CN112239750A - 一种肾癌循环肿瘤细胞系及获取分离及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肾癌循环肿瘤细胞系及获取分离及培养方法，其方法步骤包括：建立稳转人源性肾癌细胞系786‑O，用病毒感染人源性肾癌细胞系786‑O，使其稳转绿色荧光蛋白、荧光素酶、并具有Puromycin抗性，并对该人源性肾癌细胞786‑O进行培养；制备循环肿瘤细胞动物模型，将步骤S1中培养获得的人源性肾癌细胞786‑O通过尾静脉注射于小鼠体内，小鼠于SPF环境下饲养一个月，并通过小动物成像观察是否发生转移；循环肿瘤细胞的细胞系提取，采集步骤S2中已经发生转移的小鼠外周血并进行分离、培养得到肾癌循环肿瘤细胞；对步骤S3中获得的循环肿瘤细胞进行培养。本发明简单易操作，成功率高，成本低，且获得的循环肿瘤细胞纯度极高，细胞状态好，可以广泛应用于临床研究。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞的分离与培养技术领域，具体涉及一种肾癌循环肿瘤细胞系及获取分离及培养方法。
背景技术
循环肿瘤细胞作为播散进入循环血液中的肿瘤细胞，在癌症的发展过程中起着极其重要的作用。在疾病的早期阶段，循环肿瘤细胞发生上皮间质化从而获得侵袭能力，进而在免疫细胞的帮助下进入循环血液中，到达远端器官后进入休眠状态。随着肿瘤的进展，最终在一定条件下复苏发生转移。针对循环肿瘤细胞的捕获技术，也从最初的抗体捕获，发展至根据循环肿瘤细胞的物理特性捕获，以及整合两种捕获方法于一体的新技术。新技术的出现提高了肿瘤细胞捕获的准确性，高效性。丰富了人们对循环肿瘤细胞的认识，使人们从分子、机制方面对循环肿瘤细胞的研究成为可能。CTC动物模型的制备以及细胞系的制备在基础研究中起着关键性作用。然而目前为止，已有的肾癌循环肿瘤细胞动物模型制作以及循环肿瘤细胞的获取步骤过于繁琐，时间成本经济成本较高，且提取过程会对数量稀少的循环肿瘤细胞造成损伤，影响循环肿瘤细胞的细胞状态及获取率。
如申请人申请号为202010280911.X的在先申请，提供一种小鼠肾透明细胞癌循环肿瘤细胞系和人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的分离与培养方法，其步骤包括：S1：用病毒感染人源性肾透明细胞癌细胞系786-O，使其稳转绿色荧光蛋白和具有Puromycin抗性，并对该人源性肾透明细胞癌细胞系786-O进行培养； S2：将步骤S1中培养获得的人源性肾透明细胞癌细胞系786-O接种于小鼠腋下以获得肿瘤块；S3：将步骤S2中的肿瘤块接种于另一只健康小鼠的肾包膜下并进行饲养；S4：采集步骤S3中小鼠外周血并进行培养、分离得到循环肿瘤细胞。该方法分离获得的循环肿瘤细胞可以进行正常的传代培养，可以应用于临床研究，但在循环肿瘤细胞动物模型制备和循环肿瘤细胞细胞系提取中仍存在小鼠成活率低，造模成功率低，经济成本高，操作步骤复杂等缺陷。
发明内容
本发明提供一种肾癌循环肿瘤细胞系及获取分离及培养方法，方法简单易操作，时间及经济成本较低，分离获得的循环肿瘤细胞状态良好获取率高，且无需特殊培养设备及条件，可直接广泛应用于循环肿瘤细胞的基础研究。
本发明的技术方案是：一种肾癌循环肿瘤细胞系，为肾癌细胞的循环肿瘤细胞786-O-CTC，于2020.9.29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为 CCTCC NO:C2020193。
一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其步骤包括：
S1：建立稳转人源性肾癌细胞系786-O，用病毒感染人源性肾癌细胞系 786-O，使其稳转绿色荧光蛋白、荧光素酶、并具有Puromycin抗性，并对该人源性肾癌细胞786-O进行培养；
S2：制备循环肿瘤细胞动物模型，将步骤S1中培养获得的人源性肾癌细胞 786-O通过尾静脉注射于小鼠体内，小鼠于SPF环境下饲养一个月，并通过小动物成像观察是否发生转移；
S3：循环肿瘤细胞细胞系提取，采集步骤S2中已经发生转移的小鼠外周血并进行分离、培养得到肾癌循环肿瘤细胞；
S4：对步骤S3中获得的循环肿瘤细胞进行培养。
方案进一步地，上述步骤S1的具体过程为：
(1)完全培养基制备密度为3×104个/ml细胞悬液，接种到24孔板中，37℃培养24h，至细胞汇合度15-20％；
(2)吸去旧培养基，PBS冲洗后，加入新鲜完全培养基250ul，并加入10ul 慢病毒pHBLV-CMV-MCS-fLUC-EF1-ZsGreen-T2A-PURO以及30ulPolybrene；
(3)将24孔板置于37℃离心机中，1500rpm离心1.5小时；
(4)37℃培养24h，更换为新鲜完全培养基，继续培养，中途可换液保持细胞活性；
(5)转染4天后更换为含3ug/ml Puromycin的完全培养基，每24h更换一次含3ug/ml Puromycin的完全培养基，清除漂浮死亡细胞，共筛选扩增2周，直到没有细胞死亡漂浮。
方案进一步地，上述步骤S3中循环肿瘤细胞细胞系提取具体方法为：以心脏采血的方式取肿瘤肺转移小鼠全血后，通过细胞筛过滤，获取滤液，随后再将滤液通过细胞过滤器过滤从而将循环肿瘤细胞及白细胞等拦截在细胞过滤器内的纳米孔膜上。
方案进一步地，上述步骤S4的具体过程为：将细胞过滤器内的纳米孔膜剥离，将其置于60mm的细胞培养皿中，培养皿中预先加有含3ug/ml Puromycin， 0.1mM非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10％胎牛血清及1％双抗的1640培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每2天更换新鲜培养基并清除漂浮死亡细胞，即可得到贴壁生长的肾癌循环肿瘤细胞。
方案进一步地，上述步骤S4的具体过程还包括在培养箱中待贴壁肾癌循环肿瘤细胞融合度为80％时进行传代。
方案进一步地，还包括对人源性肾透明细胞癌循环肿瘤细胞的冻存和复苏过程，具体步骤为：
冻存：将肾癌循环肿瘤细胞消化离心后，以无血清冻存液重悬，随后每毫升分装一个冻存管，于-80℃保存；
复苏：将-80℃中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
方案进一步地，所述小鼠为SPF级NOD/SCID小鼠。
本发明的优点是：
本发明循环肿瘤细胞动物模型的造模方法与现有技术相比，具有高成活率，高成功率，低死亡率，低时间成本，低经济成本，实验步骤操作简单等优点；
本发明循环肿瘤细胞细胞系提取过程实验步骤简单方便，无需离心，操作简易，在超净台中即可完成，避免了超净台外反复离心所带来的污染可能，同时避免了红细胞裂解液以及反复离心操作对数量极少的循环肿瘤细胞所造成的破坏，提高循环肿瘤细胞提取成功率的同时最大程度保留循环肿瘤细胞良好的细胞状态；
本发明循环肿瘤细胞的培养过程实验操作步骤简单，无需特种大型仪器，一般实验室均能满足实验条件，且培养基成分的改良，避免了细胞因子、添加剂等对实验结果造成假阳性的可能；
本发明获得的循环肿瘤细胞纯度极高，细胞状态好，无需进行细胞鉴定，即可确定获得的细胞系为循环肿瘤细胞，可立刻进行循环肿瘤细胞相关基础实验。
附图说明
图1是本发明循环肿瘤细胞786-O-CTC与786-O细胞系增殖能力比较图；
图2是本发明循环肿瘤细胞786-O-CTC与786-O细胞系裸鼠成瘤能力比较图；
图3是本发明循环肿瘤细胞786-O-CTC与786-O细胞系划痕实验比较图；
图4是本发明循环肿瘤细胞786-O-CTC与786-O细胞系迁移侵袭实验比较图；
图5是现有技术与本发明提取出循环肿瘤细胞培养至第8天细胞数目及状态差异图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做清楚完整的描述，以使本领域的技术人员在不需要作出创造性劳动的条件下，能够充分实施本发明。
本发明的具体实施方式是：
一种肾癌循环肿瘤细胞系，为肾癌细胞的循环肿瘤细胞786-O-CTC，于 2020.9.29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020193。
一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，具体如下：
(一)实验中所用试剂
慢病毒pHBLV-CMV-MCS-fLUC-EF1-ZsGreen-T2A-PURO(汉恒生物)； Polybrene助染剂(汉恒生物)；非必须氨基酸(Gibco)；丙酮酸钠(Gibco)；谷氨酰胺(Gibco)；抗生素(索莱宝)；1640培养基(Gibco)；胎牛血清FBS (BI)；胰蛋白酶(Gibco)；细胞冻存液(Livecyte)；PBS(Gibco)；Puromycin (Sigma)。
(二)建立稳转GFP-LUC-Puro-786-O细胞系
(1)完全培养基制备密度为3×104个/ml细胞悬液，接种到24孔板中，37℃培养24h，至细胞汇合度15-20％；
(2)吸去旧培养基，PBS冲洗后，加入新鲜完全培养基250ul，并加入10ul 慢病毒pHBLV-CMV-MCS-fLUC-EF1-ZsGreen-T2A-PURO以及30ulPolybrene；
(3)将24孔板置于37℃离心机中，1500rpm离心1.5小时。
(4)37℃培养24h，更换为新鲜完全培养基，继续培养，中途可换液保持细胞活性；
(5)转染4天后更换为含3ug/ml Puromycin的完全培养基；每24h更换一次含3ug/ml Puromycin的完全培养基，清除漂浮死亡细胞，共筛选扩增2周，直到没有细胞死亡漂浮。
(三)肾癌循环肿瘤细胞小鼠模型的建立
(1)扩增筛选稳转的GFP-LUC-Puro-786-O细胞系；
(2)购买SPF级NOD/SCID小鼠6只一组；按SPF级动物饲养标准饲养于西安交通大学动物实验中心SPF级环境中，自由饮水；
(3)将扩增的GFP-LUC-Puro-786-O细胞以1×PBS重悬，细胞计数，保证 200ul中有5×107个细胞，通过尾静脉注射进小鼠循环系统中；
(4)正常饲养30天，期间通过小动物成像，确认小鼠体内的肿瘤细胞已经发生肺转移，未发生明显转移的小鼠重复(3)操作，以确保造模成功。
(四)对外周血进行处理，提取循环肿瘤细胞细胞系
(1)准备EDTA-抗凝采血管，以心脏采血的方式取肿瘤肺转移小鼠全血后，颠倒混匀，置于4℃；
(2)在超净台中，将(1)中获取的血液通过细胞筛，以除去血凝块等物质；
(3)转动细胞过滤器，沿内壁缓慢加入1ml 75％乙醇，重复三次，确保纳米孔膜润洗完全，再用1×PBS以同样方式洗涤6次，以去除残留乙醇；
(4)将(2)中获取到的血液加入到7mlPBS中，沿细胞过滤器内壁加入血样，过滤完全后，在原含血样离心管中加入5ml 1×PBS，轻微混匀后将液体加入细胞过滤器漏斗中洗涤，重复4次以上，至纳米孔膜上无可见红细胞残留。
(五)对循环肿瘤细胞进行培养
(1)超净台中用镊子将纳米孔膜从细胞过滤器上剥离，细胞贴附面朝上置于60mm细胞培养皿中，同时皿中加入含3ug/ml Puromycin，0.1mM非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10％胎牛血清及1％双抗的1640培养基4ml，在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，每3天换液1次，所换培养基与前次相同，清除漂浮死亡细胞，悬浮生长或贴壁生长的白细胞将通过换液或Puromycin 杀死清除，肾癌循环肿瘤细胞将贴壁增殖；
(2)待贴壁肾癌循环肿瘤细胞融合度为80％时，使用0.25％胰蛋白酶于37℃培养箱中消化贴壁生长的肾癌循环肿瘤细胞3分钟，随后以含10％FBS的1640 培养基终止消化，800g离心5分钟，弃上清，以含3ug/ml Puromycin，0.1mM非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10％胎牛血清及1％双抗的1640 培养基重悬细胞，于培养箱培养，2天后根据细胞生长情况换液或传代。
(六)循环肿瘤细胞的冻存和复苏
冻存：将细胞以冻存液重悬以后，冻存液中细胞的密度为2×106个/ml，每 1ml分装一个冻存管，置于-80℃保存。
复苏：将-80℃中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
(七)循环肿瘤细胞的鉴定
由于肿瘤细胞在建立动物模型前，已经通过慢病毒转染使其稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)，且具有Puromycin抗性，因此从外周血中获得细胞后，通过含 Puromycin的培养基培养，贴壁细胞均为具有Puromycin抗性细胞，再通过荧光显微镜观察，可看到100％的细胞表达GFP，即可证明此细胞为循环肿瘤细胞。
(八)循环肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力研究
(1)比较循环肿瘤细胞与母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞增殖能力与皮下成瘤能力：
将上述两种细胞以2500个/100ul种于96孔板，于5％CO2，37℃培养箱中进行培养，培养时间分别为24h，48h，72h，每孔加入10ulMTT及90ul1640培养基，继续在培养箱中孵育3h，随后吸去培养基加入150ulDMSO，使用酶标仪在 490nm测定吸光度，结果如图1所示；取上述两种细胞分别以3×106种于裸鼠腋下，待10天后，每3天测量一次肿瘤大小，结果如图2，循环肿瘤细胞系增殖与成瘤能力明显优于786-O细胞系；
(2)比较循环肿瘤细胞与母代GFP-LUC-Puro-786-O细胞迁移及侵袭能力：
划痕实验：将1×106个上述两种细胞种于六孔板，待细胞汇合度100％后，在超净台中用100ul枪头在孔底均匀画直线，PBS冲洗细胞，加无血清培养基继续培养，于划痕后0小时及24小时拍照，结果见图3；
迁移实验：将3×104个上述两种细胞以无血清1640培养基种于Transwell 小室上层，下室加入600ul含10％FBS的1640培养基，24小时候取出小室，吸去上层液体，并用棉签轻轻擦拭上层底部细胞，小室于4％多聚甲醛中固定20 分钟，后用PBS冲洗小室，再于结晶紫溶液中固定20分钟，PBS冲洗小室，显微镜下任意取5个视野拍照计数细胞个数，结果见图4；
侵袭实验：Transwell小室上层底部铺无血清1640培养基稀释至8％的基质胶，于细胞培养箱中过夜，将8×104个上述两种细胞以无血清1640培养基种于 Transwell小室上层，下室加入600ul含10％FBS的1640培养基，24小时候取出小室，吸去上层液体，并用棉签轻轻擦拭上层底部细胞，小室于4％多聚甲醛中固定20分钟，后用PBS冲洗小室，再于结晶紫溶液中固定20分钟，PBS冲洗小室，显微镜下任意取5个视野拍照计数细胞个数结果见图4。
本发明只需通过小鼠尾静脉注射0.2ml 1×PBS(内含肿瘤细胞)进入循环血液，确定发生转移，即可获得循环肿瘤细胞动物模型，操作简便，无需麻醉手术等高风险操作，单人即可完成，极大地降低了工作量。同时克服了现有技术中麻醉，开放手术，术后感染等因素造成的高死亡率的缺点，在该发明的动物实验中死亡率为零。同时简化步骤后，极大降低了实验的经济成本以及时间成本，现有技术整个动物模型的制作过程至少需要2个月，而本发明只需1个月即可得到造模成功的小鼠。此外，在造模过程中可随时进行小动物活体成像，对于成像没有发生明显转移，怀疑未能造模成功的小鼠可再次进行尾静脉肿瘤细胞注射，从而提高造模成功率，这种反复造模方法是现有技术无法做到的。
本发明在心脏釆血后，将采到的血液依次通过细胞筛及细胞过滤器即可在细胞过滤器的纳米孔膜上获得循环肿瘤细胞。整个过程无需离心，操作简便，在超净台中即可完成，避免了超净台外反复离心所带来的污染可能，同时避免了红细胞裂解液以及反复离心操作对数量极少的循环肿瘤细胞所造成的破坏，提高循环肿瘤细胞提取成功率的同时最大程度保留循环肿瘤细胞良好的细胞状态。本发明循环肿瘤细胞细胞系提取过程具有实验步骤操作简单方便，无需额外大型仪器，细胞提取率高，提取细胞状态好，污染率低等优点。
本发明只需将提取步骤中细胞过滤器中的纳米孔膜剥离滤器，细胞贴附面朝上置于60mm的细胞培养皿中即可，培养皿中含有3ug/ml Puromycin，0.1mM 非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10％胎牛血清及1％双抗的1640 培养基，培养环境为正常细胞培养箱，即37℃，5％CO2培养箱。整个过程无需使用低氧培养箱，无需低吸附96孔板，仅采用一般细胞培养环境即可，同时培养基添加物质仅为正常细胞营养物质，避免使用上皮生长因子，碱性纤维生长因子等会对细胞性状产生影响的添加剂，避免了细胞因子及添加剂对实验造成假阳性的结果。
本发明获得的循环肿瘤细胞纯度极高，细胞状态好，如图5所示，无需进行细胞鉴定，即可确定获得的细胞系为循环肿瘤细胞，可立刻进行循环肿瘤细胞相关基础实验。并且细胞自身携带绿色荧光蛋白及荧光素酶，可通过小动物成像观察肿瘤转移进展情况，以及干扰措施对肿瘤转移的影响，是科研人员研究循环肿瘤细胞转移机制、循环肿瘤细胞特性的良好工具。
以上对本发明的较佳实施例进行了描述，需要指出的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围。
Claims (8)
1.一种肾癌循环肿瘤细胞系，为肾癌细胞的循环肿瘤细胞786-O-CTC，于2020.9.29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020193。
2.一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，其步骤包括：
S1：建立稳转人源性肾癌细胞系786-O，用病毒感染人源性肾癌细胞系786-O，使其稳转绿色荧光蛋白、荧光素酶、并具有Puromycin抗性，并对该人源性肾癌细胞786-O进行培养；
S2：制备循环肿瘤细胞动物模型，将步骤S1中培养获得的人源性肾癌细胞786-O通过尾静脉注射于小鼠体内，小鼠于SPF环境下饲养一个月，并通过小动物成像观察是否发生转移；
S3：循环肿瘤细胞细胞系提取，采集步骤S2中已经发生转移的小鼠外周血并进行分离、培养得到肾癌循环肿瘤细胞；
S4：对步骤S3中获得的循环肿瘤细胞进行培养。
3.根据权利要求2所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，上述步骤S1的具体过程为：
(1)完全培养基制备密度3×104个/ml细胞悬液，接种到24孔板中，37℃培养24h，至细胞汇合度15-20％；
(2)吸去旧培养基，PBS冲洗后，加入新鲜完全培养基250ul，并加入10ul慢病毒pHBLV-CMV-MCS-fLUC-EF1-ZsGreen-T2A-PURO以及30ulPolybrene；
(3)将24孔板置于37℃离心机中，1500rpm离心1.5小时；
(4)37℃培养24h，更换为新鲜完全培养基，继续培养，中途可换液保持细胞活性；
(5)转染4天后更换为含3ug/ml Puromycin的完全培养基，每24h更换一次含3ug/mlPuromycin的完全培养基，清除漂浮死亡细胞，共筛选扩增2周，直到没有细胞死亡漂浮。
4.根据权利要求3所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，上述步骤S3中循环肿瘤细胞细胞系提取具体方法为：以心脏采血的方式取肿瘤肺转移小鼠全血后，通过细胞筛过滤，获取滤液，随后再将滤液通过细胞过滤器过滤从而将循环肿瘤细胞及白细胞等拦截在细胞过滤器内的纳米孔膜上。
5.根据权利要求4所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，上述步骤S4的具体过程为：将细胞过滤器内的纳米孔膜剥离，将其置于60mm的细胞培养皿中，培养皿中预先加有含3ug/ml Puromycin，0.1mM非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，10％胎牛血清及1％双抗的1640培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每2天更换新鲜培养基并清除漂浮死亡细胞，即可得到贴壁生长的肾癌循环肿瘤细胞。
6.根据权利要求5所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，上述步骤S4的具体过程还包括在培养箱中待贴壁肾癌循环肿瘤细胞融合度为80％时进行传代。
7.根据权利要求6所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，还包括对肾癌循环肿瘤细胞的冻存和复苏过程，具体步骤为：
冻存：将肾癌循环肿瘤细胞消化离心后，以无血清冻存液重悬，随后每毫升分装一个冻存管，于-80℃保存；
复苏：将-80℃中的细胞拿出迅速在39℃的水浴锅中融化，期间晃动冻存管，整个过程控制在3分钟内，随后以10倍体积的培养基重悬融化的细胞，800g离心5分钟，弃上清，使用新鲜培养基重悬。
8.根据权利要求7所述的一种肾癌循环肿瘤细胞系获取分离及培养方法，其特征在于，所述小鼠为SPF级NOD/SCID小鼠。
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