CN114015654A - 双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建与应用。本发明首先通过药物浓度递增系统建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，并以其为母细胞，通过荧光蛋白重组质粒、慢病毒共感染细胞步骤，得到可稳定表达红色和绿色荧光的耐药人肝癌细胞系。使用本发明提供的耐药株建立、重组质粒和双荧光标记方法，可在同一个耐药肝癌细胞中共表达两种荧光。本发明的耐药人肝癌细胞可用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究等，有着广阔的应用前景。

Description

双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用。
背景技术
众所周知，肝癌是异质性最强的实体肿瘤之一，不同致病机制加上异常复杂的时空异质性，致其治疗难度陡增；而且，随着时间的推移，尤其是在各种药物治疗背景下，肿瘤细胞多向演进，最终形成耐药。如何有效逆转耐药是目前肝癌乃至整个肿瘤治疗领域的热点，亦是肝癌患者获得长久有效持续应答的关键所在。目前，聚焦于推动肿瘤异质性转化研究面临巨大挑战，主要是因为研究人员难以理清肿瘤演进的思路，进而影响到设计和选择有效的治疗方案以应对出现的肿瘤耐药性。这不同于以往的任何耐药治疗理念，尤其具有独特性和新颖性，为进一步探究赋予肝癌细胞异质性的研究提供了一个良好的可控平台，这无疑将增强肿瘤学研究人员对肝癌细胞耐药行为的认知，也将为新型耐药逆转策略的制定提供理论依据。传统的肿瘤细胞荧光表达系统通常使用报告基因作为内参来减少实验的不可控因素；然而例如氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、葡萄醛酸糖苷酶等传统的共报告基因因各自的测试处理要求、检测特点存在差异往往不够便利；近年使用较多的萤火虫荧光素酶虽然避免了上述缺点，但是由于荧光素酶底物价格昂贵，需使用特殊仪器检测荧光素酶表达等因素限制了其使用范围。在医学研究领域引用的绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白由于具有荧光性质稳定、分子量小、对手提细胞基本无毒性、可行活细胞实时定位观察等优点，目前已被广泛用于肿瘤发生、生物学行为、血管生成、组织重构及治疗等肿瘤研究中。然而，在实际工作中，由于成像技术、光谱分析及电脑分析软件等配套设备与技术的限制，尚不能完全满足对单荧光示踪功能解读的需求。
发明内容
为了使双荧光组合在肿瘤与宿主的动态显像、肿瘤细胞演进以及耐药形成方面发挥更大的关键作用，本发明提供一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用，即提供一种稳定表达mCherry与eGFP双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株及相应的构建方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法：
以人肝癌细胞MHCC97H为母细胞，利用奥沙利铂干预人肝癌细胞MHCC97H，奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，使用CCK8法测定干预后细胞对于奥沙利铂IC50的变化，在干预后细胞获得了对奥沙利铂的稳定耐药性后，即为奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，每个干预周期为96小时，随后，奥沙利铂的干预浓度上升至5μM，重复上述的步骤，直至奥沙利铂的浓度至40μM。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，具体包括以下步骤：
(1)人肝癌细胞株的前处理：利用含EDTA的胰蛋白酶消化人肝癌细胞MHCC97H，收集传代后使用PBS冲洗；
(2)建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株：利用不同浓度梯度的奥沙利铂干预步骤(1)得到的人肝癌细胞株，获得奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化MHCC97H细胞，然后进行收集，按照1:4的比例传代，接种于细胞培养瓶中，24小时后，吸去原有的培养基；使用消毒后的PBS轻柔的冲洗，吸去PBS。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中利用不同浓度梯度的奥沙利铂干预人肝癌细胞株，获得奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的方法为：
处理后的人肝癌细胞MHCC97H中，加入含有10％FBS和2μM奥沙利铂的DMEM，48小时后，弃去原培养基遂终止药物处理，使细胞恢复并生长至细胞培养瓶的80％时继续传代，然后再暴露于2μM奥沙利铂48小时，这是一个处理的周期；随后，奥沙利铂的干预浓度，上升至5μM，重复上述的步骤，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM；在细胞获得了对奥铂的稳定耐药性后，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。然后将MHCC97H-OXR保持在含有5μM奥沙利铂溶液中继续培养。
本发明中所使用的母细胞为人肝癌细胞MHCC97H。该人肝癌细胞MHCC97H是一个已知的细胞，在以下文献中都有公开：
1、Establishment of cell clones with different metastatic potentialfrom the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97(World JGastroenterol2001；7(5):630-636)；
2、New human hepatocellular carcinoma(HCC)cell line with highlymetastatic potential(MHCC97)and its expressions of the factors associatedwith metastasis(British Journal of Cancer(1999)81(5),814–821)。
该人肝癌细胞MHCC97H一直保藏于复旦大学附属中山医院的肝研所实验室中。
本发明奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，操作手段明确，本领域技术人员根据上述记载方法能够获得MHCC97H-OXR细胞。
本发明还提供基于上述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXR细胞。
本发明还提供基于上述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的应用，所述奥沙利铂耐药人肝癌细胞株可用于构建得到可稳定表达红色和绿色荧光的耐药人肝癌细胞系。
本发明还提供一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，包括以下步骤：
A、荧光蛋白慢病毒的构建：利用HIV骨架慢病毒表达系统，构建红色荧光蛋白(mCherry)与绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒；
B、目标细胞的感染：将步骤A中获得的红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染奥沙利铂耐药人肝癌细胞株(即MHCC97H-OXR细胞)；
C、双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选：利用嘌呤毒素对感染后的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株进行筛选，然后通过荧光显微镜标记、挑选双荧光蛋白表达的细胞克隆；
D、双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得：按常规方法将步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞扩增建系，获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即为MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述红色荧光蛋白(mCherry)的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述绿色荧光蛋白(eGFP)的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述HIV骨架慢病毒表达系统为GeneCopoeia提供的HIV骨架慢病毒表达系统。所述慢病毒表达质粒为OmicsLinkTM慢病毒表达质粒，即将外源红色荧光蛋白(mCherry)和绿色荧光蛋白(eGFP)基因插入至pEZ-Lv105载体中。所述HIV慢病毒包装试剂盒为GeneCopoeia Lenti-PacTMHIV慢病毒包装试剂盒。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，构建红色荧光蛋白(mCherry)与绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染后，使重组慢病毒质粒于293Ta包装细胞中增殖、被包装成为具有感染活性的慢病毒颗粒、并分泌进入细胞培养液，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述纯化手段包括利用低蛋白结合的PES滤膜过滤慢病毒颗粒。例如以0.45μm低蛋白结合的PES滤膜过滤处理粗病毒液，可获得纯化病毒液。
在本发明的一个实施方式中，步骤B中，红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染比例为1:1。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选方法具体为：
慢病毒感染后第3天，细胞培养基中加入嘌呤霉素进行筛选，每3-4天更换一次，直至具抗药性的细胞克隆变得肉眼可见，在荧光显微镜下，标记绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白双荧光细胞克隆，小心挑出培养于96孔板，并进行编号。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，荧光显微镜观察条件为红色荧光蛋白的激发波长为587nm、发射波长为610nm；绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为507nm。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，所述嘌呤毒素的浓度为10μg/mL。
在本发明的一个实施方式中，步骤D中，双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得方法具体为：
待步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞长满后，依次移至24孔板、6孔板、10cm培养皿继续培养，获得双荧光稳定表达的耐药细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP；经体外连续传代培养，该耐药株荧光表达强度并无明显衰减，且不改变原有肝癌细胞生物学功能及耐药等特性。
本发明双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP的获得方法，操作手段明确，本领域技术人员基于MHCC97H-OXR细胞，根据上述记载方法，能够获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
本发明还提供基于上述方法得到的双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXRmCherry/eGFP，为高强度、染色体整合型、同时稳定表达红色与绿色荧光的耐药肝癌细胞株。
本发明还提供基于上述方法得到的双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的应用，所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株用于制备肿瘤荧光示踪剂的应用。可应用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究。
本发明提供了一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株以及稳定表达双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP，该稳定表达双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP巧妙地整合了奥沙利铂耐药与双荧光共表达系统，提高了耐药肝癌细胞的适用场景，突破了在实际工作中成像技术、光谱分析及电脑分析软件等配套设备与技术的限制。同时，该细胞株还保留了MHCC97H的高转移特性，便于实时监控细胞的动态转移过程及效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
(1)所采用的红色荧光及绿色荧光蛋白编码基因是经过基因改造，可有效延缓荧光淬灭的时间，增加荧光的表达强度；由于双荧光报告重组质粒载体使用了荧光蛋白作为报告基因，可以直接在荧光显微镜下进行观察。与荧光素酶报告系统相比，不需要加入底物参与反应，同时不需要其它定制的仪器来检测荧光素酶的表达，因而该重组质粒检测系统降低了对该类实验的仪器要求以及实验成本。
(2)所采用的HIV慢病毒感染新策略，对各个细胞周期耐药肝癌细胞均具有良好的感染能力，是广谱的、外源基因染色体整合型的、稳定表达的病毒感染系统；同时，经过单克隆筛选后的双荧光肝癌细胞，避免了多克隆异质性的潜在缺点，大大提高了实验的重现性及稳定性；
(3)将双荧光与采用浓度递增间隙诱导法法建立的奥沙利铂耐药株结合起来建立的MHCC97H-OXRmCherry/eGFP细胞具有染色体整合度高、遗传性状稳定、持续共表达高强度红色荧光及绿色荧光，且荧光强度不随细胞传代而减弱等特性；同时，双荧光基因的整合及表达不影响肝癌细胞的主要生物学行为，为理想的、荧光示踪的肝癌细胞耐药模型。
(4)由于双荧光报告重组质粒载体中，编码的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因均在相应转录响应原件启动子的控制下表达，本领域技术人员可基于实际情况，根据上述的方法，制备能在同一肝癌细胞中独立表达目的基因的蛋白产物避免了由于转染效率不同而引起的误差。
(5)最为突出的优势在于当实际工作中，由于成像技术、光谱分析及电脑分析软件等配套设备与技术的限制，不能完全满足对单荧光示踪功能解读的需求时，本发明所提供的双荧光组合将大大提升示踪肿瘤细胞的适用范围、辨识度及准确度。
本发明提供的双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株可用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究等，尤其为肿瘤与宿主的动态显像、肿瘤细胞演进以及耐药形成方面提供了一个坚实的工具细胞；在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。
附图说明
图1为耐药株建立过程中奥沙利铂耐药肝癌细胞MHCC97H-OXR的IC50变化图。
图2为慢病毒包装质粒的结构示意图。
图3为MHCC97H-OXRmCherry/eGFP耐药肝癌细胞克隆红色和绿色荧光表达情况示意图。
具体实施方式
本发明首先提供一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法：
以人肝癌细胞MHCC97H为母细胞，利用奥沙利铂干预人肝癌细胞MHCC97H，奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，使用CCK8法测定干预后细胞对于奥沙利铂IC50的变化，在干预后细胞获得了对奥沙利铂的稳定耐药性后，即为奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，每个干预周期为96小时，随后，奥沙利铂的干预浓度上升至5μM，重复上述的步骤，直至奥沙利铂的浓度至40μM。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM。
在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，具体包括以下步骤：
(1)人肝癌细胞株的前处理：利用含EDTA的胰蛋白酶消化人肝癌细胞MHCC97H，收集传代后使用PBS冲洗；
(2)建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株：利用不同浓度梯度的奥沙利铂干预步骤(1)得到的人肝癌细胞株，获得奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化MHCC97H细胞，然后进行收集，按照1:4的比例传代，接种于细胞培养瓶中，24小时后，吸去原有的培养基；使用消毒后的PBS轻柔的冲洗，吸去PBS。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中利用不同浓度梯度的奥沙利铂干预人肝癌细胞株，获得奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的方法为：
处理后的人肝癌细胞MHCC97H中，加入含有10％FBS和2μM奥沙利铂的DMEM，48小时后，弃去原培养基遂终止药物处理，使细胞恢复并生长至细胞培养瓶的80％时继续传代，然后再暴露于2μM奥沙利铂48小时，这是一个处理的周期；随后，奥沙利铂的干预浓度，上升至5μM，重复上述的步骤，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM；在细胞获得了对奥铂的稳定耐药性后，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。然后将MHCC97H-OXR保持在含有5μM奥沙利铂溶液中继续培养。
本发明中所使用的母细胞为人肝癌细胞MHCC97H。该人肝癌细胞MHCC97H是一个已知的细胞，在以下文献中都有公开：
1、Establishment of cell clones with different metastatic potentialfrom the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97(World JGastroenterol 2001；7(5):630-636)；
2、New human hepatocellular carcinoma(HCC)cell line with highlymetastatic potential(MHCC97)and its expressions of the factors associatedwith metastasis(British Journal of Cancer(1999)81(5),814–821)。
该人肝癌细胞MHCC97H一直保藏于复旦大学附属中山医院的肝研所实验室中。
本发明奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，操作手段明确，本领域技术人员根据上述记载方法能够获得MHCC97H-OXR细胞。
本发明还提供基于上述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXR细胞。
本发明还提供基于上述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的应用，所述奥沙利铂耐药人肝癌细胞株可用于构建得到可稳定表达红色和绿色荧光的耐药人肝癌细胞系。
本发明还提供一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，包括以下步骤：
A、荧光蛋白慢病毒的构建：利用HIV骨架慢病毒表达系统，构建红色荧光蛋白(mCherry)与绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒；
B、目标细胞的感染：将步骤A中获得的红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染奥沙利铂耐药人肝癌细胞株(即MHCC97H-OXR细胞)；
C、双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选：利用嘌呤毒素对感染后的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株进行筛选，然后通过荧光显微镜标记、挑选双荧光蛋白表达的细胞克隆；
D、双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得：按常规方法将步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞扩增建系，获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即为MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述红色荧光蛋白(mCherry)的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述绿色荧光蛋白(eGFP)的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述HIV骨架慢病毒表达系统为GeneCopoeia提供的HIV骨架慢病毒表达系统。所述慢病毒表达质粒为OmicsLinkTM慢病毒表达质粒，即将外源红色荧光蛋白(mCherry)和绿色荧光蛋白(eGFP)基因插入至pEZ-Lv105载体中。所述HIV慢病毒包装试剂盒为GeneCopoeia Lenti-PacTMHIV慢病毒包装试剂盒。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，构建红色荧光蛋白(mCherry)与绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染后，使重组慢病毒质粒于293Ta包装细胞中增殖、被包装成为具有感染活性的慢病毒颗粒、并分泌进入细胞培养液，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒。
在本发明的一个实施方式中，步骤A中，所述纯化手段包括利用低蛋白结合的PES滤膜过滤慢病毒颗粒。例如以0.45μm低蛋白结合的PES滤膜过滤处理粗病毒液，可获得纯化病毒液。
在本发明的一个实施方式中，步骤B中，红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染比例为1:1。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选方法具体为：
慢病毒感染后第3天，细胞培养基中加入嘌呤霉素进行筛选，每3-4天更换一次，直至具抗药性的细胞克隆变得肉眼可见，在荧光显微镜下，标记绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白双荧光细胞克隆，小心挑出培养于96孔板，并进行编号。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，荧光显微镜观察条件为红色荧光蛋白的激发波长为587nm、发射波长为610nm；绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为507nm。
在本发明的一个实施方式中，步骤C中，所述嘌呤毒素的浓度为10μg/mL。
在本发明的一个实施方式中，步骤D中，双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得方法具体为：
待步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞长满后，依次移至24孔板、6孔板、10cm培养皿继续培养，获得双荧光稳定表达的耐药细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP；经体外连续传代培养，该耐药株荧光表达强度并无明显衰减，且不改变原有肝癌细胞生物学功能及耐药等特性。
本发明双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP的获得方法，操作手段明确，本领域技术人员基于MHCC97H-OXR细胞，根据上述记载方法，能够获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
本发明还提供基于上述方法得到的双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。
所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，即MHCC97H-OXRmCherry/eGFP，为高强度、染色体整合型、同时稳定表达红色与绿色荧光的耐药肝癌细胞株。
本发明还提供基于上述方法得到的双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的应用，所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株用于制备肿瘤荧光示踪剂的应用。可应用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究。
本发明提供了一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株以及稳定表达双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP，该稳定表达双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP巧妙地整合了奥沙利铂耐药与双荧光共表达系统，提高了耐药肝癌细胞的适用场景，突破了在实际工作中成像技术、光谱分析及电脑分析软件等配套设备与技术的限制。同时，该细胞株还保留了MHCC97H的高转移特性，便于实时监控细胞的动态转移过程及效率。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种肝癌细胞奥沙利铂耐药株的构建方法。
(1)奥沙利铂药物的配置
奥沙利铂粉剂根据说明书，使用5％葡萄糖溶液稀释，并使用0.45μm细菌过滤器过滤。奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，故首先使用5％葡萄糖溶液稀释至10μM，再使用DMEM培养基稀释至2μM的工作浓度。根据实验要求，逐渐提高药物的浓度。在开始试验操作前2hr配置该溶液，实验操作完毕后，弃去剩余奥沙利铂溶液。
(2)药物干预
用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化MHCC97H细胞，然后进行收集，按照1:4的比例传代，接种于细胞培养瓶中。24小时后，吸去原有的培养基；使用消毒后的PBS轻柔的冲洗，吸去PBS；加入含有10％FBS和2μM奥沙利铂的DMEM。48小时后，弃去原培养基遂终止药物处理。使细胞恢复并生长至细胞培养瓶的80％时继续传代，然后再暴露于2μM奥沙利铂48小时。这是一个处理的周期。随后，奥沙利铂的干预浓度，上升至5μM，重复上述的步骤，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM(浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM)。在细胞获得了对奥铂的稳定耐药性后，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。然后将MHCC97H-OXR保持在含有5μM奥沙利铂溶液中继续培养。
(3)MHCC97H细胞IC50的测定
持续暴露于奥沙利铂中的MHCC97H细胞，在培养9个周期后，使用CCK8法测定其对于奥沙利铂的IC50的变化；结果显示，与MHCC97H细胞相比，奥沙利铂处理9个周期后，MHCC97H对于奥沙利铂的IC50明显增高，分别为30.46±7.06μM与88.62±8.87μM。该结果表明，MHCC97H细胞对奥沙利铂耐药，命名为MHCC97H-OXR细胞。
结果如图1所示。
实施例2
本实施例提供一种慢病毒感染目标细胞的方法。
(1)荧光蛋白慢病毒的构建
如图2所示，采用GeneCopoeia公司提供的HIV骨架慢病毒表达系统，分别构建红色荧光蛋白(mCherry)或绿色荧光蛋白(eGFP)基因的OmicsLinkTM慢病毒表达质粒，由RSV启动子驱动；
进行转染的两天前铺板培养293Ta包装细胞于10cm培养皿，加入10ml含10％FBS的DMEM培养基；当细胞融合度达80％时，利用Lenti-PacTMHIV慢病毒包装试剂盒(GeneCopoeia)，制备DNA-EndoFectin转染复合物，转染包装细胞；转染操作的12小时后，去除含有转染复合物的旧培养液，添加新鲜的、含2-5％FBS、青霉素和链霉素的DMEM培养液；
转染操作的48小时后收集细胞培养液，以500×g离心10分钟去除细胞碎片，即可获得慢病毒的粗病毒液。使用纯化手段(例如以0.45μm低蛋白结合的PES滤膜过滤)处理粗病毒液，获得纯化病毒液。
(2)目标细胞的感染
铺板MHCC97H-OXR细胞：在进行慢病毒感染前24小时，在24孔板上铺板培养目的细胞，每孔细胞数5x104个，添加0.5ml DMEM培养基(添加10％FBS、青霉素-链霉素双抗溶液)，在5％CO2条件下，37℃培养过夜；
慢病毒感染：制作慢病毒和全培养基的混合液(添加Polybrene终浓度为8μg/mL)，eGFP和mCherry慢病毒滴度按照1:1比例共感染细胞，每细胞孔的慢病毒混合液用量为0.5mL。去除旧培养基，加入预制慢病毒混合液0.5ml感染目的细胞。于5％CO2条件下，37℃培养细胞平板过夜。
(3)双荧光耐药株的筛选
慢病毒感染后第3天，细胞培养基中加入嘌呤霉素(10μg/mL)进行筛选，每3天更换一次，直至具抗药性的细胞克隆变得肉眼可见。如图3所示，在荧光显微镜下，标记eGFP和mCherry双荧光细胞克隆，小心挑出培养于96孔板，并进行编号；待细胞长满后，依次移至24孔板、6孔板、10cm培养皿继续培养，获得双荧光稳定表达的耐药细胞株MHCC97H-OXRmCherry/eGFP。经体外连续传代培养，该耐药株荧光表达强度并无明显衰减，且不改变原有肝癌细胞生物学功能及耐药等特性。
综上所述，使用本发明提供的方法，可在同一奥沙利铂耐药肝癌细胞中进行双荧光的同时标记；本发明提供的双荧光耐药人肝癌细胞可用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究等，尤其为肿瘤与宿主的动态显像、肿瘤细胞演进以及耐药形成方面提供了一个坚实的工具细胞；在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。
在本发明的双荧光标记的细胞中使用的是eGFP和mCherry以达到在同一个细胞中表达双荧光蛋白，但对于本领域的技术人员而言，利用其他荧光表达双标肝癌细胞达到相同的效果，这是显而易见的，因此，也是本发明需要保护的内容。而且，在本发明涉及的eGFP和mCherry重组质粒中，没有加入其他表达序列，但对于本领域的技术人员而言，加入其他表达序列可以对肝癌细胞进行分子表达及双标，本发明揭示了共转染方法也是需要保护的内容。此外，本发明涉及的双荧光奥沙利铂耐药肝癌细胞构建方法，对本领域的技术人员而言，利用eGFP和mCherry荧光慢病毒对其他耐药肝癌细胞进行共感染，以达到非奥沙利铂耐药肝癌细胞的双荧光标记是显而易见的，因此也是本发明需要保护的内容之一。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgagaat tcggtaccat ggtgagcaag ggcgaggagg ataacatggc catcatcaag 60
gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc 120
gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc 180
aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc ctcagttcat gtacggctcc 240
aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact tgaagctgtc cttccccgag 300
ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag 360
gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc 420
ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc ctccgagcgg 480
atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc agaggctgaa gctgaaggac 540
ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagctg 600
cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct cccacaacga ggactacacc 660
atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca ccggcggcat ggacgagctg 720
tacaagtagt aggctcgagt gcggccgc 748
<210> 2
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaattcgg taccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc 60
tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg 120
gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg 180
tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 240
ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg 300
agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg 360
agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca 420
acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg 480
acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 540
gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc 600
tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 660
gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg 720
agctgtacaa gtagctcgag tgcggccgc 749

Claims (10)

1.一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，其特征在于，以人肝癌细胞MHCC97H为母细胞，利用奥沙利铂干预人肝癌细胞MHCC97H，奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，使用CCK8法测定干预后细胞对于奥沙利铂IC50的变化，在干预后细胞获得了对奥沙利铂的稳定耐药性后，即为奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，其特征在于，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，每个干预周期为96小时，使用浓度梯度法，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM，直至奥沙利铂的浓度至40μM。
3.采用权利要求1-2中任一项所述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。
4.一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、荧光蛋白慢病毒的构建：利用HIV骨架慢病毒表达系统，构建红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒；
B、目标细胞的感染：将步骤A中获得的红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染权利要求3所述奥沙利铂耐药人肝癌细胞株；
C、双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选：利用嘌呤毒素对感染后的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株进行筛选，然后通过荧光显微镜标记、挑选双荧光蛋白表达的细胞克隆；
D、双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得：将步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞扩增建系，获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株。
5.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述红色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤A中，构建红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染后，使重组慢病毒质粒于293Ta包装细胞中增殖、被包装成为具有感染活性的慢病毒颗粒、并分泌进入细胞培养液，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒。
7.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染比例为1:1。
8.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤C中，荧光显微镜观察条件为红色荧光蛋白的激发波长为587nm、发射波长为610nm；绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为507nm。
9.一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，其特征在于，采用权利要求5-8任一所述方法构建得到。
10.一种如权利要求9所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的应用，其特征在于，所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株用于制备肿瘤荧光示踪剂的应用。
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