載の幹細胞の培養方法。
（１１）ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含む、幹細胞の増殖促進剤。
（１２）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（１１）に記載の幹細胞の増殖促進剤。
（１３）（１）〜（８）のいずれか１に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
（１４）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（１３）に記載の幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
（１５）（１）〜（８）のいずれか１に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程とを含む、幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
（１６）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（１５）に記載の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
（１７）（１３）又は（１４）に記載の製造方法によって製造される、幹細胞を含む細胞組成物。
（１８）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（１７）に記載の細胞組成物。
（１９）（１５）又は（１６）に記載の製造方法によって製造される、幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物。
（２０）前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、（１９）に記載の細胞組成物。

本発明の幹細胞培養用培地によれば、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有することにより、増殖因子を含まないか、または増殖因子の濃度が低濃度であっても、未分化状態を維持しつつ、幹細胞を効率よく培養することができる。

図１は、本発明の幹細胞培養用培地を用いてヒトｉＰＳ細胞を培養した時の、細胞の核の数および未分化マーカーであるＯＣＴ３／４タンパク質陽性細胞数をカウントした結果を示す。

本発明は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度であることを特徴とする、幹細胞培養用培地（以下、「本発明の培地」ともいう。）、および該培地で幹細胞を培養することにより、幹細胞の未分化状態を維持しつつ、分化能を有する幹細胞を増殖させることを特徴とする、幹細胞の培養方法（以下、「本発明の方法」ともいう。）、幹細胞の増殖促進剤（以下、「本発明の増殖促進剤」ともいう。）、並びに幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物およびその製造方法に関する。

１．本発明の培地
本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である幹細胞培養用培地である。

本発明の培地は、幹細胞を未分化状態を維持したまま増殖させることができる培地であり、分化能を有する幹細胞を培養するために用いられるものである。

本明細書において、「幹細胞」とは、自己複成能および分化増殖能を有する未熟な細胞をいう。幹細胞には階層（ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）があり、上位の未分化の幹細胞は自己複製能が高く、さまざまな細胞系列に分化できる多能性も高いが、下位になるほど自己複製能は失われていき特定の細胞系列にしか分化できないようになることが知られている。

本明細書において、「多能性」とは、多分化能とも言い換えることができるが、外胚葉、中胚葉および内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力をいい、生殖細胞への分化能もここでは包含されうる。なお、本明細書において、「分化細胞」とは、幹細胞から分化した体内の組織や臓器を構成する多種類の細胞である。

本発明の培地を適用可能な幹細胞の由来種は特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジ等の有蹄目、イヌおよびネコ等のネコ目、並びにヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータンおよびチンパンジー等の霊長類等が挙げられる。

幹細胞には、分化能に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)等が含まれる。

多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有し、かつ自己複製可能な細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有し、かつ自己複製可能な細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有し、かつ自己複製可能な細胞を意味する。

多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）および成体多能性幹細胞（Ａｄｕｌｔ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＡＰＳ細胞）等を挙げることができる。

多能性幹細胞としてはまた、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も挙げることができる（Nature,1997,385,810;Science,1998,280,1256;Nature Biotechnology,1999,17,456;Nature,1998,394,369;Nature Genetics,1999,22,127;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96,14984;Nature Genetics,2000,24,109）。

ＥＳ細胞のうちヒトＥＳ細胞としては、例えば、ＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）（いずれもＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能）、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３（いずれも京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能）を挙げることができる。

ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子（初期化因子）を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられる。例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、並びにＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nature Biotechnology,2008,26,101-106）等が挙げられる。

初期化因子に含まれる遺伝子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１等が挙げられる。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。

初期化因子の組み合わせとしては、例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.等に記載の組み合わせが挙げられる。ｉＰＳ細胞は、所定の機関（理研バイオリソースセンター、京都大学）より入手可能である。

ｉＰＳ細胞のうちヒトｉＰＳ細胞としては、より具体的には、例えば、２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００２９）、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０２２３）等が挙げられる。

複能性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞および生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。ここで、間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞若しくは脂肪芽細胞等の間葉系の細胞全てまたはいくつかへの分化が可能な幹細胞あるいはその前駆細胞の集団を広義に意味する。

間葉系幹細胞としては、具体的には、例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ、Ｔａｋａｒａ社製）、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＵＣ、Ｔａｋａｒａ社製）またはヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ、Ｔａｋａｒａ社製）等が挙げられる。

本発明の培地で培養する細胞は、比較的上位の階層に位置する細胞、すなわち、未分化状態であって、多能性が充分保持された自己複製可能な幹細胞であることが好ましい。

そのような幹細胞としては、例えば、多能性幹細胞または複能性幹細胞を挙げることができる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が好ましく、より好ましくはｉＰＳ細胞であり、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。複能性幹細胞としては、間葉系幹細胞が好ましく、より好ましくは骨髄間葉系幹細胞である。

本発明の培地は、例えば、幹細胞用基礎培地に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有させることにより調製することができる。幹細胞用基礎培地は、増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度のものであれば、特に制限されない。

幹細胞用基礎培地は、１種類以上の糖、１種類以上の無機塩、１種類以上のアミノ酸、１種類以上のビタミン、および１種類以上の微量成分を含むことが好ましい。また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。

糖としては、例えば、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトースおよびガラクトース等の単糖類、並びにスクロース、マルトースおよびラクトース等の二糖類等が挙げられる。これらの中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１または２以上組み合わせて添加することもできる。

無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物および硫酸亜鉛七水和物等が挙げられる。

アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン等が挙げられ、Ｌ体のアミノ酸が好ましい。アミノ酸には、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。

アルギニンの派生物としては、例えば、Ｌ−アルギニン塩酸塩等が挙げられる。アスパラギン酸の派生物としては、例えば、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウムおよびＬ−アスパラギン酸マグネシウム等が挙げられる。

システインの派生物としては、例えば、Ｌ−システイン二塩酸塩およびＬ−システイン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ−リジン塩酸塩等が挙げられる。グルタミン酸の派生物としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等が挙げられる。

アスパラギンの派生物としては、例えば、Ｌ−アスパラギン一水和物等が挙げられる。チロシンの派生物としては、例えば、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等が挙げられる。ヒスチジンの派生物としては、例えば、ヒスチジン塩酸塩およびヒスチジン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ−リジン塩酸塩等が挙げられる。

ビタミンとしては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２およびパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）等が挙げられる。これらの中でも、アスコルビン酸は添加されることが好ましい。ビタミンには、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。

アスコルビン酸の派生物としては、例えば、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピルおよびアスコルビン酸リン酸ナトリウム等が挙げられる。

コリンの派生物としては、例えば、塩化コリン等が挙げられる。ナイアシンの派生物としては、例えば、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよびニコチニックアルコール等が挙げられる。パントテン酸の派生物としては、例えば、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウムおよびパンテノール等が挙げられる。

ピリドキシンの派生物としては、例えば、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサールおよびピリドキサミン等が挙げられる。チアミンの派生物としては、例えば、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミンおよびベンフォチアミン等が挙げられる。

微量成分は多能性幹細胞の未分化状態の維持に有利に作用する成分であることが好ましい。微量成分としては、例えば、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジンおよびＮａＨＣＯ_３等通常培地成分として用いられている成分が挙げられる。微量成分には、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。派生物としては、例えば、プトレシン二塩酸を挙げることができる。

幹細胞用基礎培地としては、当業者に公知の基礎培地を使用することができるが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐため、培地に含まれる化合物の組成が明らかとなっている培地であることが好ましい。

そのような幹細胞用基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓ−ｇｏｗ’ｓ ＭＥＭ）、Ｆ１２（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＲＤ、ＢＭＯＣ−３（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ ＢＭＯＣ−３ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｍｅｄｉａ １９９、ＭＥＭ αＭｅｄｉａ、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ ＥおよびＥＳＦ等を挙げることができる。

幹細胞用基礎培地としてまた、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）等の前記公知の基礎培地のいずれか２以上を適当な割合で混合した培地、およびこれらの培地に前記アスコルビン酸、好ましくはアスコルビン酸２−リン酸エステルを添加した培地を挙げることもできる。

幹細胞用基礎培地としては、特に、Miho Furue et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 41, 19-28 (2005)に示されるＥＳＦ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ｍＥＳＦ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ」ともいう）を好適に例示することができる。

本明細書において、「増殖因子を含まない」とは、増殖因子を実質的に含有しないことをいう。ここで、「実質的に含有しない」とは、意図的に培地中に含有しないことを意味し、不可避的不純物の混入をも排除するものではない。

増殖因子としては、例えば繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する因子である例えば塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーに属する因子であるアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢまたはアクチビンＡＢ）あるいはＴＧＦβ１等、ニューレグリンファミリーに属する因子であるヘレグリン−β−１等、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリーに属する因子であるＩＦＧ−１等、またはＷｎｔファミリーに属する因子であるＷｎｔ３ａ等が挙げられる。

本発明の培地は、上述したように、増殖因子を実質的に含まないが、低濃度の増殖因子を含んでいてもよい。例えば、本発明の培地に増殖因子としてｂＦＧＦが含まれる場合、その濃度は好ましくは２ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下である。

例えば、本発明の培地に増殖因子としてアクチビンが含まれる場合、その濃度は好ましくは３ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下である。
例えば、本発明の培地に増殖因子としてＴＧＦβが含まれる場合、その濃度は好ましくは０．０６ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以下である。

例えば、本発明の培地に増殖因子としてヘレグリン−β−１が含まれる場合、その濃度は好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下である。

例えば、本発明の培地に増殖因子としてＩＧＦ−１が含まれる場合、その濃度は好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下である。

本発明の培地は、上述のように、低濃度の増殖因子を含んでもよいが、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ、アクチビン、ヘレグリン−β−１、ＩＦＧ−１、またはＷｎｔ３ａを含まないことが好ましい。

ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（ＨＡ１００）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−９）、Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ−１００４）、Ｎ−［（ＬＳ）−２−ヒドロキシ−ｌ−フェニルエチル］−Ｎ−［４−（４−ピリジニル）フェニル］−ウレア（ＡＳ１８９２８０２）、Ｎ−［３−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ］フェニル］−４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−メチル−６−オキソ−４−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６）、ヒドロキシファスジル（ＨＡ１１００）、２−フルオロ−Ｎ−［［４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミン（ＯＸＡ０６）、Ｎ−［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−Ｎ’−［４−（４−ピリジニル）−２−チアゾリル］ウレア（ＲＫＩ１４４７）、４−（７−｛［（３Ｓ）−３−アミノ−１−ピロリジニル］カルボニル｝−１−エチル−１Ｈイミダゾール［４，５−ｃ］ピリジン−２−イル）−１，２，５−オキサジアゾール−３−アミン（ＳＢ７７２０７７Ｂ）、Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキシアミドジヒドロクロライド（ＳＲ３６７７）、６−クロロ−Ｎ４−［３，５−ジフルオロ−４−［（３−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）オキシ］フェニル］−２，４−ピリミジンジアミン（ＴＣ−Ｓ７００１）等が挙げられる。最も好ましくは、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（ＨＡ１００）が挙げられる。

本発明の培地にＲＯＣＫ阻害剤が含まれる場合、その濃度は、好ましくは０．００１〜１０００μＭであり、より好ましくは０．０１〜１００μＭであり、最も好ましくは０．１〜１０μＭである。

ＰＫＣ阻害剤としては、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（ＨＡ１００）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）、ビスインドリルマレイミドＩＩ、Ｃ−１、カルホスチンＣ、５，６−ビス［（４−フルオロフェニル）アミノ］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＣＧＰ５３３５３）、チェレリスリン、ジヒドロスフィンゴシン、Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン（Ｈ−１１５２）、ビスインドリルマレイミドＩ）、１２−（２−シアノエチル）−６，７，１２，１３−テトラヒドロ−１３−メチル−５−オキソ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール（Ｇｏ６９７６、２−［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−５−メトキシインドール−３−イル］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）マレイミド（Ｇｏ６９８３）、スタウロスポリンアグリコン（Ｋ−２５２ｃ）、（Ｓ）−１３−［（ジメチルアミノ）メチル］−１０，１１，１４，１５−テトラヒドロ−４，９：１６，２１−ジメテノ−１Ｈ，１３Ｈ−ジベンゾ［ｅ，ｋ］ピロロ［３，４−ｈ］［１，４，１３］オキサジアザシクロヘキサデセン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＬＹ３３３５３１）、メリチン、パルミトイルカルニチン、２−｛８−［（ジメチルアミノ）メチル］−６，７，８，９−テトラヒドロピリド［１，２−ａ］インドール−３−イル｝−３−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）マレイミド（Ｒｏ−３２−０４３２）、ロットレリン、Ｅ−エリスロスフィンゴシン、３−［５−［４−（２−ヒドロキシ−２−メチル−１−オキソプロピル）−１−ピペラジニル］−２−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＴＣＳ２１３１１）等が挙げられ、最も好ましくは、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（ＨＡ１００）が挙げられる。

本発明の培地にＰＫＣ阻害剤が含まれる場合、その濃度は、好ましくは０．００１〜１０００μＭであり、より好ましくは０．０１〜１００μＭであり、最も好ましくは０．１〜１０μＭである。

前記ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＫＣ阻害剤として例示した化合物中、ＨＡ１００、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７およびＨ−１１５２は、ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＫＣ阻害剤のいずれとしても機能し得るものである。

ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤としては、例えば、３−デアザネプラノシン（ＤｚＮｅｐ）、Ｎ−［（６−メチル−２−オキソ−４−プロピル−１Ｈ−ピリジン−３−イル）メチル］−１−プロパン−２−イル−６−［６−（４−プロパン−２−イルピペラジン−１−イル）ピリジン−３−イル］インダゾール−４−カルボキシアミド（ＵＮＣ１９９９）、シネフンギン等が挙げられ、最も好ましくは、３−デアザネプラノシン（ＤｚＮｅｐ）が挙げられる。

本発明の培地にヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤が含まれる場合、その濃度は、好ましくは０．０００１〜１０μＭであり、より好ましくは０．００１〜１μＭであり、最も好ましくは０．００１〜０．１μＭである。

レチノイン酸受容体アゴニストとしては、例えば、４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）、４−［４−（２−ブトキシエトキシ−）−５−メチル−２−チアゾリル］−２−フルオロ安息香酸（ＡＣ２６１０６６）、アダパレン、４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、タミバロテン（ＡＭ８０）、４−［［（２，３−ジヒドロ−１，１，３，３−テトラメチル−２−オキソ−１Ｈ−インデン−５−イル）カルボニル］アミノ］安息香酸（ＢＭＳ７５３）、１−（４−ヘキサフェニル）−２−プロパン−１−オン、３−フルオロ−４−［［２−ヒドロキシ−２−（５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）アセチル］アミノ］−安息香酸（ＢＭＳ９６１）、４−（６−ヒドロキシ−７−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ−１−イル−２−ナフタレニル）安息香酸（ＣＤ１５３０）、５−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−アントラセニル）−３−チオフェンカルボン酸（ＣＤ２３１４）、６−［３−（１−アダマンチル）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ナフタレンカルボン酸（ＣＤ４３７）、（Ｅ）−４−［３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−オキソ−１−プロペニル］安息香酸（Ｃｈ５５）、イソトレチノイン、レチノイン酸、タザロテン等が挙げられ、最も好ましくは、４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）が挙げられる。

本発明の培地にレチノイン酸受容体アゴニストが含まれる場合、その濃度は、好ましくは０．００１ｐＭ〜１０ｎＭであり、より好ましくは０．０１ｐＭ〜１ｎＭであり、最も好ましくは０．０１ｐＭ〜０．１ｎＭである。

本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有する。

すなわち、本発明の培地には、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体のいずれかの化合物が１以上含まれ、例えばＲＯＣＫ阻害剤に含まれる化合物が１種または２種以上含まれていてもよく、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体の２種以上から選択された化合物が含まれていてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体の２種以上から選択された化合物が含まれる場合、それぞれの濃度は、上記で各化合物について定義した濃度であることが好ましい。

また、本発明の培地には、必要により、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン、脂質群、２−メルカプトエタノール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、核酸、非必須アミノ酸等を添加してもよい。さらに必要であれば、ｐＨ調整剤、緩衝剤成分、保湿剤、防腐剤または粘度調整剤等の任意成分を使用することもできる。

本発明の培地により培養される細胞が未分化状態を維持したまま増殖できる細胞であるか否かを確認する方法としては、例えば、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカー（タンパク質）の発現の検出および／または分化マーカー（タンパク質）の発現の不検出により判定する方法、各種未分化マーカー（遺伝子）の発現の検出および／または分化マーカー（遺伝子）の不検出により判定する方法、細胞の形態学的特徴を観察する方法、特定の分化誘導因子の刺激により特定の細胞に分化する能力を発揮できるか否かを判定する方法、マウスに移植してテラト―マを形成させ病理学的に組織形態を観察する方法、並びにＥＢ（胚様体）を形成させ自発的分化を誘導する方法が挙げられる。

マーカーを用いて判定する方法としては、例えば、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−２−５４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８０、ＣＤ９０またはアルカリホスファターゼ等の未分化マーカーが発現している場合は、本発明の培地で培養した幹細胞が未分化状態を維持していると判断することができる。

未分化マーカーおよび／または分化マーカーの発現をタンパク質レベルで確認する場合には、例えば、各マーカー（タンパク質）に対する特異的な抗体を用いて、フローサイトメトリー法、免疫染色法またはＥＬＩＳＡ等により確認することができる。

未分化マーカーおよび／または分化マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、例えば、各マーカー（遺伝子）の特異的プライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲまたは特異的プローブを用いたノーザンブロッティング、マイクロアレイ解析等によって確認することができる。

フローサイトメトリー法により未分化マーカーおよび／または分化マーカーの発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。

本発明の培地で培養した細胞を１ｍｌの１０％ヤギ血清中に３０分間懸濁後遠心分離し、次に対象のマーカー（タンパク質）に対するマウス抗体とともに３０時間インキュベートする。その後当該培養細胞を、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、１％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、再懸濁した細胞を適切なフローサイトメトリー用機器を用いて判定する。

免疫染色法により未分化マーカーおよび／分化マーカーの発現の有無を確認する方法としては、例えば、次の方法が挙げられる。
本発明の培地で培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、複数回ＰＢＳにて洗浄する。その後、１０％ヤギ血清またはウシ由来アルブミンでブロッキングを行った後、対象のマーカー（タンパク質）に対するマウス抗体を用いて免疫染色し、蛍光標識（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、蛍光顕微鏡観察およびイメージアナライザーにより判定する。なお、マーカー（タンパク質）が細胞質内にある場合には、トライトンＸ−１００等で培養細胞の透過性を増加させて、抗体を用いて免疫染色を行う。

アルカリホスファターゼの発現の有無を確認する方法としては、例えば、いわゆるアルカリホスファターゼ染色法が挙げられる。

本発明の培地で培養した細胞を、４．５ｍＭクエン酸、２．２５ｍＭクエン酸ナトリウム、３ｍＭ塩化ナトリウム、６５％メタノールおよび４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、洗浄し、次にＦａｓｔＲｅｄ基質キット（シグマ社製）等の適当なキットを用い、アルカリホスファターゼを可視化することにより確認することができる。

２．本発明の方法
本発明の方法は、本発明の培地で幹細胞を培養することにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま、分化能を有する幹細胞を効率よく増殖させることを特徴とする。

幹細胞が、未分化状態を維持したまま増殖できるか否かは、上述した、各種マーカー（タンパク質）に対する抗体を用いて、未分化マーカー（タンパク質）の発現の検出および／または分化マーカー（タンパク質）の発現の不検出により判定する方法等により確認することができる。

幹細胞の定義については上記１に記載の通りである。

本発明の培地により、幹細胞は、バッチ培養（Ｂａｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ−Ｂａｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ）または灌流培養（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）等により培養することができる。

培養に用いられる培養器は、特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バックまたはタンク等の培養槽などが挙げられる。これらの培養器の基材も、特に限定されず、例えば、ガラス、ポリプロピレンおよびポリスチレンなどの各種プラスチック、ステンレス等の金属並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

本発明の培地で幹細胞を培養する場合、本発明の方法は、接着培養または浮遊培養のいずれの培養にも用いることができる。

接着培養を行う場合、培養器の基材表面への幹細胞の接着を誘導するため、基材表面にコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、ラミニンの一部構造体、フィブロネクチンおよびこれら混合物（例えば、マトリゲル）並びに溶解細胞膜調製物（Lancet,2005,365,p1636-1641）等の足場をコーティングして培養することができる。

また、フィーダー細胞の存在下で培養してもよい。フィーダー細胞には、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞を用いることができる（例えば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1981,78,12,p.7634-7638、Nature,1981,292,5819,p.154-156、J. Virol.,1969,4,5,p.549-553、Science,1996,272,5262,p.722-724、J. Cell. Physiol.,1982,112,1,p.89-95、国際公開第０１／０８８１００号、国際公開第２００５／０８０５５４号参照）。

浮遊培養を行う場合、例えば、メチルセルロース等の高分子ポリマー（Stem Cell Reports,2014,2,5,734-745）、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ ｆａｔ ｇｌｏｂｕｌｅ−ＥＧＦ ｆａｃｔｏｒ ８）または該タンパク質の断片等を用いれば上記足場が不要になる。

幹細胞の培養密度は、細胞の生存および増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。培養密度は、例えば、通常１．０×１０^１〜１．０×１０^７細胞／ｍｌ、好ましくは１．０×１０^２〜１．０×１０^７細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０^３〜１．０×１０^７細胞／ｍｌ、さらに好ましくは３．０×１０^４〜１．０×１０^７細胞／ｍｌである。温度、溶存ＣＯ_２濃度、溶存酸素濃度およびｐＨ等の培養条件は、動物組織に由来する細胞の培養に従来用いられている技術に基づいて適宜設定できる。

例えば、通常３３〜４０℃、好ましくは３４〜３９℃、より好ましくは３６〜３７℃にて、通常１〜２０％、好ましくは３〜１５％、より好ましくは５〜１０％の二酸化炭素の存在下で、通常７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の高湿度下で行なうことが好ましい。

本発明の方法によると、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である培地で幹細胞の生存と増殖を促進することができる。よって、本発明の方法は、特に分散および分散後の浮遊培養等のストレスに弱いことが知られている幹細胞を効率的に培養するために利用できる。

３．本発明の増殖促進剤
本発明の増殖促進剤は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含む。

本発明の増殖促進剤を含む培地を用いて、幹細胞を培養することにより、増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度であっても幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。

本発明の増殖促進剤は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストの他に、更に、例えば、生理的な等張液［生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖またはその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールおよび塩化ナトリウム等）を含む等張液等］、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミンおよびポリエチレングリコール等）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤および上述の添加物等を含んでいてもよい。

本発明の増殖促進剤に含まれるＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物の含有量は、例えば、本発明の増殖促進剤を培地に添加する場合において、該培地中の各化合物の濃度が、幹細胞の増殖を促進するのに十分な濃度、すなわち上記１に記載の濃度で含まれるように構成されていることが好ましい。

本発明の増殖促進剤は、等張な水溶液または粉末等の状態で、培地に添加されること等の方法で用いられることが好ましい。

４．本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物の製造方法
本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物の製造方法は、本発明の幹細胞を含む細胞組成物の製造方法、または本発明の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法である。

本発明の幹細胞を含む細胞組成物の製造方法は、本発明の培地で幹細胞を培養する工程を含み、必要に応じて幹細胞を継代する工程を含む。

また、本発明の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法は、本発明の培地で幹細胞を培養する工程と幹細胞の分化を誘導する工程を含み、必要に応じて細胞を継代する工程を含む。

幹細胞の継代や分化誘導は、従来公知の手法によって行えばよい。分化誘導剤としては、例えば、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、Ｎｏｄａｌ阻害剤、レチノイン酸等が挙げられる。分化誘導は、例えば、軟骨細胞の分化誘導プロセスでは、分化誘導培地（９０％αＭＥＭ培地、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１μＭのデキサメタゾン）中で、幹細胞を培養することによって行うことができる。

本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物の製造方法では、ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物存在下で幹細胞を培養する工程によって幹細胞の生存と増殖を促進することができるので、幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物を効率的に製造できる。

５．本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物
本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物は、本発明の幹細胞を含む細胞組成物、または本発明の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物である。

本発明の幹細胞を含む細胞組成物は、上記４の方法で製造される、幹細胞を含む細胞組成物である。

本発明の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物は、上記４の方法で製造される、幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物である。

本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物は、さらなる幹細胞の培養のためまたは再生医療用の細胞ソースのために利用され得る。

本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物は、例えば、分注された後に凍結保存、輸送され、その後解凍されることにより、再び幹細胞またはその分化細胞の継代に用いられ得る。

凍結保存される場合、本発明の幹細胞またはその分化細胞を含む細胞組成物は、血清あるいはその代替物、またはＤＭＳＯ等の有機溶剤をさらに含んでいてもよい。

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

［実施例１］
幹細胞を培地中で増殖させるためには、通常は増殖因子を含む培地を用いる必要があるが、増殖因子を含まない培地に各種の化合物を添加した培地を用い、幹細胞が増殖し得るか否かを確認した。

公知の培地（ｍＥＳＦ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、和光純薬社製）に、０．２２μｍフィルターを通過して滅菌した、下記表１に示す別添成分、１０μｇ／ｍＬインスリン（シグマ−アルドリッチ社製）、５μｇ／ｍＬアポ−トランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社製）およびオレイン酸結合組換えヒト血清アルブミン（シグマ−アルドリッチ社製）を添加して、溶解させたものを陰性対象区の培地として用いた。

ここで、オレイン酸結合組換えヒト血清アルブミンは５０ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ 組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ、シグマ−アルドリッチ社製）に２３５μＬの２００ｍｇ／ｍＬのオレイン酸（シグマ−アルドリッチ社製）を添加し、混合することにより調製した。

陰性対象区の培地に、ＲＯＣＫ阻害剤およびＰＫＣ阻害剤である５μＭのＨＡ１００、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である０．０５μＭのＤＺＮｅｐ、またはレチノイン酸受容体アゴニストである０．０１ｎＭのＴＴＮＰＢを加えたものを評価対象区の培地とした。
また、陰性対照区の培地に２ｎｇ/ｍＬのアクチビンＡ（和光純薬社製）および５ｎｇ/ｍＬのｂＦＧＦ（和光純薬社製）を添加したものを陽性対象区の培地とした。

作成した陰性対象区の培地、評価対象区の培地（陰性対象区の培地にＨＡ１００を加えた培地、陰性対象区の培地にＤＺＮｅｐを加えた培地、および陰性対象区の培地にＴＴＮＰＢを加えた培地）、および陽性対象区の培地を、細胞培養用２４穴プレート（住友ベークライト社製）に１ｍＬずつ加え、ヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所樹立、ｉＰＳアカデミアジャパンより入手）を、１０％のＣＯ_２存在下、３７℃にて３日間培養した。培養した細胞について、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（同仁化学研究所製）で核を染色した。また、細胞中のＯＣＴ３／４タンパク質を、ＯＣＴ−３／４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ−１０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）およびＣｈｉｃｋｉｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）で染色した。その後、Ｉｎ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて染色された核の数とＯｃｔ３／４陽性細胞数をカウントした。４回の独立した実験結果の平均値を図１に示す。

増殖因子を添加しない培地を用いるとヒトｉＰＳ細胞は播種時と比較してほとんど増殖しなかったが、図１に示すように、ＨＡ１００を添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＨＡ１００）、ＤＺＮｅｐを添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＤＺＮｅｐ）、ＴＴＮＰＢを添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＴＴＮＰＢ）では、増殖因子を添加しない培地を用いた場合（−ＧＦ）と比べてカウントされた核の数が、それぞれ１．８３倍、１．３５倍、１．２４倍となっており、細胞が増殖することが示された。特に、ＨＡ１００を添加した培地では、増殖因子を添加した培地を用いた場合（＋ＧＦ）と同等程度の増殖を示した。
また、これらの培地で培養したｉＰＳ細胞の未分化マーカーであるＯＣＴ３／４の発現率は、ＨＡ１００を添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＨＡ１００）では８９．３％、ＤＺＮｅｐを添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＤＺＮｅｐ）では９５．６％、ＴＴＮＰＢを添加した培地を用いた場合（−ＧＦ＋ＴＴＮＰＢ）では８４．２％であり、増殖因子を添加した培地を用いた場合（＋ＧＦ、８８．１％）と同等以上であった。ここで、発現率は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で核が染色された細胞のうち、Ｏｃｔ３／４陽性細胞の割合を表わす。

この結果より、本発明の幹細胞培養用培地によれば、未分化状態を維持しつつ、幹細胞を効率よく培養することができることがわかった。

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年９月８日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６−１７５９４１号）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (20)

1. ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤、ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含有し、かつ増殖因子を含まない、または増殖因子の濃度が低濃度である幹細胞培養用培地。
2. 増殖因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子である、請求項１に記載の幹細胞培養用培地。
3. 塩基性繊維芽細胞増殖因子の濃度が２ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項２に記載の幹細胞培養用培地。
4. 塩基性繊維芽細胞増殖因子を含まない、請求項２に記載の幹細胞培養用培地。
5. 増殖因子がアクチビンである、請求項１に記載の幹細胞培養用培地。
6. アクチビンの濃度が３ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項５に記載の幹細胞培養用培地。
7. アクチビンを含まない、請求項５に記載の幹細胞培養用培地。
8. 幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の幹細胞培養用培地。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養することにより、幹細胞の未分化状態を維持しながら、分化能を有する幹細胞を増殖させることを特徴とする、幹細胞の培養方法。
10. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項９に記載の幹細胞の培養方法。
11. ＲＯＣＫ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびレチノイン酸受容体アゴニストからなる群より選択される少なくとも１以上の化合物を含む、幹細胞の増殖促進剤。
12. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１１に記載の幹細胞の増殖促進剤。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養する工程を含む、幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
14. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１３に記載の幹細胞を含む細胞組成物の製造方法。
15. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の幹細胞培養用培地で幹細胞を培養する工程と、幹細胞の分化を誘導する工程とを含む、幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
16. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１５に記載の幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物の製造方法。
17. 請求項1３又は１４に記載の製造方法によって製造される、幹細胞を含む細胞組成物。
18. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１７に記載の細胞組成物。
19. 請求項１５又は１６に記載の製造方法によって製造される、幹細胞から誘導された分化細胞を含む細胞組成物。
20. 前記幹細胞が多能性幹細胞または間葉系幹細胞である請求項１９に記載の細胞組成物。

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