CN102399748A - 表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学研究领域，具体涉及将绿色荧光蛋白及萤火虫萤光素酶导入细胞，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，其特征是：以人胃癌细胞系为母细胞，采用慢病毒感染的方法，将绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶（Fireflyluciferase,LUC）基因带入细胞，得到稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的细胞株；将所述的细胞株通过皮下，尾静脉及原位注射的方式建立不同的胃癌动物模型。它提供了人胃癌双标细胞株的建立及应用，它通过慢病毒基因感染的方法，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，用于在胃癌临床前研究中的应用。

Description

表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用

技术领域

本发明涉及生物医学研究领域，具体涉及将绿色荧光蛋白及萤火虫萤光素酶导入细胞，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，用于胃癌基础及临床前研究。

背景技术

根据世界卫生组织2008年统计，胃癌是仅次于肺癌的常见恶性肿瘤。而我国是胃癌的高发区，据统计，每年胃癌新发高达40余万人，死亡人数近30万，为世界首位。在卫生部1990~1992年的全国第二次死因调查中，胃癌约占到所有癌症死亡人数的四分之一。胃癌已日益成为影响人们健康的重大疾病，同时也为社会带来了严重的经济复负担。近年来，随着各国政府对胃癌的重视，胃癌的治疗和基础研究得到了很大的发展，新兴药品和治疗手段不断涌现，但各种治疗效果均有限，胃癌的死亡率和复发率仍依旧很高。因此，深入研究胃癌发生发展的机制，为胃癌治疗开辟新手段，为胃癌诊断创造新思路，具有重大的现实意义。而胃癌的研究必须基于可靠、优良的生物研究平台和方式，然而，目前国内外缺乏一种有效可靠的体外、体内胃癌研究平台，严重制约了胃癌的基础及临床前研究。

慢病毒感染较其他转染方式有较强的优势，具有感染谱广、效率高，可感染非分裂细胞、并可使目的基因整合至基因组因而能够长期表达、免疫反应小等特点，是一种高效的基因转移工具。

绿色荧光蛋白作为一种常见的报告基因已广泛用于生命科学研究领域，它相比于其他标记物有其独特的优点：① 荧光稳定。绿色荧光蛋白对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；绿色荧光蛋白在pH7～12范围内也能正常发光，且对高温（70℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶（链霉蛋白酶Pronase除外）都有较强抗性。②检测方便，简单直观。用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织。③对受体细胞基本无毒害。④不需任何反应底物和辅助因子。⑤可制成永久标本。可耐受福尔马林的固定，因而可制成长期保存的标本。但是绿色荧光蛋白也有其缺陷：① 需要激发光。在激发绿色荧光蛋白产生荧光的过程中，生物体内很多物质也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。②绿色荧光蛋白发射波长局限于510nm左右，当发光部位深藏于组织中时，由于组织的吸收，绿色荧光很难透过组织。

基于萤火虫荧光素酶的生物发光是近些年出现的成像方法，有别于其他光学成像方法，其特点在于①不需要激发光。因为生物发光采用的是底物发光的形式，因此不需要激发光。②高灵敏度，虽然生物发光强度弱于荧光，但是由于不需要激发光，组织自发荧光少，因而信噪比高，灵敏度高。③穿透力强。由于萤火虫荧光素酶发出的光在540~600nm，组织吸收少，因此对有深部组织成像具有较高的优势。④良好的相关性。光的强度与标记细胞的数目线性相关。其缺点在于，检测不方便，需要底物；并且由于空间分辨率低及检测方式点的限制，因而无法观察细胞的形态。

因此，通过慢病毒转染的方式将绿色荧光蛋白和荧光素酶基因导入胃癌细胞，便可充分利用荧光和生物发光在成像上的优势，因而方便胃癌的基础和临床前研究。

发明内容

本发明的目的是提供人胃癌双标细胞株的建立及应用，它通过慢病毒基因感染的方法，建立表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株及在癌模型应用，用于在胃癌临床前研究中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：以人胃癌细胞系为母细胞，采用慢病毒感染的方法，将绿色荧光蛋白（GFP） 和萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, LUC）带入细胞，得到稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的细胞株。

将所述的细胞株通过皮下，尾静脉及原位注射的方式建立不同的胃癌动物模型。

所述的慢病毒感染的方法是将外源基因导入，它的步骤是：

a) 大肠杆菌扩增慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg，pCMV-dR8.91，并酶切鉴定，纯化；

b) 用上述纯化获得的质粒按照一定比例，用脂质体法共转染入293T细胞，以分别产生含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清；

c) 以胃癌SGC7901为母细胞（亦可以其他胃癌细胞株为母细胞），用上述病毒顺次感染；

d) 扩增建系，并通过流式细胞分选技术及嘌呤霉素药物加压筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆。

所述的绿色荧光蛋白GFP及萤火虫荧光素酶 Firefly luciferase的测手段均为光学信号检测方法，其中包括：

a)体外检测手段 GFP检测条件为荧光倒置显微镜，激发光波长为488±30 nm, 发射波长为509±30 nm；萤火虫荧光素酶检测手段为化学发光检测手段，施加D-luciferin后，分别用多功能酶标仪器（Thermo Scientific），及小动物成像系统（Kinetics, Caliper Life Science）；

b)动物体体内检测手段，动物体体内检测均采用小动物体内成像系统（Kinetics, Caliper Life Science）；分别为荧光成像和生物发光成像。

所选用的动物为裸鼠或SCID鼠。

表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株在癌模型应用，其特征是：具体步骤为：

1）慢病毒载体扩增：将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2，pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.74常规转化大肠杆菌，用氨苄抗生素筛选阳性克隆，37 ℃摇菌扩增，用质粒纯化提取试剂盒收集，纯化慢病毒质粒；其中pWPT-GFP，质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因，用于观察和流式细胞分选；pLenti-CMV-puro-LUC含有荧光素酶基因及真核筛选标记嘌呤霉素（Puromycin）基因，用于生物发光成像和药物加压筛选；

2）含绿色荧光蛋白慢病毒包装：前一天将293T细胞铺于10 cm 培养板，培养于5 % CO₂ 37 ℃ 恒温培养箱；培养基为DMEM，血清选用进口小牛血清，待细胞密度长至 60~70 % 时，进行转染；首先将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2按照一定的比例与Opti-MEM混合，并将 lipofectamine 2000与Opti-MEM充分混合，室温孵育5分钟后，将上述2种液体充分混合孵育20分钟后，加入293T细胞中；8小时后荧光显微镜观察293T包装效果,并收集病毒上清；收集的病毒上清经0.2 μm 滤器过滤分装后于 -80℃保存；

3）含荧光素酶慢病毒包装：前一天将293T细胞铺于10cm 培养板，带细胞密度长至 60-70% 时，进行转染；首先将慢病毒载体pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.91按照一定的比例与Opti-MEM混合，并将 lipofectamine 2000与Opti-MEM充分混合，室温孵育5分钟后，将上述2种液体充分混合孵育20分钟后，加入293T细胞中；8小时后荧收集病毒上清；收集的病毒上清经0.2 μm 滤器过滤分装后于 -80 ℃保存；

4）病毒感染：感染前一天将SGC7901细胞铺于24孔板，密度约2×10⁵，培养于5% CO₂ 37^℃恒温培养箱；培养基为DMEM，血清选用进口小牛血清将含有绿色荧光蛋白的病毒液加入，并加polybrene 4 μg/ml增加感染效率；12小时后更换为完全培养基；48小时后，观察感染效果；如果感染效果不佳，进行流式分选；之后将带有绿色荧光的SGC7901按照密度再次铺入24孔板，并加入上述含有荧光素酶的病毒液，并加入4 μg/ml polybrene，于48小时后，加入筛选药物Puromycin，加压筛选2周后，获得阳性克隆，并扩大培养；此时获得双标胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC；

5）双标细胞系体外发光验证：利用荧光显微镜观察SGC7901绿色荧光效果， 倒置荧光显微镜观察条件为，激发条件为488 nm；采用倍比稀释的方法，采用用小动物活体成像仪鉴定在不同细胞数量下，荧光素酶及绿色荧光表达，并判断其线性关系；其中生物发光成像条件为，加入底物D-luciferin 1分钟后显像，曝光时间设为自动； 

6）肿瘤皮下注射方法：将胃癌亚系SGC7901-GFP-LUC消化后，用PBS重悬于200 μl，在裸鼠左肩部皮下注射细胞2×10⁶，并通过小动物活体成像仪动态观察细胞皮下增殖状况；

7）肿瘤原位种植方法：6~7周裸鼠购自第四军医大学动物中心，85mg/kg 戊巴比妥钠麻醉，待麻醉稳定后，使裸鼠仰卧位，于左上腹部开3cm切口，依次剪开皮肤，腹膜，暴露胃组织；将胃癌亚系SGC7901-GFP-LUC消化后，重悬约5×10⁶细胞于50 μl DMEM中，用30G注射器缓慢吸取，在体视显微镜的辅助下，注射于胃浆膜下；之后将胃还纳，7-0手术缝线缝合连续缝合腹膜，4-0手术缝线间断缝合皮肤；种植后每周，用小动物活体成像仪动态在体观察生物发光信号，检测条件为：腹腔注射D-luciferin 10 分钟后，裸鼠用异氟烷麻醉后，取左侧仰卧位，曝光时间5分钟；

8）4周后，将荷瘤裸鼠处死，制作原位胃癌HE染色切片及冰冻切片,观察胃癌原位模型建模效果。

所述的胃癌原位模型的建立是通过癌细胞胃浆膜下注射的方式完成。

所述的药物加压筛选所选用为嘌呤霉素Puromycin，筛选标记为荧光素酶。

上述可用于体内实时监测肿瘤生长评价药物疗效。

本发明的优点是：国内外目前缺乏融合上述两种成像方式的胃癌研究细胞，因此本发明基于绿色荧光蛋白和荧光素酶各自的优缺点，通过在同一种细胞内共表达这两种光学标记，用荧光成像做体外生物学观察，用生物发光成像进行动物体内的评价，建立针对胃癌的多功能影像学研究平台，以满足胃癌研究的需要。 

附图说明

下面结合实施例和实施例附图对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

图1. 慢病毒包装质粒pWPT-GFP结构图；

图2. 慢病毒包装质粒pMD2.G结构图；

图3. 慢病毒包装质粒pSPAX2结构图；

图4. 慢病毒包装质粒pLenti-CMV-puro-LUC结构图；

图5. 慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91结构图；

图6. 慢病毒包装质粒VSVg结构图；

图7. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC荧光显微镜下观察绿色荧光效果；

图8. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC倍比稀释观察生物发光效果及线性关系；

图9. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC倍比稀释观察荧光效果及线性关系；

图10.活体成像系统观察胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情况；

图11.利用活体成像系统动态监测胃癌细胞亚系在裸鼠皮下成长；

图12.裸鼠原位胃癌肿瘤构建过程大体视野，组织切片及冰冻切片；

图13.利用活体成像系统动态检测胃癌裸鼠原位胃癌的发展。

具体实施方式

表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，以胃癌SGC7901为母细胞，采用慢病毒感染的方法，将绿色荧光蛋白GFP 和萤火虫荧光素酶Firefly luciferase, LUC基因带入细胞，得到稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的细胞株，将所述的细胞株通过皮下，尾静脉及原位注射的方式建立不同的胃癌动物模型。

所述的慢病毒感染的方法是将外源基因导入，它的步骤是：

a)大肠杆菌扩增慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti- CMV-puro-LUC, VSVg，pCMV-dR8.91，并酶切鉴定，纯化；

b)用上述纯化获得的质粒按照一定比例，用脂质体法共转染入293T细胞，以产生含有慢病毒的上清；

c)以胃癌SGC7901为母细胞，亦可以其他胃癌细胞株为母细胞，用上述病毒顺次感染；

d)扩增建系，并通过流式细胞分选技术及嘌呤霉素药物加压筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆。

所述的绿色荧光蛋白GFP及萤火虫荧光素酶 Firefly luciferase的测手段均为光学信号检测方法，其中包括，其中包括：

a)体外检测手段 GFP检测条件为荧光倒置显微镜，激发光波长为488±30 nm, 发射波长为509±30 nm；萤火虫荧光素酶检测手段为化学发光检测手段，施加D-luciferin后，分别用多功能酶标仪器Varadiflash Scanner, Thermo Scientific,及小动物成像系统 kinetics, Caliper Life Science；

b)动物体体内检测手段，动物体体内检测均采用小动物体内成像系统kinetics, Caliper Life Science；分别为荧光成像和生物发光成像。

所述的动物模型为裸鼠。

其中胃癌原位模型的建立是通过癌细胞胃浆膜下注射的方式完成。

药物加压筛选所选用为嘌呤霉素Puromycin，筛选标记为荧光素酶。  

用于体内实时监测肿瘤生长评价药物疗效。

表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株在癌模型应用，具体步骤为：

1）慢病毒载体扩增：将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2，pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.74常规转化大肠杆菌，用氨苄抗生素筛选阳性克隆，37 ℃ 摇菌扩增，用质粒纯化提取试剂盒收集，纯化慢病毒质粒；其中pWPT-GFP，质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因，用于观察和流式细胞分选；pLenti-CMV-puro-LUC含有荧光素酶基因及真核筛选标记Puromycin基因，用于生物发光成像和药物加压筛选（如图1. 慢病毒包装质粒pWPT-GFP结构图；图2. 慢病毒包装质粒pMD2.G结构图；图3. 慢病毒包装质粒pSPAX2结构图；图4. 慢病毒包装质粒pLenti-CMV-puro-LUC结构图）；

2）含绿色荧光蛋白慢病毒包装：前一天将293T细胞铺于10 cm 培养板，培养于5 % CO₂ 37 ℃ 恒温培养箱；培养基为DMEM，血清选用进口小牛血清，待细胞密度长至 60-70% 时，进行转染；首先将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2按照一定的比例与Opti-MEM混合，并将 lipofectamine 2000与Opti-MEM充分混合，室温孵育5分钟后，将上述2种液体充分混合孵育20分钟后，加入293T细胞中；8小时后荧光显微镜观察293T包装效果,并收集病毒上清；收集的病毒上清经0.2 μm 滤器过滤分装后于 -80℃保存；

3）含荧光素酶慢病毒包装：前一天将293T细胞铺于10 cm 培养板，带细胞密度长至 60~70 % 时，进行转染；首先将慢病毒载体pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.91按照一定的比例与Opti-MEM混合，并将 lipofectamine 2000与Opti-MEM充分混合，室温孵育5分钟后，将上述2种液体充分混合孵育20分钟后，加入293T细胞中；8小时后荧收集病毒上清；收集的病毒上清经0.2 μm 滤器过滤分装后于 -80℃保存（如图5. 慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91结构图；图6. 慢病毒包装质粒VSVg结构图）；

4）病毒感染：感染前一天将SGC7901细胞铺于24孔板，密度约2×10⁵，培养于5% CO₂ 37 ℃ 恒温培养箱；培养基为DMEM，血清选用进口小牛血清将含有绿色荧光蛋白的病毒液加入，并加polybrene 4 μg/ml增加感染效率；12小时后更换为完全培养基；48小时后，观察感染效果；如果感染效果不佳，进行流式分选；之后将带有绿色荧光的SGC7901按照密度再次铺入24孔板，并加入上述含有荧光素酶的病毒液，并加入4 μg/ml polybrene，于48小时后，加入筛选药物Puromycin，加压筛选2周后，获得阳性克隆，并扩大培养；此时获得双标胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC（如图7. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC荧光显微镜下观察绿色荧光效果；图8. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC倍比稀释观察生物发光效果及线性关系；图9. 胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC倍比稀释观察荧光效果及线性关系）；

5）双标细胞系体外发光验证：利用荧光显微镜观察SGC7901绿色荧光效果， 倒置荧光显微镜观察条件为，激发条件为488nm；采用倍比稀释的方法，采用用小动物活体成像仪鉴定在不同细胞数量下，荧光素酶及绿色荧光表达，并判断其线性关系；其中生物发光成像条件为，加入底物D-luciferin 1分钟后显像，曝光时间设为自动； 

6）肿瘤皮下注射方法：将胃癌亚系SGC7901-GFP-LUC消化后，用PBS重悬于200μl，在裸鼠左肩部皮下注射细胞2×10⁶，并通过小动物活体成像仪动态观察细胞皮下增殖状况（如图10.活体成像系统观察胃癌细胞亚系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情况；图11.利用活体成像系统动态监测胃癌细胞亚系在裸鼠皮下成长）；

7）肿瘤原位种植方法：6~7周裸鼠购自第四军医大学动物中心，85 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉，待麻醉稳定后，使裸鼠仰卧位，于左上腹部开3 cm切口，依次剪开皮肤，腹膜，暴露胃组织；将胃癌亚系SGC7901-GFP-LUC消化后，重悬约5×10⁶细胞于50 μl DMEM中，用30G注射器缓慢吸取，在体视显微镜的辅助下，注射于胃浆膜下；之后将胃还纳，7-0手术缝线缝合连续缝合腹膜，4-0手术缝线间断缝合皮肤；种植后每周，用小动物活体成像仪动态在体观察生物发光信号，检测条件为：腹腔注射D-luciferin 10 分钟后，裸鼠用异氟烷麻醉后，取左侧仰卧位，曝光时间5分钟（如图12.裸鼠原位胃癌肿瘤构建过程大体视野，组织切片及冰冻切片）；

8）4周后，将荷瘤裸鼠处死，制作原位胃癌HE染色切片 及冰冻切片,观察胃癌原位模型建模效果（如图13. 8）4周后，将荷瘤裸鼠处死，制作原位胃癌HE染色切片及冰冻切片,观察胃癌原位模型建模效果。

所述的胃癌原位模型的建立是通过癌细胞胃浆膜下注射的方式完成。所述的药物加压筛选所选用为嘌呤霉素Puromycin，筛选标记为荧光素酶。

稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的胃癌细胞株的应用，可用于体内实时监测肿瘤生长及评价药物疗效。用于体内实时监测肿瘤生长评价药物疗效。

Claims (9)

1.表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：以人胃癌细胞系为母细胞，采用慢病毒感染的方法，将绿色荧光蛋白（GFP） 和萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase, LUC）基因带入细胞，得到稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的细胞株。

2.根据权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：将所述的细胞株通过皮下，尾静脉及原位注射的方式建立不同的胃癌动物模型。

3.根据权利要求1 所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：

所述的慢病毒感染的方法是将外源基因导入，它的步骤是：

a)大肠杆菌扩增慢病毒包装质粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg，pCMV-dR8.91，并酶切鉴定，纯化；

b)用上述纯化获得的质粒按照一定比例，用脂质体法共转染入293T细胞，以分别产生含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清；

c)以人胃癌细胞系为母细胞，用上述病毒顺次感染；

d)扩增建系，并通过流式细胞分选技术及药物加压筛选技术，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆。

4.根据权利要求1 所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：所述的绿色荧光蛋白（GFP）及萤火虫荧光素酶 （Firefly luciferase）的测手段均为光学信号检测方法，其中包括：

a)体外检测手段 GFP检测条件为荧光倒置显微镜，激发光波长为488±30 nm, 发射波长为509±30 nm；萤火虫荧光素酶检测手段为化学发光检测手段，施加D-luciferin后，分别用多功能酶标仪器及小动物成像系；

b)动物体内检测手段，动物体体内检测采用小动物体内成像系统分别为荧光成像和生物发光成像。

5.根据权利要求1所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，其特征是：所述的动物模型为裸鼠或SCID鼠。

6.表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株在癌模型应用，其特征是：具体步骤为：

1）慢病毒载体扩增：将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2，pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.74常规转化大肠杆菌，用氨苄抗生素筛选阳性克隆，37℃ 摇菌扩增，用质粒纯化提取试剂盒收集，纯化慢病毒质粒；其中pWPT-GFP，质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因，用于观察和流式细胞分选；pLenti-CMV-puro-LUC含有荧光素酶基因及真核筛选标记嘌呤霉素基因，用于生物发光成像和药物加压筛选；

2）含绿色荧光蛋白慢病毒包装：将293T细胞铺于10 cm 培养板，培养于5 % CO₂  37 ℃ 恒温培养箱；待细胞密度长至 60~70% 时，进行转染；首先将慢病毒载体pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2按照比例混合，并与脂质体充分混合并孵育后，加入293T细胞中；荧光显微镜观察293T包装效果,并收集病毒上清；过滤分装后于 -80℃保存；

3）含荧光素酶慢病毒包装：前一天将293T细胞铺于10 cm 培养板，待细胞密度长至 60~70% 时，进行转染；首先将慢病毒载体pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8.91按照一定的比例并与脂质体充分混合并孵育后，加入293T细胞中；收集病毒上清过滤后分装后于 -80 ℃保存；

4）病毒感染：感染前一天将人胃癌细胞铺于细胞培养板，将含有绿色荧光蛋白的病毒液加入；后更换为完全培养基；观察感染效果，并进行流式分选；之后将带有绿色荧光的胃癌细胞按照密度再次铺入细胞板，并加入上述含有荧光素酶的病毒液，于48小时后，加入筛选药物，加压筛选后，获得阳性克隆，并扩大培养；此时获得稳定绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因的；

5）双标细胞系体外发光验证：利用倒置荧光显微镜观察双标胃癌细胞亚系绿色荧光效果；亦可采用倍比稀释的方法，采用用小动物活体成像仪鉴定在不同细胞数量下，荧光素酶及绿色荧光表达，并判断其线性关系； 

6）肿瘤皮下注射方法：将双标胃癌细胞消化后，用PBS重悬于，在裸鼠右肩部皮下注射细胞2×10⁶，并通过小动物活体成像仪或卡尺动态观察细胞皮下增殖状况；

7）肿瘤原位种植方法：裸鼠麻醉稳定后，取仰卧位，于上腹部开手术切口，依次剪开皮肤，腹膜，暴露胃组织；将双标胃癌细胞消化后，重悬于适量培养基中，用注射器缓慢吸取，注射于胃浆膜下；之后手术缝线缝合缝合腹膜及皮肤；种植后每周，用小动物活体成像仪动态在体观察生物发光信号；

8）4周后，将荷瘤裸鼠处死，制作原位胃癌HE染色切片 及冰冻切片,观察胃癌原位模型建模效果。

7.根据权利要求6所述的稳定表达绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶在癌模型应用, 其特征是：所述的胃癌原位模型的建立是通过癌细胞胃浆膜下原位注射的方式完成。

8.根据权利要求6所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株在癌模型应用, 其特征是：所述的药物加压筛选所选用为嘌呤霉素（Puromycin）。

9.根据权利要求6所述的表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株在癌模型应用，其特征是：用于体内实时监测肿瘤生长及评价药物疗效。

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