CN103387963A

CN103387963A - 一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用

Info

Publication number: CN103387963A
Application number: CN2013103488737A
Authority: CN
Inventors: 蔡建春; 徐浩; 彭积贵; 骆启聪; 黄卫锋; 庄伊凡; 陈嘉佳
Original assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Current assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN103387963B

Abstract

一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用，涉及微生物动物细胞系。Ming氏人膨胀型胃癌细胞系为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2，保藏编号CCTCC NO：C201386。Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2可作为Ming氏膨胀型胃癌发生、发展或转移的细胞模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在建立Ming氏膨胀型胃癌动物模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2在从Ming氏分型角度研究胃癌的分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制及指导临床综合诊治等的细胞模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在研究胃癌发生机理、筛选防治胃癌药物中的应用。

Description

一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系，尤其是涉及一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用。

背景技术

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，胃癌的发病率居所有恶性肿瘤第四位，死亡率居第二位。在中国，胃癌是最常见的消化道肿瘤，占恶性肿瘤死亡率的第一位，全国平均年死亡率为16/10万人口，高发地达60/l0万人口。虽然胃癌的诊断及治疗已经取得了长足的进步，但近10年来其5年生存率并没有明显的提高，术后复发和转移是其死亡的重要原因，居高不下的发病率和死亡率已经使胃癌的研究与治疗成为亟待解决的重大课题。目前的资料表明，胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段的发展过程，其恶变过程包括了细胞增生、DNA复制过度、细胞周期功能紊乱、细胞永生化、逃逸凋亡、血管新生（Angiogenesis）及浸润转移等一系列的过程，地域环境及生活饮食、幽门螺杆菌感染（Helicobacter pylori，HP）、癌前病变以及遗传和基因等因素均与胃癌的发生、发展密切相关。分子生物学的研究显示，胃癌的癌变涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因等的改变，而基因改变的形式也是多种多样的，这些基因受一系列复杂机制调控，但是其确切的调控机制并不完全明了。

1977年美国学者闵锡钧根据显微镜下胃癌生长方式的不同将其分为膨胀型和浸润型两型（Ming氏分型），并且指出二者的生物学行为和临床预后截然不同。该分类方法很好地反映了胃癌的生物学行为，且与预后密切相关，受到国内外临床专家和学者们的公认。膨胀型胃癌癌组织呈膨胀性生长，集聚成团块状，周围纤维结缔组织增生（Desmoplasia），边界较为清楚。浸润型胃癌癌组织呈浸润性生长，分散成条索状，不形成团块状，与周围组织无明显的界限，多为低分化腺癌或印戒细胞癌。膨胀型术后5年存活率为27.4%,而浸润型仅为9.1%。迄今为止，国内外对于这方面的研究鲜有报道，两型胃癌（Ming氏膨胀型和浸润型）的发病机制和形成的分子基础更不清楚。

目前世界范围内报道的胃癌细胞系已经不少：中国的BGC-823、SGC-7901、MGC-803；美国的AGS、HS764T、SNU-1；欧洲的AGS、KATO-III、HGC-27；日本的MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMG C-3、NMG C-4、AZ-521；韩国的SNU-1、SNU-5、SNU-16等。其中大部分来源于转移的淋巴结、腹水或晚期、低分化的肿瘤组织，用这些细胞系做胃癌研究缺乏很好的代表性和科学性；另一方面很多细胞系应用至今已经有几十年的时间，在长期、反复的传代培养过程中，细胞特性会发生很大变化，不同实验室在用同种细胞的不同代次得到的数据相差会很大，结果缺乏可比性和重复性。基于以上原因，胃癌原代细胞培养并建立细胞系在现阶段仍有很大的价值。

另有研究发现，虽然各个细胞系在体外保持了许多起源细胞的形态与功能特征，但是由于周围环境的变化，这些细胞系与供体的起源细胞会存在程度不一的差异，这种差异在培养开始就存在，只是程度相对较小，以后随着不断的传代培养及变异的发生，这种差异会越来越大，甚至会产生起源细胞本不具备的特征。由于这些因素的存在，不同细胞系的建立工作更显得意义重大。

迄今世界上关于胃癌的临床和基础研究已有很多的报道，但从Ming氏分型角度去研究胃癌发生机制的报道却不多，Ming氏胃癌细胞系也未见报道。

中国专利CN101993854A公开一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF及其构建方法，所述细胞系由如下方法获得：取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞后，MACS分选出CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得可稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。该发明CJF细胞是从结肠癌人肝转移灶取材的，对大肠癌肝转移的研究有其他大肠癌细胞系无法比拟的优点；该发明CJF细胞稳定表达CD133+的细胞亚群约为10％，这株细胞系在大肠癌肝转移过程及肿瘤干细胞在转移机制中的作用研究具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用。

本发明所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞系为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2，已于2013年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201386。

本发明采用取自一72岁男性胃癌手术切除标本，经胶原酶/中性蛋白酶两者混合消化后作原代培养，经细胞培养技术培养建立了一个Ming氏膨胀型胃癌细胞系，命名为XGC-2。

所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2，具有以下生物学特性：

1、细胞贴壁生长，无接触抑制，可出现叠加生长现象。

2、细胞倍增时间接近60h。

3、细胞系具有很强的克隆形成能力，琼脂集落形成率为45.8%；平板克隆形成率接近8.13%。

4、细胞免疫组化结果显示：本细胞系角蛋白、波形蛋白、质子泵、IV型胶原、层粘连蛋白、癌胚抗原（CEA）呈阳性表达；E-钙蛋白弱阳性表达；Ki-67染色阳性率接近80.6%。

5、染色体分析提示：本株细胞为稳定的亚三倍体细胞系，有较多的染色体缺失、异位及衍生现象。

6、裸鼠接种本细胞后全部成瘤，移植瘤组织学特性与原发瘤相似。

所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2可作为Ming氏膨胀型胃癌发生、发展或转移的细胞模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在建立Ming氏膨胀型胃癌动物模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2在从Ming氏分型角度研究胃癌的分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制及指导临床综合诊治等的细胞模型中的应用；Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在研究胃癌的发生机理、筛选防治胃癌药物中的应用。

本发明希望通过从建立Ming氏胃癌细胞系为起点，为以后从Ming氏分型角度研究胃癌的发生、发展，进而揭示胃癌的发病机制提供一定的研究线索和实验模型。因此，建立Ming氏胃癌细胞系具有重要的意义。其不但为以后从Ming氏分型角度深入研究胃癌的发病机制、生物学行为提供一个很好的模型，也为进一步开展胃癌分子生物学、免疫学及临床综合诊治等研究提供有利条件。

附图说明

图1为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2来源肿瘤组织的病理结果。

图2为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在显微镜下的形态学观察图（×100）。

图3为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2的生长曲线。在图3中，横坐标为时间（天），纵坐标为吸光值（490nm）。

图4为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2软琼脂集落形成实验结果（×100）。

图5为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2平板克隆形成实验结果（×100）。

图6为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2染色体分析结果。

图7为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2免疫缺陷小鼠体内成瘤性实验结果。

图8为裸鼠移植瘤的病理切片结果（×200）。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2的建立及鉴定。

一、Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2的建立

临床采集胃癌患者肿瘤组织，经混合酶消化后作原代培养，进而成功建立一株能够连续传代的胃癌细胞系，目前传至62代，细胞性状保持稳定。该患者病理结果为胃底贲门部中分化管状腺癌（图1）。

二、Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2的生物学特性检测

1、细胞形态学：细胞生长稳定并传化后，对培养细胞进行活细胞观察；另将生长于盖玻片上的单层细胞以体积分数为95%乙醇固定，行HE染色，光镜观察。结果显示：相差显微镜下见细胞呈上皮样细胞排列，细胞贴壁生长，有重叠生长现象（图2）。

2、细胞生长曲线测定：取处于对数生长期的第8代细胞制成1×10⁵/ml的单细胞悬液，然后按照100μl/孔接种于96孔板，设置3个复孔。24h后开始加药测定490nm波长时的OD值，每天换液，共测9天。实验结束后绘制生长曲线，按公式Td=t×lg2/lg(N1/N0)计算倍增时间。结果显示：本株细胞贴壁后第1天生长缓慢，第2天开始呈指数生长，在每天更换培养基营养充足的条件下细胞可出现叠加生长，无接触抑制现象；细胞平均倍增时间约60h（图3）。

3、软琼脂集落形成实验：用0.6%低熔点琼脂糖－DMEM覆盖6孔培养板制备底层琼脂，加入1ml含500个细胞的0.3%的低熔点琼脂－DMEM作上层琼脂。置37℃、5%CO₂培养箱中培养2～3周，计数含50个以上细胞的集落，计算细胞集落形成率。集落形成率=克隆数/接种细胞数×100%。结果显示：本株细胞在0.3%低熔点琼脂糖中培养3天后即可在镜下观察到细胞克隆生长，培养2周后可见细胞克隆呈球形生长于琼脂中，3周后肉眼可见琼脂中布满白色细胞团，细胞克隆形成率约等于45.8%（图4）。

4、平板细胞克隆形成实验：接种分散均匀的第5代细胞于12孔超低吸附板中，每孔1000个细胞，设置3个复孔，静置培养1～2周。培养结束后先用甲醇固定，再加适量Giemsa染色，计数含50个以上细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。结果显示：细胞培养3天后即可在镜下观察到肿瘤细胞分裂成10～30多个细胞悬浮于培养基中，5天后可见细胞克隆呈球形悬浮生长，1周后可见细胞克隆继续增大，悬浮细胞克隆形成率约等于8.13%（图5）。

5、染色体分析：分别取对数生长期的第5、10、15代细胞作核型分析。细胞经秋水仙素作用2h，经0.075mol/L KCl低渗，甲醇－冰醋酸固定处理，冰湿片滴片，室温老化后用胰酶处理，Giemsa染色显带分析。结果显示：本细胞系染色体众数介于23～137条之间。单倍体细胞（染色体数≤23）占3.5%，二倍体及亚二倍体细胞（23<染色体数≤46）占4.5%，三倍体及亚三倍体细胞（46<染色体数≤69）占86%，超三倍体细胞（染色体数≥69）占6%，为稳定的亚三倍体细胞系。细胞染色体缺失、异位及衍生染色体等现象很常见，并可观察到费城染色小体（Philadelphia chromosome，Ph’）及不明来源染色体（见图6中的标记???）。可见本细胞系具有恶性肿瘤细胞的特征。

6、免疫缺陷小鼠体内成瘤实验：取4周龄BALB/C雌性小鼠3只，右前肢皮下分别注射1×10⁷个/100μl、2×10⁷个/100μl、5×10⁷个/100μl的培养细胞，2周后颈椎脱臼法处死裸鼠，取出移植瘤，福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察，拍照记录实验数据。结果显示：裸鼠皮下接种细胞后1周，即可见移植瘤长出。3只裸鼠全部成瘤，移植瘤呈结节状，与皮肤有粘连（图7）。

7、肿瘤的病理切片：肿瘤组织福尔马林常规固定、石蜡包埋后切片及HE染色。结果显示：临床手术标本镜下肿瘤细胞呈典型的膨胀型生长，肿瘤组织被较多结缔组织包绕，可见腺管结构，细胞中度分化，肿瘤细胞核大、深染，核浆比例增大，胞浆轻度嗜碱；裸鼠体内成瘤标本镜下观察细胞生长旺盛，细胞核增大，深染，异型性明显，其组织学形态与临床标本相似（图8）。

Claims

1.Ming氏人膨胀型胃癌细胞系，其特征在于为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2，保藏编号为CCTCC NO：C201386。

2.如权利要求1所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在建立Ming氏膨胀型胃癌发生、发展或转移的细胞模型中的应用。

3.如权利要求1所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在建立Ming氏膨胀型胃癌动物模型中的应用。

4.如权利要求1所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞系XGC-2在从Ming氏分型角度研究胃癌的分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制及指导临床综合诊治的细胞模型中的应用。

5.如权利要求1所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-2在研究胃癌的发生机理、筛选防治胃癌药物中的应用。