CN108431212B - 胰内分泌细胞的制造方法和转分化剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胰内分泌细胞的制造方法，该方法包括将下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物导入体细胞内的导入工序：(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物；(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；以及(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。

Description

胰内分泌细胞的制造方法和转分化剂
技术领域
本发明涉及一种由体细胞制造胰内分泌细胞的胰内分泌细胞的制造方法、以及将体细胞转分化成胰内分泌细胞的转分化剂。
背景技术
胰内分泌细胞被期待用作糖尿病的再生医疗材料、以及用于筛选糖尿病治疗药的材料等。从上述再生医疗的角度考虑，例如，期待着对胰岛素不足的I型糖尿病患者给予作为胰内分泌细胞之一的、产生胰岛素的β细胞。
因此，强烈要求开发一种在体外大量制备胰内分泌细胞的方法。
迄今为止，有人提出了利用胚胎干细胞(embryonic stem cell、以下有时称作“ES细胞”)或人工多能性干细胞(induced pluripotent stem cell、以下有时称作“iPS细胞”)来制造β细胞的方法。然而，在上述方法中，需要在细胞培养用的培养基中加入各种参与成长分化的抑制剂等以调整培养环境，存在着繁琐的问题，另外，还存在着有时无法获得重现性的问题。另外，在上述方法中，由于还制造了β细胞以外的细胞，因此还存在着效率方面的问题。而且，到获得β细胞为止最少需要21天～30天，还存在着无法在短期内制造β细胞的问题。
因此，现状是强烈要求及时提供一种胰内分泌细胞的制造方法，所述制造方法简便且容易重现、生产效率优异、并且能够在短期内制造胰内分泌细胞。
此外，已知GLIS1(GLIS family zinc finger1)会改善iPS细胞的建立改善效率(例如参照专利文献1)。
然而，GLIS1参与将体细胞直接转变成胰内分泌细胞而不经过干细胞一事还完全未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2013－519371号公报
发明内容
技术问题
本发明的课题在于：解决上述现有的诸多问题，达到以下目的。即，本发明的目的在于提供：一种胰内分泌细胞的制造方法，所述制造方法简便且容易重现、生产效率优异、并且能够在短期内制造胰内分泌细胞；以及将体细胞转分化成胰内分泌细胞的转分化剂。
解决问题的方案
用于解决上述课题的方法如下。即：
＜1＞一种胰内分泌细胞的制造方法，其特征在于，包括下述的导入工序：将下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物导入体细胞内。
(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素(Neurogenin)3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜2＞一种转分化剂，该转分化剂将体细胞转分化成胰内分泌细胞，其特征在于：
包含下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物。
(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
发明效果
根据本发明，可以解决上述现有的诸多问题，达到上述目的，可以提供：一种胰内分泌细胞的制造方法，该制造方法简便且容易重现、生产效率优异、并且可以在短期内制造胰内分泌细胞；以及将体细胞转分化成胰内分泌细胞的转分化剂。
附图说明
图1A是显示试验例1－1中产生DsRed2阳性胰岛素的细胞数的测定结果的图。
图1B是显示试验例1－1中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图1C是显示试验例1－2中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图2A是显示试验例2－1中产生DsRed2阳性胰岛素的细胞数的测定结果的图。
图2B是显示试验例2－1中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图2C是显示试验例2－2中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图3A是显示试验例3－1中产生DsRed2阳性胰岛素的细胞数的测定结果的图。
图3B是显示试验例3－1中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图3C是显示试验例3－2中胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图4是显示试验例4的葡萄糖应答性胰岛素分泌试验的结果的图。
图5是显示试验例5的葡萄糖应答性胰岛素分泌试验的结果的图。
图6是显示试验例6的胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图7是显示试验例7的胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
图8是显示试验例8的胰岛素基因的相对表达量的测定结果的图。
具体实施方式
(胰内分泌细胞的制造方法)
本发明的胰内分泌细胞的制造方法至少包括导入工序，根据需要还包括其他工序。
＜导入工序＞
上述导入工序是指将下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物导入体细胞内。
(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物(以下有时称作“基因或其基因产物(A)”)。
(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物(以下有时称作“基因或其基因产物(B)”)。
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物(以下有时称作“基因或其基因产物(C)”)。
(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物(以下有时称作“基因或其基因产物(D)”)。
上述基因产物是指由上述基因转录的mRNA、由上述mRNA翻译的蛋白。
＜＜基因或其基因产物＞＞
－方案－
通过上述导入工序导入体细胞内的基因或其基因产物的方案只要包括上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)、上述基因或其基因产物(C)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种即可，没有特别限定，可以根据目的而适当选择，在胰内分泌细胞的生产效率优异方面，优选包含上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种的方案，更优选包含上述基因或其基因产物(A)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种的方案。
通过上述导入工序导入体细胞内的基因或其基因产物可以只是上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)、上述基因或其基因产物(C)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种的方案，也可以是包含其他基因或其基因产物的方案。
－GLIS1基因或其基因产物－
对上述GLIS1基因的来源没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举人、小鼠等。
上述GLIS1基因的序列信息可以由公知的数据库获得，例如在NCBI中可以通过检索号NM＿147193(人)、NM＿147221(小鼠)来获取。
－突变GLIS1基因或其基因产物－
上述突变GLIS1基因是指与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的基因。
上述序列号:1所表示的碱基序列是编码缺失了小鼠GLIS1蛋白N末端的360个氨基酸残基的蛋白的基因的序列。
上述序列号:2所表示的碱基序列是编码缺失了人GLIS1蛋白N末端的190个氨基酸残基的蛋白的基因的序列。
与上述序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的序列同源性只要在85％以上即可，没有特别限定，可以根据目的而适当选择，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％以上，特别优选99％以上。
对上述序列同源性的确定方法没有特别限定，可以适当选择公知的方法，例如可以利用Karlin和Altscul的算法BLAST(Karlin,S.&Altschul,S.F.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264－2268、Karlin,S.&Altschul,S.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873)来确定。
－神经原素3基因或其基因产物－
对上述神经原素3基因的来源没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举人、小鼠等。
上述神经原素3基因的序列信息可以由公知的数据库获得，例如，在NCBI中可以通过检索号NM＿009719(小鼠)、NM＿020999(人)来获取。
－Pdx1基因或其基因产物－
对上述Pdx1基因的来源没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举人、小鼠等。
上述Pdx1基因的序列信息可以由公知的数据库获得，例如在NCBI中通过检索号NM＿000209(人)、NM＿008814(小鼠)来获取。
－MafA基因或其基因产物－
对上述MafA基因的来源没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举人、小鼠等。
上述MafA基因的序列信息可以由公知的数据库获得，例如在NCBI中可以通过检索号NM＿201589(人)、NM＿194350(小鼠)来获取。
－其他基因或其基因产物－
对上述其他基因或其基因产物没有特别限定，只要不损及本发明的效果即可，可以根据目的而适当选择。
上述GLIS1基因、突变GLIS1基因、神经原素3基因、Pdx1基因、MafA基因和其他基因的序列可以是由上述各基因的序列中仅编码蛋白的部分的序列构成的方案，也可以是包含编码蛋白的部分以外的序列的方案。
另外，只要不损及本发明的效果，上述GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物、MafA基因或其基因产物和其他基因或其基因产物可以包含突变。
作为上述突变，例如可以列举：对上述各基因的蛋白的氨基酸序列没有影响的突变；上述各基因的蛋白的氨基酸序列中有1个或多个(2个～5个)氨基酸发生缺失、取代、插入或添加而得到的突变等。
当上述GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物、MafA基因或其基因产物和其他基因或其基因产物具有突变时，其与野生型的序列同源性没有特别限定，只要不损及本发明的效果即可，可以根据目的而适当选择，在翻译成蛋白的部分的碱基序列中，优选70％以上，更优选80％以上，特别优选90％以上。
＜＜体细胞＞＞
对上述体细胞没有特别限定，可以根据目的而适当选择。上述体细胞可以是未分化的前体细胞，也可以是最终分化了的成熟细胞。
上述体细胞可以是来自ES细胞或者来自iPS细胞的体细胞。
作为上述体细胞的具体例子，例如可以列举源自脂肪组织的间质(干)细胞、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、肝细胞、上皮细胞、肾细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、神经细胞、神经胶质细胞等。其中，优选成纤维细胞、间充质干细胞、肝细胞、上皮细胞、肾细胞，更优选成纤维细胞、间充质干细胞。
对采集上述体细胞的个体的种类没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举人、小鼠等。
对采集上述体细胞的个体没有特别限定，可以根据目的而适当选择，在将所得的胰内分泌细胞用于再生医疗用途时，从排斥反应的角度考虑，优选个体本身、或者MHC型相同或者实质上相同的其他个体。这里，上述MHC型实质上相同是指，通过使用免疫抑制剤等将来自上述体细胞的胰内分泌细胞移植到个体中时，MHC型的一致达到了移植细胞能够生存的程度。
对采集上述体细胞的个体的时期没有特别限定，可以根据目的而适当选择。
对上述体细胞的培养条件没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如培养温度可以列举约37℃，CO2浓度可以列举约2％～5％等。
对上述体细胞的培养中使用的培养基没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举含有5质量％～20质量％的血清的最小必须培养基(以下有时称作“MEM”)、Dulbecco’s改良Eagle培养基(以下有时称作“DMEM”)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。
＜＜导入方法＞＞
将上述各基因或其基因产物导入体细胞内的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举使用载体的方法、使用合成的mRNA(信使RNA)的方法、使用重组蛋白的方法等。
－载体－
对上述载体没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举病毒载体、非病毒载体等。
作为上述病毒载体的具体例子，可以列举逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
作为上述非病毒载体的具体例子，可以列举质粒载体、附加型载体等。
将上述载体导入上述体细胞内的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择公知的方法。
使用上述逆逆转录病毒载体时的方法例如可以采用国际公开第2007/69666号、Cell,126，663－676(2006)、Cell,131,861－872(2007)等中记载的方法，使用上述慢病毒载体时的方法例如可以列举Science,318,1917－1920(2007)等中记载的方法。
另外，使用上述质粒载体时的方法例如可以采用Science,322,949－953(2008)等中记载的方法，使用上述附加型载体时的方法例如可以采用Science,324:797－801(2009)、Biochemical and Biophysical Research Communications,426:141－147(2012)等中记载的方法。
使用上述病毒载体时，可以使用利用包装细胞得到的病毒颗粒。
上述包装细胞是导入了编码病毒的结构蛋白的基因的细胞，向该细胞中导入插入了目标基因的重组病毒载体时，会产生插入有该目标基因的重组病毒颗粒。
对上述包装细胞没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举：以来自人肾脏的HEK293细胞、来自小鼠成纤维细胞的NIH3T3细胞作为基础的包装细胞；能够长期产生高效价病毒、且在MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus))LTR(长末端重复序列(long terminal repeats))的控制下表达病毒结构蛋白gag－pol和env的包装细胞Platinum－E(以下有时称作“Plat－E细胞”)；设计成表达来自双嗜性病毒(Amphotropic virus)的包膜糖蛋白的PLAT－A细胞；以及设计成表达来自疱疹性口腔炎病毒的包膜糖蛋白的PLAT－GP细胞等。
向上述包装细胞内导入病毒载体的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举脂质转染法、电穿孔法、磷酸钙法等。
用上述得到的病毒颗粒感染上述体细胞的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举聚凝胺法。
上述载体可以包含用于确认上述各基因的导入的标记基因。
上述标记基因是指，通过将该标记基因导入细胞内，能够进行细胞的分类及选择的基因。作为上述标记基因的具体例子，可以列举耐药性基因、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。这些标记基因可以单独使用一种，也可以并用两种以上。
作为上述耐药性基因的具体例子，可以列举新霉素耐性基因、四环素耐性基因、卡那霉素耐性基因、博来霉素耐性基因、潮霉素耐性基因等。
作为上述荧光蛋白基因的具体例子，可以列举绿色荧光蛋白(GFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因等。
作为上述发光酶基因的具体例子，可以列举萤光素酶基因等。
作为上述显色酶基因的具体例子，可以列举β半乳糖苷酶基因、β葡糖醛酸糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因等。
在利用上述载体将上述各基因导入体细胞内的方法中，1个载体中可以插入1个基因也可以插入2个以上的基因。通过在上述1个载体中插入2个以上的基因，可以使这2个以上的基因同时表达(以下有时称作“共表达”)。
在上述1个载体中插入2个以上的基因的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择，但优选通过连接序列插入上述2个以上的基因。
对上述连接序列没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举编码来自口蹄疫病毒(Picornaviridae Aphthovirus)的2A肽的基因序列、IRES(内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites))等。
将上述mRNA导入上述体细胞内的方法没有特别限定，可以适当选择采用公知的方法。
将上述重组蛋白导入上述体细胞内的方法没有特别限定，可以适当选择采用公知的方法。
向体细胞内导入上述各基因或其基因产物的次数没有特别限定，可以根据目的而适当选择，可以是1次，也可以是2次以上。
向体细胞内导入上述各基因或其基因产物的时期没有特别限定，可以根据目的而适当选择，可以同时导入所有的上述各基因或其基因产物，也可以在不同的时期导入。
向体细胞内导入上述各基因或其基因产物的导入量没有特别限定，可以根据目的而适当选择，所有的基因或其基因产物的导入量可以是等量，也可以分别是不同的量。
上述基因或其基因产物在同一基因或其基因产物中可以是仅使用基因的方案，也可以是仅使用基因产物的方案，还可以是使用两者的方案。
另外，在上述基因或其基因产物与不同的基因或其基因产物的组合中，可以是所有基因或其基因产物中的仅基因的组合，也可以是所有基因或其基因产物中的仅基因产物的组合，还可以是以任一种基因或基因产物作为基因、以其他的基因或基因产物作为基因产物的组合。
在上述基因或其基因产物的导入工序中，只要不损及本发明的效果，可以导入除上述基因或其基因产物以外的物质。
＜其他工序＞
对上述其他工序没有特别限定，只要不损及本发明的效果即可，可以根据目的而适当选择，例如可以列举导入有基因或其基因产物的细胞的培养工序等、即培养导入有上述各基因或其基因产物的体细胞。
－导入有基因或其基因产物的细胞的培养工序－
导入有上述基因或其基因产物的细胞的培养工序是指培养导入了上述各基因或其基因产物的体细胞的工序。
对导入有上述基因或其基因产物的细胞的培养条件没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如，培养温度可以列举约37℃，CO2浓度可以列举约2％～5％等。
对上述导入有基因或其基因产物的细胞的培养中使用的培养基没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举含有5质量％～20质量％的血清的MEM、DMEM、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。
对上述导入有基因或其基因产物的细胞的培养期间没有特别限定，可以根据目的而适当选择。
对上述培养基的替换频率没有特别限定，可以根据目的而适当选择，例如可以列举每2天～3天进行替换等。
＜胰内分泌细胞＞
对确认通过上述胰内分泌细胞的制造方法能否制造胰内分泌细胞的方法没有特别限定，可以根据目的而适当选择，可以列举：确认胰内分泌细胞所表达的蛋白的表达的方法、确认胰内分泌细胞所表达的基因的表达的方法等。
例如，是否制得胰内分泌细胞的α细胞可以通过胰高血糖素是否表达来确认，是否制得β细胞可以通过胰岛素是否表达来确认，是否制得δ细胞可以通过生长抑素是否表达来确认。
对确认上述蛋白的表达的方法没有特别限定，可以适当选择公知的方法，例如可以通过免疫染色来进行确认。
对确认上述基因的表达的方法没有特别限定，可以适当选择公知的方法，例如可以通过定量PCR来进行确认。
根据本发明的胰内分泌细胞的制造方法，通过转分化，可以由体细胞制造胰内分泌细胞，因此在不经过具有肿瘤形成风险的iPS细胞即可制造胰内分泌细胞方面有利。
此外，上述转分化是指由某细胞型不经过干细胞而直接转变成其他的细胞型。
另外，本发明的胰内分泌细胞的制造方法是指向体细胞内导入基因或其基因产物的简便且容易重现的方法，同时能够在短期内高效率地生产胰内分泌细胞。另外，根据本发明的胰内分泌细胞的制造方法，不必使用在培养基中添加生长抑制剂等等以进行调整培养环境的处理等的特殊培养基，即可制造胰内分泌细胞，在这方面也有利。
上述胰内分泌细胞可以是α细胞，也可以是β细胞，还可以是δ细胞，还可以是它们的混合物。其中，从对糖尿病患者的再生医疗的角度考虑，优选β细胞。
本发明的胰内分泌细胞例如可以适合用作用于再生医疗及糖尿病治疗药的筛选的胰内分泌细胞等。
(转分化剂)
本发明的转分化剂是将体细胞转分化成胰内分泌细胞的转分化剂，至少包括上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)、上述基因或其基因产物(C)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种，根据需要还包括其他的构成。
＜体细胞＞
上述转分化剂的对象的体细胞和上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的体细胞相同，优选方案也相同。
＜胰内分泌细胞＞
通过上述转分化剂得到的胰内分泌细胞与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的胰内分泌细胞相同，优选方案也相同。
＜基因或其基因产物＞
－方案－
作为上述转分化剂中的基因或其基因产物的方案，只要包括上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)、上述基因或其基因产物(C)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种即可，没有特别限定，可以根据目的而适当选择，在胰内分泌细胞的生产效率优异方面，优选包含上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种的方案，更优选包含上述基因或其基因产物(A)和上述基因或其基因产物(D)中的任一种的方案。
上述转分化剂中的基因或其基因产物可以仅是上述基因或其基因产物(A)、上述基因或其基因产物(B)、上述基因或其基因产物(C)和上述基因或其基因产物(D)中的任一项的方案，也可以是包含其他基因或其基因产物的方案。
－GLIS1基因或其基因产物－
上述GLIS1基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的GLIS1基因相同。另外，上述GLIS1基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。另外，上述GLIS1基因或其基因产物可以包含与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变相同的突变。
－突变GLIS1基因或其基因产物－
上述突变GLIS1基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变GLIS1基因相同。另外，上述突变GLIS1基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。
－神经原素3基因或其基因产物－
上述神经原素3基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的神经原素3相同。另外，上述神经原素3基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。另外，上述神经原素3基因或其基因产物可以包含与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变相同的突变。
－Pdx1基因或其基因产物－
上述Pdx1基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的Pdx1基因相同。另外，上述Pdx1基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。另外，上述Pdx1基因或其基因产物可以包含与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变相同的突变。
－MafA基因或其基因产物－
上述MafA基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的MafA基因相同。另外，上述MafA基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。另外，上述MafA基因或其基因产物可以包含与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变相同的突变。
－其他基因或其基因产物－
上述的其他基因与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的其他基因相同。另外，上述的其他基因序列的方案与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的方案相同。另外，上述其他基因或其基因产物可以包含与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的突变相同的突变。
上述转分化剂中的上述各基因或其基因产物可以是将该基因插入载体中的方案，也可以是合成mRNA的方案，还可以是重组蛋白的方案。
作为上述载体，可以列举与上述胰内分泌细胞的制造方法项下记载的载体相同的载体。
上述合成mRNA、上述重组蛋白可以通过公知的方法进行制造。
＜其他构成＞
对上述的其他构成没有特别限定，只要不损及本发明的效果即可，可以根据目的而适当选择。
上述转分化剂可以是上述各基因或其基因产物分摊到各个容器中的方案，也可以是集中在1个容器中的方案，还可以是每任意数量集中在容器中的方案。
对上述转分化剂中的上述各基因或其基因产物的量没有特别限定，所有的基因或其基因产物可以是等量，也可以是不同的量。
上述转分化剂可以适合用作胰内分泌细胞制造用试剂盒的构成。
上述胰内分泌细胞制造用试剂盒至少包含上述的转分化剂，根据需要还包含其他的构成。
对上述胰内分泌细胞制造用试剂盒中的其他构成没有特别限定，只要不损及本发明的效果即可，可以根据目的而适当选择，例如可以列举包装细胞、培养基等。
作为上述包装细胞、培养基，可以列举与上述胰内分泌细胞的制造方法项下所记载的相同的包装细胞、培养基。
实施例
下面，列举试验例来说明本发明，但本发明并不受下述试验例的任何限定。
(试验例1－1：胰内分泌细胞的制造－1－1)
＜细胞的制备＞
如下操作，制备作为体细胞之一的双重荧光标记的小鼠胚胎成纤维细胞(dual－labeled－mouse embryonic fibroblast、以下有时称作“dMEF”)。
－将胰内分泌前体细胞用GFP进行了荧光标记的基因修饰小鼠的制作－
如下操作，制作了将胰内分泌前体细胞用GFP进行了荧光标记的基因修饰小鼠(在Ngn3基因的启动子控制下表达EGFP的小鼠(Ngn3－eGFP))。
将在由BAC克隆分离的Ngn3基因的启动子(5kb)的下游连接有GFP和核定位信号(以下有时称作“nls”)的融合蛋白基因的构建体显微注射到约400个受精卵中，制作将胰内分泌前体细胞用GFP进行了荧光标记的基因修饰小鼠。
－将胰β细胞用DsRed2进行了荧光标记的基因修饰小鼠的制作－
如下操作，制作了将胰β细胞用DsRed2进行了荧光标记的基因修饰小鼠(在大鼠胰岛素启动子控制下表达DsRed2的小鼠(Ins－DsR))。
将在大鼠胰岛素基因的启动子(800bp)的下游连接有DsRed2基因的构建体显微注射到约400个受精卵中，制作将胰β细胞用DsRed2进行了荧光标记的基因修饰小鼠。
－双重荧光标记小鼠胚胎成纤维细胞的制作－
使上述胰内分泌前体细胞用GFP进行了荧光标记的基因修饰小鼠和上述胰β细胞用DsRed2进行了荧光标记的基因修饰小鼠交配，之后将产仔小鼠(杂合)的雌和雄交配，制作出通过基因组DNA印迹法进行了同源化的双重荧光标记基因修饰小鼠(Ngn3－eGFP/Ins－DsR)。使上述同源化了的双重荧光标记基因修饰小鼠的雌和雄交配(2对)，使用小镊子从子宫内摘出16只胚胎期第14.5天的胎儿，在超净工作台内用装有10mL磷酸缓冲盐水(含10mg/mL的卡那霉素)的10cm培养皿清洗血液，之后在装有10mL DMEM(Sigma公司制造、#D5796；含青霉素、链霉素、10％的FBS)的10cm细胞培养皿(TPP公司制造、#93150)内，使用剪刀细切胚胎。将细切了的胚胎组织转移到15mL的管中，在1.4krpm、室温下离心4分钟，舍去上清，在颗粒中加入1mL含有0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液(和光纯药工业株式会社制造、#201－16945)(含有0.25％的DNase I)，悬浮后在37℃的水浴中培养。每隔10分钟用手搅拌。将5mL的DMEM(含10％FBS)装入15mL管中，充分悬浮1只分的胚胎组织片段，移入装有5mLDMEM的10cm的细胞培养皿中，在37℃、5％CO2培养箱中培养，第二天换成10mL的DMEM(含有10％的FBS)，以后每2天替换一次培养基。约4天～5天后用6mL的磷酸缓冲盐水(以下有时称作“PBS”)清洗增加至满满的10cm培养皿的dMEF，之后加入1mL含0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，在37℃、5％CO2培养箱内2分钟后确认细胞被剥离，之后加入10mL的DMEM(含10％FBS)充分悬浮，在5个新的10cm培养皿中接种1个培养皿分的dMEF，进一步培养。在5天～6天后确认dMEF在汇合中增殖，用6mL PBS清洗后，加入1mL 0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液，在37℃、5％CO2培养箱内2分钟后确认细胞被剥离，之后加入6mL的DMEM(含10％FBS)，充分悬浮，装入50mL管中，在1.4krpm、室温下离心4分钟，之后舍去上清，在细胞颗粒中加入10mL的CELLBANKER(Takara Bio株式会社制造、#CB011)，悬浮后，在小管中分别注入0.5mL，在－145℃的超低温冷库内保管。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－E细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体)，如下操作，制作逆转录病毒(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)，所述Plat－E细胞在MoMuLVLTR的控制下表达能够长期产生高效价的病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
pMX－GFP载体是在pMX载体和pMXpuro载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码GFP蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码全长GFP蛋白的基因序列在NCBI通过检索号L29345来检索。
[pMX－小鼠GLIS1载体]
pMX－小鼠GLIS1载体是在pMX载体(由Addgene获取)的多克隆位点插入了编码小鼠GLIS1蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码小鼠全长GLIS1蛋白的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿147221来检索。
[pMX－小鼠神经原素3载体]
pMX－小鼠神经原素3载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码小鼠神经原素3蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码小鼠全长神经原素3蛋白的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿009719来检索。
[pMX－小鼠Pdx1载体]
pMX－小鼠Pdx1载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码小鼠Pdx1蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码小鼠全长Pdx1蛋白的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿008814来检索。
[pMX－小鼠MafA载体]
pMX－小鼠MafA载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码小鼠MafA蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码小鼠MafA蛋白全长的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿194350来检索。
－逆转录病毒的制作－
在使用经PBS稀释了10倍的聚－L－赖氨酸(Sigma公司制造、P8920)进行了包被处理(37℃、5％CO2下1小时)的6孔板(TPP公司制造、92406)上以8×105细胞数/孔接种Plat－E细胞，培养一夜。
第二天，将4μg上述的质粒DNA加入到装有250μL OPTI－MEM(注册商标)(LifeTechnologies公司制造、11058021)的1.5mL管中，通过振动进行混合，在室温下放置5分钟(以下有时称作“质粒/OPTI－MEM溶液”)。另一方面，在装有250μL OPTI－MEM的另一个1.5mL管中加入10μL LIPOFECTAMINE(注册商标)2000(LP2000)(Life Technologies公司制造、11668500)，混合，在室温下放置5分钟(以下有时称作“LP2000/OPTI－MEM溶液”)。将上述质粒/OPTI－MEM溶液和上述LP2000/OPTI－MEM溶液充分混合，在室温下静置20分钟(以下有时称作“质粒/LP2000/OPTI－MEM混合液”)。
将形成了脂质体DNA复合体的上述质粒/LP2000/OPTI－MEM混合液添加(转染)到培养前一天接种的Plat－E细胞的6孔板的1个孔中。混合后，在37℃、5％CO2培养箱内培养一夜。24小时后进行培养基替换，重新添加1.5mL的DMEM(含10％FBS)，再培养24小时。
转染后48小时用2.5mL的注射器(Terumo株式会社制造、SS－02SZ)回收含有病毒颗粒的培养上清，使用0.45滤器(Whatman公司制造、PURADISC FP30(CA－S0.45μm)、10462100)除去Plat－E细胞，将含有病毒颗粒的培养上清转移到2.0mL管中。
通过以上操作，得到来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
通过用上述逆转录病毒感染上述dMEF，将基因导入细胞中。如下操作，进行感染。
将上述dMEF以2.5×104细胞数/孔接种在24孔板上。
第二天，在上述病毒溶液中添加8mg/mL的聚凝胺溶液(Sigma公司制造、107689)使最终浓度达到8μg/mL。吸引除去上述的dMEF培养上清后，在24孔板的每个孔中分别加入200μL下述的病毒溶液。此外，用含有8μg/mL聚凝胺的DMEM(含10％FBS)溶液进行调整，使各孔的病毒溶液的量达到均匀。添加病毒溶液后，在37℃、5％CO2培养箱内进行培养。培养中，每隔2天或3天进行培养基替换。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液
(3)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
(4)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
＜来自dMEF的产生胰岛素的细胞数的确定＞
进行上述的导入，在培养22天后，使用荧光显微镜装置(CARL ZEISSAxiovert200M)拍摄DsRed2阳性产胰岛素的细胞。
统计分析如下进行。
在孔中添加Hoechst 33342(Life Technologies公司制造、H1399)使最终浓度达到0.1μg/ml，之后使用高端细胞成像装置(Thermo Fisher Scientific公司制造、ArrayScan XTI)，对于在37℃、5％CO2培养箱内培养30分钟以上的细胞培养多孔板的各孔，将物镜设定为10倍，拍摄100个视野，测定100个视野中的所有细胞数中的DsRed2阳性产胰岛素的细胞数。结果见图1A。
图1A中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“GNM”显示使用(3)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果，“GNPM”显示使用(4)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果。
图1A的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
＜定量PCR分析＞
进行上述的导入，使用培养24天后的细胞，如下操作，进行定量PCR分析，研究胰岛素基因相对于GAPDH基因的相对表达量。
将上述细胞悬浮在细胞溶解液中，利用qPCR用SuperPrepTM Cell Lysis&RT试剂盒(东洋纺株式会社制造、#SCQ－101)或SV 96总RNA分离系统(Promega公司制造、#Z3505)、ReverTraAce qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(东洋纺株式会社制造、#FSQ－301)进行RNA制备和cDNA合成，之后使用GeneAce SYBR qPCR Mixα(日本GENE株式会社制造)，通过Roche Light Cycler480进行定量PCR。
此外，定量PCR中使用的引物如下所示。
－小鼠GAPDH基因－
正向引物：5’－tggagaaacctgccaagtatg－3’(序列号:3)
反向引物：5’－ggagacaacctggtcctcag－3’(序列号:4)
－小鼠胰岛素2基因－
正向引物：5’－tttgtcaagcagcacctttg－3’(序列号:5)
反向引物：5’－ggtctgaaggtcacctgctc－3’(序列号:6)
定量PCR分析的结果见图1B。图1B中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“GNM”显示使用(3)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果，“GNPM”显示使用(4)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果。
图1B的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，胰岛素基因的表达量也增加，从这个角度考虑，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
(试验例1－2：胰内分泌细胞的制造－1－2)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－GP细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体、VSVG载体)，如下操作，制作逆转录病毒，所述Plat－GP细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－GFP载体。
[pMX－人GLIS1载体]
pMX－人GLIS1载体是在pMX载体(由Addgene获取)的多克隆位点插入了编码pMX－人GLIS1蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码pMX－人GLIS1蛋白全长的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿147193来检索。
[pMX－人神经原素3载体]
pMX－人神经原素3载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码人神经原素3蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码人神经原素3蛋白全长的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿020999来检索。
[pMX－人Pdx1载体]
pMX－人Pdx1载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码人Pdx1蛋白全长的基因的载体。此外，上述编码人Pdx1蛋白全长的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿000209来检索。
[pMX－人MafA载体]
pMX－人MafA载体是在pMX载体(由东京大学医学研究所获取)的多克隆位点插入了编码人MafA蛋白全长基因的载体。此外，上述编码人MafA蛋白全长的基因的序列在NCBI中通过检索号NM＿201589来检索。
－逆转录病毒的制作－
在利用经PBS稀释了10倍的聚－L－赖氨酸(Sigma公司制造、P8920)进行了包被处理(37℃、5％CO2下1小时)的6孔板(TPP公司制造、92406)上，以8×105细胞数/孔接种Plat－GP细胞，培养一夜。
第二天，在装有250μL OPTI－MEM(注册商标)(Life Technologies公司制造、11058021)的1.5mL管中加入4μg上述的质粒DNA(2μg pMX载体、2μg VSVG载体)，通过振动进行混合，在室温下放置5分钟(以下有时称作“质粒/OPTI－MEM溶液”)。另一方面，在另一个装有250μL OPTI－MEM的1.5mL管中，加入10μL LIPOFECTAMINE(注册商标)2000(LP2000)(Life Technologies公司制造、11668500)进行混合，在室温下放置5分钟(以下有时称作“LP2000/OPTI－MEM溶液”)。将上述质粒/OPTI－MEM溶液和上述LP2000/OPTI－MEM溶液充分混合，在室温下静置20分钟(以下有时称作“质粒/LP2000/OPTI－MEM混合液”)。
向培养前一天接种的Plat－GP细胞的6孔板的1个孔中添加形成了(转染)脂质体DNA复合体的上述质粒/LP2000/OPTI－MEM混合液。混合后，在37℃、5％CO2培养箱内培养一夜。24小时后进行培养基交换，重新添加1.5mL DMEM(含10％FBS)，再培养24小时。
转染后48小时用2.5mL注射器(Terumo株式会社制造、SS－02SZ)回收含有病毒颗粒的培养上清，用0.45滤器(Whatman公司制造、PURADISC FP30(CA－S0.45μm)、10462100)除去Plat－GP细胞，将含有病毒颗粒的培养上清转移到2.0mL管中。
通过上述操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
通过使上述dMEF感染上述逆转录病毒，将基因导入细胞内。感染通过如下操作来进行。
以2.5×104细胞数/孔在24孔板上接种上述dMEF。
第二天，在上述病毒溶液中添加8mg/mL的聚凝胺溶液(Sigma公司制造、107689)使最终浓度达到8μg/mL。吸引除去上述dMEF的培养上清，之后在24孔板的每孔中分别加入200μL下述的病毒溶液。此外，用含有8μg/mL聚凝胺的DMEM(含有10％FBS)溶液进行调整，使各孔的病毒溶液的量均匀。添加病毒溶液后，在37℃、5％CO2培养箱内进行培养。培养中，每隔2天或3天进行培养基的交换。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液
(3)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
(4)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
定量PCR分析的结果见图1C。图1C中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“GNM”显示使用(3)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果，“GNPM”显示使用(4)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果。
图1C的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，即使在使用人基因的情况下，胰岛素基因的表达量也有所增加，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
(试验例2－1：胰内分泌细胞的制造－2－1)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－E细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体)，如下操作，制作了逆转录病毒，所述Plat－E细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了pMX－GFP载体。
[pMX－小鼠GLIS1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠GLIS1载体。
[pMX－小鼠突变GLIS1载体]
pMX－小鼠突变GLIS1载体是在pMX载体(由Addgene获取)的多克隆位点插入了编码缺失了小鼠GLIS1蛋白N末端的360个氨基酸残基的蛋白的基因的载体。
编码上述缺失了小鼠GLIS1蛋白N末端的360个氨基酸残基的蛋白的基因的序列用序列号:1表示，如下操作进行制备。
以上述pMX－小鼠GLIS1载体作为模板DNA，通过使用PrimeSTAR(注册商标)MAXDNA聚合酶(Takara Bio株式会社制造)的PCR法，扩增编码缺失了小鼠GLIS1蛋白N末端的360个氨基酸残基的蛋白的DNA片段。然后，通过琼脂糖电泳纯化上述DNA片段，将其插入pMX载体的BamHI位点和XhoI位点之间。上述插入片段的碱基序列通过测序反应来确认。
[pMX－小鼠神经原素3载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠神经原素3载体。
[pMX－小鼠Pdx1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠Pdx1载体。
－逆转录病毒的制作－
除了将上述试验例1－1中使用的质粒DNA换成本试验例的质粒DNA以外，进行相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－1中使用的病毒溶液换成下述病毒溶液以外，进行相同的操作，将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液
(3)来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液
＜来自dMEF的产生胰岛素的细胞数的确定＞
进行上述的导入，在培养17天后使用荧光显微镜装置拍摄DsRed2阳性产胰岛素的细胞，除此以外，进行与试验例1－1相同的操作，测定DsRed2阳性产胰岛素的细胞数。结果见图2A。
图2A中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“dGNP”显示使用(3)来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果。
图2A的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时，与使用GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时相比，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图2B。图2B中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“dGNP”显示使用(3)来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液时的结果。
图2B的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时，与使用GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时相比，胰岛素基因的表达量也有所增加，从这个角度考虑，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
(试验例2－2：胰内分泌细胞的制造－2－2)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－GP细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体、VSVG载体)，如下操作，制作了逆转录病毒，所述Plat－GP细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了pMX－GFP载体。
[pMX－人GLIS1载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备了pMX－人GLIS1载体。
[pMX－人突变GLIS1载体]
pMX－人突变GLIS1载体是在pMX载体(由Addgene获取)的多克隆位点插入了编码缺失了人GLIS1蛋白N末端的190个氨基酸残基的蛋白的基因的载体。
编码缺失了上述人GLIS1蛋白N末端的190个氨基酸残基的蛋白的基因的序列用序列号:2表示，如下操作进行制备。
以上述pMX－人GLIS1载体作为模板DNA，通过使用了PrimeSTAR(注册商标)MAXDNA聚合酶(Takara Bio株式会社制造)的PCR法，扩增编码缺失了人GLIS1蛋白N末端的190个氨基酸残基的蛋白的DNA片段。然后，通过琼脂糖电泳纯化上述DNA片段，将其插入pMX载体的BamHI位点和XhoI位点之间。上述插入片段的碱基序列通过测序反应来确认。
[pMX－人神经原素3载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人神经原素3载体。
[pMX－人Pdx1载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人Pdx1载体。
－逆转录病毒的制作－
除了将上述试验例1－2中使用的质粒DNA换成本试验例的质粒DNA以外，进行相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－2中使用的病毒溶液换成下述病毒溶液以外，进行相同的操作，将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液
(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图2C。图2C中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNP”显示使用(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液时的结果，“dGNP”显示使用(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液时的结果。
图2C的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时，即使在使用人基因的情况下，与使用GLIS1、神经原素3和Pdx1这3种因子时相比，胰岛素基因的表达量也有所增加，胰内分泌细胞的生产效率非常高。
(试验例3－1：胰内分泌细胞的制造－3－1)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－E细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体)，如下操作，制作了逆转录病毒，所述Plat－E细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了pMX－GFP载体。
[pMX－小鼠GLIS1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠GLIS1载体。
[pMX－小鼠突变GLIS1载体]
进行与上述试验例2－1相同的操作，制备pMX－小鼠突变GLIS1载体。
[pMX－小鼠神经原素3载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠神经原素3载体。
[pMX－小鼠Pdx1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠Pdx1载体。
[pMX－小鼠MafA载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠MafA载体。
－逆转录病毒的制作－
除了将上述试验例1－1中使用的质粒DNA换成本试验例的质粒DNA以外，进行相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－1中使用的病毒溶液换成下述病毒溶液以外，进行相同的操作，将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
(3)来自pMX－小突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
＜来自dMEF的产胰岛素的细胞数的确定＞
进行上述的导入，在培养21天后，使用荧光显微镜装置拍摄DsRed2阳性产胰岛素的细胞，除此以外，进行与试验例1－1相同的操作，测定DsRed2阳性产胰岛素的细胞数。结果见图3A。
图3A中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNPM”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNPM”显示使用(3)来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果。
图3A的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，与作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时相比，胰内分泌细胞的生产效率进一步提高。
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图3B。图3B中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNPM”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNPM”显示使用(3)来自pMX－小鼠突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果。
图3B的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，与作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时相比，胰岛素基因的表达量也有所增加，从这个角度考虑，胰内分泌细胞的生产效率进一步提高。
(试验例3－2：胰内分泌细胞的制造－3－2)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－GP细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体、VSVG载体)，如下操作，制备逆转录病毒，所述Plat－GP细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－GFP载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－GFP载体。
[pMX－人GLIS1载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人GLIS1载体。
[pMX－人突变GLIS1载体]
进行与上述试验例2－2相同的操作，制备pMX－人突变GLIS1载体。
[pMX－人神经原素3载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人神经原素3载体。
[pMX－人Pdx1载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人Pdx1载体。
[pMX－人MafA载体]
进行与上述试验例1－2相同的操作，制备pMX－人MafA载体。
－逆转录病毒的制作－
除了将上述试验例1－2中使用的质粒DNA换成本试验例的质粒DNA以外，进行相同的操作，得到来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－2中使用的病毒溶液换成下述病毒溶液以外，进行相同的操作，将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图3C。图3C中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNPM”显示使用(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNPM”显示使用(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果。
图3C的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时，即使在使用人基因的情况下，与作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子时相比，胰岛素基因的表达量也有所增加，胰内分泌细胞的生产效率进一步提高。
(试验例4：葡萄糖应答性胰岛素分泌试验－1)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备了dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
使用Plat－E细胞和质粒DNA(pMX载体或pMX－puro载体)，如下操作，制备了逆转录病毒，所述Plat－E细胞在MoMuLV LTR的控制下表达能够长期产生高效价病毒的病毒结构蛋白gag－pol和env(Onishi，M.，等人，Exp.Hematol.24，324－329，1996)。
－质粒DNA的制备－
[pMX－小鼠GLIS1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠GLIS1载体。
[pMX－小鼠神经原素3载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠神经原素3载体。
[pMX－小鼠Pdx1载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠Pdx1载体。
[pMX－小鼠MafA载体]
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备pMX－小鼠MafA载体。
－逆转录病毒的制作－
除了将上述试验例1－1中使用的质粒DNA换成本试验例的质粒DNA以外，进行相同的操作，得到了来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－1中使用的病毒溶液换成下述病毒溶液以外，进行相同的操作，将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
＜葡萄糖应答性胰岛素分泌试验＞
在上述导入的34天后，使用移液管拾取所有的胰岛样块，转移到24孔板(低粘附板(EZ－BindShut II、AGC TECHNO GLASS公司制造))上，如下操作，实施葡萄糖应答性胰岛素分泌试验。
将上述胰岛样块在添加有1.4mM葡萄糖的林格溶液中培养3小时，之后交换培养基，再用含有2.8mM葡萄糖的林格溶液培养1小时，以该培养上清作为基础(以下有时称作“基础培养上清”)。
然后，将上述胰岛样块用添加有16.8mM葡萄糖的林格溶液培养1小时，将该培养上清转移到1.5mL管中(以下有所称作“高葡萄糖培养上清”)。
通过ELISA试验(人胰岛素ELISA试剂盒、Mercodia公司制造)测定上述各培养上清中的胰岛素浓度。结果见图4。
图4中，左侧(“低”)显示基础培养上清的结果，右侧(“高”)显示高葡萄糖培养上清的结果。
由图4的结果确认：当葡萄糖浓度低时，胰岛素的量少，当葡萄糖浓度升高时，胰岛素的量上升，通过本发明的制造方法制造的上述胰岛样块具有胰内分泌细胞所要求的功能。
(试验例5：葡萄糖应答性胰岛素分泌试验－2)
＜细胞的制备＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，制备dMEF。
＜逆转录病毒的制作＞
进行与试验例4相同的操作，得到了来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
进行与上述试验例4相同的操作，使用下述病毒溶液将基因导入细胞内。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
＜葡萄糖应答性胰岛素分泌试验＞
在上述导入的27天后，在实体显微镜下，使用移液管拾取30个直径为100μm～300μm的均匀的胰岛样块，转移到24孔板(低粘附板(EZ－BindShut II、AGC TECHNO GLASS公司制造))上，如下操作，实施葡萄糖应答性胰岛素分泌试验。
将上述胰岛样块用添加有2.8mM葡萄糖的林格溶液培养3小时，之后交换培养基，再培养1小时，以该培养上清为基础(以下有所称作“基础培养上清”)。
然后，将上述胰岛样块用添加有16.8mM葡萄糖的林格溶液培养1小时，将该培养上清转移到1.5mL管中(以下有时称作“高葡萄糖培养上清”)。
之后，在孔中加入含有2.8mM葡萄糖的林格溶液，培养上述胰岛样块1小时，之后将该培养上清转移到1.5mL管中(以下有所称作“低葡萄糖培养上清”)。
通过ELISA试验(株式会社Shibayagi制造、T型)测定上述各培养上清中的胰岛素浓度。结果见图5。
图5中，左侧((1))显示基础培养上清的结果，中央((2))显示高葡萄糖培养上清的结果，右侧((3))显示低葡萄糖培养上清的结果。
由图5的结果确认：当葡萄糖浓度低时，胰岛素的量少((1))；葡萄糖浓度升高时，胰岛素的量上升((2))；葡萄糖浓度变低时，胰岛素的浓度减少((3))。因此，由本试验例还确认到：通过本发明的制造方法得到的胰内分泌细胞具有胰内分泌细胞所要求的功能。
(试验例6：由小鼠间充质干细胞制造胰内分泌细胞)
＜细胞的制备＞
作为细胞，准备了小鼠间充质干细胞(Cyagen目录号No.MUBMX－01001)(以下有时称作“小鼠MSC”)。上述小鼠MSC利用ADSC－BM培养基(添加10％的FBS、青霉素、链霉素)进行继代培养。
＜逆转录病毒的制作＞
进行与试验例1－1相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
通过用上述逆转录病毒感染上述小鼠MSC，将基因导入细胞内。感染如下进行。
将上述小鼠MSC以2.5×104细胞数/孔接种在24孔板上。
第二天，在上述病毒溶液中添加8mg/mL的聚凝胺溶液(Sigma公司制造、107689)使最终浓度达到8μg/mL。吸引、除去上述小鼠MSC的培养上清后，在24孔板的每孔中加入200μL下述的病毒溶液。此外，用含有8μg/mL聚凝胺的DMEM(含10％的FBS)溶液进行调节，使各孔的病毒溶液量均匀。添加病毒溶液后，在37℃、5％CO2培养箱内进行培养。培养中每隔2天或3天进行培养基交换。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例1－1相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图6。图6中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNPM”显示使用(2)来自pMX－小鼠GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－小鼠Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－小鼠MafA载体的病毒溶液时的结果。
图6的结果显示：即使在使用间充质干细胞作为细胞的情况下，通过作为本发明的制造方法的方案之一的、使用GLIS1、神经原素3、Pdx1和MafA这4种因子，能够高效率地生产胰内分泌细胞。
(试验例7：由人新生胚胎成纤维细胞制造胰内分泌细胞)
＜细胞的制备＞
作为人细胞，准备了人新生胚胎成纤维细胞(D10051、宝酒造株式会社)。
＜逆转录病毒的制作＞
进行与试验例1－2或2－2相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－2中使用的细胞(dMEF)换成上述人新生胚胎成纤维细胞以外，进行与试验例1－2相同的操作，将基因导入细胞内。此外，使用的病毒溶液如下。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
除了将上述试验例1－1中使用的引物换成以下的引物以外，进行相同的操作，进行定量PCR分析。
－人GAPDH基因－
正向引物：5’－atgttcgtcatgggtgtgaa－3’(序列号7)
反向引物：5’－tgtggtcatgagtccttcca－3’(序列号8)
－人胰岛素基因－
正向引物：5’－gccatcaagcagatcactgt－3’(序列号9)
反向引物：5’－caggtgttggttcacaaagg－3’(序列号10)
结果见图7。图7中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“dGNM”显示使用(2)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载的病毒溶液时的结果。
图7的结果显示：在作为本发明的制造方法的方案之一的、使用突变GLIS1、神经原素3和MafA这3种因子时，即使在使用人细胞的情况下，也能够高效率地生产胰内分泌细胞。
(试验例8：由人神经胶质瘤T98G细胞株制造胰内分泌细胞)
＜细胞的制备＞
准备人神经胶质瘤T98G细胞株(RCB1954、RIKEN)作为人细胞。
＜逆转录病毒的制作＞
进行与试验例1－2或2－2相同的操作，得到了来自pMX－GFP载体的病毒溶液、来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液。
＜导入＞
除了将上述试验例1－2中使用的细胞(dMEF)换成上述人神经胶质瘤T98G细胞株以外，进行与试验例1－2相应的操作，将基因导入细胞内。此外，使用的病毒溶液如下所示。
[病毒溶液]
(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)
(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
(4)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液
(5)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液
＜定量PCR分析＞
进行与上述试验例7相同的操作，进行定量PCR分析。
结果见图8。图8中，“CTL”显示使用(1)来自pMX－GFP载体的病毒溶液(对照)时的结果，“GNPM”显示使用(2)来自pMX－人GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNPM”显示使用(3)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液、来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNM”显示使用(4)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人MafA载体的病毒溶液时的结果，“dGNP”显示使用(5)来自pMX－人突变GLIS1载体的病毒溶液、来自pMX－人神经原素3载体的病毒溶液和来自pMX－人Pdx1载体的病毒溶液时的结果。
图8的结果显示：即使在使用本发明的制造方法的任一方案的因子时，也能够使用人细胞高效率地生产胰内分泌细胞。
与现有的使用ES细胞或iPS细胞、在培养基中添加生长抑制剂等以调整培养环境来制造胰内分泌细胞的方法相比，本发明的胰内分泌细胞的制造方法简便且容易重现。而且，根据本发明的制造方法，可以非常高效地生产胰内分泌细胞。另外，还可以大幅缩短胰内分泌细胞的制造期间。
另外，根据本发明的制造方法，即使在不经过具有肿瘤形成风险的iPS细胞即可制造胰内分泌细胞方面也是有利的。
因此，本发明的胰内分泌细胞的制造方法例如可适用于针对糖尿病的再生医疗用途的胰内分泌细胞的制造等。
作为本发明的方案，例如可以列举以下的方案等。
＜1＞一种胰内分泌细胞的制造方法，其特征在于，包括下述的导入工序：将下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物导入体细胞内。
(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜2＞上述＜1＞所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，通过上述导入工序导入体细胞内的上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜3＞上述＜1＞所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，通过上述导入工序导入体细胞内的上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
＜4＞上述＜1＞所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，通过上述导入工序导入体细胞内的上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜5＞上述＜1＞所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，通过上述导入工序导入体细胞内的上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜6＞上述＜1＞～＜5＞中任一项所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，上述体细胞为成纤维细胞和间充质干细胞中的任一种。
＜7＞上述＜1＞～＜6＞的任一项所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，胰内分泌细胞为β细胞。
＜8＞一种转分化剂，其将体细胞转分化成胰内分泌细胞，其特征在于：
包含下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物。
(A)与序列号:1和序列号:2的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(B)与序列号:1和序列号:2的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
(D)与序列号:1和序列号:2的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜9＞上述＜8＞所述的转分化剂，其中，上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(A)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜10＞上述＜8＞所述的转分化剂，其中，上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(B)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物。
＜11＞上述＜8＞所述的转分化剂，其中，上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜12＞上述＜8＞所述的转分化剂，其中，上述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物为：(D)与序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列具有85％以上的序列同源性的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物。
＜13＞上述＜8＞～＜12＞中任一项所述的转分化剂，其中，上述体细胞为成纤维细胞和间充质干细胞的任一种。
＜14＞上述＜8＞～＜13＞中任一项所述的转分化剂，其中，胰内分泌细胞为β细胞。
Figure IDA0001677102010000011
Figure IDA0001677102010000021
Figure IDA0001677102010000031
Figure IDA0001677102010000041

Claims (4)

1.一种胰内分泌细胞的制造方法，其特征在于，
包括导入工序：将下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物导入体细胞内，
(A)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；
(B)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物；
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；
(D)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物，
所述胰内分泌细胞为β细胞。
2.根据权利要求1所述的胰内分泌细胞的制造方法，其中，
所述体细胞为成纤维细胞和间充质干细胞中的任一种。
3.一种转分化剂，其将体细胞转分化成胰内分泌细胞，其特征在于，
包含下述(A)～(D)中的任一种基因或其基因产物，
(A)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；
(B)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和Pdx1基因或其基因产物；
(C)GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物、Pdx1基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物；
(D)序列号:1和序列号:2中的任一个所表示的碱基序列的突变GLIS1基因或其基因产物、神经原素3基因或其基因产物和MafA基因或其基因产物，
所述胰内分泌细胞为β细胞。
4.根据权利要求3所述的转分化剂，其中，
所述体细胞为成纤维细胞和间充质干细胞中的任一种。
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