WO2020173365A1 - 一种脑胶质瘤动物模型的构建方法 - Google Patents

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WO2020173365A1
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glioma
cell suspension
cells
constructing
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白玥
钟晓松
李文斌
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首都医科大学附属北京世纪坛医院
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the present invention relates to the pathogenesis and recurrence mechanism of brain glioma, the development of new therapeutic drugs and other technical fields, in particular to a method for constructing an animal model of brain glioma.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Glioma is the most common primary malignant tumor of the brain caused by the cancerous transformation of glial cells in the brain and spinal cord. Its incidence accounts for about 35.2%-61.0% of intracranial tumors. It is derived from glioblasts. Since then, it has the characteristics of high morbidity, high recurrence, high mortality and low cure rate.
  • the most common technique is to establish subcutaneous tumor models under the skin of mice.
  • the existing evaluation methods of subcutaneous tumor models include vernier caliper measurement and tumor removal measurement.
  • the first method can achieve continuous observation, but the error is large and the process lacks effective Recording method;
  • the second method cannot be continuously observed.
  • the construction of the human glioma model under the skin is far away from the growth environment of the primary lesion, the constructed tumor model is not conducive to the research on the proliferation, metastasis and treatment of human glioma.
  • the purpose of the present invention is to construct a human glioma model in an environment closer to the growth environment of the primary human glioma foci, which can effectively evaluate tumor growth, facilitate continuous observation and obtain important data required by the research. For this reason, The invention provides a method for constructing an animal model of brain glioma.
  • a method for constructing an animal model of brain glioma comprising the following steps: Step 1, Transducing Luciferase-GFP gene into human glioma, and screening out the infected human glioma positive cells, Prepare cell suspension; Step 2. After the animal is anesthetized, its head is fixed, and the sterilized injection needle is sucked by the cell suspension and placed in the surgical area above the animal's skull;
  • Step 3 drilling the animal skull surgery area to form an injection hole
  • Step 4 move the injection needle into the injection hole, and slowly inject the cell suspension into the brain tissue; Step 5, after injecting the cell suspension, raise the injection needle to paste the wound after disinfection;
  • Step 6 After the cell suspension was injected for a week, the tumor site was visualized and observed, and the constructed orthotopic human glioma model was evaluated.
  • the animals Before transducing the Luciferase-GFP gene into human gliomas, the animals need to be fasted and watered, and the food conditions in the animals are detected under 740nm infrared light until the food in the animals is completely empty.
  • Step 1 The specific method for preparing GFP human glioma positive cells in the step 1 is: Step 1.1, inoculate human glioma cells in a cell culture dish, 5 ⁇ 10 5 cells/dish; Step 1.2, use Gaotang 4DMEM to culture Culture M-PG-13-GL cells on the base (containing 10% fetal bovine serum), collect 5ml of the virus produced, centrifuge at 2000g for 5min, save the supernatant, and add gene transfection enhancer to the supernatant, and aspirate After discarding the medium, add 5 ml of the virus produced above to infect human glioma cells;
  • Step 1.3 Repeat the above process to produce U87-GL and other human-derived cell lines or primary glioma cells, and continuously infect human glioma cells for at least 3 days;
  • Step 1.4 Amplify the human glioma cells that have been transferred to GFP in the corresponding medium;
  • Step 1.5 Use flow cytometry to sort out positive cells to prepare GFP human glioma cells.
  • step 2 an anesthetic reagent is injected to anesthetize the animal; skin preparation and disinfection are performed on the surgical area set on the animal's head, and the surgical area is cut backward from the midpoint of the intraocular canthus connection; transcranial locator Fix the head of the animal; sterilize and rinse the matched injection needle, suck the prepared cell suspension, and fix the injection needle on the animal cranial locator.
  • the injection of the cell suspension is directed to the quasi-animal anterior map, and each is moved 2cm backward and right, and the surface of the skull by the injection needle is drilled with a drilling tool, and the formation is formed after drilling through the skull Injection hole.
  • the step 4 the syringe deep brain 3.5cm, reinstituted 0.5cm, was slowly injected cell suspension containing 105-106 cells, the injection time was 3-8min.
  • the method for evaluating the constructed model in step 6 is: injecting D-Luciferin solution into the abdominal cavity of the animal, and after reacting for 3-8 minutes, placing the animal in the in vivo imaging system for burning Photograph the light for color development, and calculate the fluorescence value.
  • the measured fluorescence value is greater than 1 X 10 5 p/sec/cm 2 /sr, the constructed in-situ animal model of human glioma is successful.
  • D-Luciferin solution 150-250 is injected into the abdominal cavity of the animal.
  • the animal of the present invention is a mouse.
  • the Luciferase-GFP gene is transduced into human gliomas, and the infected positive human glioma cells are configured to form a cell suspension by screening the infected positive human glioma cells.
  • the suspension is injected into the brain tissue, and then the tumor model is evaluated by imaging and observing the tumor site, which realizes the visualization of the tumor model and effectively evaluates changes such as tumor growth and metastasis.
  • Fig. 2 is an image diagram of the human glioma in the skull of a mouse provided by the present invention. Specific Implementation Modes The technical solutions of the present invention will be clearly and completely described below with reference to the accompanying drawings. Obviously, the described embodiments are part of the embodiments of the present invention, rather than all of them. Based on the embodiments of the present invention, all other embodiments obtained by those of ordinary skill in the art without creative work shall fall within the protection scope of the present invention.
  • the GFP used below is a green fluorescent protein, which can see green light under ultraviolet excitation, which is a way of exciting fluorescence; while luciferase expresses luciferase, which requires a specific substrate reaction to achieve bioluminescence, and luciferase emits natural light .
  • the present invention provides a method for constructing an animal model of glioma, specifically a method for constructing an orthotopic mouse model of human brain tumor, and the specific steps are as follows:
  • Step 1 the Luciferase-GFP gene is transduced into human glioma, and the infected human glioma positive cells are screened out, and the cell suspension is prepared.
  • Step 1.1 Inoculate human glioma cells in a cell culture dish, 5 ⁇ 10 5 cells/dish;
  • Step 1.2 use Gaotang 4DMEM medium (containing 10% fetal bovine serum) to culture M-PG-13-GL cells , Collect 5ml of the virus produced, centrifuge at 2000g for 5min, save the supernatant, add gene transfection enhancer to the supernatant, aspirate the medium, add 5ml of the virus produced above to infect human glioma cells ;
  • Step 1.3 Repeat the above process to make U87-GL cells, and continuously infect human glioma cells for at least 3 days;
  • Step 1.4 Amplify the human glioma cells that have been transferred to GFP in the corresponding medium;
  • Step 1.5 Use flow cytometry to sort out positive cells to prepare GFP human glioma cells.
  • Step 1.6 Remove the medium, digest with trypsin and resuspend by pipetting with PBS, and configure to form Cell suspension: Resuspend cells in PBS, preferably with a density of 1-10*10 5 /5ul.
  • Step 2 After the mouse is anesthetized, the head is fixed, the sterilized injection needle is sucked into the cell suspension and placed in the surgical area above the mouse skull
  • 10% chloral hydrate with a dosage of 3.5ml/g it is preferable to use 10% chloral hydrate with a dosage of 3.5ml/g to anesthetize the mouse; perform skin preparation and disinfection on the surgical area set on the mouse head, and start from the midpoint of the intraocular canthal line Later, incise the operation area of 1cm; fix the head of the mouse by the mouse cranial locator; sterilize and rinse the matching injection needle, suck the cell suspension and fix it on the mouse cranial locator.
  • Step 3 After drilling the mouse skull surgery area, an injection hole is formed.
  • the injection of the cell suspension is directed at the quasi-mouse bregma, and the injection needle is moved backward and right by 2 cm with the drilling tool. Drill holes on the surface of the skull and drill through the skull to form an injection hole.
  • Step 4 Move the injection needle into the injection hole and inject the cell suspension slowly into the brain tissue. Specifically, the injection needle is penetrated into the brain tissue by 3.5 cm, then lifted by 0.5 cm, and slowly injected into the cell suspension, 5 ul/piece, and the injection time is 3-8 minutes, preferably 5 minutes.
  • the injection depth, dose, and injection time of the injection needle can be reset according to the set parameters, which are not limited to the above parameter values.
  • Step 5 After injecting the cell suspension, let it stand for 4-6 minutes, preferably 5 minutes, and then slowly raise the injection needle to disinfect and glue the wound.
  • Step 6 After the cell suspension is injected for one week, the tumor site is imaged and observed, and the constructed orthotopic human glioma model is evaluated. By injecting luciferin into the abdominal cavity of mice, it is fully combined with human glioma cells and then photographed for color development.
  • the specific method for evaluating human glioma in situ model is as follows: Mice are injected with D-Luciferin solution 200 into the abdominal cavity and reacted for 3-8 minutes to fully combine with human glioma cells. Place the mouse in a small animal in vivo imaging system, take a fluorescent photo to develop the color and calculate the fluorescence value. The fluorescence value greater than 1 X 10 5 p/sec/cm 2 /sr is considered to be successful.
  • Luciferase In the presence of magnesium ions, luciferase reacts luciferin with ATP, which is then oxidized to form a dioxetane structure and emit a yellow-green light.
  • the protein expressed by Luciferase-GFP gene can be Combining with fluorescein and emitting light, and then using the small animal imaging system, allows researchers to directly monitor cell activity and gene behavior in living organisms. Through the present invention, it is possible to observe biological processes such as tumor growth and metastasis in living animals, the development process of infectious diseases, and the expression of specific genes.
  • the size and distribution of tumors in living mice developed by D-fluorescein can be visually displayed to researchers through fluorescence. According to the measurement of fluorescence values, statistical differences in tumor size between groups can be counted.

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Abstract

提供了一种新的脑胶质瘤动物模型的构建方法，将Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤，并筛选出感染后的人脑胶质瘤阳性细胞，配制形成细胞悬液；小鼠麻醉后将其头部固定，将消毒后的进样针吸取细胞悬液后置于小鼠颅骨上方手术区域；对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔；移动进样针至注射孔中，并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液；注射完细胞悬液后提出进样针，将伤口消毒后粘合；待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察，并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。

Description

一种脑胶质瘤动物模型的构建方法
技术领域 本发明涉及脑胶质瘤发病及复发机制， 开发新的治疗药物研究等技术 领域， 具体涉及一种脑胶质瘤动物模型的构建方法。 背景技术 脑胶质瘤是因为大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的最常见的原发性颅 脑恶性肿瘤， 其发病率约占颅内肿瘤的 35.2%-61.0%， 由成胶质细胞衍化而 来， 具有发病率高、 复发率高、 死亡率高以及治愈率低的特点。
目前， 比较常见的技术是在小鼠皮下建立皮下肿瘤模型， 现有皮下肿 瘤模型的评估方式包括游标卡尺测量及取瘤测量， 第一种方法可实现连续 观测， 但是误差较大， 过程缺乏有效的记录方法； 第二种方法不可连续观 察。 由于在皮下进行人脑胶质瘤模型的构建远离了原发病灶的生长环境， 因此， 所构建的肿瘤模型不利于对人脑胶质瘤增殖、 转移及治疗等方面的 研究。 发明内容 本发明的目的在于在更接近人类脑胶质瘤原发病灶生长环境下构建人 脑胶质瘤模型， 可以有效评估肿瘤生长， 方便连续观测并获取研究所需要 的重要数据， 为此， 本发明提供了一种脑胶质瘤动物模型的构建方法。
一种脑胶质瘤动物模型的构建方法， 所述方法包括如下步骤： 步骤 1， 将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤， 并筛选出感染后的 人脑胶质瘤阳性细胞， 配制形成细胞悬液； 步骤 2, 动物麻醉后将其头部固定， 将消毒后的进样针吸取细胞悬液后 置于动物颅骨上方手术区域；
步骤 3 , 对动物颅骨手术区域钻孔后形成注射孔；
步骤 4 ,移动进样针至注射孔中，并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液; 步骤 5 , 注射完细胞悬液后提出进样针， 将伤口消毒后粘合；
步骤 6, 待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察， 并对所构建 的人脑胶质瘤原位模型进行评估。
在将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤之前需要对动物禁食不禁 水， 在 740nm的红外光下检测动物体内食物状况， 直至动物体内食物完全 排空为止。
所述步骤 1中制备 GFP人脑胶质瘤阳性细胞的具体方法是： 步骤 1.1、 将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中， 5xl05个 /皿； 步骤 1.2、 采用高唐 4DMEM 培养基 （含 10%的胎牛血清） 培养 M-PG-13-GL细胞，收集产生的病毒 5ml，采用 2000g离心 5min，留上清液， 并在上清液中加入基因转染增强剂， 吸弃培养基后， 加入上述所产生的病 毒 5ml感染人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.3、 重复上述过程制作 U87-GL等人源的细胞株或原代胶质瘤细 胞， 且连续感染人脑胶质瘤细胞至少 3天；
步骤 1.4、 相应培养基扩增已转入 GFP的人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.5、 采用流式分选出阳性细胞， 制得 GFP人脑胶质瘤细胞。
所述步骤 2 中注入麻醉试剂将动物麻醉； 在动物头部所设定的手术区 域进行备皮、 消毒， 并自眼内眦连线中点向后切开作为手术区域； 经动物 颅定位仪将动物的头部固定； 消毒冲洗配套的进样针， 吸取配制好的细胞 悬液后将进样针固定在动物颅定位仪上。
所述步骤 3 中将吸取细胞悬液的进样针对准动物前図， 向后向右各移 动 2cm, 通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔， 钻穿颅骨后形成 注射孔。
所述步骤 4中将进样针深入脑组织 3.5cm， 再提起 0.5cm， 缓慢注入含 有 105-106个细胞的细胞悬液， 注入时间为 3-8min。
所述步骤 5中注射完细胞悬液后需静置 4-6mm， 然后缓慢提出进样针， 对伤口进行消毒、 粘合。
所述步骤 6中并对所构建模型进行评估的方法是： 在动物腹腔注射 D- 虫荧光素 (D-Luciferin)溶液， 经反应 3-8分钟后， 将动物置于活体成像系统 内进行焚光拍照显色，并计算焚光值，当所测焚光值大于 1 X 105p/sec/cm2/sr 时， 所构建的人脑胶质瘤动物原位模型造模成功。
优选地， 在动物腹腔注射 D-虫荧光素 (D-Luciferin)溶液 150-250 。 本发明的动物为小鼠。
本发明技术方案具有如下优点：
A.本发明将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤中，通过筛选出被感 染的阳性人脑胶质瘤细胞配置形成细胞悬液， 通过对小鼠进行烦骨钻孔方 式将细胞悬液注入脑组织中， 再经对肿瘤部位进行显像观测对所构建的肿 瘤模型进行评估， 实现了肿瘤模型的可视化、 有效评估肿瘤生长、 转移等 变化。
B.本发明通过在在小鼠腹腔注射 D-虫荧光素 (D-Luciferin)溶液，经反应 3-8分钟后，将小鼠置于活体成像系统内进行荧光拍照显色，并计算荧光值， 根据荧光值的大小对肿瘤模型进行评估， 方便工作人员进行连续性观测， 其评估受人为因素影响小， 为实验的真实性提供了可靠的依据。 附图说明 为了更清楚地说明本发明具体实施方式， 下面将对具体实施方式中所 需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图是本发明 的一些实施方式， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的 前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 图 1为本发明所提供的人脑胶质瘤小鼠原位模型构建方法框图;
图 2为本发明所提供的人脑胶质瘤在小鼠颅骨部显像图示。 具体实旆方式 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发 明的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。
如下所采用的 GFP为绿色荧光蛋白， 其在紫外激发下可见绿光， 为激 发焚光方式； 而 luciferase表达的是焚光素酶， 需要特定底物反应后才能实 现生物发光， luciferase发光为自然光。 如图 1 所示， 本发明提供了一种脑胶质瘤动物模型的构建方法， 具体 为人脑脑质瘤小鼠原位模型的构建方法， 具体步骤如下：
【步骤 1】， 将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤， 并筛选出感染 后的人脑胶质瘤阳性细胞， 配制形成细胞悬液。
具体方法是：
步骤 1.1、 将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中， 5xl05个 /皿； 步骤 1.2、 采用高唐 4DMEM 培养基 （含 10%的胎牛血清） 培养 M-PG-13-GL细胞，收集产生的病毒 5ml，采用 2000g离心 5min，留上清液， 并在上清液中加入基因转染增强剂， 吸弃培养基后， 加入上述所产生的病 毒 5ml感染人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.3、 重复上述过程制作 U87-GL细胞， 且连续感染人脑胶质瘤细 胞至少 3天；
步骤 1.4、 相应培养基扩增已转入 GFP的人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.5、 采用流式分选出阳性细胞， 制得 GFP人脑胶质瘤细胞。
步骤 1.6、 移走培养基， 采用胰蛋白酶消化和 PBS吹打重悬， 配置形成 细胞悬液； PBS重悬细胞， 优选采用密度为 l-10* 105/5ul。
【步骤 2】， 小鼠麻醉后将其头部固定， 将消毒后的进样针吸取细胞悬 液后置于小鼠颅骨上方手术区域
这里优选采用 10%的水合氯醛， 使用剂量为 3.5ml/g， 将小鼠麻醉； 在 小鼠头部所设定的手术区域进行备皮、 消毒， 并自眼内眦连线中点向后切 开 lcm的手术区域； 经小鼠颅定位仪将小鼠的头部固定； 消毒冲洗配套的 进样针， 吸取细胞悬液后将其固定在小鼠颅定位仪上。
【步骤 3】 ， 对小鼠颅骨手术区域钻孔后形成注射孔 将吸取细胞悬液的进样针对准小鼠前囟， 向后向右各移动 2cm， 通过 钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔， 钻穿颅骨后形成注射孔。
【步骤 4】， 移动进样针至注射孔中， 并深入至脑组织中缓慢注入细胞 悬液。 具体地将进样针深入脑组织 3.5cm， 再提起 0.5cm， 缓慢注入细胞悬 液， 5ul/只， 注入时间为 3-8min， 优选 5min。 当然还可以根据所设定的参 数对进样针的注入深度、 剂量和注入时间进行重新设定， 不限于上述参数 值。
【步骤 5】 ， 注射完细胞悬液后需静置 4-6min， 优选 5min， 然后缓慢 提出进样针， 对伤口进行消毒、 粘合。
【步骤 6】， 待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察， 并对所 构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。 通过在小鼠腹腔注射荧光素 (luciferin), 与人脑胶质瘤细胞充分结合后， 拍照显色。
具体的人脑胶质瘤原位模型评估方法如下： 小鼠腹腔注射 D-虫荧光素 (D-Luciferin)溶液 200 ， 反应 3-8分钟， 使 其与人脑胶质瘤细胞充分结合后， 将小鼠置于小动物活体成像系统内， 荧 光拍照显色并计算焚光值， 焚光值大于 1 X 105p/sec/cm2/sr被认定为造模成 功。
在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与 ATP反应， 接着它被氧化形成二 氧杂环丁焼结构并发出黄绿色的光。 Luciferase-GFP基因所表达的蛋白既可 与荧光素结合并发光， 再利用小动物成像系统， 能够让研究人员直接监控 活体生物体内的细胞活动和基因行为。 通过本发明， 可以观测活体动物体 内肿瘤的生长及转移、 感染性疾病发展过程、 特定基因的表达等生物学过 程。
Figure imgf000008_0001
经 D-虫荧光素显色的活体小鼠， 其肿瘤的大小与分布可通过荧光直观 的展示给研究者， 根据对荧光值的测定， 可以统计各组间肿瘤大小的统计 学差异。
显然， 上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例， 而并非对实施方 式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。 而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范 围之中。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种脑胶质瘤动物模型的构建方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 步骤 1， 将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤， 并筛选出感染后的 人脑胶质瘤阳性细胞， 配制形成细胞悬液；
步骤 2, 动物麻醉后将其头部固定， 将消毒后的进样针吸取细胞悬液后 置于动物颅骨上方手术区域；
步骤 3 , 对动物颅骨手术区域钻孔后形成注射孔；
步骤 4 ,移动进样针至注射孔中，并深入至脑组织中缓慢注入细胞悬液; 步骤 5 , 注射完细胞悬液后提出进样针， 将伤口消毒后粘合；
步骤 6, 待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察， 并对所构建 的人脑胶质瘤原位模型进行评估。
2、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 将 Luciferase-GFP基因转导进人脑胶质瘤之前需要对动物禁食不禁水， 在 740nm 的红外光下检测动物体内食物状况， 直至动物体内食物完全排空为 止。
3、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 1中制备 GFP人脑胶质瘤阳性细胞的具体方法是：
步骤 1.1、 将人脑胶质瘤细胞接种于细胞培养皿中， 5xl05个 /皿； 步骤 1.2、 采用高唐 4DMEM 培养基 （含 10%的胎牛血清） 培养 M-PG-13-GL细胞，收集产生的病毒 5ml，采用 2000g离心 5min，留上清液， 并在上清液中加入基因转染增强剂， 吸弃培养基后， 加入上述所产生的病 毒 5ml感染人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.3、 重复上述过程制作 U87-GL细胞， 且连续感染人脑胶质瘤细 胞至少 3天；
步骤 1.4、 相应培养基扩增已转入 GFP的人脑胶质瘤细胞；
步骤 1.5、 采用流式分选出阳性细胞， 制得 GFP人脑胶质瘤细胞。
4、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 2 中注入麻醉试剂将动物麻醉； 在动物头部所设定的手术区域进 行备皮、 消毒， 并自眼内眦连线中点向后切开作为手术区域； 经动物颅定 位仪将动物的头部固定； 消毒冲洗配套的进样针， 吸取配制好的细胞悬液 后将进样针固定在动物颅定位仪上。
5、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 3 中将吸取细胞悬液的进样针对准动物前図， 向后向右各移动 2cm, 通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔， 钻穿颅骨后形成注射 孔。
6、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 4 中将进样针深入脑组织 3.5cm, 再提起 0.5cm, 缓慢注入含有 105-106个人脑胶质瘤细胞的细胞悬液， 注入时间为 3-8min。
7、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 5中注射完细胞悬液后需静置 4-6mm， 然后缓慢提出进样针， 对 伤口进行消毒、 粘合。
8、 根据权利要求 1所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 所述步骤 6中对所构建模型进行评估的方法是： 在动物腹腔注射 D-虫荧光 素 (D-Luciferin)溶液， 经反应 3-8分钟后， 将动物置于活体成像系统内进行 焚光拍照显色， 并计算焚光值， 当所测焚光值大于 1 X 105p/sec/cm2/sr时， 所构建的人脑胶质瘤动物原位模型造模成功。
9、 根据权利要求 8所述的脑胶质瘤动物模型的构建方法，其特征在于， 在动物腹腔注射 D-虫荧光素 (D-Luciferin)溶液 150-250pL。
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