CN116649297A - 一种高级别浆液性卵巢癌pdx模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，属于生物科学技术领域，其技术方案要点包括有卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3，在于提供高级别浆液性卵巢癌PDX模型的建立方法，通过卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织分为4部分，并将其中通过含有1％双抗Hank's平衡盐溶液冷藏运送的一个部分作为模型原料P0，随后对实验鼠进行卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1建立、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2建立和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3建立实验，从而通过稳定构建的高级别浆液性卵巢癌PDX模型为筛选疗效更优的抗卵巢癌药物，制定个体化的治疗方案奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，特别涉及一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法。
背景技术
1、卵巢癌是全球第三大致命的妇科恶性肿瘤，在世界各地都呈现较高死亡率。卵巢癌具有异质性，病理类型多样，包括卵巢上皮性肿瘤、生殖细胞肿瘤、性索间质肿瘤等，其中卵巢上皮性癌(卵巢癌)占卵巢恶性肿瘤的80％。高级别浆液性卵巢癌属于上皮性卵巢癌，包括浆液性、粘液性、子宫内膜样等。高级别通常表示癌细胞分化程度较低，恶性程度较高，容易转移和复发，因此高级别浆液性卵巢癌预后较差，患者存活时间较短；
2、传统的妇科恶性肿瘤临床前研究在很大程度上依赖于克隆的癌源细胞系和从这些细胞系中获得的肿瘤异种移植瘤，但是使用细胞系进行转化研究存在明显的缺点，主要表现为：癌细胞株不可逆地丧失了原始肿瘤重要的生物学特性，细胞株及其异种移植模型不能准确地反应卵巢癌的原始表型及基因组特征。故导致了在肿瘤研究中，许多临床前研究结果与实际临床治疗效果相比存在较大差异，对临床治疗的指导价值有限；
3、人源性异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型的构建：说明书手术切除的新鲜肿瘤组织，将坏死和液化部分剔除后，剩余部分切成组织小块，通过皮下包埋或原位种植到免疫缺陷小鼠的体内进行培养，卵巢癌PDX模型来源于未经培养的人类肿瘤，在保留细胞遗传学、细胞复杂性、血管和间质肿瘤结构的情况下，更好地表现了妇科恶性肿瘤和人类肿瘤微环境的异质性。
发明内容
4、模型能够准确反映与人类卵巢癌发生和发展相关的细胞和分子变化，是一种较为理想的人肿瘤动物模型。其价值可体现在包括靶向治疗在内的临床前药物筛选和生物标志物鉴定中，从而实现个体化治疗。因此，本领域迫切需要高级别浆液性卵巢癌PDX模型的建立方法以解决卵巢癌临床前研究中的不足。
本发明针对以上问题，提出一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法通过稳定构建高级别浆液性卵巢癌PDX模型为筛选疗效更优的抗卵巢癌药物，制定个体化的治疗方案奠定基础来解决上述问题。
本发明是这样实现的，所述高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法包括有卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3。
为了得到卵巢癌PDX皮下移植瘤建立模型数据，作为本发明的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法优选的，所述卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1操作步骤如下：
AS1：卵巢癌原代组织的获取、保存及运输：在卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织送至病理科进行确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织其分为4部分：①置于含有1％双抗Hank's平衡盐溶液中冷藏运送；②置于有RNAlater冻存管中4℃过夜后液氮保存为后续分子实验研究；③置于4％中性甲醛溶液中固定，用作病理等实验研究。④置于冻存液中液氮快速冷冻后保存，用于肿瘤复苏实验。将装有①标本的离心管标记为P0代，立即放入冰盒中保存运送，在标本离体3～4h内完成小鼠皮下接种；
AS2:原代组织的皮下移植：无菌V型槽中加入10mL Hank's液，将原代组织放入V型槽中，剔除周围坏死液化组织和脂肪组织后剪成若干个2mm*2mm小瘤块备用。5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，背部常规75％酒精消毒，在右后腿臀部上方皮肤剪一个小口，将肿瘤组织块装入套管针植入皮下，左右后腿双侧皮下接种，用5-0可吸收性外科缝合线缝好伤口，酒精再次消毒伤口，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，命名为P1代鼠，密切观察术后小鼠生长情况；
AS3：PDX成瘤传代、冻存及鉴定：P1代肿瘤在小鼠皮下生长达500-1000mm3则进行动物体内传代。颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精消毒背部皮肤，无菌器械剪开皮肤，剥离皮下肿瘤，V型槽中洗涤肿瘤组织，将组织分为三份，其中一份用于P2传代移植，一份加RNAlater液氮保存，另一份加4％中性甲醛溶液固定用于病理鉴定，传代移植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型，待小鼠皮下肿瘤体积生长至500-1000mm 3左右时取出肿瘤组织，重复上述肿瘤传代方法，建立P3、P4、P5代卵巢癌小鼠模型。
为了得到卵巢癌PDX原位移植瘤建立模型数据，作为本发明的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法优选的，所述卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2操作步骤如下：
BS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15～20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，
吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12
培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×108个/mL，冰浴下待用；
BS2：使用5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，消毒背部皮肤。在裸鼠背部正中纵行剪开长约1cm，向左侧牵拉皮肤，暴露右侧腹膜，显微无损伤镊轻轻提起腹膜后剪开进入腹腔，于右肾下极脂肪垫处找到卵巢子宫，显微无损伤镊小心牵拉出卵巢于腹膜外，无损伤镊固定卵巢位置，显微注射器于卵巢处多点注射上述细胞悬液共5μL，5×10 5个/只。将卵巢囊还纳于腹腔，可吸收外科缝合线缝合腹膜及皮肤，75％酒精消毒皮肤，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，密切观察术后裸鼠的生长情况。
为了得到卵巢癌PDX腹腔转移瘤建立模型数据，作为本发明的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法优选的，所述卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3操作如下：
CS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15-20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，
吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×10 7个/mL，冰浴下待用；
CS2：小鼠腹部皮肤常规75％酒精消毒，无菌注射器吸取0.2mL细胞悬液后腹腔注射，密切观察术后小鼠的生长情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该种一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，在于提供高级别浆液性卵巢癌PDX模型的建立方法，通过卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织分别对实验鼠进行卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1建立、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2建立和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3建立实验，从而通过稳定构建的高级别浆液性卵巢癌PDX模型为筛选疗效更优的抗卵巢癌药物，制定个体化的治疗方案奠定基础。
附图说明
图1为本发明的高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法原理；
图2为本发明的患者肿瘤组织原料运输保存方法；
图3为本发明卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1的AS2操作流程；
图4为本发明卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1的AS3操作流程建立流程；
图5为本发明卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2离心沉淀操作流程；
图6为本发明卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2的BS2操作流程；
图7为本发明卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3离心沉淀操作流程；
图8为本发明卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3的CS2流程；
图9为本发明卵巢癌PDX皮下转移瘤模型的NOG瘤体解剖图；
图10为本发明卵巢癌PDX原位移植瘤模型的NOG瘤体解剖图；
图11为本发明卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型的NOG瘤体ICG成像图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”“宽度”“上”“下”“前”“后”“左”“右”“竖直”“水平”“顶”“底”“内”“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
请参阅图1-8，一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法包括有卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3。
作为本发明的一种技术优化方案，卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1操作步骤如下：
AS1：卵巢癌原代组织的获取、保存及运输：在卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织送至病理科进行确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织其分为4部分：①置于含有1％双抗Hank's平衡盐溶液中冷藏运送；②置于有RNAlater冻存管中-80℃过夜后液氮保存为后续分子实验研究；③置于4％中性甲醛溶液中固定，用作病理等实验研究；④置于冻存液中液氮快速冷冻后保存，用于肿瘤复苏实验。将装有①标本的离心管标记为P0代，立即放入冰盒中保存运送，在标本离体3-4h内完成小鼠皮下接种；
AS2:原代组织的皮下移植：无菌V型槽中加入10mL Hank's液，将原代组织放入V型槽中，剔除周围坏死液化组织和脂肪组织后剪成若干个2mm×2mm小瘤块备用。5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，背部常规75％酒精消毒，在右后腿臀部上方皮肤剪一个小口，将肿瘤组织块装入套管针植入皮下，左右后腿双侧皮下接种，用5-0可吸收性外科缝合线缝好伤口，酒精再次消毒伤口，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，命名为P1代鼠，密切观察术后小鼠生长情况；
AS3：PDX成瘤传代、冻存及鉴定：P1代肿瘤在小鼠皮下生长达500-1000mm3则进行动物体内传代。颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精消毒背部皮肤，无菌器械剪开皮肤，剥离皮下肿瘤，V型槽中洗涤肿瘤组织，将组织分为三份，其中一份用于P2传代移植，一份加RNAlater液氮保存，另一份加4％中性甲醛溶液固定用于病理鉴定，传代移植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型，待小鼠皮下肿瘤体积生长至500-1000mm 3左右时取出肿瘤组织，重复上述肿瘤传代方法，建立P3、P4、P5代卵巢癌小鼠模型。
本实施例中：一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，通过在卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织送至病理科进行确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织其分为4部分，并将其中含有1％双抗Hank's平衡盐溶液中冷藏运送的部分作为模型原料P0，接着3～4h内完成小鼠皮下接种，当接种完成后，P1代肿瘤在小鼠皮下生长达500-1000mm3则进行动物体内传代，随后从P1代小鼠背部剥离皮下三组肿瘤，取其中一组植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型，从而重复肿瘤传代方法，建立P3、P4、P5代卵巢癌小鼠模型。
作为本发明的一种技术优化方案，卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2操作步骤如下：
BS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15～20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，
吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12
培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×108个/mL，冰浴下待用；
BS2：使用5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，消毒背部皮肤。在裸鼠背部正中纵行剪开长约1cm，向左侧牵拉皮肤，暴露右侧腹膜，显微无损伤镊轻轻提起腹膜后剪开进入腹腔，于右肾下极脂肪垫处找到卵巢子宫，显微无损伤镊小心牵拉出卵巢于腹膜外，无损伤镊固定卵巢位置，显微注射器于卵巢处多点注射上述细胞悬液共5μL，5*10 5个/只。将卵巢囊还纳于腹腔，可吸收外科缝合线缝合腹膜及皮肤，75％酒精消毒皮肤，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，密切观察术后裸鼠的生长情况。
本实施例中：将P0肿瘤样本进行清理和使用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡，随后取下1mm3肿瘤转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h，接着通过吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化，接着用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀后调整细胞浓度约1.0×108个/mL，随后使用显微注射器于小鼠卵巢处多点注射上述细胞悬液共5μL，5×10 5个/只后对小鼠进行观察，从而完成卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2的建立。
作为本发明的一种技术优化方案，卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3操作如下：
CS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15～20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1：1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，
吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×10 7个/mL，冰浴下待用；
CS2：小鼠腹部皮肤常规75％酒精消毒，无菌注射器吸取0.2mL细胞悬液后腹腔注射，密切观察术后小鼠的生长情况。
本实施例中：通过对P0肿瘤样本进行清理和使用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡，随后取下1mm3肿瘤转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h，接着通过吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化，接着用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀后调整细胞浓度约1.0×10 7个/mL，随后无菌注射器吸取0.2mL细胞悬液对小鼠后腹腔注射，随后密切观察小鼠反应，从而完成卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3的建立。
本发明的工作原理及使用流程：使用时，通过在卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织送至病理科进行确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织其分为4部分，并将其中通过含有1％双抗Hank's平衡盐溶液中冷藏运送的一个部分作为模型原料P0，为后期进行建立卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3。
1.在建立卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1的过程中：
将原料P0在接着3～4h内完成小鼠皮下接种，当接种完成后，得到P1代鼠，当肿瘤在P1代小鼠皮下生长达500-1000mm3则进行动物体内传代，随后从小鼠背部剥离皮下三组肿瘤，取其中一组植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型，从而重复肿瘤传代方法，建立P3、P4、P5代卵巢癌小鼠模型。传代移植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型；
2.在建立卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2的过程中：
将P0肿瘤样本进行清理和使用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡，随后取下1mm3肿瘤转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1：1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h，接着通过吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化，接着用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀后调整细胞浓度约1.0×108个/mL，随后使用显微注射器于小鼠卵巢处多点注射上述细胞悬液共5μL，5×10 5个/只后对小鼠进行观察，从而完成卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2的建立；
3.在建立卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3的过程中：
通过对P0肿瘤样本进行清理和使用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡，随后取下1mm3肿瘤转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h，接着通过吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化，接着用1-2mLDMEM/F12培养基重悬沉淀后调整细胞浓度约1.0×10 7个/mL，随后无菌注射器吸取0.2mL细胞悬液对小鼠后腹腔注射，随后密切观察小鼠反应，从而完成卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3的建立；
通过卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织分别对实验鼠进行卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1建立、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2建立和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3建立实验，从而通过稳定构建的高级别浆液性卵巢癌PDX模型为筛选疗效更优的抗卵巢癌药物，制定个体化的治疗方案奠定基础。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，其特征在于，所述高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法包括有卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1、卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2和卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3。
2.根据权利要求1所述的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，其特征在于：所述卵巢癌PDX皮下移植瘤模型A1操作步骤如下：
AS1：卵巢癌原代组织的获取、保存及运输：在卵巢癌患者手术过程中切取部分肿瘤组织送至病理科进行确诊确定为高级别浆液性卵巢癌后将肿瘤组织分为4部分：①置于含有1％双抗Hank's平衡盐溶液中冷藏运送；②置于有RNAlater冻存管中4-80℃过夜后液氮保存为后续分子实验研究；③置于4％中性甲醛溶液中固定，用作病理等实验研究；④置于冻存液中液氮快速冷冻后保存，用于肿瘤复苏实验。将装有①标本的离心管标记为P0代，立即放入冰盒中保存运送，在标本离体3～4h内完成小鼠皮下接种；
AS2：原代组织的皮下移植：无菌V型槽中加入10mL Hank's液，将原代组织放入V型槽中，剔除周围坏死液化组织和脂肪组织后剪成若干个2mm*2mm小瘤块备用。5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，背部常规75％酒精消毒，在右后腿臀部上方皮肤剪一个小口，将肿瘤组织块装入套管针植入皮下，左右后腿双侧皮下接种，用5-0可吸收性外科缝合线缝好伤口，酒精再次消毒伤口，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，命名为P1代鼠，密切观察术后小鼠生长情况；
AS3：PDX成瘤传代、冻存及鉴定：P1代肿瘤在小鼠皮下生长达500-1000mm3则进行动物体内传代。颈椎脱臼法处死小鼠，75％酒精消毒背部皮肤，无菌器械剪开皮肤，剥离皮下肿瘤，V型槽中洗涤肿瘤组织，将组织分为三份，其中一份用于P2传代移植，一份加RNAlater液氮保存，另一份加4％中性甲醛溶液固定用于病理鉴定，传代移植瘤块按S2所述方法，建立P2代卵巢癌小鼠模型，待小鼠皮下肿瘤体积生长至500-1000mm 3左右时取出肿瘤组织，重复上述肿瘤传代方法，建立P3、P4、P5代卵巢癌小鼠模型。
3.根据权利要求1所述的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，其特征在于：所述卵巢癌PDX原位移植瘤模型A2操作步骤如下：
BS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15～20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×108个/mL，冰浴下待用；
BS2：使用5％异氟烷持续吸入麻醉小鼠，俯卧位，消毒背部皮肤。在裸鼠背部正中纵行剪开长约1cm，向左侧牵拉皮肤，暴露右侧腹膜，显微无损伤镊轻轻提起腹膜后剪开进入腹腔，于右肾下极脂肪垫处找到卵巢子宫，显微无损伤镊小心牵拉出卵巢于腹膜外，无损伤镊固定卵巢位置，显微注射器于卵巢处多点注射上述细胞悬液共5μL，5×10 5个/只。将卵巢囊还纳于腹腔，可吸收外科缝合线缝合腹膜及皮肤，75％酒精消毒皮肤，烤灯照射恢复小鼠体温，自然苏醒，密切观察术后裸鼠的生长情况。
4.根据权利要求1所述的一种高级别浆液性卵巢癌PDX模型建立方法，其特征在于：所述卵巢癌PDX腹腔转移瘤模型A3操作如下：
CS1：将P0肿瘤样本置于35×15mm无菌玻璃培养皿中，用含1％三抗DMEM/F12培养基浸泡样本15～20min，期间用眼科剪和镊子除去肿瘤样本多余脂肪及结缔组织，吸去浸泡液。将肿瘤组织剪成1mm3左右小碎块并转移至50mL离心管中，加入15mL组织消化酶采用12mL组织消化酶瓶(DMEM/F12进行1:1稀释)，放置于37℃恒温摇床中消化0.5-1.0h。肉眼观察无明显颗粒状物体，摇晃后管内液体呈糊状、粘液顺滑。用巴氏吸管轻吹打消化液，吸取少量悬液，涂片后镜下观察几乎无组织块状，至少80％呈单细胞状，判断为消化时间足够，终止消化。用巴士吸管反复吹打组织液，200目细胞筛过滤至试剂槽。收集过滤后细胞悬液，1500rpm离心15min，用1-2mL DMEM/F12培养基重悬沉淀，混匀，台盼蓝染色进行活细胞计数，调整细胞浓度约1.0×10 7个/mL，冰浴下待用；
CS2：小鼠腹部皮肤常规75％酒精消毒，无菌注射器吸取0.2mL细胞悬液后腹腔注射，密切观察术后小鼠的生长情况。
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| CN202310582596.XA CN116649297A (zh) | 2023-05-23 | 2023-05-23 | 一种高级别浆液性卵巢癌pdx模型建立方法 |
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| CN (1) | CN116649297A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118397220A (zh) * | 2024-07-01 | 2024-07-26 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 一种基于医学影像数据分析的肾肿瘤及癌栓造模方法 |
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2023
- 2023-05-23 CN CN202310582596.XA patent/CN116649297A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118397220A (zh) * | 2024-07-01 | 2024-07-26 | 中国人民解放军总医院第三医学中心 | 一种基于医学影像数据分析的肾肿瘤及癌栓造模方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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