CN111321120A - 小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法 - Google Patents
小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，涉及肿瘤细胞的分离与培养技术领域；所述小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系为原位肾癌NOD/SCID小鼠的循环肿瘤细胞；所述环肿瘤细胞的分离与培养方法主要包括以下步骤：首先用病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786‑O，使其稳转绿色荧光蛋白和具有Puromycin抗性，并对该细胞系进行培养；再建立小鼠模型，采集小鼠外周血并进行培养、分离得到肾癌循环肿瘤细胞。本发明的分离与培养方法简单易操作，分离获得的循环肿瘤细胞可以进行正常的传单培养，可以广泛应用于临床研究。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤细胞的分离与培养技术领域，具体涉及一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。
背景技术
肾细胞癌（RCC）是肾脏中最常见的恶性肿瘤，20%-30%的病人在治疗后会复发，且有极高的可能因肿瘤而死。恶性肿瘤细胞在癌症早期便可由原发灶脱落进入血液循环中，利用循环系统到达远端器官进入休眠状态或形成转移灶。循环肿瘤细胞（CTC）是癌症患者外周血中播散性的肿瘤细胞，其从原发性肿瘤或转移部位脱落到外周血中，可作为液体活检，用于早期诊断，风险评估和治疗监测。已有大量研究表明，病人外周血中CTC的数量以及分型，与病人预后密切相关。CTC在癌症的转移及治疗中有重大意义，CTC的分离和体外培养是CTC基础研究的重中之重。目前为止，尚未见到肾癌循环肿瘤细胞分离培养方法的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法。
本发明的一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系为原位肾癌NOD/SCID鼠的循环肿瘤细胞。
本发明的一种人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，包括以下步骤：
S1：用病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786-O，使其稳转绿色荧光蛋白和具有Puromycin抗性，并对该人源性肾透明细胞癌细胞系786-O进行培养；
S2：将步骤S1中培养获得的人源性肾透明细胞癌细胞系786-O接种于小鼠腋下以获得肿瘤块；
S3：将步骤S2中的肿瘤块接种于另一只健康小鼠的肾下极并进行饲养；
S4：采集步骤S3中小鼠外周血并进行培养、分离得到循环肿瘤细胞。
进一步地，所述使用慢性病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786-O的具体过程为：将人源性肾透明细胞癌细胞系786-O培养至细胞汇合度为20-30%时加入9ul慢病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly-Luc-IRES-Puromycin以及20ul Polybrene。
更进一步地，对所述被病毒感染后的人源性肾透明细胞癌细胞系786-O培养的培养基为：含3ug/ml Puromycin，10%FBS的培养基。
更进一步地，所述步骤S4中小鼠外周血的处理方法为：加入6倍于外周血体积的红细胞裂解液，于冰上裂解2分钟。
更进一步地，步骤S4中对小鼠外周血进行培养、分离得到循环肿瘤细胞的具体过程为：
S7：将经过红细胞裂解液处理所得细胞重悬于含20ng/ml上皮生长因子EGF，20ng/ml碱性纤维生长因子FGF2，B27添加剂及1%抗生素的1640培养基中，种于低吸附96孔板，于37℃，5%CO2，4%O2低氧培养箱中培养；
S8:6天后转移至正常氧浓度培养箱使用含3ug/ml Puromycin，10%FBS的1640培养基于24孔板中继续培养，每2天更换新鲜培养基并清除漂浮死亡细胞，即可得到贴壁生长的循环肿瘤细胞。
更进一步地，还包括在正常氧浓度培养箱中，待贴壁循环肿瘤细胞融合度为90%时进行传代。
更进一步地，还包括对癌循环肿瘤细胞的冻存和复苏过程，具体步骤为：
冻存：将人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞以冻存液重悬后置于4℃预冷的程序降温盒中，放置于-80℃过夜，后移至液氮中保存；
复苏：将液氮中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
更进一步地，所述小鼠为SPF级NOD/SCID小鼠。
本发明的有益效果：
本发明的循环肿瘤细胞分离培养方法简单易操作，分离获得的循环肿瘤细胞可正常传代；
本发明获得的循环肿瘤细胞与原母代人源性肾透明细胞癌细胞系786-O（GFP-LUC-Puro-786-O）细胞相比，具有更强的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力；
本发明获得的循环肿瘤细胞纯度极高，无需进行细胞鉴定，即可确定获得的细胞系为循环肿瘤细胞，并且细胞自身携带荧光蛋白及荧光素酶，可迅速进行相关动物实验，通过动物成像观察肿瘤转移进展情况，以及干扰措施对肿瘤转移的影响，是科研人员研究肾癌转移机制、循环肿瘤细胞特性的良好工具，为肾癌的早期诊断，预后评估，病情监测提供了可靠的研究模型。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例的循环肿瘤细胞培养过程的显微镜图，A为经红细胞后的循环肿瘤细胞图；B为悬浮培养6天后的循环肿瘤细胞图；C为正常培养箱中贴壁培养的循环肿瘤细胞图；
图2是本发明实施例的循环肿瘤细胞和母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞不同时间段的划痕实验显微镜图，A为0h的显微镜图；B为24h的显微镜图；
图3是本发明实施例的循环肿瘤细胞和母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞的侵袭实验图，A为母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞的侵袭实验图；B为循环肿瘤细胞的侵袭实验图；
图4是本发明实施例的循环肿瘤细胞和母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞培养24h后的侵袭能力图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明是实施例的一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系为原位肾癌NOD/SCID小鼠的循环肿瘤细胞
本发明实施例的肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离和培养方法，具体如下：
（一）实验中所用试剂
慢病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly_Luc-IRES-Puromycin（吉凯基因）；Polybrene助染剂（吉凯基因）；红细胞裂解液（碧云天）；上皮生长因子EGF（Gibco）；碱性纤维生长因子FGF2（Gibco）；抗生素（索莱宝）；1640培养基（Gibco）；胎牛血清FBS（BI）；胰蛋白酶（Gibco）；细胞冻存液（Livecyte）；PBS（Gibco）；Puromycin（Sigma）。
（二）建立稳转GFP-LUC-Puro-786-O细胞系
（1）完全培养基制备密度为3×104个/ml细胞悬液，接种到24孔板中，37℃培养24h，至细胞汇合度20-30%；
（2）吸去旧培养基，PBS冲洗后，加入新鲜完全培养基250ul，并加入9ul慢病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly-Luc-IRES-Puromycin以及20ul Polybrene；
（3）37℃培养24h，更换为新鲜完全培养基，继续培养，中途可换液保持细胞活性；
（4）转染4天后更换为含3ug/ml Puromycin的完全培养基；每24h更换一次含3ug/mlPuromycin的完全培养基，清除漂浮死亡细胞，共筛选扩增2周，直到没有细胞死亡漂浮。
（三）原位肾癌小鼠模型的建立
（1）扩增筛选稳转的GFP-LUC-Puro-786-O细胞系；
（2）购买SPF级NOD/SCID小鼠（北京维通利华）6只一组；按SPF级动物饲养标准饲养于西安交通大学动物实验中心SPF级环境中，自由饮水；
（3）将扩增的GFP-LUC-Puro-786-O细胞以无血清培养基重悬，细胞计数，保证200ul中有5×107个细胞，接种于小鼠腋下；
（4）每2天用游标卡尺测量肿瘤体积，待肿瘤体积长至1cm3时，处死小鼠，取出肿瘤并剪切至1×1×1mm的肿瘤块；
（5）在无菌环境下以给小鼠注射10g 0.3%戊巴比妥对小鼠进行麻醉处理，使小鼠俯卧位固定于铺巾上；
（6）将麻醉后的小鼠整个背部用碘伏消毒3遍，于左侧肋脊角切开皮肤及肌层，切口长约1cm；找到肾脏，镊子提起肾上极，剪刀轻轻切开肾包膜，使用玻璃分针由切口处向下分离肾实质与肾包膜至肾下极；将肿瘤块由切口置入肾下极，医用连线针分别缝合肌层及皮肤。
（7）用碘伏消毒切口，背部皮下注射0.5ml生理盐水补液后将小鼠置于电热毯上，待复苏后放回鼠笼，继续饲养约2周，待其发展至恶病质状态，准备取其外周血。
（四）对外周血进行处理
（1）准备EDTA-抗凝采血管，以心脏采血的方式取小鼠全血后，颠倒混匀，取500g离心5分钟去上清液，然后加入6倍于外周血体积的红细胞裂解液，于冰上裂解2分钟，且裂解过程中每隔30s摇动一次，以促进红细胞裂解；
（2）取上步裂解后的液体500g，在4℃离心5分钟，弃红色上清液，然后用5倍于细胞沉淀的无血清培养基重悬洗涤细胞，取500g于4℃离心5分钟，弃上清，重复洗涤并离心一次，得到肾透明细胞癌循环肿瘤细胞，结果见图1A。
（五）对循环肿瘤细胞进行培养
（1）以1640培养基重悬经过洗涤后得到的循环肿瘤细胞，同时加入20ng/ml上皮生长因子EGF，20ng/ml碱性纤维生长因子FGF2，B27添加剂及1%抗生素，来保证循环肿瘤细胞的活性，以每孔100ul种于低吸附96孔板中，在37℃，5%CO2，4%O2的低氧培养箱中进行培养，每3天换液1次，每次换液收集含悬浮细胞的培养基，800g离心5分钟，吸去旧培养基，添加新培养基重悬，所换培养基与前次相同,6天后，循环肿瘤细胞的培养情况见图1B；
（2）6天后转移至正常氧浓度培养箱使用含3ug/ml Puromycin，10%FBS的1640培养基于24孔板中继续培养，每2天更换新鲜培养基，所换培养基与前次相同，清除漂浮死亡细胞，悬浮生长或贴壁生长的白细胞将通过换液或Puromycin杀死，循环肿瘤细胞将贴壁增殖,；
（3）待贴壁循环肿瘤细胞融合度为90%时，使用0.25%胰蛋白酶于37℃培养箱中消化贴壁生长的肾癌循环肿瘤细胞3分钟，随后以含10%FBS的1640培养基终止消化，800g离心5分钟，弃上清，以含3ug/ml Puromycin，10%FBS的1640培养基重悬细胞，于正常氧浓度培养箱培养，2天后根据细胞生长情况换液或传代，循环肿瘤细胞正常培养箱培养情况见图1C。
（六）循环肿瘤细胞的冻存和复苏
冻存：将细胞以冻存液重悬以后，冻存液中细胞的密度为2×106个/ml，每1ml分装一个冻存管，置于4℃预冷的程序降温盒中，放置于-80℃过夜，后移至液氮中保存。
复苏：将液氮中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
（七）循环肿瘤细胞的鉴定
由于肿瘤细胞在建立动物模型前，已经通过慢病毒转染使其稳定表达绿色荧光蛋白（GFP），且具有Puromycin抗性，因此从外周血中获得细胞后，通过含Puromycin的培养基培养，贴壁细胞均为具有Puromycin抗性细胞，再通过荧光显微镜观察，可看到100%的细胞表达GFP，即可证明此细胞为循环肿瘤细胞。
（八）循环肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力研究
（1）比较循环肿瘤细胞与母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞增殖能力与皮下成瘤能力。
将上述两种细胞以1000个/100ul种于96孔板，于5%CO2，37℃培养箱中进行培养，培养时间为24h，每孔加入10ulCCK-8溶液，继续在培养箱中孵育2h，随后使用酶标仪在450nm测定吸光度；取上述两种细胞分别以5×107种于裸鼠腋下，待形成肿瘤后，每2天测量一次肿瘤大小。
（2）比较循环肿瘤细胞与母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞迁移及侵袭能力。
划痕实验：将1×106上述两种细胞种于六孔板，待细胞汇合度100%后，在超净台中用100ul枪头在孔底均匀画直线，PBS冲洗细胞，加完全培养基继续培养，于划痕后0小时及24小时拍照，结果分别见图2A和图2B。
侵袭实验：康宁Transwell小室上层底部铺无血清1640培养基稀释至8%的基质胶，于细胞培养箱中过夜，将2×104个上述两种细胞以无血清1640培养基种于Transwell小室上层，下室加入600ul含10%FBS的1640培养基，24小时候取出小室，吸去上层液体，并用棉签轻轻擦拭上层底部细胞，小室于4%多聚甲醛中固定20分钟，后用PBS冲洗小室，再与结晶紫溶液中固定20分钟，PBS冲洗小室，显微镜下观察并计数母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞与循环肿瘤细胞在不同视野下的细胞数量和侵袭能力，结果见表1、图3A、图3B和图4。
表1 培养24小时循环肿瘤细胞与母代GFP-LUC-Puro-786-O不同视野下的细胞侵袭数量
结果表明，本发明首次通过小鼠分离培养得到肾透明癌循环肿瘤细胞，且该循环肿瘤细胞具有更强的增殖、迁移、侵袭及成瘤能力；本发明的分离与培养方法简单易得，方便研究人员研究肾癌转移机制以及肾癌循环肿瘤细胞特性，同时为靶向于肾癌循环肿瘤细胞的药物研究提供了细胞模型，本发明将在肾癌转移、术后化疗等方面应用广泛。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系，其特征在于，所述肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系为原位肾癌NOD/SCID鼠的循环肿瘤细胞。
2.一种人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786-O，使其稳转绿色荧光蛋白和具有Puromycin抗性，并对该人源性肾透明细胞癌细胞系786-O进行培养；
S2：将步骤S1中培养获得的人源性肾透明细胞癌细胞系786-O接种于小鼠腋下以获得肿瘤块；
S3：将步骤S2中的肿瘤块接种于另一只健康小鼠的肾下极并进行饲养；
S4：采集步骤S3中小鼠外周血并进行培养、分离得到循环肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，所述使用慢性病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786-O的具体过程为：将人源性肾透明细胞癌细胞系786-O培养至细胞汇合度为20-30%时加入9ul慢病毒EF1A-MCS-P2A-EGFR-SV40-firefly-Luc-IRES-Puromycin以及20ul Polybrene。
4.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，对所述被病毒感染后的人源性肾透明细胞癌细胞系786-O进行培养的培养基为：含3ug/ml Puromycin，10%FBS的培养基。
5.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，所述步骤S4中小鼠外周血的处理方法为：加入6倍于外周血体积的红细胞裂解液，于冰上裂解2分钟。
6.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，步骤S4中对小鼠外周血进行培养、分离得到循环肿瘤细胞的具体过程为：
S7：将经过红细胞裂解液处理所得细胞重悬于含20ng/ml上皮生长因子EGF，20ng/ml碱性纤维生长因子FGF2，B27添加剂及1%抗生素的1640培养基中，种于低吸附96孔板，于37℃，5%CO2，4%O2低氧培养箱中培养；
S8:6天后转移至正常氧浓度培养箱中使用含3ug/ml Puromycin，10%FBS的1640培养基于24孔板中继续培养，每2天更换新鲜培养基并清除漂浮死亡细胞，即可得到贴壁生长的循环肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，还包括在正常氧浓度培养箱中，待贴壁肾癌循环肿瘤细胞融合度为90%时进行传代。
8.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，还包括对得到的循环肿瘤细胞的冻存和复苏过程，具体步骤为：
冻存：将循环肿瘤细胞以冻存液重悬后置于4℃预冷的程序降温盒中，放置于-80℃过夜，后移至液氮中保存；
复苏：将液氮中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
9.根据权利要求1所述人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其特征在于，所述小鼠为SPF级NOD/SCID小鼠。
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