CN117660351A - 人egfr基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株hc5720及其应用 - Google Patents
人egfr基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株hc5720及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720及其应用。该细胞株有EGFR基因L858R和V834L两个位点的突变，EGFR(L858R Mutant Specific)、角蛋白Pan‑Keratin及Epcam蛋白表达阳性，该细胞株对Erlotinib敏感。该细胞株可以作为研究人EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、分析EGFR基因L858R和V834L双位点突变靶向药物敏感性及筛选和评估靶向抗肿瘤药物、以及研究耐药机制、耐药性逆转的重要工具，从而为人类寻求更有效的肿瘤治疗方法等，具有较高的科研和生产应用价值，预期有良好的科研、经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤生物学领域，尤其涉及一种人的EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720，同时涉及该非小细胞肺癌细胞株HC5720的应用。
背景技术
肺癌是严重危害人类生命和健康的常见恶性肿瘤。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中80％～85％为非小细胞肺癌，约2/3非小细胞肺癌存在基因改变，约1/2患者可获得靶向治疗机会。对靶向治疗有显著反应的NSCLC基因型包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变、ALK基因重排、ROS原癌基因重排等。为了促进和满足对人非小细胞肺癌的研究，需要越来越多的各种人体来源的存在特殊基因改变的肺癌细胞株。为此我们建立了一种人的非小细胞肺癌细胞株HC5720，该细胞株有EGFR基因L858R和V834L两个位点的突变。查阅最新文献，目前世界上还未见有EGFR基因L858R和V834L两个位点的突变细胞株的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人的EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌细胞株及其应用。该细胞株可用于构建人的有EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌体内外肿瘤的动物和细胞模型，还能用于抗肿瘤药物的筛选及耐药机制的研究等等。
上述提及的人非小细胞肺癌细胞株，命名为人非小细胞肺癌细胞株HC5720，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年11月16日，保藏编号为CCTCC NO：C2023357。
所述的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，该细胞株有EGFR基因L858R和V834L两个位点的突变。
所述的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，该细胞株EGFR(L858R
Mutant Specific)蛋白、角蛋白Pan-Keratin及Epcam蛋白表达阳性，
所述的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，该细胞株对Erlotinib敏感。
本发明还提供所述的人非小细胞肺癌细胞株HC5720在药物筛选中的应用。
所述的应用是在筛选制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供所述的人非小细胞肺癌细胞株HC5720在构建人非小细胞肺癌体内、外肿瘤模型中的应用。
本发明的细胞株取自一个54岁的女性黄种人的中至低分化腺癌的肺部手术肿瘤标本，然后接种至SCID Beige小鼠背部皮下，当SCID Beige小鼠背部某一点的皮下移植瘤直径大于1-1.5cm时，取瘤块剪碎继续接种至SCID Beige小鼠，这样接种5代，取第5代瘤块用II型胶原酶消化，接种至T25培养瓶中，采用改良的ACL4无血清培养基培养2个月后改用含10％FBS RPMI1640培养基扩增培养。该细胞株角蛋白Pan-Keratin、Epcam、及EGFR(L858RMutant Specific)蛋白表达阳性。
本发明包括以下步骤：
(1)人非小细胞肺癌细胞株HC5720在SCID Beige小鼠背部皮下接种传代及在ACL4无血清培养基中的培养。
(2)人非小细胞肺癌细胞株HC5720在含10％FBS RPMI1640培养基中培养、消化及传代。
(3)人非小细胞肺癌细胞株HC5720角蛋白Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858RMutant Specific)蛋白的表达。
(4)人非小细胞肺癌细胞株HC5720在免疫缺陷小鼠体内的致瘤能力。
(5)检测人非小细胞肺癌细胞株HC5720 EGFR基因突变。
(6)人非小细胞肺癌细胞株HC5720对靶向药物Erlotinib的敏感性。
(7)人非小细胞肺癌细胞株HC5720种属及STR的鉴定。
本发明的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，可以用于研究人的EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌细胞形态学及生物学特点、筛选和评估抗肿瘤药物及作用机制、研究肿瘤耐药机制、开发肿瘤耐药逆转药物及研究更有效的肿瘤治疗方法等，并可用于EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌致瘤机制及其相关信号通路的研究。具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明的人非小细胞肺癌细胞株HC5720在倒置相差显微镜下拍摄的照片；A为40倍，B为100倍。
图2为本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720角蛋白Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858R MUTANT SPECIFIC)蛋白的表达。
A、B、C为HC5720细胞在200倍显微镜下免疫荧光角蛋白Pan-Keratin(A)、Epcam(B)及EGFR(L858R Mutant Specific)(C)蛋白的表达(绿色荧光为角蛋白Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858R Mutant Specific，蓝色荧光为细胞核)；D为本发明人非小细胞肺癌细胞株免疫印迹角蛋白Pan-Keratin及EGFR(L858R Mutant Specific)蛋白的表达，平滑肌细胞、H3122细胞株为对照细胞，GAPDH为内参蛋白对照。
图3为本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720在免疫缺陷小鼠SCID Beige皮下所成的瘤体(红色箭头所指处)。
图4为本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720 EGFR基因L858R和V834L双位点突变，箭头处为EGFR基因21号外显子核酸2761G被T取代、2834T被G取代，即第834号氨基酸V被L取代、第858号L被R取代；P0为病人来源的肿瘤标本，P1、P2、P3及P4为SCID Beige小鼠皮下移植瘤，HC5720为建成的HC5720细胞株。
图5为本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720对靶向药物Erlotinib的敏感性测定。
图6为本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720种属(A)及STR(B)的鉴定。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以详细说明。
本发明中涉及的现有实验方法、测试方法及溶液配制方法可以参考《细胞实验指南》，标准书号：7-03-007598-6/Q.891原著：[美]D.L.斯佩克特R.D.戈德曼&L.A.莱因万德。
实施例中提及的试剂、抗体及试剂盒均为市购产品。
实施例1人的EGFR基因L858R和V834L双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720的制备
步骤为：
(1)HC5720细胞获取：细胞取自一个54岁的女性黄种人的中至低分化腺癌的肺部手术肿瘤标本。从手术室无菌取该病人肺肿瘤组织转移至含15mL Hank’s液的无菌离心管中，4℃运至实验室。在实验室生物安全柜中用0.01M PBS缓冲液清洗3次，去除正常组织及坏死肿瘤组织，将瘤体剪成1.0～1.5mm大小的瘤块，接种至SCID Beige小鼠背部皮下，在肿瘤标本离开人体后1h内完成接种。此为第1代荷瘤小鼠(下称P1)。当SCID Beige小鼠某一点的皮下移植瘤直径大于1～1.5cm时，用戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠，剥离肿瘤，取部分瘤块按上述方法继续接种至SCID Beige小鼠背部皮下，重复上述步骤，进行肿瘤传代，建立第2、3、4、5代荷瘤小鼠(下称P2、P3、P4、P5)，待P5代皮下移植瘤直径大于1-1.5cm时，用戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠，剥离肿瘤。实验室生物安全柜中用0.01M PBS缓冲液清洗3次，去除正常组织及坏死肿瘤组织，将瘤体剪成1mm×1mm×1mm的组织块，用400units/mlcollagenase type II消化瘤块，将消化好的细胞置于70um一次性滤筛过滤，离心，小心去上清。再次清洗离心，按照人单个核细胞分离液试剂盒分离单个核细胞，以去除死细胞和红细胞，再次清洗细胞两次，去上清，用ACL4培养基将细胞团稀释到0.5×106个/ml，将5ml细胞接种至25cm2培养瓶中。采用ACL4无血清培养基培养2个月后改用含10％FBS RPMI1640培养基扩增培养。
(2)人非小细胞肺癌细胞株HC5720的形态学观察：取人非小细胞肺癌细胞株HC5720接种于25cm2培养瓶中，待生长至对数期，置倒置相差显微镜下观察活细胞形态并拍照，如图1所示，可见本发明细胞株HC5720呈上皮样细胞形态贴壁生长。
(3)本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720的消化：取人非小细胞肺癌细胞株HC5720接种于25cm2培养瓶中，待生长汇合至80％时，吸走培养基，加入5ml不含钙镁磷酸盐缓冲液(D-PBS缓冲液)清洗，加0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)1ml室温消化，镜下观察，待细胞变圆，成流沙样，加入3mL含10％FBS RPMI1640培养基中和，稍吹打，吸入15ml离心管中，800转/分离心5分钟，弃上清，加入含10％FBS RPMI1640培养基，稍吹打混匀，1:3-4传代培养。
(4)本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720的冻存：将实施例1中获得的细胞置入冻存管的冻存液中，再将冻存管置于液氮中保存。冻存液由95％含10％FBS RPMI1640培养基和5％二甲基亚砜(DMSO)组成。冻存过程采取将冻存管置于nalgene程序降温盒，-80℃过夜后放入液氮的步骤。
(5)本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720的复苏：从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即直立放入37-40℃水浴中轻轻摇动，保证冻存管盖在水面上，使冻存物在1-2分钟内解冻，用酒精擦拭冻存管外壁后拿入生物安全柜。将解冻后的细胞悬液置于15ml无菌离心管中，加入D-PBS缓冲液5ml，800转/分离心5分钟，弃上清，加入5mL含10％FBS RPMI1640培养基，稍吹打混匀成混合液，吸混合液置入一个25cm2的细胞培养瓶中，拧松瓶盖放入二氧化碳培养箱，在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养，2-3天更换培养基一次，细胞密度达到80-90％时消化传代。
实施例2本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720角蛋白Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858R MUTANT SPECIFIC)蛋白的表达。
(1)人非小细胞肺癌细胞株HC5720免疫荧光Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858RMUTANT SPECIFIC)蛋白的表达取12孔板培养的汇合至30-40％本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720，吸去原培养基，冷D-PBS缓冲液漂洗一遍，冰甲醇固定，按常规免疫荧光染色，结果见图2,HC5720表达Pan-Keratin、Epcam及EGFR(L858R MUTANT SPECIFIC)蛋白。
(2)人非小细胞肺癌细胞株HC5720免疫印迹Pan-Keratin及EGFR(L858R MUTANTSPECIFIC)蛋白的表达取6孔板培养的汇合至80-90％本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720，吸去原培养基，冷D-PBS缓冲液漂洗一遍，加入含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上立即用细胞刮刮取细胞，转刮取的细胞抽提液置EP管，超声10-15s，冰上冷却，4℃12000转/分离心10分钟，取上清,用BCA试剂盒测蛋白浓度，取总蛋白25ug加上样缓冲液上样，按蛋白免疫印迹方法常规电泳、转膜、孵育抗体，机器曝光。结果见图2，蛋白免疫印迹的结果显示Pan-Keratin及EGFR(L858R MUTANT SPECIFIC)蛋白表达。
实施例3人非小细胞肺癌细胞株HC5720的细胞生长曲线和倍增时间测定
取本发明的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)消化制备成单细胞悬液，接种于24孔板，每孔细胞1×104个，于24、48、72、96、120、144、168小时计算细胞数，每次计数3孔，取平均值绘制细胞曲线，并计算倍增时间(Td)。按Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间Td(h)＝Tlg2/lg(N/NO)，其中T表示细胞对数增值的时间，N为对数增殖期结束时的细胞数，NO为对数增殖期开始时的细胞数，算得HC5720群体倍增时间为27.85±2.08h。
实施例4本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720免疫缺陷小鼠SCID Beige皮下成瘤性测定
用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)分别消化处于对数生长期的本发明的人非小细胞肺癌细胞株HC5720，预冷PBS洗两遍，去除细胞中残余的血清，预冷无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，加4度基质胶与无血清培养基的比例1:1，2-3×10^6个细胞/只接种至3-4周SCID Beige皮下，接种体积为0.1ml，每周两次观察成瘤情况直至瘤体形成。图3为人非小细胞肺癌细胞株HC5720在免疫缺项小鼠SCID Beige皮下所形成的瘤体。
实施例5人非小细胞肺癌细胞株HC5720的EGFR基因L858R和V834L双位点突变测定
取T25培养瓶培养的汇合至80-90％本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720，吸去原培养基，加入细胞裂解液，按试剂盒的方法抽提RNA，逆转录成CDNA，使用如下引物扩增
EGFRForward 5'-AGCTTGTGGAGCCTCTTACACC-3'
EGFRReverse5'-TAAAATTGATTCCAATGCCATCC-3'，送公司测序，分析测序结果，可见HC5720 EGFR基因有L858R和V834L双位点突变，见图4。
实施例6人非小细胞肺癌细胞株HC5720对靶向药物Erlotinib的敏感性测定
取汇合至70％左右的一瓶T25细胞，消化、中和、离心，加培养基混匀计数，取混匀液100ul(约5000个细胞)接种至96孔板，接种24小时后加入不同浓度Erlotinib(0nmol/L、33nmol/L、66nmol/L、100nmol/L、333nmol/L、666nmol/L、1μmol/L、3.33μmol/L、6.66μmol/L、10μmol/L)100ul，每个浓度重复6孔。72小时后用CCK8试剂盒检测，检测结果显示HC5720对Erlotinib敏感，见图5。Erlotinib IC50＝96.15nmol/L。
实施例7本发明人非小细胞肺癌细胞株HC5720种属及STR鉴定
取本发明的人非小细胞肺癌细胞株HC5720汇合至80-90％25cm2培养瓶细胞一瓶，吸去培养液，0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(0.25％Trypsin-EDTA)消化，离心，弃去培养基，加入5ml磷酸盐缓冲液，漂洗一遍，离心，弃去磷酸盐缓冲液，将细胞沉淀送至公司进行细胞种属鉴定及人源细胞STR鉴定。结果见图6，细胞来源为人类，HC5720为新细胞株，查阅数据库未见与此一样的STR序列。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720，保藏编号为CCTCC NO：C2023357。
2.如权利要求1所述的人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720，其特征在于，该细胞株有EGFR基因L858R和V834L两个位点的突变。
3.如权利要求1所述的人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720，其特征在于，该细胞株EGFR(L858R Mutant Specific)蛋白、角蛋白Pan-Keratin及Epcam蛋白表达阳性。
4.如权利要求1所述的人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720，其特征在于，该细胞株对Erlotinib敏感。
5.权利要求1所述的人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720在药物筛选中,特别是在筛选制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1所述的人EGFR基因双位点突变非小细胞肺癌细胞株HC5720在构建人非小细胞肺癌体内、外肿瘤模型中的应用。
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